Sc v3n3

Scientia Chromatographica Revista Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia

2011 | Volume 3 | NĂşmero 3

Apre esenta ando o Sistema ACQUITY UPLC I-Class

A Wa Wateers cri riou ou o UPL PLC C® de ma maio iorr de dese semp mpen enho ho já pr proj ojet etad ado. o. Mel elho horo rouu si sign gnifi ificcat ativ ivam amen ente te a perffor pe orma manc ncee cr crom omat atog ográ ráfifica ca,, da dand ndoo a vo você cê mai aior or con onfifian ança ça em se seus us res esul ulta tado doss e pe perm rmit itin indo do que voocê obt bten enha ha máx áxim imaa se sens nsib ibil ilid idad adee do seu Esp spec ectr trôm ômet etro ro de Ma Mass ssas as.. Ma Mass pa para ra os ci cien enti tist stas as que querem em res espo post stas as par araa os des esafi afioos ma mais is com ompl plex exos os,, o AC ACQU QUIT ITY Y UP UPLC LC® I-C -Cla lass ss sim impl ples esme ment ntee traz algo: Opoort rtun unid idad ade. e. Lei eiaa ma mais is em wa wate ters rs.c .com om/i /icl clas asss Leia o código de barra 2D com seu smartphone para conteúdo exclusivo. ©2011 Waters Corporation Waters, UPLC e ACQUITY UPLC são marcas registradas da Waters Corporation. The Science of What’s Possible é uma marca da Waters Corporation.

SUMÁRIO

Editorial ...............................................................................................................................183

HPLC-LC/MS Cromatografia líquida capilar: 2. Alargamento das bandas por efeitos extracoluna.......................................................................................... 185 Lincoln Coutinho, Fernando Mauro Lanças

GC-MS Algunos consejos útiles para el análisis cromatográfico de compuestos orgánicos volátiles ............................................................................... 199 Elena Stashenko, Jairo René Martínez

PREPARO DE AMOSTRAS Microextração em sorvente empacotado (MEPS) para a determinação de fármacos em fluidos biológicos ........................................................ 223 Maria Eugênia Costa Queiroz

TÉCNICAS ELETROFORÉTICAS Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos empregando eletroforese capilar .............................................................................. 231 Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira

QUALIDADE Desvendando a medição nos ensaios químicos: 1. A curva analítica ou de calibração .................................................................................. 251 Oscar Bahia Filho, Patrícia Regina Prada, Carla Meneghesso, Fernando Mauro Lanças

Instituto Internacional de Cromatografia ................................................................................265 Bookstore .............................................................................................................................266 Calendário de Cursos do I.I.C. ..............................................................................................267 Calendário Geral .................................................................................................................268

Scientia Chromatographica 2011; 3(3)

181

EDITORIAL

A demanda pelo uso das várias técnicas cromatográficas vem acompanhando, de forma notável, o crescimento dos requisitos para uma melhora da qualidade de vida da população em todo o mundo; o enorme potencial da América neste nicho foi rapidamente percebido por outras matizes geopolíticas e econômicas (1). O aumento da exigência de órgãos governamentais com relação aos registro de produtos químicos para uso como medicamento veterinário e humano, com a qualidade dos alimentos, meio ambiente, combustíveis e outras necessidades, tem exigido uma melhora frenética na area, tanto na parte acadêmica quanto na tecnológica.

A cromatografia líquida moderna (HPLC), técnica praticamente dominante nas análises de medicamentos veterinários e humanos, verificou recentemente um crescimento marcante na qualidade da instrumentação, maior oferta de colunas (microempacotadas menores que 2 mm; superficialmente porosas; monolíticas, dentre outras), e no desenvolvimento de software mais apropriado para validação de metodologias e para gestão da qualidade. O aprimoramento da qualidade, miniaturização, e barateamento da espectrometria de massas, fizeram desta técnica a forma de detecção ideal para as técnicas cromatográficas, popularizando o uso da LC-MS/MS, GC-MS/MS, CE-MS/MS e outras.

A cromatografia gasosa de alta resolução (HRGC), mais antiga como técnica instrumental e melhor consolidada, tem tido desenvolvimento mais tecnológico do que científico, sendo que os avanços neste técncia tem sido mais de natureza incremental tais como melhora na estabilidade térmica das colunas, injetores com menor discrimimação, e similares.

Mais recentemente, houve um renascimento consistente da cromatografia com fluido supercrítico (SFC), a qual se encontrava “dormente” desde meados da década de 1990. O grande potencial do seu uso, principalmente nas análises farmacêuticas, aliado ao apelo de química verde quando CO2 é usado como fase móvel, começa a despertar o interesse dos atuais usuários tanto de HPLC quanto de HRGC, como uma alternativa mais rápida, barata e ambientalmente correta.

Estamos vivendo neste momento a “era da cromatografia”, cuja expansão gradativa vem ganhando adeptos vindos de outras áreas, especialmente daquelas que podem ser acopladas às técnicas cromatográficas e/ou à espectrometria de massas empregando a cromatografia com técnica de separação. Exemplos típicos são a termoanálise, pirólise, radiolise, tecnologia de reatores em engenharia hidráulica, dentre muitos outros.

O momento é apropriado, oportuno e a educação na área torna-se preponderante para que o país possa saber desenvolver novas ferramentas e utilizar corretamente as existentes.

Fernando M. Lanças Editor chefe

Scientia Chromatographica 2011; 3(3) 183

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: 10.4322/sc.2011.011

HPLC-LC/MS

ISSN 1984-4433

Cromatografia líquida capilar: 2. Alargamento das bandas por efeitos extracoluna Lincoln Coutinho, Fernando Mauro Lanças* Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo Cep 13560-970, São Carlos, SP, Brasil e-mail: flancas@iqsc.usp.br

Resumo O alargamento da banda é um fator altamente indesejável em todas as técnicas cromatográficas, uma vez que diminui a eficiência da coluna (menor número de pratos, N) e deteriora a resolução (menor Rs). Este efeito é particularmente crítico na cromatografia líquida capilar (c-LC) devido aos pequenos volumes da instrumentação, conexões, colunas, etc., empregados na técnica. Como parte de uma série de artigos a respeito da c-LC, neste trabalho serão abordados os principais fatores que ocasionam o alargamento das bandas cromatográficas em c-LC, assim como a maneira de evitá-lo.

Palavras-chave Cromatografia líquida capilar; alargamento de bandas; fatores extra coluna; micro LC; LC capilar.

Capillary liquid chromatography: 2. Band broadening due to extracolumn effects Abstract Band broadening is one of the major factors to be avoided in chromatographic techniques, once it decreases the column efficiency (the number of plates, N) and deteriorates the Resolution (Rs). This effect is particularly critical in capillary liquid chromatography due to the very low volumes, instrumentation, connections and columns employed in this technique. As a part in a series of papers dealing with c-LC, this work describes the major factors responsible for band broadening in chromatography, as well as the ways to minimize it.

Keywords Capillary liquid chromatography; band broadening; extracolumn effects; micro-LC; capillary LC.

Coutinho LFM, Lanças FM

1 Introdução Os primeiros trabalhos relacionados à utilização de colunas capilares na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) surgiram no final da década de 60, praticamente ao mesmo tempo que o surgimento da própria HPLC. Apesar de seu início promissor, o desenvolvimento da cromatografia líquida capilar (c-LC) foi bastante lento ao longo dos últimos 40 anos e, até o presente, não alcançou ampla difusão, fazendo com que as colunas de 4,6 mm de diâmetro interno ainda permaneçam como padrão comercial. Um dos principais motivos que levaram a este lento avanço, e a consequente padronização das colunas de 4,6 mm, está diretamente relacionado a um grande, e lamentável, equívoco ocorrido no início do desenvolvimento das colunas de HPLC. As primeiras colunas desenvolvidas para a versão instrumental da cromatografia líquida possuíam entre 1,6-3,0 mm de diâmetro interno (d.i.) x 50-100 cm de comprimento e eram geralmente empacotadas com partículas de 30 µm recobertas com uma fase estacionária pelicular.

No entanto, logo após a introdução das primeiras fases estacionárias compostas de micropartículas porosas de 5-10 µm, foi observado que as antigas colunas – agora empacotadas com a nova fase estacionária – diferentemente do esperado, possuíam menor eficiência quando comparadas com colunas de diâmetro interno maiores (5-6 mm) empacotadas também com o novo material. Esta observação fez com que grande parte dos cromatografistas acreditasse, erroneamente, que colunas de pequeno diâmetro interno possuíam intrinsecamente eficiências menores que as de grande diâmetro interno, fazendo assim com que estas se tornassem o novo padrão a partir de então[1].

186

Alargamento de bandas em micro-LC

Na realidade, a menor eficiência obtida pelas colunas de pequeno diâmetro interno não estava relacionada à sua dimensão, mas sim ao excessivo alargamento de banda ocorrido tanto dentro da coluna – devido à limitada tecnologia de empacotamento existente na época – quanto fora da coluna – devido à utilização de detectores inadequados aos picos estreitos eluídos pelas novas colunas[1], uma vez que estas podiam atingir até 10.000 pratos, fornecendo assim picos 10 vezes mais estreitos que aqueles fornecidos pelas primeiras colunas empacotadas com partículas de 30 µm, que possuíam em torno de 500 pratos[1].

Deste modo, quando surgiram as primeiras fases estacionárias porosas de 5-10 µm, havia a necessidade de se redesenhar grande parte do equipamento cromatográfico (incluindo os detectores) para que se adaptasse às novas colunas, no entanto, ocorreu o inverso, as novas colunas tiveram seu diâmetro interno aumentado para que se adaptassem aos antigos equipamentos[2].

Este equívoco na interpretação da origem da baixa eficiência obtida pelas colunas capilares, que acabou resultando no abandono de seu uso, ilustra muito bem a importância que o conhecimento dos aspectos teóricos referentes à miniaturização das colunas cromatográficas pode ter para o cromatografista e para a técnica em si.

Assim como ocorreu 40 anos atrás, atualmente o alargamento de banda extracoluna ainda vem sendo considerado um dos maiores desafios da miniaturização da cromatografia líquida (LC)[3-8], uma vez que possui grandes implicações no desenvolvimento de sistemas instrumentais de alta eficiência destinados à escala capilar.

Deste modo, provavelmente o aspecto teórico mais importante que um bom cromatografista deve dominar, para que finalmente as colunas capilares na LC possam produzir implicações similares àquelas introduzidas pelas colunas Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

Alargamento de bandas em micro-LC

Coutinho LFM, Lanças FM

capilares na GC, seja o completo entendimento dos processos envolvidos no alargamento de banda extracoluna.

Este trabalho, como parte de uma série de artigos a respeito da cromatografia líquida capilar (c-LC), tem como objetivo discutir os principais processos de dispersão relacionados ao alargamento de banda extracoluna, assim como seu significado prático.

2 Largura do pico cromatográfico Sob condições ideais, quando uma pequena quantidade de amostra é introduzida em um sistema cromatográfico na forma de uma pequena zona retangular, os picos eluídos desse sistema idealmente possuirão uma distribuição gaussiana descrita pela Equação 1: y=

A

σ obs

 −(t − t r )2  exp   2 2π  2σ obs 

(1)

onde A é a área do pico, sobs o desvio padrão do pico observado a partir do cromatograma, t o tempo e tr o tempo de retenção do pico.

Como descrito pela Equação 1, um pico gaussiano é matematicamente caracterizado pela sua área, tempo de retenção, e desvio padrão.

Esta caracterização em função do desvio padrão ao invés da largura do pico, como é corriqueiramente feita pelos cromatografistas, vem do fato de que, matematicamente, a largura de base de uma curva gaussiana é infinita, uma vez que tal curva é assintótica, tocando assim a linha de base somente em valores de t infinitos.

Deste modo, para caracterizarmos um pico cromatográfico em função da sua largura de base, torna-se necessária a estipulação de um método para definirmos como tal largura será obtida. Atualmente, é comum considerar que a largura de um pico cromatográfico gaussiano Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

será aquela definida pela intersecção das tangentes do ponto de inflexão do pico com a linha de base. Graficamente, isto equivale ao valor de 4 desvios padrão, como mostrado na Figura 1.

Utilizando tal critério, podemos reescrever a Equação 1, agora em função da largura de base, da seguinte forma: y=

 −8(t − t r )2  exp   w2 w 2π   4A

(2)

onde w é a largura de base do pico obtida pela intersecção das linhas tangentes aos pontos de inflexão com a linha de base.

Uma vez que a largura de um pico cromatográfico gaussiano está diretamente relacionada ao seu desvio padrão, poderíamos utilizar tal valor como um bom parâmetro para a avaliação do alargamento de banda. No entanto, em várias situações, torna-se mais vantajoso (devido à sua propriedade aditiva) a utilização do valor do quadrado do desvio padrão (isto é, a variância) para tal propósito. A relação entre a eficiência de uma separação cromatográfica (em termos da altura de um prato) e o alargamento da banda cromatográfica (em termos da variância) é dada pela Equação 3:

Figura 1 Pico cromatográfico com distribuição gaussiana.

187

Coutinho LFM, Lanças FM

H=

Alargamento de bandas em micro-LC

2 s obs (3) L

onde H é a altura equivalente de um prato, s2obs é a variância do pico observada a partir do registro do cromatograma, e L o comprimento da coluna.

3 Fontes de alargamento de banda Idealmente, o alargamento da banda cromatográfica deveria depender somente dos processos de dispersão relacionados à coluna[9], ou seja: 2 s obs

2 = s col

(4)

onde s2col é a contribuição da coluna para a variância total observada a partir do cromatograma.

No entanto, na prática, é verificado que tanto a coluna quanto o equipamento influenciam na largura do pico. Desta forma, a variância do pico pode ser mais bem expressada pela seguinte equação: 2 s obs

2 = s col

2 + s ex

(5)

onde s2ex é a contribuição de todas as fontes de dispersão extracoluna para o alargamento total do pico.

3.1 Processos de dispersão intracoluna – s 2col Saito et al.[1] foram os primeiros pesquisadores a estudarem a contribuição dos diferentes processos de dispersão ocorridos dentro de uma coluna empacotada para o alargamento total da banda. Tais autores postularam a existência de basicamente quatro processos de dispersão que influenciam de forma significativa a variância final da banda cromatográfica. Estes processos foram designados pelos autores como: • Dispersão devido aos múltiplos caminhos; 188

• Dispersão devido à difusão longitudinal; • Dispersão devido à resistência à transferência de massa na fase móvel; • Dispersão devido à resistência à transferência de massa na fase estacionária.

Segundo estes autores, todos estes processos seriam aleatórios e essencialmente independentes entre si fornecendo, assim, contribuições individuais para a variância da banda cromatográfica que, quando somadas, produziriam a variância final da banda[10], ou seja: 2 2 2 s col = s mc + s dl2 + s rm + s rs2 (6)

onde s2mc, s2dl, s2rm e s2rs representam as contribuições da dispersão causada pelos múltiplos caminhos, difusão longitudinal, resistência à transferência de massa na fase móvel e resistência à transferência de massa na fase estacionária, respectivamente.

3.2 Processos de dispersão extracoluna – s 2ex Semelhantemente ao feito de Saito et al.[1] para os processos de dispersão intracoluna, um grande número de pesquisadores vem propondo e desenvolvendo vários métodos e equações específicas para estimar as contribuições das diversas fontes de dispersão extracoluna[11-22]. A seguir discutiremos as suas cinco principais fontes, a citar: • Dispersão devido ao volume de amostragem (s2inj); • Dispersão ocorrida nas tubulações (s2tub); • Dispersão devido aos processos de mistura e difusão ocorridas nas conexões (s2md); • Dispersão devido ao volume da cela de detecção (s2det); Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

Alargamento de bandas em micro-LC

Coutinho LFM, Lanças FM

• Dispersão devido à constante de tempo do detector (s2ct).

Semelhantemente ao alargamento de banda intracoluna, o alargamento de banda extracoluna é expresso como a soma de todas as contribuições individuais, como mostrada pela Equação 7.

2 2 2 2 2 s ex = s inj + s tub + s md + s det + s ct2 (7)

O completo entendimento da origem e da magnitude destes diferentes processos de alargamento extracoluna é de fundamental importância para o desenvolvimento de sistemas cromatográficos capilares de alta eficiência e, uma vez que – por motivos óbvios – tais processos de dispersão sempre estarão presentes em maior ou menor grau[23], a principal preocupação no desenvolvimento de equipamentos dedicados a c-LC é o quanto esses efeitos podem influenciar a separação.

Atualmente há um consenso de que a variância proporcionada pelos processos de dispersão extracoluna não deve superar 10% da contribuição da coluna, ou seja: 2 2 (8) s ex ≤ 0,10s col

A Equação 8 ainda pode ser escrita, em termos dos parâmetros cromatográficos, da seguinte forma:

2 σ ex ≤ 0,10

π 2 r 4 L2ε 2 (1 + k)2 (9) N

onde s2ex possui unidades de volume, r, L e e são respectivamente o raio, comprimento e permeabilidade da coluna, enquanto N e k são respectivamente o número de pratos e o fator de retenção para um dado composto.

A Tabela 1 mostra os valores máximos tolerados para a variância extracoluna para diversos picos com diferentes fatores de retenção em sete diferentes colunas, calculadas a partir da Equação 9.

A partir dos valores da Tabela 1, podemos observar que uma coluna com diâmetro interno de 250 µm admitirá uma variância extracoluna máxima cerca de 115.000 vezes menor que aquela admitida para uma coluna convencional de 4,6 mm de diâmetro interno. Esta observação demonstra claramente a importância que a redução de todas as fontes de dispersão extracoluna possui para a c-LC. Apesar da Equação 9 ser muito útil no cálculo do máximo alargamento de banda extracoluna tolerado para um sistema em particular, ela não fornece nenhuma informação sobre as máximas contribuições individuais de cada fonte de alargamento. Para tal, podemos utilizar a Equação 10:

Tabela 1 Valores máximos tolerados para a variância extracoluna (s2ex) calculados a partir da Equação 9*.

D.I.† da coluna

Fator de retenção (k) 0

2

6

10

20

4,6 mm

20,3 µL2

183 µL2

995 µL2

2.456 µL2

8.952 µL2

1,0 mm

0,05 µL2

0,41 µL2

2,22 µL2

5,49 µL2

20,0 µL2

250 μm

2

177 nL

1.594 nL

8.678 nL

21.429 nL

78.103 nL2

100 μm

4,53 nL2

40,8 nL2

222 nL2

549 nL2

1999 nL2

50 μm

0,28 nL2

2,55 nL2

13,9 nL2

34,3 nL2

125 nL2

20 μm

0,01 nL2

0,07 nL2

0,36 nL2

0,88 nL2

3,20 nL2

10 μm

453 pL2

4.080 pL2

22.216 pL2

54.859 pL2

199.943 pL2

2

2

2

* L = 0,15 m; e = 0,7; N = 15.000. † Diâmetro interno.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197 189

Coutinho LFM, Lanças FM

Alargamento de bandas em micro-LC

2 (10) σ x2 = θ xσ ex

onde s2x é a contribuição individual para alargamento de banda proporcionado pela fonte de dispersão x e θx a fração do máximo alargamento de banda extracoluna (s2ex) tolerado para tal fonte de dispersão, sendo que a somatória de todas as frações individuais deverá ser sempre igual a 1, ou seja:

∑θ x = θinj + θtub + θmd + θdet + θct = 1 (11) 3.3 Dispersão devido à introdução da amostra O alargamento de banda proporcionado pelo processo de introdução da amostra tem origem em basicamente duas fontes distintas.

A primeira fonte é inerente a todos os sistemas de introdução de amostras e, desta forma, infelizmente não pode ser evitada. Tal fonte de dispersão resulta da natureza finita do volume da amostra introduzida no sistema e é diretamente proporcional a ele. Desta forma, esta fonte de alargamento de banda é independente do tipo de sistema de introdução da amostra.

Por sua vez, a segunda fonte de alargamento de banda está diretamente relacionada ao perfil com o qual a amostra é introduzida no sistema cromatográfico, sendo dependente do tipo de sistema de introdução da amostra, do design utilizado pela válvula, do diâmetro interno da alça de amostragem (independente se é externa ou interna), velocidade de comutação da posição Load para a Inject, entre muitos outros fatores.

A contribuição de ambas as fontes para o alargamento de banda pode ser calculada a partir da seguinte equação: 2 s inj

=

2 Vinj

K2

(12)

onde Vinj é o volume de injeção e K é uma constante que caracteriza o perfil com o qual a amostra é introduzida no sistema cromatográfico. Para 190

um perfil perfeitamente retangular, gaussiano e exponencial, K2 assume os valores 12, 36 e 1, respectivamente.

A Tabela 2 mostra os volumes máximos de injeção calculados com cinco valores de θinj para picos com diferentes fatores de retenção (k) em colunas de diversos diâmetros internos. Tais valores foram calculados considerando um perfil de injeção perfeitamente retangular (K2 = 12).

No entanto, na prática dificilmente tal perfil será atingido utilizando as válvulas atualmente disponíveis no mercado. Desse modo, os volumes de injeção não devem ultrapassar dois terços dos valores tabelados (a não ser nos casos nos quais se utilizam algum tipo de pré-concentração ­on-line como, por exemplo, a focalização on-column ou column-switching). É importante salientar que um processo ideal de injeção deve introduzir rapidamente uma quantidade de amostra pequena o suficiente para não proporcionar um excessivo alargamento de banda, mas, ao mesmo tempo, grande o suficiente para permitir a detecção de todos os seus constituintes, mesmo em concentrações muito baixas. Deste modo, existe um compromisso entre eficiência de separação e sensibilidade de detecção que, em escalas capilares, ganha importância ainda maior que em escala convencional[1], uma vez que as celas de detecção dos métodos óticos desenvolvidas para a escala capilar obviamente possuem caminhos óticos muito menores que as desenvolvidas para a escala convencional.

Um meio de se contornar tal paradigma pode ser atingido minimizando todas as outras fontes de dispersão, fazendo com que seus respectivos q’s tendam a zero, o que, consequentemente, resultaria em valores elevados para qinj, permitindo, assim, a utilização de grandes volumes de injeção sem que a eficiência da separação seja significativamente prejudicada.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

Alargamento de bandas em micro-LC

Coutinho LFM, Lanças FM

Tabela 2 Volume máximo de injeção.

D.I. coluna

4,6 mm

1,0 mm

250 μm

100 μm

50 μm

20 μm

10 μm

s2inj = qinjs2ex

k qinj=1

qinj=0,75

qinj=0,5%

qinj=0,25

qinj=0,1

0

15,61 μL

13,52 μL

11,04 μL

7,80 μL

4,94 μL

2

46,82 μL

40,55 μL

33,11 μL

23,41 μL

14,81 μL

10

171,69 μL

148,68 μL

121,40 μL

85,84 μL

54,29 μL

0

0,74 μL

0,64 μL

0,52 μL

0,37 μL

0,23 μL

2

2,21 μL

1,92 μL

1,56 μL

1,11 μL

0,70 μL

10

8,11 μL

7,03 μL

5,74 μL

4,06 μL

2,57 μL

0

46,10 nL

39,92 nL

32,60 nL

23,05 nL

14,58 nL

2

138,30 nL

119,77 nL

97,79 nL

69,15 nL

43,73 nL

10

507,10 nL

439,16 nL

358,58 nL

253,55 nL

160,36 nL

0

7,38 nL

6,39 nL

5,22 nL

3,69 nL

2,33 nL

2

22,13 nL

19,16 nL

15,65 nL

11,06 nL

7,00 nL

10

81,14 nL

70,27 nL

57,37 nL

40,57 nL

25,66 nL

0

1,84 nL

1,60 nL

1,30 nL

0,92 nL

0,58 nL

2

5,53 nL

4,79 nL

3,91 nL

2,77 nL

1,75 nL

10

20,28 nL

17,57 nL

14,34 nL

10,14 nL

6,41 nL

0

295,04 pL

255,51 pL

208,63 pL

147,52 pL

93,30 pL

2

885,13 pL

766,54 pL

625,88 pL

442,56 pL

279,90 pL

10

3245,46 pL

2810,65 pL

2294,89 pL

1622,73 pL

1026,31 pL

0

73,76 pL

63,88 pL

52,16 pL

36,88 pL

23,33 pL

2

221,28 pL

191,64 pL

156,47 pL

110,64 pL

69,98 pL

10

811,37 pL

702,66 pL

573,72 pL

405,68 pL

256,58 pL

* K = 12; L = 0,15 m; e = 0,7; N = 15.000.

2

Atualmente, válvulas de até 4 nL podem ser encontradas comercialmente, no entanto, caso se necessite de volumes de injeção menores que aqueles fornecidos por tais válvulas, pode-se ainda empregar diversas técnicas alternativas de injeção descritas na literatura[24-27], as quais serão discutidas detalhadamente em outra parte desta série de artigos.

3.4 Dispersão ocorrida nas tubulações Junto com os processos de mistura e dispersão (conhecidos também como câmara de mistura e câmara de dispersão), o processo de

dispersão ocorrido nas tubulações é uma das três maiores fontes de alargamento de banda extracoluna.

O processo de dispersão ocorrido dentro das tubulações normalmente utilizadas entre o injetor e a coluna e entre a coluna e o detector, resulta do perfil parabólico da velocidade com a qual a fase móvel flui através dela[28,29] (Figura 2). Este fenômeno conhecido como fluxo de Poiseuille é matematicamente descrito pela equação de Hagen-Poiseuille: u(r ) =

∆P 2 2 (r0 − r ) (13) 4η L

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197 191

Coutinho LFM, Lanças FM

onde u(r) é a velocidade linear em função da distância r a partir do centro do tubo, r0 é o raio interno do tubo, L o comprimento, ∆P a diferença de pressão entre os dois extremos do tubo e η a viscosidade dinâmica da fase móvel.

Devido ao perfil não linear da velocidade, as moléculas dos analitos próximas ao centro do tubo fluirão mais rapidamente que aquelas próximas à parede, provocando, assim, a dispersão da banda cromatográfica como ilustrado na Figura 2.

A partir da Equação 13 também podemos verificar que as moléculas dos analitos próximas ao centro do tubo (r = 0) fluirão com a máxima velocidade permitida, enquanto as moléculas próximas à parede (r = r0) permanecerão paradas indefinidamente, caso não exista nenhum mecanismo de transferência de massa radial.

Alargamento de bandas em micro-LC

Sob condições de fluxo laminar, o único mecanismo de transferência de massa radial existente dentro do tubo é a difusão molecular[1].

Deste modo, qualquer meio que promova uma maior difusão das espécies também proporcionará uma diminuição do alargamento do pico.

Diversas geometrias de tubulações (espiraladas, torcidas, em forma de serpentina, com seção transversal ovalada, etc.) já foram propostas visando aumentar tal difusão radial. No entanto, apesar de tais geometrias terem aumentado significativamente a difusão das espécies dentro do tubo (proporcionando assim uma menor dispersão) tais tubulações não são utilizadas com muita frequência.

O efeito da dispersão devido ao perfil da velocidade da fase móvel é pouco pronunciado na cromatografia gasosa, uma vez que a grande difusibilidade dos gases possibilita uma rápida difusão radial que, em parte, compensa a não linearidade do perfil de velocidade[30]. No entanto, a difusibilidade dos líquidos é cerca de 5 ordens de grandeza menor que as dos gases o que, consequentemente, promove uma dispersão proporcionalmente maior.

Se considerarmos uma tubulação como sendo uma coluna tubular aberta que não retém de nenhuma forma os analitos, poderemos estimar a contribuição da dispersão da banda cromatográfica devido ao fluxo de Poiseuille a partir da equação de Taylor-Golay[11] para um pico não retido: H (comp) =

Figura 2 Velocidades da fase móvel em função da distância do centro do tubo. a) Perfil ideal, resultante da passagem de um fluido através de um tubo em velocidade uniforme, sem alargamento da banda; b) Perfil resultante do alargamento da banda devido ao perfil não linear da velocidade ocasionado pela viscosidade do fluido e forças de fricção.

192

2Dm r 2u + u 24 Dm

(14)

onde H(comp) é a altura de um prato em unidades de comprimento, Dm é o coeficiente de difusão molecular do analito na fase móvel, r o raio interno da tubulação e u a velocidade média linear da fase móvel.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

Alargamento de bandas em micro-LC

Utilizando a seguinte relação: H (comp) =

2 σ tub 1 (15) L (π r 2 )2

onde s2tub é a variância em unidades de volume, podemos reescrever a Equação 14 em termos da variância proporcionada pela dispersão devido ao fluxo de Poiseuille (em unidade de volume) da seguinte forma: 2 σ tub =

2Dmπ 2 r 4 L π 2 r 6 Lu + u 24 Dm (16)

ou em termos do fluxo volumétrico: 2 σ tub

2D π 3r 6 L π r 4 LF = m + (17) F 24 Dm

Uma vez que o coeficiente de difusão dos líquidos é muito pequeno (na ordem de 10-5 cm2.s-1), assim como o raio interno das colunas capilares (na ordem de 10-2 cm2), o primeiro termo das Equações 16 e 17 pode ser negligenciado quando aplicado na cromatografia líquida capilar. Desta forma, a contribuição para a variância total do pico, devido aos processos de dispersão ocorridos dentro das tubulações, pode ser calculada a partir da seguinte equação: 2 σ tub =

4

π r LF (18) 24 Dm

A partir da Equação 18, podemos observar que a variância proporcionada pelo fluxo de Poiseuille é proporcional à quarta potência do raio do tubo. Deste modo, pode-se concluir que a redução do diâmetro interno do tubo é o meio mais efetivo de se reduzir o alargamento de banda causado pelas tubulações. No entanto, a pressão do sistema cromatográfico é inversamente proporcional ao quadrado do raio do tubo, como descrito pela seguinte equação: ∆P =

8η Lu r2

(19)

Coutinho LFM, Lanças FM

Deste modo, o diâmetro interno mínimo que uma tubulação utilizada em um sistema cromatográfico capilar de alta eficiência poderá possuir é limitado pela pressão que a própria tubulação proporcionará no sistema cromatográfico, impossibilitando assim a utilização de tubulações de diâmetro interno muito reduzido.

Semelhantemente ao cálculo do volume máximo tolerado para a injeção, a Tabela 3 mostra o comprimento máximo tolerado para as tubulações utilizadas em 5 diferentes colunas.

3.5 Processos de difusão e mistura (câmaras de difusão e de mistura) O alargamento da banda cromatográfica resultante dos efeitos da câmara de mistura e da câmara de difusão está inerentemente relacionado às conexões entre duas tubulações (tanto de mesmo diâmetro interno, quanto de diâmetros diferente) através de uma cavidade (ou câmara), como mostrado na Figura 3.

O efeito da câmara de difusão é muito similar à dispersão devido ao fluxo de Poiseuille, no entanto, com um perfil de velocidade do fluxo muito mais complexo e dependente da geometria das tubulações e do volume morto associado à câmara que conecta as duas tubulações. Desta forma, a contribuição dos efeitos da câmara de difusão para o alargamento do pico geralmente não pode ser calculada.

Sternberg[11] demonstrou que o comportamento das câmaras de difusão e de mistura é funcionalmente muito similar, sendo a primeira controlada pela constante de tempo da difusão do soluto e a segunda controlada pelo fluxo da fase móvel. A constante de tempo do decaimento da concentração de um soluto da amostra, devido aos efeitos da câmara de difusão, é inversamente

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197 193

Coutinho LFM, Lanças FM

Alargamento de bandas em micro-LC

Tabela 3 Comprimento máximo (cm) tolerado para as tubulações utilizadas com colunas de 5 diferentes diâmetros internos para um pico pouco retido*.

D.I. coluna

4,6 mm

1,0 mm

250 µm

100 µm

50 µm

20 µm

10 µm

Fluxo volumétrico†

1,0 mL/min

47 µL/min

3 µL/min

473 nL/min

118 nL/min

18 nL/min

5 nL/min

D.I. tubo

s2tub = θtubs2ex θtub=1

θtub=0,75

θtub=0,5

θtub=0,25

θtub=0,1

1,0 mm

0,13

0,10

0,07

0,03

0,01

250 µm

34,3

25,7

17,2

8,58

3,43

100 µm

1340

1005

670

335

134

250 µm

1,63

1,22

0,81

0,41

0,16

100 µm

63,7

47,8

31,8

15,9

6,37

50 µm

1019

764

509

255

102

100 µm

3,90

2,92

1,95

0,97

0,39

50 µm

62,3

46,8

31,2

15,6

6,23

25 µm

998

748

499

249

99,8

50 µm

10,2

7,64

5,09

2,6

1,02

25 µm

163

122

81,5

40,8

16,3

10 µm

6367

4775

3184

1592

637

25 µm

40,6

30,4

20,3

10,1

4,06

10 µm

1585

1189

793

396

159

5 µm

25360

19020

12680

6340

2536

10 µm

266

200

133

66,5

26,6

5 µm

4256

3192

2128

1064

426

2 µm

166253

124690

83127

41563

16625

10 µm

59,9

44,9

29,9

15,0

5,99

5 µm

958

718

479

239

95,8

2 µm

37407

28055

18703

9352

3741

* k = 2; L = 0,15 m; e = 0,7; N = 15.000; Dm = 10 . u = 1,0 mm/s.

-5

†

proporcional ao coeficiente de difusão molecular do soluto, enquanto que o efeito da câmara de mistura é inversamente proporcional ao fluxo.

Tanto o alargamento de banda causado pela câmara de difusão quanto o causado pela câmara de mistura são de natureza exponencial. Tal natureza é consideravelmente mais prejudicial ao sistema cromatográfico capilar que as fontes de alargamento de banda que possuem natureza gaussiana, pois aquela resulta em picos com caudas[31].

Figura 3 câmara.

194

Conexões entre dois tubos através de uma

Nos atuais sistemas de HPLC e c-LC, os fenômenos das câmaras de difusão e de mistura são combinados de uma forma complexa. No Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

Alargamento de bandas em micro-LC

Coutinho LFM, Lanças FM

caso particular da c-LC, na qual a velocidade da fase móvel que flui pelos tubos é geralmente mais baixa que aquelas utilizadas na HPLC convencional, os efeitos das câmaras de difusão e de mistura podem contribuir de forma mais significativa que na HPLC. Deste modo, é imprescindível para a c-LC que até mesmo os menores volumes mortos sejam completamente eliminados do sistema.

Figura 4

Circuito RC.

3.6 Dispersão no detector O sistema eletrônico do detector também pode contribuir de forma significativa para o alargamento do pico. Isto se deve à velocidade finita com a qual o circuito eletrônico responde a uma variação do sinal proveniente do transdutor[11,32-34]. Uma vez que grande parte do circuito elétrico é composta de resistores associados com capacitores (circuitos RC), como mostrado na Figura 4, tais circuitos responderão a um estímulo elétrico de forma exponencial.

O tempo de resposta de um circuito RC, é caracterizado pela sua constante de tempo τ, que representa o tempo necessário para que o sinal na saída do circuito (Vo) atinja aproximadamente 63% do sinal de entrada (Vi), como mostrado na Figura 5.

Figura 5 Constante de tempo. (–) Sinal elétrico na entrada do circuito RC (Vi); (---) Sinal elétrico na saída do Circuito RC (Vo).

A contribuição da constante de tempo para a variância total do pico (em unidades de volume) é dada pela seguinte equação: σ ct2 = F 2τ 2

(20)

onde s2ct é a contribuição da constante de tempo do circuito eletrônico do detector para a variância total do pico.

Para calcularmos qual a constante de tempo máxima tolerada para um sistema de detecção, podemos utilizar a Equação 21: τ=

2 θ .σ ex

F

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

(21)

Figura 6 Efeito da constante de tempo em um pico com largura de 24 segundos.

195

Coutinho LFM, Lanças FM

Alargamento de bandas em micro-LC

Além da influência que a constante de tempo do detector tem no alargamento do pico, ela também pode influenciar de forma significativa na sua simetria, como pode ser visto na Figura 6.

3

Ishii D, Asai K, Hibi K, Jonokuchi T, Nagaya M. A study of micro-high-performance liquid chromatography: I. Development of technique for miniaturization of high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1977; 144(2):157-68. http://dx.doi. org/10.1016/S0021-9673(00)99351-8

4 Conclusão

4

Scott RPW, Simpson CF. Journal of Chromatographic Science 1982; 20:62.

5

Vonk N, Verstraeten WP, Marinissen JW. Journal of Chromatographic Science 1992; 30:296.

6

Chervet JP, Ursem M, Salzmann JP. Instrumental Requirements for Nanoscale Liquid Chromatography.

Analytical Chemistry 1996; 68:1507-12. http://dx.doi. org/10.1021/ac9508964

7

Heron S, Tchapla A, Chervet JP. Influence of injection parameters on column performance in nanoscale high-performance liquid chromatography.

Chromatographia, 2000; 51:495-9. http://dx.doi. org/10.1007/BF02490492

8

Beisler AT, Schaefer KE, Weber SG. Simple method for the quantitative examination of extra column band broadening in microchromatographic systems.

Journal of Chromatography A 2003; 986(2):247-51. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(02)02018-6

9

Szumski M, Buszewski B. State of the Art in Miniaturized Separation Techniques. Critical Reviews in Analytical Chemistry 2002; 32(1):1-46. http:// dx.doi.org/10.1080/10408340290765434

O alargamento da banda é um fator altamente indesejável em cromatografia, uma vez que diminui a eficiência da coluna (menor N) e deteriora a resolução (menor Rs). Os principais fatores que ocasionam este alargamento podem ser resumidos em alargamento devido a fatores intrínsecos da coluna e a fatores extracoluna. No presente artigo, demonstraram-se os principais fatores extracoluna responsáveis pelo alargamento das bandas cromatográficas, assim como as maneiras de evitá-los. Apesar de o alargamento ser indesejável em qualquer técnica de separação, ele se torna particularmente crítico na cromatografia líquida capilar (c-LC) devido aos pequenos volumes inerentes à técnica.

Agradecimentos À FAPESP pela bolsa de doutorado concedida a Lincoln Coutinho (processo N.º 04/09384-7), ao Instituto Internacional de Cromatografia pelas facilidades para o desenvolvimento deste traballho e à FAPESP e CNPq pelo apoio financeiro ao Laboratório CROMA.

Referências

10 Scott RPW. Liquid Chromatography Column Theory.

New York: Wiley; 1992.

11 Sternberg JC. In: Giddings JC, Keller RA, editors.

Adavances in Chromatography. New York: Marcel Dekker; 1966. vol. 2, p. 205-270.

12 Martin M, Eon C, Guiochon G. Study of the pertinency

of pressure in liquid chromatography: II. Problems in equipment design. Journal of Chromatography A 1975; 108(2):229-41. http://dx.doi.org/10.1016/S00219673(00)84666-X 13 Kirkland JJ, Yau WW, Stoklosa HJ, Dilks Junior CH.

Journal of Chromatographic Science 1977; 15:303.

1

2

196

Saito M, Hibi K, Ishii D, Takeuchi T. In: Ishii D, editor.

Introduction to Microscale High-Performance Liquid Chromatograph. New York: VCH Publisher; 1988.

Knox JH. Journal of Chromatographic Science 1977; 15:352.

14 Reese CE, Scott RPW. J. Chromatogr. 1980; 18:479.

15 Lauer HH, Rozing GP. The selection of optimum

conditions in HPLC I. The determination of external band spreading in LC instruments. Chromatographia 1981; 14(11):641-7. http://dx.doi.org/10.1007/BF02291104

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197

Alargamento de bandas em micro-LC

16 DiCesare JL, Dong MW, Atwood JG. Very-high-speed

liquid chromatography: II. Some instrumental factors influencing performance. Journal of Chromatography A 1981; 217:369-86. http://dx.doi.org/10.1016/S00219673(00)88091-7

Coutinho LFM, Lanças FM

25 Harvey MC, Stearns SD, Averette JP. LC Liq.

Chromatogr. HPLC Mag. 1985; 3:5.

26 Jorgenson JW, Guthrie EJ. Liquid chromatography

on conventional and miniaturised HPLC systems.

Chromatographia 1984; 19(1):37-47. http://dx.doi. org/10.1007/BF02687717

in open-tubular columns : Theory of column optimization with limited pressure and analysis time, and fabrication of chemically bonded reversedphase columns on etched borosilicate glass capillaries Journal of Chromatography A 1983; 255:335-48. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(01)88293-5

18 Hupe KP, Jonker RJ, Rozing G. Determination

27 Manz A, Simon W. Injectors for open-tubular column

of band-spreading effects in high-performance liquid chromatographic instruments. Journal of Chromatography A 1984; 285:253-65. http://dx.doi. org/10.1016/S0021-9673(01)87767-0

liquid chromatography with 106 theoretical plates at retention times in the minute range. Journal of Chromatography A 1987; 387:187-96. http://dx.doi. org/10.1016/S0021-9673(01)94523-6

19 Cohen KA, Stuart JD. Journal of Chromatographic

28 Taylor G. Proceedings of the Royal Society A:

17 Freebaim KW, Knox JH. Dispersion measurements

Science 1987; 25:381.

20 Liu G, Svenson L, Djordjevie N, Erni F. Extra-column

band broadening in high-temperature open-tubular liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1993; 633(1-2):25-30. http://dx.doi.org/10.1016/00219673(93)83134-E 21 Bakalyar SR, Phipps C, Spuce B, Olsen K. Choosing

sample volume to achieve maximum detection sensitivity and resolution with high-performance liquid chromatography columns of 1.0, 2.1 and 4.6 mm I.D. Journal of Chromatography A 1997; 762(1-2):167‑85. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(96)00851-5 22 Prüβ A, Kempter C, Gysler J, Jira T. Extracolumn

band broadening in capillary liquid chromatography.

Journal of Chromatography A 2003; 1016(2):129-41. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(03)01290-1 23 Visser JPC. Recent developments in microcolumn

liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1999; 856(1-2):117-143. http://dx.doi.org/10.1016/ S0021-9673(99)00692-5 24 Claessens HA, Burcinova A, Cramers CA, Mussche

P, Van Tilburg CE. Evaluation of injection systems for open tubular liquid chromatography. Journal of Microcolumn Separations 1990; 2(3):132-37. http://dx.doi.org/10.1002/mcs.1220020309

Mathematical, Physical and Engineering Sciences 1953; 219:186.

29 Taylor G. Proceedings of the Royal Society A:

Mathematical, Physical and Engineering Sciences 1954; 225:473.

30 Cazes J. Chromatography Theory. New York: Marcel

Dekker Inc.; 2002.

31 Scott RPW, Kucera P. Journal of Chromatographic

Science 1971; 9:641.

32 Schmauch L. J. Response Time and Flow Sensitivity

of Detectors for Gas Chromatography. Analytical Chemistry 1959; 31(2):225-30. http://dx.doi.org/10.1021/ ac60146a021 33 Vandenheuvel FA. Estimation and Correction of Post-

Column Dead Volume Effect in Chromatography.

Analytical Chemistry 1963; 35(9):1193-98. http:// dx.doi.org/10.1021/ac60202a064 34 McWilliam IG, Bolton HC. Instrumental peak

distortion. I. Relaxation time effects. Analytical Chemistry 1969; 41(13):1755-62. http://dx.doi. org/10.1021/ac60282a001 Recebido: 12/07/2011 Aceito: 26/07/2011

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):185-197 197

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221 Instituto Internacional de Cromatografia DOI: 10.4322/sc.2011.012

GC-MS

ISSN 1984-4433

Algunos consejos útiles para el análisis cromatográfico de ­compuestos orgánicos volátiles Elena Stashenko*, Jairo René Martínez Centro de Investigación de Excelencia, CENIVAM, Centro de Cromatografía y Espectrometría de Masas, Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, UIS, Bucaramanga, Colombia e-mail: elena@tucan.uis.edu.co

Resumen El análisis cromatográfico confiable de mezclas de compuestos orgánicos volátiles es el resultado de la atención cuidadosa a detalles del proceso de preparación de la muestra y de la selección del sistema cromatográfico a emplear y sus condiciones de operación. En este artículo se discuten los efectos de las principales variables que inciden en el análisis cromatográfico de compuestos orgánicos volátiles y se presentan algunas recomendaciones para varios procedimientos, junto con varios ejemplos que ilustran su aplicación.

Palabras clave Cromatografía de gases; cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas; compuestos orgánicos volátiles.

Some useful tips for the chromatographic analysis of volatile organic compounds Abstract The reliable chromatographic analysis of mixtures of volatile organic compounds is the result of careful attention to details during sample preparation, chromatographic system and operating conditions selection. This article discusses the effects of the main variables that have incidence on the chromatographic analysis of volatile organic compounds. Recommendations are presented for various procedures, together with various examples that illustrate their application.

Keywords Gas chromatography; gas chromatography-mass spectrometry; volatile organic compounds.

Coutinho LFM, Lanças FM

Alargamento de bandas em micro-LC

1 Introducción Las ventajas comparativas de la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) se destacan fundamentalmente en el campo del análisis de compuestos volátiles. En términos generales, los compuestos volátiles son aquellas moléculas que poseen presión de vapor alta (temperaturas de ebullición relativamente bajas, generalmente, menores de 200-250 °C) y peso molecular que no supera 250‑300 Da; son sustancias que pueden tener diversos grupos funcionales, e.g., grupos aldehído, alcohol, amino, sulfuro, entre otros, de polaridad media, algunos, parcialmente o muy solubles en agua. Muchos de estos compuestos poseen olor y, varios, umbrales de percepción odorífera muy bajos; por ejemplo, compuestos azufrados (diversos sulfuros presentes en ajo, cebolla, huevo podrido, etc.). El análisis de sustancias volátiles es importante y se requiere en diferentes ramas del saber químico: 1) Ambiental (BTEX, VOC, THM, hidrocarburos volátiles, etc.); 2) Productos naturales (metabolitos secundarios volátiles, e.g., aceites esenciales, fragancias florales, aleloquímicos, feromonas, etc.); 3) Control de calidad de productos finales (per-

fumes, productos de aseo personal, solventes residuales en fármacos, compuestos de bajo peso molecular en polímeros, entre ellos, monómeros, plastificantes y otros aditivos; 4) Alimentos (aromatizantes, saborizantes, compuestos off-flavor, etc.); 5) Estudios toxicológicos y forenses (residuos de explosivos y derivados, acelerantes de incendios maliciosos o premeditados, gases venenosos, compuestos tóxicos, solventes y metabolitos de drogas en fluidos fisiológicos, etc.) y 6) Investigaciones bio-médicas (compuestos biogénicos, e.g., volátiles en aliento, etc.), entre algunos otros campos. En la Tabla 1 aparecen algunas referencias sobre el análisis por GC-MS de compuestos volátiles, según el campo de aplicación.

El análisis de compuestos orgánicos volátiles (VOC) posee sus particularidades; entre algunas, figuran las siguientes: 1) Son mezclas complejas, multicomponente, que pueden contener más de 300 compuestos; por ejemplo, en el aliento humano se han registrado centenares de moléculas diferentes[38]; las fragancias florales pueden tener hasta mil sustancias de diversa naturaleza química[39]; en el aroma de café, según su procedencia, el grado y la duración de tostado del grano, el tipo de café (C. arabica, C. robusta, híbridos o variedades) se han encontrado más

Tabla 1 Algunas aplicaciones de la técnica GC-MS para el estudio de compuestos orgánicos volátiles. Área de aplicación

Objetos de análisis

Ambiental

Contaminantes volátiles: BTEX, VOC, trihalometanos[1-3], hidrocarburos volátiles

Productos naturales

Metabolitos secundarios volátiles de plantas: aceites esenciales[4], fragancias florales[5-9] aleloquímicos, feromonas[10,11]

Ciencias forenses

Acelerantes de incendio[12-14], residuos de explosivos[15,16], compuestos volátiles en muestras de evidencias forenses[17,18]

Estudios biomédicos

Muestras biológicas: aliento[19,20], sudor[21], saliva[22], metabolitos de drogas en fluidos fisiológicos[23-25], compuestos tóxicos[26]

Alimentos Control de calidad de productos finales

200

Residuos de pesticidas[27], saborizantes[31,32]

compuestos

off-flavor[28-30],

aromatizantes,

Polímeros[33,34], productos de aseo personal[35], cosméticos[36], residuos de solventes en fármacos[37], etc.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

de mil sustancias químicas[40]; 2) Los compuestos volátiles (detectables) presentes en mezclas se encuentran en concentraciones muy diferentes; su rango puede ir de ppt hasta ppm, o concentraciones más altas[41]; 3) La naturaleza química de las sustancias en las mezclas de volátiles es muy diversa, pueden encontrarse simultáneamente tanto moléculas apolares (hidrocarburos), como polares (aldehídos, ácidos, aminas, sulfuros, etc.)[42]; se pueden hallar, a menudo, compuestos con heteroátomos, por ejemplo, nitrógeno o azufre[43], cuya detección selectiva demandará el uso de detectores cromatográficos selectivos o específicos.

Los compuestos azufrados, aislados de ajo (bulbos) por la técnica de destilación-extracción simultánea con solvente (SDE) se registran por un sistema de detección con captura de electrones (ECD) selectivamente y con sensibilidad muy alta (Figura 1). Después del consumo de una ensalada con cebolla fresca, en el aliento humano aparecen compuestos azufrados, mayoritariamente sulfuros (mono-, di- y trisulfuros) de alquilos (-C3) y alquenilos (=C3). En la Figura 2 aparecen perfiles cromatográficos típicos de volátiles presentes en el aliento humano, después del consumo de ensalada, aislados por HS-SPME (PA, 85 mm), y registrados por un detector fotométrico de llama (FPD). Si más bien el FPD no se destaca por la sensibilidad tan alta como la del ECD, su selectividad para detectar compuestos azufrados en una mezcla es excelente.

La diversidad y la cantidad de compuestos volátiles presentes en diferentes matrices es tan alta, que su análisis demanda a veces la combinación de diversas estrategias para su aislamiento (no hay un método “ideal”, único), separación y detección. La base de datos FLAVOR-BASE 2010 (www.Leffingwell.com), por ejemplo, reúne la información sobre la toxicología, estructuras y propiedades físico-químicas de más de 4000 susScientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Stashenko EE, Martínez JR

Figura 1 Cromatogramas típicos del extracto de ajo (bulbos), obtenido por destilación-extracción simultánea con solvente (SDE) y analizado en la columna DB-5 (60 m), con diferentes sistemas de detección, a saber: detector de ionización en llama (FID), atenuación de la señal At = 0 (20 = 1); detector de captura de electrones (ECD), atenuación de la señal At = 5 (25 = 32). Istd –n-tetradecano.

Figura 2 Perfiles cromatográficos típicos de aliento humano, monitoreado por HS-SPME (fibra recubierta con poliacrilato) (PA, 85 µm); temperatura ambiente, exposición al aliento por 2 minutos), a diferentes intervalos de tiempo después del consumo de ensalada de cebolla. Detector fotométrico de llama (FPD), registro selectivo de compuestos azufrados, mono-, di- y trisulfuros de alquilos (-C3) y alquenilos (=C3).

Columna HP-5 (60 m).

tancias reconocidas como compuestos-flavor.

Los autores, Nijssen y sus colaboradores, reportan en alimentos un número total de compuestos volátiles diferentes mayor de 7000[44].

201

Stashenko EE, Martínez JR

2 Aislamiento de compuestos volátiles La estrategia para aislar compuestos orgánicos volátiles depende fundamentalmente de: 1) Su naturaleza química; 2) La concentración en la mezcla y sobre todo 3) Del tipo de matriz (estado de agregación, homogeneidad y composición), donde se encuentran. Los experimentos para el monitoreo in vivo de volátiles biogénicos (metabolitos secundarios volátiles de plantas, aliento humano, etc.) conforman un diseño experimental más complejo y esmerado, cuyos aspectos más “frágiles” están relacionados con la cuantificación correcta de los analitos y la reproducibilidad de estas mediciones. Distintos métodos de aislamiento de volátiles pueden producir diferentes composiciones (cuantitativas, pero también cualitativas) de extractos; por ello, a menudo, se usan varias técnicas de extracción para describir lo más completamente posible la composición de la mezcla de volátiles aislada. Es importante tener en cuenta que, para comparar diferentes métodos de extracción incluyendo los aspectos cuantitativos, es necesario usar patrones (estándares) internos, tanto para enriquecer la matriz antes de su extracción, como para agregar a los extractos obtenidos, antes de su inyección al cromatógrafo. Ello dará sentido a la investigación comparativa de diferentes métodos de aislamiento de volátiles.

Entre los métodos más comunes para aislar los compuestos volátiles figuran los de destilación con vapor (SD), la hidrodestilación (HD), la destilación-extracción simultánea con solvente (SDE), la extracción asistida por la radiación de microondas (MWAE), la desorción térmica (TD), el atrapamiento en sorbentes poliméricos y purga y trampa (Purge and Trap, P&T), la extracción en fase sólida (SPE), la microextracción en fase sólida (SPME), la extracción asistida 202

Agunos consejos análisis VOC

por membrana, la extracción con fluido supercrítico (SFE), la extracción por sorción en barra de agitación (SBSE) o sobre la cinta recubierta con un sorbente (STE), la microextracción en fase líquida o, simplemente, la transferencia de volátiles directamente al instrumento analítico, e.g., headspace estático, y otros[45,46].

Cuál técnica de extracción se escoge, depende mucho del objetivo del experimento, el tipo de sustancias (target) para extraer, asimismo, de los instrumentos analíticos disponibles y del grado de sensibilidad que se requiere, entre otros aspectos. Por ejemplo, los compuestos carbonílicos volátiles requieren su derivación previa, para ser detectados en la matriz de donde se aíslan, sobre todo, si se encuentran en cantidades a nivel de trazas. El método de extracción no debe generar cambios en el sistema sometido al análisis o monitoreo (e.g., inducir una descomposición térmica o hidrólisis, etc.) y, para la mayoría de aplicaciones, debe ser reproducible, cuantitativo, ojalá evitar el uso de solventes y, que no sea invasivo en sistemas biológicos.

El aislamiento, la detección y la identificación de compuestos carbonílicos volátiles se dificultan debido a las propiedades -muy particulares-, de estas sustancias, a saber: 1) Tienen masas moleculares bajas; 2) Poseen una alta volatilidad; 3) Son parcialmente solubles en agua; 4) Muchos, son reactivos debido a la presencia de grupos aldehído o cetona; 5) Se encuentran a menudo a nivel de trazas y 6) Los detectores convencionales, e.g., TCD, FID o MSD, son poco sensibles para registrarlos de modo reproducible.

Por ejemplo, la detección de acetaldehído, CH3CHO, en modo directo, por GC-MS, se dificulta adicionalmente por el hecho de que su masa nominal (44 g.mol–1) es igual a la del gas carbónico, CO2, que forma parte del background de muchas matrices, incluyendo el del mismo instrumento de medición, verbigracia, un especScientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

trómetro de masas. Todo ello indica que estas sustancias deben ser derivadas, previa su detección. La derivación de sustancias carbonílicas volátiles permite aumentar su peso molecular, bajar su volatilidad y reactividad y, sobre todo, permite introducir un grupo o varios grupos funcionales, que pueden generan la respuesta más sensible en varios detectores selectivos, e.g., NPD, FPD o ECD (este último, es uno de los más sensibles en cromatografía de gases).

Los productos secundarios finales, aldehídos y cetonas, que se generan durante el proceso de oxidación en lípidos, por ejemplo, en los aceites vegetales, las grasas y las margarinas, pueden ser derivados con pentafluorofenilhidracina (PFPH), formando hidrazonas, cuya detección por ECD, selectiva y sensible (gracias a la presencia de 5 átomos de flúor en la molécula), es además altamente reproducible[47,48]. En la Figura 3 aparece un perfil cromatográfico de aldehídos derivados con la PFPH directamente en el aceite de girasol calentado a 220 °C durante 2 horas, y luego extraídos con solvente.

Uno de los principales productos del metabolismo del alcohol etílico es el acetaldehído, que puede -después del consumo de una bebida alcohólica-, encontrarse tanto en orina y sangre, como en el aliento humano. Su monitoreo por la técnica de HS-SPME en el aliento humano constituye un método sensible, no invasivo y fácil de llevar a cabo. La fibra de SPME (PDMS/DVB, 65 µm) se satura previamente con el agente derivatizante, i.e., PFPH, y luego, por unos 2 minutos, se expone al aliento humano. La derivación del aldehído acontece in situ, sobre la fibra. Cuando se requiere la cuantificación, se necesita una calibración previa del método. En la Figura 4 aparecen perfiles cromatográficos del acetaldehído (derivado sobre la fibra SPME saturada con PFPH), en función del tiempo transcurrido desde la ingestión de una bebida alcohólica (cerveza).

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Stashenko EE, Martínez JR

Figura 3 Perfil cromatográfico de aldehídos (derivados con la PFPH) generados en el aceite de girasol (ácido linoleico - 65%, ácido oleico - 25%) sometido a calentamiento (220 °C durante 2 horas). Detector de micro-captura de electrones (µ-ECD). Columna DB-1 (60 m). 1. Acetaldehído; 2. Propanal; 3. Acroleína; 4. Butanal; 5. Crotonaldehído; 6. Pentanal; 7. trans-2-Pentenal; 8. Hexanal; 9. trans-2 Hexenal; 10. Heptanal; 11. trans-2-Heptenal; 12. Octanal; 13. Nonanal; 14. Decanal.

Figura 4 Perfiles cromatográficos típicos del acetaldehído, derivado directamente sobre la fibra de SPME (PDMS/DVB, 65 µm) saturada con PFPH y expuesta al aliento humano (temperatura ambiente, 2 minutos). La detección del acetaldehído se llevó a cabo antes (control) y después (15 minutos, 1 hora) de la ingestión, por un voluntario, de una bebida alcohólica (cerveza). Detector de micro-captura de electrones (µ-ECD). Columna HP-5 (30 m).

Otro ejemplo es el aislamiento y estudio de volátiles (aroma) de granos de café tostado; para ello, se pueden emplear métodos de headspace dinámico. Por ejemplo, el de purga y trampa 203

Stashenko EE, Martínez JR

Agunos consejos análisis VOC

(P&T), donde un gas (N2) barre el espacio encima de los granos de café y arrastra sus compuestos de aroma; éstos se disuelven parcialmente en agua, de la cual se extraen y se concentran en un solvente, e.g., diclorometano, en un arreglo que se asemeja a un extractor líquido-líquido continuo (Figura 5a), según el diseño descrito por Shibamoto y colaboradores[49]. El perfil cromatográfico de los volátiles aislados depende tanto de la temperatura de muestreo, como de la duración de la purga (barrido) con el gas inerte; asimismo, del grado de concentración del extracto obtenido y del sistema cromatográfico empleado (modo de inyección, resolución de la columna y sensibilidad del sistema de detección) (Figura 5b).

3

Aspectos cromatográficos

3.1

Inyección de la muestra

Para el análisis cromatográfico (GC) de una mezcla de sustancias volátiles, virtualmente, se pueden utilizar todos los tipos de inyectores, i.e., el puerto de inyección “clásico” split/splitless, inyectores con temperatura programada (PTV), que, entre otras bondades (e.g., inyección de grandes volúmenes de muestra, LVI), permiten concentrar in situ los analitos en el extracto, evaporando “programadamente” el solvente; los inyectores on-column, que son aptos tanto para sustancias muy volátiles (con un dispositivo de crio-enfocamiento), como para sustancias poco volátiles o inestables térmicamente. El modo de inyección splitless pulsado también puede ser una buena opción para compuestos presentes a nivel de trazas, pero, a la vez, para aquellos que son inestables térmicamente. Cuando se usa el puerto de inyección split/splitless, sobre todo, en el modo split, es importante que la cantidad de analitos que entre a una columna GC sea suficiente y comparable con los niveles mínimos de: 204

Figura 5 a) Dispositivo de purga con gas (N2) y atrapamiento simultáneo en solvente (CH2Cl2) (P&T) de volátiles de café. b) Perfiles cromatográficos típicos de las fracciones volátiles de los granos de café tostado, obtenidos por el método de P&T, a diferentes temperaturas (70 y 100 °C). Duración de purga con N2 - 2 horas. GC-MS. EI (70 eV). Columna DB-5MS (60 m).

1) Detección (si sólo se trata de la necesidad de registrar la presencia de un analito en la muestra); 2) Cuantificación (cuando se requiere la cuantificación exacta de un analito y, para ello, es importante obtener la señal reproducible del detector); 3) Identificación. En este caso, el nivel mínimo de identificación es aquella cantidad mínima del analito que genera una señal espectroscópica, Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

verbigracia, un espectro de masas, que cumpla con todos los criterios de calidad; entre ellos, se destacan la presencia de todas las señales isotópicas en el espectro, niveles muy bajos de ruido y de señales intrusas, e.g., de background químico (contaminación, fugas) y la concordancia del espectro obtenido con la estructura química propuesta.

La temperatura del puerto de inyección split/splitless debe ser suficientemente alta para evaporar todos los componentes de la mezcla, pero sin exceder las temperaturas de descomposición. Para el análisis de compuestos volátiles la temperatura del inyector puede estar en el rango de 200-250 °C (Figura 6a); por supuesto, en las pruebas preliminares hay que encontrar aquella temperatura que conduzca a la mayor sensibilidad (área de la señal cromatográfica). Si el análisis cromatográfico requiere determinaciones cuantitativas y la identificación de analitos se basa en sus índices de retención y espectros de masas (GC-MS), es importante establecer la reproducibilidad de los tiempos de retención y de las áreas cromatográficas. Para esto la misma muestra se inyecta a la columna varias veces (el mismo día y en días diferentes) y se determina la desviación estándar o coeficiente de variación (CV, %) de estas mediciones.

3.2

Columna cromatográfica

Esta parte del equipo es fundamental para el análisis de mezclas multicomponente, ya que permite vislumbrar el número mínimo de componentes presentes, puesto que algunos pueden presentar co-eluciones. Cuántos analitos, en realidad se encuentran en una mezcla (un extracto) depende de varios parámetros, a saber: 1) La preparación del extracto (grado de su concentración); 2) El modo de inyección (split, splitless, on-column, PTV); 3) La capacidad que tenga la Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Figura 6 a) Las áreas cromatográficas del α-pineno (monoterpeno con temperatura de ebullición de 155 °C) inyectado a la columna cromatográfica en el modo split (1:30), a diferentes temperaturas del puerto de inyección (150, 200, 250 y 300 °C); b) Reproducibilidad de tiempos de retención y áreas cromatográficas de óxido de cariofileno (tR = 55.4 minutos) y (Z)-nerolidol (tR = 55.6 minutos), analizados por GC-MS, en diferentes días de la semana, en la columna DB-5MS (60 m). EI (70 eV).

columna cromatográfica de separar completamente los componentes de la mezcla y 4) La sensibilidad del sistema de detección empleado.

Ya que las mezclas o extractos de compuestos orgánicos volátiles pueden estar conformadas por una cantidad grande de componentes (decenas y hasta centenares) y, además, muchos de ellos pueden ser isómeros (de posición, geométricos, estereoisómeros), se emplean para su análisis columnas cromatográficas largas de 205

Stashenko EE, Martínez JR

50 ó 60 m; para análisis de gasolinas, de 100 m de longitud. El diámetro interno (D.I.) de la columna se escoge de acuerdo con la cantidad de la muestra a inyectar (a menudo, se requiere incrementar la cantidad de analitos introducidos a la columna), pero típicamente se usan columnas de 0.25 ó 0.32 mm de D.I. (drogas, pesticidas, residuos de explosivos), aunque las columnas de menor diámetro (0.18, 0.20 ó 0.22 mm) permiten lograr una eficiencia de separación mucho más alta, pero comprometiendo, en algunos casos, la sensibilidad (capacidad de carga de la columna). Un parámetro importante es el grosor de la fase estacionaria (df ), que, para el análisis cromatográfico de compuestos volátiles, debe ser mayor (comúnmente, se usan columnas de 0.25 µm, df ) y, para analitos muy volátiles, puede llegar hasta 5 µm. La polaridad de la fase estacionaria se escoge de acuerdo con la polaridad de los analitos, pero, en el caso de mezclas “heterogéneas”, por ejemplo, aceites esenciales, que contienen analitos tanto polares como apolares, es necesario (obligatorio!) usar ambas columnas, i.e., polar (f.e. de polietilenglicol) y apolar (100%-polidimetilsiloxano ó 5-95%-fenil polimetilsiloxano).

La identificación (presuntiva) de los analitos se basa en los índices de retención lineales medidos en dos columnas “ortogonales”[50], y en los espectros de masas (EI, 70 eV, patrones de fragmentación)[51]. La confirmación de la identidad química de una sustancia se hace usando compuestos-patrón, que son imprescindibles también para la cuantificación de analitos por medio de curvas de calibración. Para la cuantificación, se pueden usar métodos de estandarización externa, interna o de adición de compuesto estándar. Frecuentemente, para el análisis de aceites esenciales se reportan cantidades relativas (%) de los componentes presentes en el aceite. En la Figura 7 aparecen dos perfiles cro206

Agunos consejos análisis VOC

Figura 7 Perfiles cromatográficos típicos obtenidos por GC-MS (EI, 70 eV) del aceite esencial de patchoulí (Pogostemon cablin, familia Labiatae) en: a) Columna con la fase estacionaria polar (DB-WAX, 60 m, polietilenglicol) y b) Columna apolar (DB-5, 60 m, 5%-fenil-polimetilsiloxano).

matográficos del aceite esencial, hidrodestilado de las hojas de patchoulí (Pogostemon cablin, familia Labiatae), y analizado en columnas polar y apolar. La diferencia de los dos perfiles es muy notoria, pero en ninguna de las dos columnas se logran separar completamente todos los componentes de esta compleja mezcla. La identificación completa de algunos sesquiterpenoides presentes en el aceite de patchoulí se dificulta porque las respectivas sustancias-patrón no están disponibles y, además, en varios casos, se presenta la co-elución de sustancias, unas en la columna polar, otras, en la apolar. La cromatografía total o exhaustiva (Comprehensive GCxGC) sería una solución para este último inconveniente: esta técnica comprende la unión de una columna analítica estándar (25-30 m), a través de un modulador, con una columna de cromatografía rápida (muy corta, ultra-delgada) con la fase estacionaria “ortogonal” (polar-apolar o apolar-polar).

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Sistemas de detección

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Figura 8 Perfiles cromatográficos típicos de la fracción volátil (aislada por la técnica P&T de granos de café tostado), obtenidos en la columna HP-5 (50 m x 0.25 mm x 0.33 µm) con diferentes sistemas de detección, MSD (EI, 70 eV), NPD y FPD.

30

40 Minutos

50

2,5

5

7,5

60

Undecanal

Dodecanal

20

10

Nonanal Decanal

En muchos extractos de compuestos orgánicos volátiles se pueden encontrar diferentes familias de sustancias, entre ellas, las que tienen heteroátomo(s). El ejemplo típico es el aroma de café, que, junto con muchos otros, contiene compuestos nitrogenados (derivados de piridina, piperazinas, oxazoles, pirroles, etc.) y azufrados (derivados de tiofeno y tetrahidrotiofeno), productos de la reacción de Maillard. La combinación de sistemas de detección selectivos (e.g., NPD y FPD) con el detector de masas (MSD), ayuda mucho a la identificación química de componentes de la mezcla compleja (Figura 8).

Algunas sustancias nitrogenadas o azufradas pueden co-eluir en la columna cromatográfica con aquellos compuestos que no generan respuesta en detectores selectivos. Sus espectros de masas no son “homogéneos”, ya que se vislumbra en ellos la superposición de señales de distintas moléculas. Aunque se pueden emplear los programas computaciones especiales para revisar la “pureza” del pico cromatográfico (peak purity) o para realizar la deconvolución de espectros, la presencia de nitrógeno o azufre en una molécula se confirmará inequívocamente sólo usando los respectivos detectores selectivos. La solución “total” para separar la mezcla compleja de volátiles -con un número muy alto de componentes, presencia de estructuras isoméricas, con heteroátomos y compuestos a nivel de trazas, etc.-, sería el uso de la cromatografía exhaustiva (Comprehensive GCxGC), en combinación con un analizador másico de barrido (scan) muy rápido y de alta resolución, para determinar la composición elemental de los iones (e.g., analizador de tiempo de vuelo, TOF, con reflectrón, o espectrometría de masas de ion-ciclotrón con transformada de Fourier, FT-ICR-MS), pero… ¡vaya la accesibilidad y costo de estos instrumentos!

Octanal

3.3

Stashenko EE, Martínez JR

10 12,5 15 17,5 20 22,5 Minutos

Figura 9 a) Corriente iónica total obtenida por GC-MS (EI, 70 eV) de la fracción volátil de granos de café tostado (aislada por el método P&T). b) Perfil cromatográfico de aldehídos derivados con PFPH in situ sobre la fibra de SPME expuesta al espacio de cabeza (headspace) de granos de café tostado. Detector de captura de electrones (ECD). Columna DB-5 (60 m).

207

Stashenko EE, Martínez JR

Agunos consejos análisis VOC

Sería un trabajo verdaderamente titánico descubrir la presencia de compuestos carbonílicos, de peso molecular bajo y mediano, en una corriente iónica total (=cromatograma), obtenida por GC-MS (EI, 70 eV) de la fracción volátil -aislada por P&T- de granos de café tostado (Figura 9a). La dificultad consiste en que muchos de estos compuestos se encuentran a nivel de trazas, algunos, co-eluyen con otras sustancias, mientras que en los espectros de masas de varios aldehídos alifáticos y cetonas frecuentemente no se observan señales de iones moleculares. Sobre una fibra de SPME, saturada previamente con el agente derivatizante (i.e., PFPH) y expuesta a la fase vapor de café (granos tos-

tados), los aldehídos y cetonas, presentes en el aroma de café, reaccionarán in situ formando las respectivas hidrazonas, que luego se desorben en el puerto de inyección de GC y se registran por el sistema de detección altamente sensible, ECD (Figura 9b). La identificación de compuestos carbonílicos se basa en la comparación de sus tiempos de retención y espectros de masas con los de las sustancias-patrón (hidrazonas sintetizadas).

Para el desarrollo del método GC-MS para análisis de compuestos orgánicos volátiles, es importante tener en cuenta varios aspectos y “normalizar” diferentes parámetros, algunos de los cuales aparecen descritos en la Figura 10.

Detector de masas

Cromatógrafo

Sistema de datos

Modo de ionización

Modo de inyección

Software

Analizador(es) (MS/MS)

Selección de la columna

Velocidad de aquisición, deconvolución

Modo de aquisición (SIM, scan, MS/MS)

L × D.I. × df, polaridad de la fase estacionaria

Bases de datos de espectros Índices de retención

Especificidad y resolución

Programación de temperatura

Reporte

Mantenimiento preventivo y correctivo

Atualización

Figura 10 Esquema general del sistema GC-MS y varios aspectos y parámetros -a tener en cuenta-, para su desempeño eficiente.

208

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

Masa baja

Masa alta

Scan/segundos

tR

58,92 minutos

30

300

5,19

Compuesto

Guaiol (P.M. 222)

30

400

3,89

Rango de masas

50

550

2,94

Número de barridos registrados en el ápice

m/z 40-280

8549

m/z 40-550

16895

Figura 11 Relación entre el rango de masas (masas mínima y máxima) y el número de barridos (scans = espectros de masas) registrados por unidad de tiempo. El número de scans adquiridos en el ápice del pico cromatográfico correspondiente a sesquiterpenol, guaiol (C15H26O, tR = 58.92 minutos) es casi dos veces mayor para el intervalo de masas m/z 40-280, que para el de m/z 40-550. GC-MS. Detector selectivo de masas Agilent Technologies MSD 5975, EI, 70 eV.

La parte cromatográfica de GC-MS es prácticamente la misma que se usa para el sistema GC convencional; se necesita considerar los siguientes aspectos, a saber: 1) la selección correcta de la columna; 2) sus dimensiones (L x D.I. x df ); 3) la polaridad de la fase estacionaria; 4) el modo de inyección y 5) la programación de temperatura de horno. Las restricciones para el método GC-MS son el diámetro interno de la columna (generalmente, igual o menor de 0.25 mm) y la naturaleza de la fase estacionaria, que debe ser “fortalecida”, es decir, más resistente a las temperaturas altas y con un menor nivel de sangrado (bleeding); este último puede afectar drásticaScientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

mente el desempeño del espectrómetro de masas, produciendo su contaminación, conducente a la pérdida de sensibilidad, y el deterioro de la calidad de los espectros de masas, por la aparición en ellos de señales intrusas (background).

Cuando se desarrolla un método cuantitativo o se comparan las corrientes iónicas totales (TIC = cromatograma) de una serie de muestras o se construye una curva de calibración, hay que considerar varios aspectos para la operación correcta del detector selectivo de masas (MSD). Para alcanzar la reproducibilidad de mediciones más alta, es importante mantener la temperatura constante de la 209

Stashenko EE, Martínez JR

Agunos consejos análisis VOC

Figura 12 a) Picos cromatográficos (GC-MS, EI, 70 eV) del isopulegol presente en un aceite esencial inyectado en modos: 1) split 1:100; 2) split 1:30; 3) splitless; 4) pulsed splitless. b) Espectros de masas del isopulegol obtenidos de la corriente iónica total de un aceite esencial inyectado en modos split (1:100) y splitless. Solo el segundo espectro (modo de inyección splitless) cumple con criterios de calidad del espectro de masas y descubre la presencia de todas las señales isotópicas (véanse señales en m/z 136, 139 y 154).

210

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

Tabla 2 Descripción de las once muestras de Pisco peruano de diferencies localidades, cuyas fracciones volátiles fueron aislados por HS-SPME y analizadas por GC-MS. N°

Pisco

1

Albilla

2 3

Tipo

Valle

Marca

Descripción suministrada

Puro

Chincha

Viña Oro

Italia

Mosto verde

Chincha

Viña Oro

Italia

Puro

Chincha

Viña Oro

4

Mollar

Puro

Ica

Viejo Tonel

5

Moscatel

Puro

Chincha

Viñas Oro

6

Negra Criolla

Puro

Chincha

Viñas Oro

No aromático

7

Quebranta

Mosto verde

Chincha

Viñas Oro

No aromático

8

Quebranta

Puro

Chincha

Viñas Oro

No aromático

9

Torontel

Mosto verde

Chincha

Viñas Oro

Fermentación interrumpida*

10

Torontel

Puro

Chincha

Viñas Oro

Fermentación interrumpida*

11

Uvina

Puro

Mala

Gran Cruz

No aromático

– Fermentación interrumpida* – No aromático –

*Se destila con un poco de azúcar remanente.

Figura 13 Perfil cromatográfico típico (TIC, EI, 70 eV) de la fracción volátil de Pisco, aislada por la técnica de HS-SPME/GC-MS. Columna DB-WAX (60 m).

cámara de ionización (200-300 °C), de la línea de transferencia (Columna → Cámara de ionización, 280-310 °C) y del analizador de masas (150-200 °C), durante el análisis de todas las muestras a comparar o de patrones de calibración. Es importante evitar fugas en el sistema, hay que supervisar la presión residual (10-5-10-6 Torr) en el espectrómetro de masas y calibrarlo (tune) frecuentemente, para poder registrar oportunamente los cambios en su desempeño (e.g., aumento brusco del voltaje de electromultiplicador, etc.) o una posible contaminación.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Para el diseño del método de adquisición, por GC-MS, hay que tener en cuenta lo siguiente: 1) El modo de ionización: para la técnica de GC-MS es más frecuente el uso de impacto de electrones (EI, 70 eV), aunque también se emplea -para algunas muestras-, la ionización química (CI) de iones positivos (PI) o de iones negativos (NI); por ejemplo, para determinar la masa de una molécula cuyo ion molecular, debido a su labilidad o inestabilidad, no se registra en el espectro obtenido por EI, pero sí aparecerá en los espectros obtenidos por métodos “blandos” de ionización (PI CI o NI CI, según la naturaleza de la molécula); 2) El modo de adquisición, barrido completo (full scan) o monitoreo de ion(es) seleccionado(s) (SIM); si se tiene el sistema tándem (MS/MS), se pueden emplear diferentes modos de monitoreo a) de un ion precursor, b) de fragmentos filiales, c) iones con la pérdida de un fragmento neutro común o d) monitoreo de una reacción específica, verbigracia, el proceso de transición entre los dos iones, A+ → B+, cuyo registro puede elevar sobremanera la especificidad de la detección de un analito target en una mezcla muy compleja, con bastantes interferencias químicas[52].

211

212

<0,001 <0,001

3-Metilbutanol

Óxido de cis-linalol (furanoide)

Hexanoato de etilo

Óxido de trans-linalol (furanoide)

7

8

9

10

Óxido de trans-linalol (piranoide)

Acetato de geranilo

Linalol

18

19

20

<0,001

α-Terpineol

Furfural

Óxido de cis-linalol (piranoide)

15

16

Octanoato de etilo

14

17

<0,001

Hexanol

13

<0,001

<0,001

0,03

<0,001

0,07

<0,001

0,05

<0,001

Acetato de linalilo

Lactato de etilo

11

12

<0,001

4,09

<0,001

0,47

<0,001

2-Metilpropanol

Propanol

4

94,75

Butanol

Etanol

3

0,07

5

Acetato de etilo

2

<0,001

Puro

Albilla

6

Acetaldehído

Compuesto

1

N°

0,04

<0,001

0,03

<0,001

<0,001

<0,001

0,10

<0,001

<0,001

0,03

<0,001

<0,001

<0,001

1,02

<0,001

0,36

0,03

97,72

0,09

<0,001

Mosto verde Puro

0,05

<0,001

0,03

<0,001

<0,001

<0,001

0,04

<0,001

0,02

0,02

<0,001

<0,001

<0,001

1,13

<0,001

0,30

<0,001

97,89

0,22

<0,001

Italia

<0,001

<0,001

0,02

<0,001

<0,001

<0,001

0,15

0,03

0,02

<0,001

<0,001

0,03

<0,001

4,64

0,16

1,21

0,04

91,35

1,93

<0,001

Puro

Mollar

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,16

0,02

<0,001

<0,001

<0,001

0,04

<0,001

4,83

<0,001

0,64

0,02

93,64

0,02

<0,001

Puro

Moscatel

<0,001

<0,001

0,02

<0,001

<0,001

<0,001

0,59

0,03

0,07

<0,001

<0,001

0,12

<0,001

8,80

0,02

1,64

0,27

86,56

0,83

<0,001

Puro

Negra Criolla

<0,001

<0,001

0,02

0,02

<0,001

<0,001

1,97

0,07

0,03

<0,001

<0,001

0,32

<0,001

7,23

0,02

0,63

0,92

85,37

0,61

<0,001

Mosto verde

<0,001

<0,001

0,03

<0,001

<0,001

<0,001

0,15

0,05

<0,001

<0,001

<0,001

0,03

<0,001

6,02

<0,001

0,81

0,05

90,32

0,84

<0,001

Puro

Quebranta

Cantidad relativa (GC área), %

0,45

0,08

0,11

0,02

0,04

0,03

0,19

0,12

0,05

0,06

<0,001

0,03

0,03

6,00

0,02

2,03

0,10

86,02

2,38

0,06

Mosto verde

0,34

<0,001

<0,001

<0,001

0,04

0,02

0,30

0,11

0,15

0,06

0,02

0,04

0,03

6,88

0,02

1,58

0,43

87,06

1,92

<0,001

Puro

Torontel

Tabla 3 Cantidad relativa (%) e identificación de compuestos principales de la fracción volátil de los Piscos analizados por la técnica HS-SPME/GC-MS.

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,02

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

2,07

<0,001

0,44

0,07

96,99

0,09

<0,001

Puro

Uvina

Coutinho LFM, Lanças FM Alargamento de bandas em micro-LC

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Hexadecanoato de etilo

32

<0,001

0,47 0,16

Ésteres de ácidos grasos (C6-C16)

Otros compuestos (aldehídos, ésteres, bencenoides) 0,10

0,66

0,11

99,13

99,31

verde

Mosto 2

0,04

0,04

0,02

<0,001

<0,001

0,09

<0,001

<0,001

<0,001

0,02

<0,001

0,11

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,07

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,29

<0,001

0,03

Puro

Mollar

0,07

0,05

<0,001

<0,001

0,21

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,27

<0,001

<0,001

Puro

Moscatel

0,06

0,03

0,04

0,02

0,25

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,04

0,59

<0,001

<0,001

Puro

Negra Criolla

0,03

0,06

0,03

0,04

0,63

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,02

1,94

<0,001

0,03

Mosto verde

3

Puro

0,25

0,30

0,13

99,32

Italia

1,98

0,54

0,03

97,43

4

Puro

Mollar

0,03

0,80

0,01

99,15

5

Puro

Moscatel

0,94

1,70

0,03

97,32

6

Puro

Negra Criolla

0,72

5,01

0,03

94,24

7

Mosto verde

0,98

1,73

0,04

97,25

8

Puro

Quebranta

0,06

0,12

0,09

0,05

0,72

<0,001

0,05

<0,001

<0,001

<0,001

0,60

<0,001

<0,001

Puro

Quebranta

Cantidades relativas (%) por principales familias de compuestos

<0,001

0,04

<0,001

<0,001

0,24

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,28

<0,001

Puro <0,001

Italia

<0,001

Mosto verde

1

Puro

Albilla

0,03

0,03

0,04

<0,001

0,17

<0,001

<0,001

Terpenoides (alcoholes, ésteres)

Alcoholes alifáticos

Familias de compuestos

Bencenoetanol

Tetradecanoato de etilo

30

31

Dodecanoato de etilo

Decanoato de 3-metilbutilo

28

Geraniol

27

29

Citronelol

Acetato de 2-feniletilo

25

26

<0,001 <0,001

Octanoato de 3-metilbutilo

β-Fenchol

23

0,17

<0,001

<0,001

Puro

Albilla

24

Hotrienol

Decanoato de etilo

22

23

Vitispirano

Compuesto

21

N°

Cantidad relativa (GC área), %

Mosto verde

2,60

2,03

1,06

94,29

9

0,09

0,03

0,03

<0,001

0,17

<0,001

<0,001

0,02

0,05

<0,001

0,44

0,08

0,05

Puro

2,15

1,07

0,66

96,08

10

Puro

Torontel

0,05

0,08

0,03

0,04

0,74

0,02

<0,001

0,04

0,09

0,02

0,88

0,11

0,06

Mosto verde

Torontel

Tabla 3 Cantidad relativa (%) e identificación de compuestos principales de la fracción volátil de los Piscos analizados por la técnica HS-SPME/GC-MS.

0,10

0,30

0,03

99,57

11

Puro

Uvina

0,15

<0,001

<0,001

<0,001

0,06

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

<0,001

0,08

<0,001

<0,001

Puro

Uvina

Alargamento de bandas em micro-LC Coutinho LFM, Lanças FM

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221 213

Stashenko EE, Martínez JR

Para la adquisición de la corriente iónica, en función del tiempo, es importante establecer un rango (intervalo) de masas -mínima y máxima-, ya que de esto dependerá el número de espectros obtenidos por unidad de tiempo. En la Figura 11 aparece la relación entre el rango de masas y el número de barridos (scans) obtenidos. A mayor rango de masas, el numero de espectros de masas (scans) obtenidos por unidad de tiempo será menor; el número de barridos es muy importante para la “reconstrucción” de un pico cromatográfico con base en la corriente iónica obtenida y reconstruida.

En numerosas publicaciones científicas, se puede encontrar a menudo, que se usa un rango de masas (∆m) de m/z 30-550 para análisis de sustancias volátiles, por GC-MS y cuyos pesos moleculares no superan 250-280 Da (por ejemplo, aceites esenciales). La masa máxima del intervalo ∆m podría ser el peso molecular del compuesto “más pesado” presente en una mezcla (extracto) mas unas 40-50 unidades; mientras que la masa mínima depende del tipo de sustancias, porque, por ejemplo, los alcoholes y aminas, en sus espectros de masas, registran fragmentos, respectivamente, en m/z 31 y 30, que son estructuralmente relevantes para su identificación. Para compuestos aromáticos, la masa mínima en m/z 50 puede ser adecuada para empezar los barridos (scans). En la región de masas livianas, se pueden encontrar las señales de gases (N2, O2, CO, Ar, CO2) y de solventes remanentes presentes en la cámara de ionización, mientras que en la región de masas más pesadas prevalecen señales intrusas (exógenas, no propias de una molécula de analito) debido al sangrado de la fase estacionaria de la columna o iones provenientes de la contaminación de diferentes partes del equipo (inyector, columna, cámara de ionización).

214

Agunos consejos análisis VOC

Otro aspecto importante está relacionado con la calidad del espectro de masas obtenido, que es importante para identificar el compuesto con base en su patrón de fragmentación o por comparación con el espectro de masas de la base de datos o con el espectro de la respectiva sustancia-patrón. En la Figura 12a aparece el pico cromatográfico de isopulegol registrado, presente en una concentración relativa menor del 0.005%; en los cromatogramas (aparece sólo el pico del isopulegol) presente en un aceite esencial, inyectado en modo split (relación 1:100 y 1:30), splitless y pulsed splitless. La cantidad máxima del isopulegol ingresa a la columna cuando la mezcla se inyecta en modo pulsed splitless. Los espectros de masas del isopulegol obtenidos cuando la muestra se inyecta en modos splitless o pulsed splitless cumplen con los criterios de calidad del espectro de masas, mientras que los obtenidos de corrientes iónicas totales de muestras inyectadas en modo split, carecen de varias señales (por ejemplo, picos isotópicos de los iones en m/z 136, 139 y 154) (Figura 12b).

4 Algunos ejemplos 4.1 Análisis de fracciones volátiles de Piscos Para dar valor agregado y científico a muchos productos agrícolas, evaluar su calidad y aumentar su competitividad en los mercados, es necesario hacer su caracterización completa, establecer propiedades físico-químicas, composiciones químicas y, en el caso de algunos productos, tales como vinos u otras bebidas alcohólicas, se requiere a menudo certificar su denominación de origen. El estudio cromatográfico de aromas de vinos y otros spirits se ha empleado tradicionalmente como herramienta para establecer su origen, calidad y autenticad, entre otros aspectos.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

Tabla 4 Descripción de las notas odoríferas de algunos componentes presentes en las fracciones volátiles (aroma) de Piscos analizados.

Sustancia

Descripción organoléptica*

(R)-(-)-Linalol

Floral, woody lavender note.

(S)-(+)-Linalol

Sweet, floral; odor reminiscent of petit-grain and lavender.

(3R)-(+)-Citronellol

Citronella, oil-like, slightly oily, light rosy-leafy, petal-like.

(3S)-(-)-Citronellol

Floral, rose-like odor, reminiscent of geranium oil, citronellal-like odor with woody aspect.

(3S)-(+)-Hotrienol

Green fresh flower aroma, graceful and sweet.

(3R)-(-)-Hotrienol

Citrus fruit-juice aroma with a pure sweet flower aroma.

(3R,6R)- Óxido de cis-linalol (Pyranoide)

Earthy.

(3S,6S)- Óxido de cis-linalol (Pyranoide)

Sweet, floral, creamy.

(3R,6S)- Óxido de trans-linalol (Pyranoide)

Sweet, floral, creamy.

(3S,6R)- Óxido de trans-linalol (Pyranoide)

Earthy.

(2R,5R)- Óxido de trans-linalol (Furanoide)

Leafy, earthy.

(2S,5S)- Óxido de trans-linalol (Furanoide)

Sweet, floral, creamy.

(2S,5R)- Óxido de cis-linalol (Furanoide)

Sweet, floral, creamy.

(2R,5S)- Óxido de cis-linalol (Furanoide)

Leafy, earthy.

(S)-(-)-α-Terpineol

Coniferous odor character, tarry.

(R)-(+)-α-Terpineol

Heavy floral, typically lilac odor.

Hexanoato (Caproato) de etilo

Banana, pineapple.

Octanoato (Caprilato) de etilo

Floral, fruity, sweet, vinous, waxy.

Dodecanoato (Laureato) de etilo

Fruity, floral, soapy, sweet, waxy.

Tetradecanoato (Miristato) de etilo

Waxy, soapy.

Hexadecanoato (Palmitato) de etilo

Waxy, fruity, creamy

*Nota: Para una mayor precisión, se conservó el nombre en inglés de las notas aromáticas, tal como lo registran las bases de datos consultadas: http://www.leffingwell.com/chirality/, http://www.thegoodscentscompany.com/data/

La combinación de la técnica de extracción

C6-C16, y terpenoides. El perfil cromatográfico

de SPME en el modo headspace y el análisis por

típico de la fracción volátil de Pisco aparece en la

GC-MS de fracciones volátiles fue aplicada para

Figura 13, mientras que en la Tabla 3 se registra

distinguir los Piscos provenientes de diferentes

la información sobre composición química de

localidades de Perú (Tabla 2).

las fracciones volátiles de las bebidas analizadas

El estudio de la composición química de las

y la cantidad relativa (%) tanto de las sustancias

fracciones volátiles de los once Piscos, aisladas

individuales, como de las principales familias de

por HS-SPME [fibra de poli(acrilato), PA, de

compuestos presentes. Estos resultados revelan

65 µm de grosor, 40 °C, 10 minutos)] y analizadas

que las fracciones volátiles de las bebidas des-

por GC-MS, reveló la ocurrencia de un total de

critas como “no aromáticas” (Véase la Tabla 2)

32 sustancias (en cantidades relativas >0.001%).

poseen una cantidad relativa (%) de terpenoides

Entre éstas, predominaron alcoholes alifáticos

más baja que e.g., los Piscos identificados con los

(básicamente, etanol), ésteres de ácidos grasos,

números 2, 3, 9 y 10.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221 215

Stashenko EE, Martínez JR

En la Tabla 4 se resume la información sobre las notas odoríferas de algunos compuestos presentes en las fracciones volátiles de los Piscos analizados. Es importante anotar, que el impacto odorífero (nota organoléptica, sensorial, y el umbral de su percepción) es función de la configuración enantiomérica de la sustancia (isomería óptica), y de su concentración en la mezcla. Por ello, para el estudio mucho más completo de aromas, se requiere no solamente hallar cantidades relativas (%), sino también cantidades exactas de componentes presentes, junto con el establecimiento de su configuración óptica, ya que de estos parámetros finalmente dependerá la descripción completa del bouquet aromático de una bebida fermentada. Aún así, la información composicional obtenida permitió establecer diferencias y similitudes de fracciones volátiles de los Piscos analizados, ya que conforma una base objetiva para diferenciarlos. Los datos se sometieron al análisis de componentes principales (PCA), cuyo resultado aparece en la Figura 14 y permite vislumbrar las semejanzas composicionales de las fracciones volátiles (aromas) y clasificar las once muestras de Pisco analizadas, por grupos (clusters), que descubren la mayor similitud de sus fracciones volátiles. Las muestras N° 9 y 10 (Pisco Torontel) presentaron las mayores diferencias composicionales con respecto a otros Piscos analizados.

4.2

Análisis de drogas de síntesis

Indudablemente, la técnica de GC-MS tiene una gran importancia para el análisis de drogas de síntesis o de diseño (street drugs), ya que sus extractos frecuentemente son mezclas multicomponente, a menudo de composición desconocida y compleja. Precisamente, es cuando el poder de la espectrometría de masas -como método para elucidar estructuras químicas con base en los patrones de fragmentación o por comparación de sus 216

Agunos consejos análisis VOC

Figura 14 Análisis de componentes principales (PCA) de los once Piscos analizados, según las similitudes composicionales de sus fracciones volátiles aisladas por HS-SPME/GC-MS (Véanse los nombres y tipo de Pisco en la Tabla 2).

espectros con los de las bases de datos o con los de compuestos estándar-, es ventajoso y mucho más eficiente que el de otras técnicas analíticas.

El resultado del análisis por GC-MS de un extracto de una tableta, una cápsula o una pastilla de la presunta droga sicotrópica, permite esclarecer varios aspectos, entre ellos: 1) cuáles son los componentes principales (principios activos) y en qué cantidad se encuentran (se requieren patrones certificados y la debida calibración; en GC-MS ello generalmente se hace en el modo de monitoreo de ion(es) seleccionado(s), SIM); 2) cuáles son las impurezas, adulterantes, precursores o productos intermedios de la síntesis presentes generalmente a nivel de trazas, en la mezcla; 3) qué solventes residuales u otros componentes volátiles, productos de una contaminación cruzada o, al contrario, enmascaradores de olores, se encuentran en la mezcla. El análisis de todos estos componentes permite hacer la llamada perfilación de la droga ilícita, que es como su “huella digital” o firma (signature investigation). Ello, no solamente permite identificarla y caracterizarla, Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

Figura 15 a) Cromatograma típico del extracto obtenido de una pastilla de droga de diseño (droga de síntesis, street drug). GC-MS (EI, 70 eV). Columna DB-5 (60 m). b) Modo de preparación del extracto y su composición química: escopolamina - compuesto mayoritario.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

217

Stashenko EE, Martínez JR

sino relacionarla con su origen (modo de síntesis, reactivos y solventes empleados, precursores, etc.) y, en algunos casos, con su fabricante (país, ciudad). Frecuentemente se logra establecer el vínculo entre los distribuidores quienes realizan la dilución o adulteración (cutting) del producto, para su venta al por menor. En la Figura 15 aparece la corriente iónica total (GC-MS, EI, 70 eV) del extracto de una pastilla decomisada en una discoteca; ésta fue vendida como una pastilla de “Extacy” (MDMA, 3,4-metilenodioximetilanfetamina), pero, en realidad, resultó ser una peligrosa mezcla que contenía cafeína, escopolamina (alcaloide tropánico, presente en varias plantas de la familia Solanácea, por ejemplo en géneros Datura o Brugmansia) y sus derivados.

Referencias 1

2

3

4

218

García C, Herrero S, Pérez JL, Moreno B. A simplified Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe approach for the determination of trihalomethanes and benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in soil matrices by fast gas chromatography with mass spectrometry detection. Analytica Chimica Acta 2011; 689(1):129-136. PMid:21338768. http://dx.doi. org/10.1016/j.aca.2011.01.023 Pérez JL, Herrero S, García C, Moreno B. Programmed temperature vaporizer based method for the sensitive determination of trihalomethanes and benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes in soils.

Journal of Chromatography A 2009; 1216(32):60636070. PMid:19577756. http://dx.doi.org/10.1016/j. chroma.2009.06.057 Pérez JL, Herrero S, García C, Moreno B. Headspaceprogrammed temperature vaporizer-fast gas chromatography-mass spectrometry coupling for the determination of trihalomethanes in water.

Journal of Chromatography A 2008; 1194(1):103110. PMid:18482730. http://dx.doi.org/10.1016/j. chroma.2008.04.037 Zhang Z, Li G. A review of advances and new developments in the analysis of biological volatile organic compounds.

Microchemical Journal 2010; 95(2):127-139. http://dx.doi.org/10.1016/j. microc.2009.12.017

Agunos consejos análisis VOC

4

Wang L, Li M, Jin W, Li S, Zhang S, Yu L. Variations in the components of Osmanthus fragrans Lour. essential oil at different stages of flowering. Food Chemistry 2009; 114(1):233-236. http://dx.doi.org/10.1016/j. foodchem.2008.09.044

6

Chalchat J-C, Özcan MM. Comparative essential oil composition of flowers, leaves and stems of basil (Ocimum basilicum L.) used as herb. Food Chemistry 2008; 110(2):501-503. http://dx.doi.org/10.1016/j. foodchem.2008.02.018

7

Stashenko E, Ordóñez SA, Marín NA, Martínez JR. Determination of the volatile and semi-volatile secondary metabolites, and aristolochic acids in Aristolochia ringens Vahl. Journal of Chromatographic Science, 2009; 47(9):817-821.

8

Pedroza MA, Zalacain A, Lara JF, Salinas MR. Global grape aroma potential and its individual analysis

by SBSE-GC-MS. Food Research International 2010; 43(4):1003-1008. http://dx.doi.org/10.1016/j. foodres.2010.01.008

9

Courtois EA, Paine CET, Blandinieres P-A, Stien D, Bessiere JM, Houel E et al. Diversity of the volatile organic compounds emitted by 55 species of tropical trees: a survey in French Guiana. Journal of Chemical Ecology 2009; 35(11):1349-1362. PMid:20012675. http://dx.doi.org/10.1007/s10886-009-9718-1

10 Goodwin TE, Brown PA, Eggert MS, Evola MG,

House SJ, Morshedi RG et al. Use of automated solid phase dynamic extraction (SPDE)/GC-MS and novel macros in the search for african elephant pheromones.

Chemical Signals in Vertebrates 2008;11(I):25-35. http://dx.doi.org/10.1007/978-0-387-73945-8_2 11 Riu-Aumatell M, Vargas L, Vichi S, Guadayol JM,

López-Tamames E, Buxaderas S. Characterisation of volatile composition of white salsify (Tragopogon porrifolius L.) by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and simultaneous distillation-extraction (SDE) coupled to GC-MS. Food Chemistry 2011; 129(2):557-564.

12 Sandercock PML. Fire investigation and ignitable

liquid residue analysis - A review: 2001-2007.

Forensic Science International 2008;176(2-3):93110. PMid:17949931. http://dx.doi.org/10.1016/j. forsciint.2007.09.004 13 Monfreda

M, Gregori A. Differentiation of unevaporated gasoline samples according to their brands, by SPME-GC-MS and multivariate statistical analysis. Journal of Forensic Sciences 2011; 56(2):372-380. PMid:21265832. http://dx.doi. org/10.1111/j.1556-4029.2010.01644.x

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

14 Yoshida H, Kaneko T, Suzuki S. A solid-phase

23 Probert CSJ, Ahmed I, Khalid T, Johnson E, Smith

microextraction method for the detection of ignitable liquids in fire debris. Journal of Forensic Sciences 2008; 53(3):668-676. PMid:18471212. http://dx.doi. org/10.1111/j.1556-4029.2008.00704.x

S, Ratcliffe N. Volatile organic compounds as diagnostic biomarkers in gastrointestinal and liver diseases. Journal of Gastrointestinal and Liver Disease 2009;18(3):337-343. PMid:19795029.

15 McCord B, Bottegal M, Mathis J. Mass spectrometry

24 Kataoka H, Saito K. Recent advances in SPME

for the analysis of low explosives. Detection of biological agents for the prevention of bioterrorism.

NATO Science for Peace and Security Series A: Chemistry and Biology 2011; 221-229. http://dx.doi. org/10.1007/978-90-481-9815-3_14 16 Dalby O, Butler D, Birkett JW. Analysis of gunshot

residue and associated materials - A review. Journal of Forensic Sciences 2010; 55(4):924-943. PMid:20384934. http://dx.doi.org/10.1111/j.1556-4029.2010.01370.x 17 Hoffman EM, Curran AM, Dulgerian N, Stockham

RA, Eckenrode BA. Characterization of the volatile organic compounds present in the headspace of decomposing human remains. Forensic Science International 2009; 186(1-3):6-13. PMid:19203852. http://dx.doi.org/10.1016/j.forsciint.2008.12.022 18 Castiglioni S, Zuccato E, Chiabrando C, Fanelli R,

Bagnati R. Mass spectrometric analysis of illicit drugs in wastewater and surface water. Mass Spectrometry Reviews, 2008; 27(4):378-394. PMid:18421768. http:// dx.doi.org/10.1002/mas.20168 19 Turner C. Potential of breath and skin analysis

for monitoring blood glucose concentration in diabetes. Expert Review of Molecular Diagnostics 2011; 11(5):497-503. PMid:21707458. http://dx.doi. org/10.1586/erm.11.31 20 Song G, Qin T, Liu H, Xu GB, Pan Y-Y, Xiong F-X

et al. Quantitative breath analysis of volatile organic compounds of lung cancer patients. Lung Cancer 2010; 67(2):227-231. PMid:19409642. http://dx.doi. org/10.1016/j.lungcan.2009.03.029 21 Mebazaa R, Rega B, Camel V. Analysis of human

male armpit sweat after fenugreek ingestion: Characterisation of odour active compounds by gas chromatography coupled to mass spectrometry and olfactometry. Food Chemistry 2011; 128(1):227-235. http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2011.02.063 22 Soini HA, Klouckova I, Wiesler D, Oberzaucher

E, Grammer K, Dixon SJ et al. Analysis of volatile organic compounds in human saliva by a static sorptive extraction method and gas chromatographymass spectrometry. Journal of Chemical Ecology 2010; 36(9):1035-1042. PMid:20809147. http://dx.doi. org/10.1007/s10886-010-9846-7

techniques in biomedical analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011; 54(5):926-950.

PMid:21194868. http://dx.doi. org/10.1016/j.jpba.2010.12.010 25 Pasikanti KK, Ho PC, Chan ECY. Gas chromatography/

mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B 2008; 871(2):202211. PMid:18479983. http://dx.doi.org/10.1016/j. jchromb.2008.04.033 26 Logue BA, Hinkens DM, Baskin SI, Rockwood GA.

The analysis of cyanide and its breakdown products in biological samples. Critical Reviews in Analytical Chemistry 2010; 40(2):122-147. http://dx.doi. org/10.1080/10408340903535315 27 LeDoux M. Analytical methods applied to the

determination of pesticide residues in foods of animal origin. A review of the past two decades.

Journal of Chromatography A 2011; 1218(8):10211036. PMid:21236435. http://dx.doi.org/10.1016/j. chroma.2010.12.097 28 Marriott

PJ, Eyres GT, Dufour JP. Emerging opportunities for flavor analysis through hyphenated gas chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009; 57:9962-9971. PMid:19817416. http://dx.doi.org/10.1021/jf9013845

29 López-Feria S, Cárdenas S, Valcárcel M. Simplifying

chromatographic analysis of the volatile fraction of foods. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2008; 27(9):794-803. http://dx.doi.org/10.1016/j. trac.2008.07.006 30 Barata A, Campo E, Malfeito-Ferreira M, Loureiro

V, Cacho J, Ferreira V. Analytical and sensorial characterization of the aroma of wines produced with sour rotten grapes using GC-O and GC-MS: Identification of key aroma compounds. Journal of.

Agricultural and Food Chemistry 2011; 59:2543-2553.

PMid:21348497. http://dx.doi.org/10.1021/jf104141f 31 Ikem A. Measurement of volatile organic compounds

in bottled and tap waters by purge and trap GC-MS: Are drinking water types different? Journal of Food Composition and Analysis 2010; 23(1):70-77. http:// dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2009.05.005

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221 219

Stashenko EE, Martínez JR

32 Zellner B, Dugo P, Dugo G, Mondello L. Gas

43 Dincer F, Odabasi M, Muezzinoglu A. Chemical

chromatography-olfactometry in food flavour analysis.

Journal of Chromatography A 2008; 1186(1-2):123143. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2007.09.006

characterization of odorous gases at a landfill site by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A 2006; 1122(1-2):222-229. http:// dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2006.04.075

33 Linsinger TPJ, Birgersson-Liebich A, Lamberty A,

Pellizzato F, Venelinov T, Voorspoels S. Development of the first certified reference materials for several brominated flame retardants in polymers. Analytical.

Chemistry 2009; 81:3792-3800. http://dx.doi. org/10.1021/ac900139r

44 Nijssen LM, Visscher CA, Maarse H, Wilemsens LC,

34 Kawakami T, Isama K, Matsuoka A. Analysis

volatile and semi-volatile organic compounds in air: Part 1: Sorbent-based air monitoring options. Journal of Chromatography A 2010; 1217(16):2674-2684. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2009.12.042

of phthalic acid diesters, monoester, and other plasticizers in polyvinyl chloride household products in Japan. Journal of Environmental Science and Health, Part A 2011; 46(8):855-864.

35 Odabasi M. Halogenated volatile organic compounds

from the use of chlorine-bleach-containing household products. Environmental Science and Technology 2008; 42(5):1445-1451. http://dx.doi.org/10.1021/ es702355u 36 Salgueiro L, Martins AP, Correia H. Raw materials: the

importance of quality and safety. A review. Flavour and Fragrance Journal 2010; 25(5):253-271. http:// dx.doi.org/10.1002/ffj.1973 37 Nagpal S, Karan, Upadhyay A, Bhardwaj R, Thakkar A.

A review on need and importance of impurity profiling.

Current Pharmaceutical Analysis 2011; 7(1):62-70. http://dx.doi.org/10.2174/157341211794708749 38 Risby TH, Solga SF. Current status of clinical breath

analysis. Applied Physics B: Lasers and Optics 2006; 85(2-3):421-426. http://dx.doi.org/10.1007/s00340006-2280-4 39 Stashenko E, Martinez J. Sampling flower scent for

chromatographic analysis. Journal of Separation Science 2008; 31(11):2022-2031. http://dx.doi. org/10.1002/jssc.200800151 40 Korhoňová M, Hron K, Klimčíková D, Müller L,

Bednář P, Barták P. Coffee aroma—Statistical analysis of compositional data. Talanta 2009; 80(2):710-715. http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2009.07.054 41 Król S, Zabiegała B, Namieśnik J. Monitoring

VOCs in atmospheric air II. Sample collection and preparation. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2010; 29,(9):1101-1112. http://dx.doi.org/10.1016/j. trac.2010.05.010 42 Van Dam NM, Poppy GM. Why plant volatile analysis

needs bioinformatics - detecting signal from noise in increasingly complex profiles. Plant Biology 2008; 10(1):29-37. http://dx.doi.org/10.1055/s-2007-964961

220

Agunos consejos análisis VOC

Boelens MH. Volatile Compounds in Food. Qualitative and Quantitative Data. 7rd ed. Zeist, The Netherlands: TNO Nutrition and Food Research Institute; 1996.

45 Woolfenden E. Sorbent-based sampling methods for

46 Bohlin P, Jones KC, Strandberg B. Occupational and

indoor air exposure to persistent organic pollutants: A review of passive sampling techniques and needs.

Journal of Environmental Monioring 2007; 9:501-509. http://dx.doi.org/10.1039/b700627f 47 Stashenko E, Wong JW, Martínez JR, Mateus A,

Shibamoto T. High resolution gas chromatography nitrogen - phosphorous detection of saturated volatile aldehydes derivatized with 2-hydrazinobenzothiazole.

Journal of Chromatography A 1996; 752:209. http:// dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(96)00494-3 48 Stashenko E, Puertas MA, Salgar W, Delgado W,

Martínez J. Solid-phase microextraction with on-fibre derivatisation applied to the analysis of volatile carbonyl compounds. Journal of Chromatography A 2000; 886:175181. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(00)00479-9 49 Stashenko E, Macku C, Shibamoto T. Monitoring

volatile chemicals formed from must during yeast fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1992; 40(11):2257-2259. http://dx.doi. org/10.1021/jf00023a040 50 Stashenko E, Martínez JR. Algunos aspectos prácticos

para la identificación de analitos por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Scientia Chromatographica 2010; 2 (1):29-47.

51 Stashenko E, Martínez JR. Separar, fragmentar e

integrar: la rutina de un análisis por GC-MS. Patrones de fragmentación de moléculas orgánicas. Scientia Chromatographica 2010; 2(2):23-46.

52 Stashenko

E, Martínez JR. GC-MS: Más de un analizador de masas, ¿para qué?. Scientia Chromatographica 2010; 2(4):33-59.

Recebido: 28/07/2011 Aceito: 03/08/2011

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

Anexo 1 Abreviaturas.

BTEX CI D.I.

benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos ionización química diámetro interno

df

grosor de la fase estacionaria.

ECD

detector de captura electrónica

EI

ionización por impacto electrónico

FID

detector de ionización en llama

FPD

detector fotométrico de llama

FT-ICR-MS GC GC-MS

espectrometría de masas de resonancia ion-ciclotrón con transformada de Fourier cromatografía de gases cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

HD

hidrodestilación

HS

espacio de cabeza, fase vapor

LVI

inyección de volúmenes grandes de muestra

MS

espectrometría de masas

MSD

detector selectivo de masas

MWAE

extracción asistida por la radiación de microondas

NI CI

ionización química de iones negativos

P&T PDMS/DVB

purga y trampa polidimetilsiloxano/divinilbenceno

PFPH

pentafluorofenilhidracina

PI CI

ionización química con iones positivas

PTV

inyector de temperatura programada

SBSE

extracción por sorción en barra de agitación

SD

destilación por arrastre con vapor

SDE

destilación-extracción simultánea con solvente

SFE

extracción con fluido supercrítico

SIM

monitoreo de iones selectivos

SPE

extracción en fase sólida

SPME

microextracción en fase sólida

STE

extracción por sorción sobre cinta sorbente

TCD

detector de conductividad térmica

TD

desorción térmica

THM

trihalometanos

TIC

corriente iónica total

TOF

analizador de masas de tiempo de vuelo

VOC

compuestos orgánicos volátiles

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):199-221 221

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229 Instituto Internacional de Cromatografia

PREPARO DE AMOSTRAS

DOI: 10.4322/sc.2011.013 ISSN 1984-4433

Microextração em sorvente empacotado (MEPS) para a determinação de fármacos em fluidos biológicos Maria Eugênia Costa Queiroz Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Departamento de Química, Universidade de São Paulo, Cep 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil e-mail: mariaeqn@ffclrp.usp.br

Resumo A microextração em sorvente empacotado (MPES) é uma nova técnica de preparo de amostra que foi desenvolvida em 2004. Na verdade, a MEPS é a miniaturização dos volumes dos dispositivos sortivos da extração em fase sólida (SPE) convencional, de mililitros para microlitros. O principal destaque da MEPS é que a ordem de magnitude do volume do solvente utilizado para a eluição dos analitos no processo de extração é adequada para injeção direta em sistemas de cromatografia líquida, cromatografia gasosa ou eletroforese capilar, sem nenhuma modificação do instrumento. Esta revisão apresenta os fundamentos teóricos da técnica MEPS e suas aplicações. O procedimento de MEPS com suas diferentes etapas (preparo da amostra, préconcentração dos analitos, limpeza do sorvente e eluição dos analitos) é discutido para amostras biológicas.

Uma breve discussão geral das recentes aplicações da MEPS é também apresentada para determinação de fármacos e seus metabólitos em diferentes matrizes biológicas (plasma, urina, sangue, cabelo) para fins de monitorização terapêutica, controle de doping, análises de biomarcadores e toxicologia forense.

Palavras-chave Microextração em sorvente empacotado; fármacos; amostras biológicas.

Microextraction by packed sorbent (MEPS) for determination of drugs in biological fluids Abstract Microextraction by packed sorbent (MEPS) is a new sample preparation technique developed in 2004.

Actually, MEPS is a miniaturization of conventional solid phase extraction (SPE) packed bed devices from mililitre bed volumes to microlitre volumes. The key factor in MEPS is that the volume of solvent used to elute the analytes from the extraction process is of a suitable order of magnitude to be injected directly on-line into Liquid Chromatography, Gas Chromatography or Capillary Electrophoresis systems, without any modification of the instrument. This review focuses on MEPS theory and applications. MEPS procedure with different steps (sample preparation, analytes pre-concentration, sorbent washing, and analytes elution) is discussed for biological samples. A short overview of recent and successful applications of MEPS for determination of drugs and their metabolites in different biological matrices (plasma, urine, blood, hair) for therapeutic drug monitoring, doping inspection, biomarkers analysis, and forensic toxicology are also summarized.

Keywords Microextraction by packed sorbent; drugs; biological samples.

Queiroz MEC

1 Introdução [1-12] A microextração em sorvente empacotado (MEPS) é uma recente técnica de preparo de amostra desenvolvida em 2004. Essa técnica consiste na miniaturização da técnica convencional de extração em fase sólida (SPE), na qual os volumes das amostras e dos solventes (eluentes) foram reduzidos de mililitros para microlitros (10-1000 µL).

Na MEPS, uma microcoluna (≈1 cm × 0,2 mm d.i.), com aproximadamente 1-2 mg de material sólido empacotado, é conectada à agulha de uma microsseringa (100 – 250 µL), ou seja, integrada à microsseringa, como um plug com filtros polietileno em ambos os lados, Figura 1.

Diferentes fases seletivas adsorventes ou absorventes, ou seja, com diferentes mecanismos de extração, estão disponíveis no comércio, tais como: sílica (fase normal), dissilano (C2), octilsilano (C8), octadecilsilano (C18) - fases reversas, trocador de cátions forte (SCX), trocador de ânions forte (SAX) e fase mista M1 (C8 + SCX). No entanto, a diversidade de fases extratoras para MEPS disponíveis no comércio é muito inferior à variabilidade de fases para SPE. Os materiais sorventes para MEPS, geralmente, apresentam partículas irregulares de aproximadamente 50 μm e porosidade 60 Å.

Em razão da miniaturização do sistema de extração, na MEPS, em uma única etapa, os solutos sorvidos na microcoluna são eluídos (dessorvidos) da fase extratora com alguns microlitros de solvente orgânico ou de fase móvel e diretamente injetados no sistema analítico. Esta etapa do processo de extração é o grande destaque da técnica de MEPS, ou seja, a ordem de magnitude do volume do solvente de dessorção (µL) é adequada para introdução (injeção) direta deste eluente em sistemas cromatográficos. Desta forma, a técnica de MEPS tem sido hifenada às técnicas de separação, tais como: a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), cromatografia gasosa (GC) ou a eletroforese capilar (CE).

224

Microextração em sorvente empacotado

Podemos também destacar a hifenação das técnicas de MEPS e espectrometria de massas. A técnica de MEPS foi utilizada para a pré-concentração de drogas de abuso (cocaína e seus metabólitos) de amostras de urina para análise direta em espectrômetro de massas com detector time-of-flight (DART-TOF). Dentre os vários sorventes avaliados (C8: octilsilano, ENV: poliestireno –divinilbenzeno hidroxilado, MCX: (divinilbeneno-N-polivinil-pirrolidona) polissulfônico, DAU: trocador iônico), a fase DAU apresentou os melhores resultados, ou seja, extrações mais eficientes que resultaram em espectros de massas com excelente razão sinal/ruído. A combinação das técnicas de MEPS/DART-TOF (Figura 2) resultou em análise rápida e grande confiabilidade na identificação dos analitos e seus isótopos[8].

Figura 1 a) Esquema da microsseringa MEPS com microcoluna com material sorvente empacotado; e b) foto ilustrativa da microcoluna conectada à microsseringa [adaptada da referência n.1].

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229

Microextração em sorvente empacotado

Queiroz MEC

Figura 2 Esquema da combinação MEPS com análise direta em espectrômetro de massas DART-TOF [adaptada da referência n. 8].

O processo de MEPS (extração e introdução da amostra) pode ser realizado manualmente ou com auxílio do autoinjetor, procedimento em linha totalmente automatizado. As extrações (MEPS) automatizadas diminuem os coeficientes de variação interensaios (precisão analítica) e o tempo de extração para alguns minutos (1-2 minutos). O procedimento repetitivo de aspirar/dispensar a amostra por vários ciclos, para a pré-concentração dos analitos, quando realizado manualmente, tem sido descrito por alguns autores como uma desvantagem da técnica de MEPS. Os cartuchos de SPE, geralmente são utilizados uma única vez e descartados, já as microcolunas de MEPS, dependendo da complexidade da amostra e dos cuidados do analista, podem ser reutilizadas de 50 a 100 vezes.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229

2 Procedimento MEPS para a determinação de fármacos em fluidos biológicos [1-12] 2.1 Preparo das amostras biológicas Inicialmente, os fluidos biológicos (10-250 µL) têm sido diluídos com solução tampão, para que os fármacos, geralmente ácidos fracos ou bases fracas, estejam na forma não ionizada (extração em fase reversa ou normal) ou ionizada (extração por troca iônica), favorecendo o processo de MEPS. As soluções tampão com valores de pH em intervalos extremos (pH < 3 ou pH > 7) deverão ser evitadas, pois poderão danificar as fases sorventes à base de sílica. A precipitação das proteínas das amostras biológicas, com solventes orgânicos (acetonitrila ou metanol) ou com solu225

Queiroz MEC

ções ácidas aquosas ou soluções ácidas orgânicas, tem sido outro procedimento também realizado no pré-preparo das amostras biológicas.

Esses procedimentos descritos minimizam o efeito da matriz biológica no procedimento de MEPS, ou seja, minimizam a sorção (algumas vezes irreversível) dos compostos endógenos na fase extratora, resultam em cromatogramas mais limpos, com menores ruídos na linha de base e aumentam o número de vezes de reutilização dos sorventes de MEPS. A diluição da amostra biológica diminui a viscosidade da amostra, consequentemente favorece a transferência de massas dos solutos para a fase extratora.

2.2 Pré-concentração dos fármacos Anterior ao procedimento de extração, a fase extratora tem sido condicionada ou ativada com alíquotas, respectivamente, de metanol e água (por exemplo, 3 × 100 µL). Após esse procedimento, com o auxílio da microsseringa de MEPS, os fármacos são sorvidos na fase extratora da microcoluna, através dos processos de aspirar/dispensar alíquotas da amostra (20-250 µL), no mesmo frasco que contém o fluido biológico, ou aspirar a amostra do frasco e dispensar no descarte.

A pré-concentração dos solutos tem sido realizada em um único ciclo aspirar/dispensar ou em vários. O aumento do número de ciclos resulta em aumento linear das taxas de recuperação dos solutos. Geralmente, as extrações de MEPS têm sido realizadas com 4 ciclos aspirar/ dispensar de 50 µL de amostra. A seleção do sorvente é um fator importante para a obtenção de altas taxas de recuperação, por exemplo: as fases C2-C18 são adequadas para extração de solutos lipofílicos, já as fases poliméricas, tais como o poliestireno-divilnilbenzeno com grupos iônicos quimicamente ligados (troca iônica), ou as fases mistas (C8 + SCX) são adequadas para as determinações de solutos ácidos ou básicos.

226

Microextração em sorvente empacotado

2.3 Eliminação dos interferentes Após a pré-concentração dos fármacos, a fase sólida é lavada com solvente (50 µL), tais como água, solução ácida (exemplo, 0,1% ácido fórmico), soluções tampão ou misturas de solução aquosas com solvente orgânico (metanol ou isopropanol), para remoção dos compostos endógenos. Nesta etapa de limpeza, a concentração de solvente orgânico, assim como o pH das soluções tampão deverão ser considerados para evitar ou minimizar a perda do soluto. O aumento da porcentagem de solvente orgânico na solução, geralmente, aumenta a perda do soluto.

2.4 Eluição dos fármacos Os fármacos sorvidos na fase sólida são eluídos com alíquotas (20-50 µL) de solvente orgânico ou de fase móvel e diretamente injetados no sistema analítico. O ajuste do pH da solução eluente (ionização dos solutos) é um fator importante para a obtenção de altas taxas de extração.

O aumento do volume do eluente e da porcen-

Figura 3 Processo MEPS com suas diferentes etapas, amostragem, pré-concentração dos solutos, eliminação dos interferentes, eluição dos solutos e introdução do extrato no sistema analítico.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229

Microextração em sorvente empacotado

Queiroz MEC

Tabela 1 Aplicações da MEPS associada a diferentes técnicas analíticas para a determinação de fármacos e seus metabólitos em fluidos biológicos.

Fármacos (fluido biológico) Ropivacaina e metabólitos (urina)

Busulfan (plasma) Acebutolol e metoprolol (plasma e urina) Dopamina e serotonina (urina) Metanfetamina e anfetamina (cabelo)

MEPS (Observações)

Fluoroquinolonas (urina)

Linearidade

Referências

LC-MS/MS

2-2000 nmol.L–1

M. Abdel-Rehim et al. (2004)[2]

LC-MS

5-2500 ng.mL–1

M. Abdel-Rehim et al. (2007)[3]

LC-MS/MS

1-100 ng.mL–1

M. Abdel-Rehim et al. (2007)[4]

LC-MS/MS

50-4000 µg.mL–1

M. Abdel-Rehim et al. (2007)[5]

GC-MS

0,20-50 ng.mg–1

Miyaguchi et al.

(2009)[6]

LC-MS/MS

0,5-150 µg.mL–1

M. Abdel-Rehim et al. (2008)[7]

DART-TOF

65-1200 ng.mL–1

M. Abdel-Rehim et al. (2009)[8]

CE-MS

6,3–10,6 µg.L–1

Valcárcel et al.

(2009)[9]

HPLC-UV

10-1000 ng.mL–1

Queiroz et al.

(2010)[10]

UHPLC-MS/ MS

0,5-100 nM

Nováková et al.

(2011)[11]

FE: poliestireno Urina: 50 µL (3 x) Lavagem: 50 µL água Eluição: 0,2% NH4OH em metanol (20 μL) FE: poliestireno Plasma: 25 µL (MEPS: 1 minuto versus LLE: 40 minutos) FE: poliestireno Fluido biológico: 50 µL FE: C8 (reutilizado 300 vezes) Fluido biológico: 50 µL (Carry-over : 0,1-0,2%) FE: Cabelo: 1 mg Acetilação aquosa-MEPS Eluição/Injeção (direta): 50 µL metanol - GC-MS (PTV)

FE: poliestireno Ciclofosfamida (sangue total - rato) Plasma: 20 µL (diluição 5 x – 0,1% HCOOH) Cocaína e metabólitos (urina)

Técnica analítica

FE: C8 (apolares-moderadamene polares), ENV (alifáticos e aromáticos), MCX, DAU (básicos e ácidos) Urina: 100 μL FE: C18 Urina: 48 µL – diluída 2,5% ácido fórmico Eluição: 5% ácido fórmico em metanol FE: (C8 + SCE)

Antidepressivos (plasma)

Plasma: 250 µL (3 x) Lavagem: 100 µL sol. ác fórmico 0,1% Eluição: fase móvel (150 μL) FE: C8

Atorvastatin e metabólitos (soro)

Soro: 50 μL Lavagem: Acetato amônio pH 4,5 (100 μL) Eluição: acetonitrila: Acetato amônio pH 4,5 (100 μL) PTFE filtro 0,20 μm

Clozapina e metabólitos (sangue – dried spots)

FE: C8 Sangue: 25 µL (diluição tampão fosfato) Lavagem: água e sol. água + metanol Eluição: fase móvel

HPLC – detector 2,5-1000 ng.mL–1 coulométrico

Raggi et al.

(2011)[12]

FE: Fase extratora, LLE: extração líquido-líquido, PTV: vaporizador com programa de temperatura, C8: octilsilano, ENV: poliestireno– divinilbenzeno hidroxilado, MCX: (divinilbeneno-N-polivinil-pirrolidona) polissulfônico, DAU (trocador iônico), DART-TOF: análise direta em tempo real em espectrômetro de massas time-of-flight, SCE: forte trocador de cátions.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229 227

Queiroz MEC

tagem de solvente orgânico favorece a dessorção dos fármacos. Para definir o volume da solução eluente, a eficácia do processo de dessorção dos solutos e o volume da alça de amostragem do HPLC são os fatores considerados.

2.5 Limpeza da fase sólida Para reutilizar as microcolunas de MEPS, estas são lavadas (interensaios) 3-4 vezes com água e 4-5 vezes com o solvente utilizado na etapa de eluição. Este procedimento minimiza o efeito de memória para valores menores que 0,2%.

A Figura 3 ilustra o processo de MEPS com suas diferentes etapas, pré-concentração dos fármacos, eliminação dos interferentes, eluição e introdução do extrato no sistema analítico.

As variáveis da técnica de MEPS, (volume de amostra, pH da amostra, número de ciclos aspirar/dispensar, composição e volume dos solventes de lavagem (remoção interferentes) e de eluição, têm sido otimizadas não somente para aumentar a sensibilidade analítica, mas também para minimizar o volume da amostra, o consumo de solventes orgânicos, o efeito de memória e o tempo de análise.

Microextração em sorvente empacotado

injeção do extrato nos sistemas analíticos resultam não somente na minimização do volume dos fluidos biológicos, geralmente 50 µL, e do consumo de solvente orgânicos (µL), mas também em rápido procedimento de preparo de amostra, adequado para análises de rotina de amostras biológicas. Podemos também destacar a minimização da exposição dos analistas aos fluidos biológicos e redução ou eliminação de resíduos de solventes orgânicos gerados no processo de extração.

Segundo os trabalhos da literatura apresentados (Tabela 1), os métodos desenvolvidos com as associações da MEPS com as técnicas analíticas, HPLC, UHPLC, GC, CE e DART-TOPF apresentaram seletividade, alta sensibilidade analítica e linearidade adequada para a determinação de fármacos e seus metabólitos em diferentes amostras biológicas (sangue total, plasma, urina, cabelo) para diferentes fins, tais como, monitorização terapêutica, screening de drogas de abuso, toxicologia forense, análises de biomarcadores, dentre outros.

Referências 1

Abdel-Rehim M. Recent advances in microextraction by packed sorbent for bioanalysis. Journal of Chromatography A 2010; 1217(16):2569. PMid:19811788. http://dx.doi. org/10.1016/j.chroma.2009.09.053

2

Abdel-Rehim M, Altun Z, Blomberg L. Microextraction in packed syringe (MEPS) for liquid and gas chromatographic applications. Part II - Determination of ropivacaine and its metabolites in human plasma samples using MEPS with liquid chromatography/tandem mass spectrometry.

Journal of Mass Spectrometry 2004; 39:1488-93.

PMid:15578759. http://dx.doi.org/10.1002/jms.731

3

Abdel-Rehim M, Hassan Z, Skansem P, Hassan M. Simultaneous Determination of Busulphan in Plasma Samples by Liquid Chromatographyelectrospray Ionization Mass Spectrometry Utilizing Microextraction in Packed Syringe (MEPS) as On-line Sample Preparation Method. Journal of

3 Aplicações da MEPS A Tabela 1 ilustra as aplicações da MEPS associada a diferentes técnicas analíticas para a determinação de fármacos e seus metabólitos em fluidos biológicos para diferentes fins.

4 Considerações finais A amostragem/pré-concentração dos fármacos em microcolunas de MEPS e a associação das etapas de eluição (dessorção) dos solutos e 228

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229

Microextração em sorvente empacotado

Liquid Chromatography & Related Technologies 2007; 30:3029. PMCid:1176066. http://dx.doi. org/10.1080/10826070701632337 4

5

6

7

El-Beqqali A, Kussak A, Blomberg L, AbdelRehim M. Microextraction in Packed Syringe/ Liquid Chromatography/Electrospray Tandem Mass Spectrometry for Quantification of Acebutolol and Metoprolol in Human Plasma and Urine Samples. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2007; 30:575. PMCid:1176066. http://dx.doi.org/10.1080/10826070601093895 El-Beqqali A, Kussak A, Abdel-Rehim M. Determination of dopamine and serotonin in human urine samples utilizing microextraction online with liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science 2007; 30(3):421-24. PMid:17396602. http://dx.doi. org/10.1002/jssc.200600369 Miyaguchi H, Iwata YT, Kanamori T, Tsujikama K, Inoue H. Rapid identification and quantification of methamphetamine and amphetamine in hair by gas chromatography/mass spectrometry coupled with micropulverized extraction, aqueous acetylation and microextraction by packed sorbent. Journal of Chromatography A 2009; 1216(18):4063-70.

PMid:19286186. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2009.02.093 Said R, Hassan Z, Hassan M, Abdel-Rehim M. Rapid and Sensitive Method for Determination of Cyclophosphamide in Patients Plasma Samples Utilizing Microextraction by Packed Sorbent Online with Liquid Chromatography‐Tandem Mass Spectrometry (MEPS-LC-MS/MS). Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies 2008; 31:683. PMCid:1176066. http://dx.doi. org/10.1080/10826070701853867

Queiroz MEC

8

Jagerdeo E, Abdel-Rehim MZ. Screening of cocaine and its metabolites in human urine samples by direct analysis in real-time source coupled to time-of-flight mass spectrometry after online preconcentration utilizing microextraction by packed sorbent. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2009; 20(5):891-9. http://dx.doi.org/10.1016/j.jasms.2009.01.010

9

Morales-Cid G, Cardenas S, Simonet BM, Valcarcel M. Fully Automatic Sample Treatment by Integration of Microextraction by Packed Sorbents into Commercial Capillary Electrophoresis−Mass Spectrometry Equipment: Application to the Determination of Fluoroquinolones in Urine. Analytical Chemistry 2009; 81(8):3188-93. http://dx.doi.org/10.1021/ac900234j

10 Chaves AR, Leandro FZ, Carris JA, Queiroz MEC.

Microextraction in packed sorbent for analysis of antidepressants in human plasma by liquid chromatography and spectrophotometric detection.

Journal of Chromatography B 2010; 878(23):2123-9. http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2010.06.023 11 Vičková H, Solichová D, Bláha M, Solich P, Nováková L.

Microextraction by packed sorbent as sample preparation step for atorvastatin and its metabolites in biological samples-Critical evaluation. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011; 55(2):301-8. http:// dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2011.01.025 12 Saracino MA, Lazzara G, Prugnoli B, Raggi MA.

Rapid assays of clozapine and its metabolites in dried blood spots by liquid chromatography and microextraction by packed sorbent procedure. Journal of Chromatography A 2011; 1218(16):2153-9. http:// dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2011.01.071

Recebido: 22/07/2011 Aceito: 02/08/2011

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):223-229 229

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247 Instituto Internacional de Cromatografia

TÉCNICAS ELETROFORÉTICAS

DOI: 10.4322/sc.2011.014 ISSN 1984-4433

Análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos empregando eletroforese capilar Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Cep 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brasil e-mail: deoliveira@usp.br

Resumo Este artigo tem como objetivo discutir os fundamentos da análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos, empregando a eletroforese capilar como técnica de análise. Aspectos teóricos envolvendo os principais seletores quirais empregados nas análises são apresentados, assim como aplicações em diversas áreas.

Palavras-chave Eletroforese capilar; análise enantiosseletiva; fármacos; metabólitos.

Enantioselective analysis of drugs and metabolites by capillary electrophoresis Abstract This article aims to discuss the basics of enantioselective analysis of drugs and metabolites using capillary electrophoresis as analytical technique. The main theoretical aspects involving chiral selectors used in the analysis are presented as well as applications in various areas.

Keywords Capillary electrophoresis; enantioselective analysis; drugs; metabolites.

1 Introdução A história da estereoquímica começou há mais de 150 anos atrás, quando Louis Pasteur demonstrou que quando um feixe de luz polarizada incidia através de soluções de ácido tartárico, o feixe de luz planopolarizada girava diferentemente. Pasteur também observou que

este ácido, quando cristalizado, formava cristais em duas diferentes formas que eram imagens especulares uma da outra. As espécies que são imagens especulares não sobreponíveis são chamadas de enantiômeros. Os enantiômeros diferem um do outro apenas no arranjo espacial dos

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

ligantes ao redor do centro quiral. Os enantiô-

Assim, a procura de métodos analíticos ade-

meros possuem as mesmas propriedades físico-

quados para determinação precisa, exata e repro-

-químicas (por exemplo, ponto de fusão, solu-

dutível dos enantiômeros em diversas amostras

bilidade) em um ambiente aquiral. No entanto,

tem aumentado significativamente nos últimos

em um ambiente quiral, os enantiômeros podem

anos[7].

se comportar diferentemente. Uma mistura de

Várias técnicas podem ser empregadas na

dois enantiômeros na mesma proporção é cha-

análise enantiosseletiva de fármacos, tais como

mada de racemato . Na natureza, muitos dos

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC),

processos essenciais para a vida são estereoes-

cromatografia gasosa (GC) e eletroforese capi-

pecíficos e centros quirais são comuns em bio-

lar (CE). Dentre essas técnicas, a HPLC é a téc-

moléculas. Alvos farmacológicos, tais como

nica mais empregada em análise enantiossele-

receptores, enzimas e canais iônicos, são, muitas

tiva. Contudo, o uso da eletroforese capilar vem

vezes, moléculas quirais. Portanto, quando fár-

aumentando significativamente devido às inú-

macos quirais são introduzidos no organismo,

meras vantagens dessa técnica, tais como: baixo

poderá haver um grau de discriminação quiral

custo de análise, ausência ou reduzido consumo

com a atividade farmacológica dos enantiôme-

de solventes orgânicos, alta seletividade e exce-

ros podendo ser marcadamente diferente, como

lente eficiência na separação dos enantiômeros.

consequência da interação com esses ambientes

Este artigo tem como objetivo apresentar a CE

biológicos assimétricos. Essas interações distin-

como técnica na análise enantiosseletiva de fár-

tas podem resultar em diferenças nos parâme-

macos e metabólitos, enfatizando os princípios

tros farmacocinéticos, eficácia ou toxicidade dos

teóricos da técnica, assim como demonstrar

medicamentos[2].

alguns exemplos de aplicações práticas em diver-

[1]

Compreender a contribuição da estereoquí-

sas áreas.

mica na ação e disposição de fármacos é fundamental para o êxito do desenvolvimento de medicamentos quirais , bem como para deter[3]

minar se o fármaco já desenvolvido ou utilizado como mistura racêmica pode ser substituído pelo mais seguro ou eficaz enantiômero puro

A separação de enantiômeros por CE pode

desse fármaco . No entanto, essa decisão exige

ser feita de duas maneiras, empregando o modo

uma justificativa científica baseada na qualidade,

indireto ou modo direto de separação[7]. No

segurança e eficácia do fármaco[5]. Como resul-

modo indireto a separação é baseada na forma-

tado, vários novos medicamentos vêm sendo

ção de diastereoisômeros estáveis após a reação

comercializados como enantiômeros puros.

com um agente de derivatização quiral. Os resul-

Contudo, há também exemplos de novos fárma-

tantes diastereoisômeros podem então serem

cos que eram ou são comercializados como mis-

separados, com base em suas diferentes proprie-

turas racêmicas e hoje são comercializados como

dades físico-químicas, usando uma solução tam-

enantiômeros puros .

pão convencional.

[4]

[6]

232

2 Análise enantiosseletiva empregando a eletroforese capilar

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Análise enantiosseletiva por CE

No modo direto de separação, seletores quirais são adicionados na solução tampão de análise e complexos diastereoisoméricos transitórios são formados. Tais complexos poderão ter mobilidades diferentes, atingindo o detector em tempos diferentes. Atualmente, a grande maioria das separações enantioméricas por CE é realizada empregando o modo direto, com adição de seletores quirais na solução tampão de análise.

Portanto, este artigo dará enfase a essa modalidade de separação.

Na análise enantiosseletiva por CE com o uso de seletores quirais adicionados na solução tampão de análise, dois mecanismos de separação podem ser considerados, um cromatográfico e outro eletroforético[8,9]. O reconhecimento estereosseletivo dos enantiômeros pelos seletores quirais é um princípio cromatográfico.

Normalmente os seletores quirais estão dissolvidos na solução tampão de análise, formando assim, uma pseudofase estacionária. Por outro lado, o princípio eletroforético da técnica também influencia a migração do analito, do seletor quiral e do complexo analito-seletor quiral em direção ao detector. Dessa forma, alguns autores chamam essa técnica de eletrocromatografia capilar[8,9] e não somente eletroforese capilar.

A resolução dos enantiômeros é baseada em um equilíbrio de complexação e pode ser descrito de acordo com a Equação 1[8,10]: ∆µ = µ R − µS

µ ∫ + µcR K R C  µ ∫ + µcS K S C  − (1) 1 + K R C  1 + K S C 

Onde µR e µS são as mobilidades observadas dos enantiômeros R- e S-, respectivamente; µ∫ é a mobilidade dos enantiômeros não complexados; KR e KS são as constantes de equilíbrio de complexação dos enantiômeros R- e S- com o seletor quiral, respectivamente; µcR e µcS são as mobilidades dos respectivos complexos diastereoisoméricos temporários entre o seletor quiral

De Oliveira, ARM

e os enantiômeros R- e S-; e [C] é a concentração do seletor quiral. Enquanto as mobilidades dos enantiômeros livres são iguais, as constantes de equilíbrio e/ou a mobilidade dos complexos diastereoisoméricos formados podem ser diferentes. Considerando uma separação baseada nas diferenças das constantes de complexação, as mobilidades dos analitos livres e complexados devem ser diferentes para se conseguir a separação dos enantiômeros. Derivando a Equação 1, uma enantiosseparação pode ser obtida no caso de constantes diferentes (KR ≠ KS) ou, alternativamente, no caso de mobilidades diferentes dos complexos formados (µcR ≠ µcS). No primeiro caso, a enantiosseparação é somente devido à diferença nas constantes de complexação, de acordo com a Equação 2, abaixo[8,10]: ∆µ =

(µ∫ − µc ) ( K R − K S )C  1 + ( K R + K S )C  + K R K S C 

2

(2)

No caso de mobilidades diferentes do complexo, a Equação 1 pode ser ainda mais simplificada, de acordo com a Equação 3, abaixo[8,10]: ∆µ =

K C ( µcR − µcS ) 1 + K C 

(3)

Dessa forma, a separação enantiosseletiva dos enantiômeros pode ser alcançada devido a diferentes constantes de ligação (KR ≠ KS) ou devido a diferentes mobilidades do complexo formado (µcR ≠ µcS).

3 Seletores quirais empregados em CE Diversos seletores quirais podem ser utilizados em eletroforese capilar para separação de enantiômeros. Uma característica fundamental dos seletores quirais é apresentar estabilidade química e estabilidade quiral[11]. Essas estabilidades são fundamentais tanto no estado sólido

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247 233

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

como na solução tampão de análise. A falta de estabilidade quiral é observada quando ocorre a racemização do seletor quiral. Além disso, é fundamental que o seletor quiral seja solúvel na solução tampão de análise. Entre esses se destacam as: (i) ciclodextrinas e seus derivados, (ii) seletores baseados em surfactantes quirais, (iii) seletores quirais baseados em antibióticos macrocíclicos, (iv) seletores quirais baseados em éteres de coroa, (iv) seletores quirais baseados em proteínas e (v) misturas de dois ou mais seletores quirais, conhecidos como sistemas dual system. Além desses seletores, existem ainda os seletores quirais por troca de ligantes, seletores quirais baseados em polissacarídeos e reagentes para formação de par iônico quiral. Sem dúvida alguma, o seletor que mais se destaca entre esses são as ciclodextrinas e seus derivados. Neste artigo, serão discutidos os seletores enumerados de i-v. Para maiores detalhes sobre outros seletores quirais, os leitores podem consultar as referências bibliográficas no final deste artigo.

Figura 1

234

3.1 Ciclodextrinas e seus derivados Ciclodextrinas (CDs) são os seletores quirais mais empregados em análise enantiosseletiva por eletroforese capilar. Essas moléculas possuem diversas propriedades que tornam seu uso atraente tais como: baixa absorção no UV, possibilidade de obtenção de CDs com diferentes polaridades e solubilidades e alto grau de enantiodiscriminação. As CDs são oligossacarídeos quirais cíclicos obtidas pela degradação enzimática do amido. Essas moléculas têm o formato de um cone truncado com uma cavidade interna, relativamente hidrofóbica e, devido à presença de grupos hidroxila nas bordas da cavidade, essas moléculas possuem também uma região hidrofílica[12]. As ciclodextrinas nativas, que ocorrem naturalmente, são: α-, β-, γ-CDs, compostas por seis, sete e oito unidades de anidroglicopiranose, respectivamente[13] (Figura 1).

O mecanismo mais aceito para separação dos enantiômeros com as CDs envolve a inclusão do analito quiral em sua cavidade e o estabeleci-

Estrutura química e esquema da α- β- e γ- ciclodextrinas.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Agunos consejos análisis VOC

Stashenko EE, Martínez JR

mento de interações secundárias com os grupos hidroxila nas bordas da cavidade da CD. A diferença nas constantes de inclusão entre os enantiômeros e as CDs é responsável pela enantiorresolução, pois os diasteroisômeros transitórios formados terão tempos de migração diferentes[13].

Algumas CDs nativas apresentam um baixo poder de separação dos enantiômeros, portanto diversos derivados vêm sendo sintetizados empregando essas CDs como “molde”. As CDs derivadas são moléculas com um alto poder de resolução e com diferentes características químicas. Dessa forma, quatro grupos diferentes de derivados podem ser distinguidos: as CDs i) neutras, ii) aniônicas, iii) catiônicas e iv) anfóteras.

3.1.1 Ciclodextrinas neutras As CDs neutras são obtidas pela substituição de grupos hidroxila por grupos alquila ou hidroxialquila, o que aumenta a solubilidade e flexibilidade das CDs[14]. Alguns exemplos desta classe de CD são: 2-hidroxipropil-β-CD, dimetil-β-CD, trimetil-β-CD, hidroxietil-CD, heptakis-(2,6-diO-metil)-β-CD, heptakis-(2,3, 6-tri-O-metil)β-CD. As heptakis são CDs em suas formas enantioméricas puras tendo, portanto, um custo mais elevado. As CDs neutras são utilizadas na separação de analitos ionizados[13] que apresentam algum grau de mobilidade eletroforética.

Assim, a separação de bases ionizáveis é frequentemente realizada em meio ácido, enquanto que a separação de ácidos ionizáveis é realizada empregando um meio mais alcalino. A Tabela 1 apresenta alguns exemplos de separações quirais, empregando CDs neutras. A Figura 2 apresenta a separação quiral da terbutalina, um medicamento beta-agonista adrenérgico empregado no tratamento de doenças respiratórias.

3.1.2 Ciclodextrinas aniônicas As CDs neutras possuem limitada enantiorresolução e analitos neutros não podem ser separados. Assim, CDs carregadas vêm sendo desenvolvidas. Essas ciclodextrinas podem separar analitos não ionizados ou ionizados. Portanto, a mobilidade eletroforética da CD e do analito são importantes na separação quiral com CDs ionizadas.

As CDs aniônicas mais empregadas são: carboximetil-β-CD (CM-β-CD), carboxietil-β-CD, succinil-β-CD, sulfobutiléter-β-CD (SB-β-CD) e sulfoetil-β-CD e CD-β-sulfatada (S-β-CD). CDs aniônicas, como a S-β-CD e SB-β-CD, são carregadas negativamente em qualquer faixa de pH e são usadas principalmente para a separação de compostos quirais neutros e básicos[21,22]. Por outro lado, a CM-β-CD contém grupos carboxílicos e sua carga depende do pH da solução tampão de análise. Em

Tabela 1 Alguns exemplos de separações quirais empregando CDs neutras.

Analito

Seletor quiral

pH da solução tampão

Matriz

Ref.

Amlodipina

HP-β-CD

2,5

Soro

15

Cetoprofeno

TM-β-CD

5,0

Soro

16

Metotrexato

β-CD

9,3

Formulação farmacêutica

17

Etodolaco

HP-β-CD

7,0

Formulação farmacêutica

18

Baclofeno

α-CD

9,5

Plasma

19

DM-β-CD

2,5

Plasma

20

Clenbuterol

HP-β-CD, hidroxipropil-beta-ciclodextrina; TM-β-CD, trimetil-beta-ciclodextrina; β-CD, beta-ciclodextrina, α-CD, alfa-ciclodextrina; DM-β-CD, dimetil-beta-ciclodextrina.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247 235

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

pH baixo (2,5), essa CD não está ionizada e se comporta como uma CD neutra. Em pH acima de 5, essa CD está completamente ionizada. Assim, o pH do meio deve ser avaliado quando a CM-β-CD for empregada. Ciclodextrinas fosfatadas também vêm sendo desenvolvidas, porém seu uso ainda é muito

limitado[23]. Assim, como nas CDs neutras, CDs aniônicas formadas por isômeros isolados também vêm sendo sintetizadas, podendo-se citar: hexakis (2,3-diacetil-6-O-sulfo)-α-CD, hexakis (2,3-di-Ometil-6-O-sulfo)-α-CD, hexakis (6-O-sulfo)-α-CD, heptakis (2,3-diacetil-6-O-sulfo)-β-CD, heptakis (2,3-di-O-metil-6-O-sulfo)-β-CD[11,24]. A Tabela 2 apresenta algumas aplicações das CDs aniônicas na análise enantiosseletiva de compostos quirais.

A Figura 3 apresenta a separação quiral do ricobendazol (também conhecido como albendazol sulfóxido), um medicamento anti-helmíntico, utilizando a betaciclodextrina sulfobutiléter.

3.1.3 Ciclodextrinas catiônicas

Figura 2 Eletroferograma referente à análise dos enantiômeros da terbutalina. Tampão de análise: tampão fosfato 50 mmol.L-1 pH 2,5 contendo HP-βCD 15 mmol.L-1. Temperatura de análise de 20 oC, tensão aplicada de +30 kV. (1) Enantiômero 1; (2) Enantiômero 2, detecção em 205 nm.

Tabela 2

As CDs catiônicas são usadas para a separação de compostos quirais ácidos, básicos e neutros[33,34], mas não têm sido empregadas com muita frequência na separação de fármacos e metabólitos. A CD catiônica mais usada é a 2-hidroxipropil-3-trimetilamônio-β-CD (QA-β-CD). Sua principal aplicação é na separação de ácidos carboxílicos e aminoácidos.

QA-β-CD contém grupos de amônio quaternário, que são carregados em qualquer faixa de pH[21]. Essa CD apresenta uma mobilidade eletroforética independente do pH da solu-

Alguns exemplos de separações quirais empregando CDs aniônicas.

Analito

Seletor quiral

pH da solução tampão

Matriz

Ref.

Amissulprida

S-β-CD

3,5

Formulação farmacêutica

25

Ibuprofeno

S-β-CD

2,6

Plasma

26

Efedrina e pseudoefedrina

S-γ-CD

2,6

Metanfetamina apreendida

27

Mirtazapina e metabólitos

CM-β-CD

2,5

Plasma

28

Mirtazapina e metabólitos

CM-β-CD

2,5

Urina

29

Ofloxacina e metabólitos

SB-β-CD

2,0

Urina

30

Feniramina e metabólitos

CE-β-CD

4,5

Urina

31

S-β-CD

8,7

Plasma

32

Cetirizina

S-β-CD, ciclodextrina-beta-sulfatada; S-γ-CD, ciclodextrina-gama-sulfatada; CM-β-CD, carboximetil-betaciclodextrina; CE-β-CD, carboxietil-beta-ciclodextrina; SB-β-CD, sulfobutiléter-beta-ciclodextrina.

236

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Análise enantiosseletiva por CE

Figura 3 Eletroferograma referente à análise dos enantiômeros do ricobendazol. Tampão de análise: tris(hidroximetil)aminometano 25 mmol.L-1 pH 9,3, contendo SBE-β-CD 4% + 10% de acetonitrila.

Temperatura de análise de 25 oC, tensão aplicada de +25 kV. (1) Enantiômero 1; (2) Enantiômero 2, detecção em 220 nm.

ção tampão. Além disso, o fluxo eletrosmótico da solução é invertido quando compostos de amônio quaternário são utilizados[11]. Somente pequenas quantias dessa CD são necessárias para a separação quiral. Liu et al.[35] desenvolveram a separação enantiomérica de um dissulfato orgânico altamente carregado negativamente. Este composto é um análogo estilbeno dissulfonato que possui interessantes propriedades em membranas. A separação dos enantiômeros foi realizada com uma solução tampão glicina com 5 mmol.L-1 de QA-β-CD. O método foi utilizado para avaliar a pureza enantiomérica após a síntese estereosseletiva do composto.

3.1.4 Ciclodextrinas anfóteras Dependendo do pH da solução tampão de análise, estas CDs podem se comportar como aniônicas, neutras ou catiônicas[36]. Um exemplo de CD anfótera é o cloreto de 2-hidroxipropiltrimetilamônio. Existem poucas aplicações com estas CDs. Alguns racematos ácidos (ácido 4-bromomandélico, ácido 4-cloromandélico, ácido crisântemo monocarboxílico, ácido 3-fenilbutíScientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

De Oliveira, ARM

rico e ácido 2-fenoxipropiónico) foram separados usando uma CD-β anfotérica (AM-β-CD) como seletor quiral[37]. Neste estudo foi empregado um capilar recoberto com poliacrilamida, polaridade reversa de -12 kV e solução tampão fosfato 50 mmol.L-1. A concentração do seletor quiral foi de 20 mmol.L-1. Neste estudo foi possível obter a resolução de linha de base de todos os analitos avaliados.

3.2 Seletores quirais baseados em surfactantes quirais Surfactantes são moléculas anfifílicas constituídas por um grupamento polar (cabeça polar) e um grupamento apolar (cauda apolar).

Quando empregados acima de sua concentração micelar crítica (CMC), ocorre a formação de micelas. Como exemplo, o surfactante SDS ou dodecil sulfato de sódio acima de 8,1 mmol.L-1 encontra-se sob a forma micelar.

Portanto, micelas são agregados cuja superfície é formada por uma cabeça polar e o interior é apolar, devido à cauda hidrofóbica do surfactante (em solução aquosa). Se essas micelas forem formadas por moléculas quirais, então ocorrerá a formação de uma pseudofase estacionária quiral no interior do capilar. O uso de surfactantes quirais foi introduzido por Terabe et al.[38]. Devido à formação dessa pseudofase estacionária, essa técnica foi chamada de cromatografia eletrocinética micelar (MECK).

Diferentes tipos de surfactantes quirais (aniônicos, catiônicos, neutros e surfactantes anfóteros) podem ser empregados, tais como: sais biliares, saponinas, n-alquil-L-aminoácidos de cadeia longa, n-alcanoil-L-aminoácidos, alquilglicosídeos e outros[39,40]. A Figura 4 ilustra um esquema geral de um sal biliar e seus possíveis derivados.

237

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

O mecanismo de separação quiral que envolve esses seletores é baseado nas interações estereoespecíficas entre o enantiômero e as micelas quirais. A discriminação quiral em MECK envolve a formação de complexos diastereoisoméricos temporários entre os enantiômeros do analito e o surfactante quiral. Os enantiômeros são separados quando suas constantes de ligação com o surfactante e/ou as mobilidades dos complexos diastereoisoméricos formados são diferentes[41]. Contudo, deve ser ressaltado que as interações diastereoisoméricas são depen-

dentes do coeficiente de partição do analito entre as micelas e a fase aquosa total, em que as micelas estão dissolvidas. Na separação quiral por MECK, o centro quiral do surfactante está localizado próximo ao grupamento polar, que constitui a camada de Stern da micela. Portanto, o mecanismo de reconhecimento quiral acontece próximo à superfície da micela, na sua interface.

Na tentativa de melhorar a discriminação quiral entre os enantiômeros, sistemas compostos por micelas e ciclodextrinas podem ser empregados.

Esses sistemas são chamados de dual system ou “sistemas mistos”. Esses sistemas serão discutidos posteriormente neste artigo. A Tabela 3 ilustra algumas aplicações que envolvem surfactantes quirais como seletor quiral.

3.3 Seletores quirais baseados em antibiótico macrocíclicos

Figura 4 Esquema geral de um seletor quiral baseado em um sal biliar e seus possíveis derivados.

Tabela 3

Entre os numerosos tipos de seletores quirais empregados em eletroforese capilar, os antibióticos macrocíclicos (MA) apresentam um alto grau de enantiosseletividade para uma variada classe de enantiômeros. Esses seletores quirais foram introduzidos por Armstrong e colaboradores para serem, primeiramente, empregados em cromatografia líquida de alta eficiência e, posteriormente, em eletroforese capilar[48].

Diversos seletores quirais baseados em MAs

Alguns exemplos de separações quirais empregando surfactantes quirais.

Analito

Pseudoefedrina

Seletor quiral

pH da solução tampão

Matriz

Ref

Poly-L-SUCLS

2,0

Urina

42

Arotinolol

STC

2,5

Soro

43

Warfarina

Poly-L-L-SULV

6,0

Plasma

44

Colato sódico

9,2

Soro, microssomas

45

STC

7,0

Solução padrão

46

DDCV

-

Solução padrão

47

Derivado benzoporfirínico mono e diácido Diltiazem e análogos 20 compostos farmacêuticos básicos

Poly-L-SUCLS, N—undecenoxicarbonil-L-leucina sulfato de polissódio; STC, N-undecenoilleucilvalinato de polissódio; DDCV, N-dodeciloxicarbonil-L-valina.

238

taurocolato

de

sódio;

Poly-L-L-SULV,

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Análise enantiosseletiva por CE

Figura 5

De Oliveira, ARM

Estrutura química do seletor quiral vancomicina (a) e teicoplanina (b).

podem ser encontrados tais como: rifamicina B, rifamicina SV, vancomicina, ristocetina A, teicoplanina, fradiomicina, kanamicina, estreptomicina, balhimicina, actaplanina e avoparcina[49,50].

Dessa lista, merecem destaque a vancomicina (Figura 5a) e a teicoplanina (Figura 5b).

Os MAs são excelentes seletores quirais, pois apresentam inúmeros centros assimétricos que podem variar desde 9 até 38. Além disso, possuem anéis aromáticos, moléculas de açúcares, assim como grupamentos carboxílicos que estão envolvidos em interações não estereoespecíficas e estereoespecíficas. Entre essas interações, podemos citar ligações de hidrogênio, interação π-π, hidrofóbicas ou interações repulsivas. Além disso, a cavidade aglicona, que é uma característica de diversos MAs, permite também a formação de complexos de inclusão, favorecendo ainda mais a discriminação quiral. Grupamentos ionizáveis, que podem ser catiônicos ou aniônicos, dependendo do pH do meio, favorecem interações eletrostáticas entre o analito e o MAs. Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Finalmente, a habilidade de enantiosseparação dos MAs foi relacionada também com a sua capacidade de sofrer dimerização[49].

Os MAs teicoplanina e vancomicina vêm se mostrando eficientes na separação de compostos aniônicos ou compostos ácidos ionizáveis em pH entre 4-7. Nesse intervalo de pH, esses seletores estão positivamente carregados, favorecendo assim a separação de compostos aniônicos, através de interações eletrostáticas. A separação de diversos enantiômeros com essas características, incluindo defensivos agrícolas, fármacos e hidroxiálcoois podem ser encontrados na literatura[51].

Portanto, trabalhos mostram que a presença de grupamentos ácidos carboxílicos nas moléculas é importante na discriminação quiral[52].

O grande problema enfrentado com o uso de MAs como seletores quirais é sua alta absorção no UV, devido, principalmente, aos diversos anéis aromáticos presentes nessas moléculas.

Essa alta absorção dificulta a detecção dos analitos, sendo, portanto, recomendável o uso de con239

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

centrações muito baixas desses seletores, entre 1-5 mmol.L-1. Na tentativa de resolver esse problema, pesquisadores vêm utilizando a técnica conhecida como partial-filling countercurrent[49].

Nessa técnica, o capilar é primeiramente lavado com a solução tampão de análise (STA) sem o seletor quiral. Posteriormente, a STA contendo o seletor quiral é injetada no capilar. Antes da STA contendo o seletor quiral atingir o detector, a análise é parada. Posteriormente, a amostra é injetada e uma tensão apropriada é aplicada para que o processo eletroforético inicie a separação.

Essa técnica será eficiente se os analitos e o seletor

quiral migrarem em direções opostas. Portanto, é necessário que eles tenham cargas diferentes.

Como exemplos, pode-se realizar a análise de um composto ácido em pH 6, empregando a vancomicina como seletor quiral e polaridade reversa. Nesse pH, a vancomicina estará positivamente carregada e o analito negativamente carregado (considerando seu pKa menor que 6).

Após a aplicação de uma diferença de potencial, o seletor migra em direção oposta ao detector, enquanto o analito migra em direção ao detector.

Dessa forma, o seletor quiral deixa de interferir na detecção dos analitos, e os analitos, enquanto migram em direção ao detector, interagem com o MAs, podendo assim haver a separação dos enantiômeros nesse percurso. A Figura 6 ilustra esse processo de partial-filling countercurrent. A Tabela 4 apresenta algumas aplicações na análise de fármacos e metabólitos empregando os AMs como seletores quirais.

3.4 Seletores quirais baseados em éteres de coroa

Figura 6 Esquema do processo de partial-filling countercurrent. 1) Preenchimento com a solução tampão de análise e o seletor quiral até a janela de detecção; 2) Injeção dos enantiômeros com características ácidas; 3) Aplicação de tensão e posterior análise. A seta (em 3) indica o sentido do seletor quiral após a aplicação de uma tensão.

Éteres de coroa formam complexos de inclusão estereosseletivos principalmente com aminas primárias. Além da inclusão, interações vicinais, tais como iônica, dipolo-dipolo e ligações de hidrogênio podem acontecer entre o éter de coroa e grupamentos polares do analito[39,60].

Tabela 4 Alguns exemplos de separações quirais empregando antibióticos macrocíclicos como seletores quirais.

Analito

240

Seletor quiral

pH da solução tampão

Matriz

Ref.

AINEs

Vancomicina

6,0

Solução padrão

53

Warfarina

Vancomicina

7,0

Solução padrão

54

Ofloxacina

Vancomicina

4,0

Solução padrão

55

Ácido glutâmico e aspártico

Teicoplanina

6,0

Solução padrão

56

Glutetimida, hexobarbital

Rifamicina SV

7,0

Solução padrão

57

Fármacos básicos

Rifamicina B

7,0

Solução padrão

57

Fenoprofeno, Cetoprofeno

Teicoplanina

5,0

Solução padrão

58

Loxiglumida

Vancomicina

6,0

Formulação farmacêutica

59

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Análise enantiosseletiva por CE

Entre os éteres de coroa disponíveis, o 6-ácido tetracarboxílico-18-coroa vem sendo amplamente empregado na separação quiral de aminoácidos, dipeptídeos e vários fármacos contendo grupamentos amina primária. A Figura 7 mostra os enantiômeros do 6-ácido tetracarboxílico-18-coroa.

3.5 Seletores quirais baseados em proteínas Outros seletores quirais que podem ser empregados em análise enantiosseletiva por eletroforese capilar são as proteínas. Esses seletores podem interagir estereosseletivamente com os analitos de diversas formas, sendo que a estereosseletividade é fortemente influenciada pela estrutura terciária das proteínas[61]. A grande vantagem desses seletores quirais é que eles podem separar compostos ácidos, neutros ou básicos, dependendo de seu grau de ionização e, portanto, do pH da solução tampão de análise e do ponto isoelétrico da proteína. Diversas proteínas podem ser utilizadas, tais como: albumina sérica bovina, α-1-glicoproteína ácida, ovomucoide, transferrina, pepsina, avidina, caseína, penicilina G acilase e outras[62,63]. O mecanismo exato de reconhecimento quiral depende do seletor em questão, não havendo um mecanismo geral aceito que possa ser usado para todas as proteínas empregadas como seletores quirais. A complexidade dessas moléculas, que possuem massa molar desde 12.000 (Citocromo C) até 150.000 (Imunoglobulina G), torna a elucidação dos mecanismos de discriminação quiral extremamente complexa. Contudo, estudos mostram que as interações hidrofóbicas, interações iônicas e ligações de hidrogênio têm um papel importante na enantiosseletividade.

O uso de proteínas em análise enantiosseletiva por CE não é muito expressivo e seu emprego como seletor quiral vem diminuindo. A Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

De Oliveira, ARM

Figura 7 Enantiômeros do seletor quiral 6-ácido tetracarboxílico-18-coroa.

baixa eficiência apresentada na separação (frente a outros seletores quirais), adsorção das proteínas na parede do capilar de sílica, a alta complexidade das proteínas e alta absorção na região do UV tornam esses seletores quirais não atrativos ou de segunda escolha para uso em análise enantiosseletiva por CE. 3.6 Sistemas mistos ou dual system Os sistemas conhecidos como dual system ou sistemas mistos utilizam dois ou mais seletores adicionados à solução tampão de análise.

Esses seletores podem ser uma mistura de seletores aquirais/quirais ou uma mistura de seletores quirais. Os seletores podem ser da mesma classe, como por exemplo, uma CD neutra e outra carregada, ou podem ser de classes diferentes, como por exemplo, uma CD e um surfactante quiral.

Os sistemas mais utilizados empregam duas ciclodextrinas. Essa combinação pode levar a uma melhor resolução devido às diferenças nos mecanismos de complexação das duas CDs com os enantiômeros em relação à estabilidade de complexação, o padrão de reconhecimento quiral e a mobilidade do analito[64]. Em separações contendo duas CDs, ambos os seletores podem atuar de um modo cooperativo assim como de uma forma contrária. Crommen e colaboradores desenvolveram modelos matemáticos para explicar a enantiosseparação quando duas CDs são utilizadas[65]. Esse modelo assume que os dois seletores formam somente complexos 1:1 com os 241

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

enantiômeros do analito e que eles levam a uma complexação independente. Contudo, os dois seletores devem ser bem caracterizados e serem isômeros isolados, o que na prática é raramente possível. Esse modelo geral é aplicável à sepa-

Figura 8 Eletroferograma referente à análise dos enantiômeros da hidroxicloroquina e seus metabólitos.

Tampão de análise: tampão tris(hidroximetil) aminometano 100 mmol.L-1 pH 9,0 + 1% de -CDsulfatada sódica e 30 mg.mL-1 de HP-β-CD. Capilar de sílica fundida não recoberto de 50 µm de diâmetro interno, 50 cm de comprimento total e 42 cm de comprimento efetivo, temperatura de análise de 20 °C, tensão aplicada de +18 kV. 1-(-)-(R)-HCQ, 2-(+)-(S)HCQ 3-(-)-(R)-DHCQ, 4-(+)-(S)-DHCQ, 5-(-)-(R)DCQ, 6-(+)-(S)-DCQ e 7-(+)-(S)-BDCQ, detecção em 343 nm. Modificado da referência 69 com permissão da Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Tabela 5

ração de enantiômeros neutros ou ionizados, empregando seletores quirais neutros ou carregados.

O uso desses sistemas vem crescendo e conferindo à eletroforese capilar um poder de resolução de enantiômeros ainda maior. O uso de CDs com surfactantes quirais[66], CDs com seletores quirais de troca de ligantes[67], CDs com antibióticos macrocíclicos[68] e CDs com éteres de coroa[60] também tem sido descritos na literatura. A Figura 8 mostra um eletroferograma da separação quiral da hidroxicloroquina e seus metabólitos, empregando uma mistura de ciclodextrina-β-sulfatada e 2-HP-β-CD[69]. A Tabela 5 apresenta algumas separações envolvendo sistemas mistos de seletores quirais.

4 Considerações finais O emprego da eletroforese capilar na análise enantiosseletiva de fármacos e metabólitos em diversas matrizes vem crescendo nas últimas décadas. A grande diversidade de seletores quirais torna possível a separação de compostos

Alguns exemplos de separações quirais empregando mistura de seletores quirais.

Analito

Seletor quiral

pH da solução tampão

Matriz

Ref.

Tramadol

CM-β-CD + M-β-CD

10,0

Urina

70

Carvedilol

succinil-β-CD + M-β-CD

3,0

Plasma

71

Tioridazina-5-sulfóxido

HP-β-CD + S-β-CD

3,0

Plasma

72

Efaroxan

DM-β-CD + CM-β-CD

3,0

Solução padrão

73

9-hidroxirisperidona

HP-β-CD + S-α-CD

2,5

Solução padrão

74

Citalopram, citadiol

S-β-CD + S-β-CD

2,5

Formulação farmacêutica

75

Propiconazol, fenbuconazol, tebuconazol

HP-γ-CD + SDS

3,0

Amostras de uvas

76

Ácido glicirretínico e derivados

β-CD + SC

8,5

Raiz de alcaçuz

77

Isoxantohumol

HP-γ-CD + SDS

7,0

Amostras de cervejas

78

S-β-CD, ciclodextrina-beta-sulfatada; HP-γ-CD, hidroxipropil-gama-ciclodextrina; CM-β-CD, carboximetil-beta-ciclodextrina; CE-β-CD, carboxietil-beta-ciclodextrina; DB-β-CD, dimetil-beta-ciclodextrina; β-CD, beta-ciclodextrina; HP-β-CD, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, S-α-CD, ciclodextrina-alfa-sulfatada; SDS, dodecilsulfato de sódio, SC, colato de sódio; M-β-CD, metil-beta-ciclodextrina.

242

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Análise enantiosseletiva por CE

De Oliveira, ARM

extremamente complexos com diferentes características físico-químicas, aumentando muito a seletividade da técnica. Além disso, o emprego de sistemas mistos aumenta ainda mais a possibilidade de resolução de enantiômeros, que, em outras técnicas, seria praticamente impossível.

Outros seletores como os líquidos iônicos quirais e a modalidade cromatografia eletrocinética quiral em microemulsão vem crescendo, aumentando ainda mais a diversidade de compostos que podem ser analisados. A grande limitação em análise enantiosseletiva por eletroforese capilar reside no alto preço de alguns seletores quirais, que aumenta o custo da análise.

8

Scriba GKE. Cyclodextrins in capillary electrophoresis enantioseparations – Recent developments and applications. Journal of Separation Science 2008; 1931:1991.

9

Chankvetadze B. Enantioseparations by using capillary electrophoretic techniques The story of 20 and a few more years. Journal of Chromatography A 2007; 1168:45. http://dx.doi.org/10.1016/j. chroma.2007.08.008

Referências

12 Fanali S. Enantioselective determination by capillary

1

2

3

Andersson T. Single-isomer drugs - True therapeutic advances. Clinical Pharmacokinetics 2004; 43:279.

PMid:15080761. http://dx.doi.org/10.2165/00003088200443050-00001 Waldeck B. Biological significance of the enantiomeric purity of drugs. Chirality 1993; 5:350. http://dx.doi. org/10.1002/chir.530050514 Williams RC, Riley CM, Sigvardson KW, Fortunak J, Ma P, Nicolas EC et al. Pharmaceutical development and specification of stereoisomers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 1998;17:917. http://dx.doi.org/10.1016/S0731-7085(98)00059-4

4

Tucker GT. Chiral switches. Lancet 2000; 355:1085. http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(00)02047-X

5

Branch S. Chiral Separation Techniques: A Practical Approach. 2th ed. Wiley-VCH; 2001.

6

Agranat I, Caner H, Caldwell J. Putting chirality to work: The strategy of chiral switches Nature Reviews Drug Discovery 2002; 1:753. http://dx.doi.org/10.1038/ nrd915

7

Santana FJM, Magalhães IRS, Da Fonseca P, Barth T, De Oliveira ARM. Analytical tools for the enantioselective analysis of drugs and metabolites. In: Lopes NP, Guaratini T, edtors. Analytical Chemistry for Pharmaceutical and Medical Sciences. Transworld Research Network; 2009. cap. 2, p. 19-49.

10 Wren SAC, Rowe RC. Theoretical aspects of chiral

separation in capillary electrophoresis. 1. Initial evaluation of a model. Journal of Chromatography 1992; 603:269. http://dx.doi.org/10.1016/00219673(92)85366-2 11 Vespalec RY. Principles of chiral separations by

free-solution electrophoresis. In: Van Eeckhaut A, Michotte Y, edtors. Chiral Separations by Capillary Electrophoresis. CRC Press; 2010. cap. 2, p. 23-46. electrophoresis with cyclodextrins as chiral selectors.

Journal of Chromatography A 2000; 875:89. http:// dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(99)01309-6 13 Blanco M, Valverde I. Choice of chiral selector for

enantioseparation by capillary electrophoresis. TRACTrends in Analytical Chemistry 2003; 22:428. http:// dx.doi.org/10.1016/S0165-9936(03)00705-2 14 Easton CJ, Lincoln SF. Chiral discrimination by

modified cyclodextrins. Chemical Society Reviews 1996; 25:163. http://dx.doi.org/10.1039/cs9962500163 15 Mikus P, Marakova K, Marak J, Nemec I, Valaskova I,

Havranek E. Enantioselective analysis of pheniramine in urine by charged CD-mediated CZE provided with a fiber-based DAD and an on-line sample pretreatment by capillary ITP. Electrophoresis 2007; 28:2738. PMid:17600843. http://dx.doi.org/10.1002/ elps.200600748 16 Glówka FK, Karazniewicz M. High performance

capillary electrophoresis for determination of the enantiomers of 2-arylpropionic acid derivatives in human serum - Pharmacokinetic studies of ketoprofen enantiomers following administration of standard and sustained release tablets. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2004; 35:807. PMid:15193725. http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2004.01.030 17 Gotti R, El-Hady DA, Andrisano V, Bertucci C, El-Maali

NA, Cavrini V. Determination of the chiral and achiral related substances of methotrexate by cyclodextrinmodified micellar electrokinetic chromatography.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247 243

De Oliveira, ARM

Electrophoresis 2004; 25:2830. PMid:15352016. http:// dx.doi.org/10.1002/elps.200405926

Biomedical Analysis 2008; 46:966. PMid:17606354. http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2007.05.022

18 De Pablos RR, Garcia-Ruiz C, Crego AL, Marina

26 Jabor VAP, Lanchote VL, Bonato PS. Enantioselective

ML. Separation of etodolac enantiomers by capillary electrophoresis. Validation and application of the chiral method to the analysis of commercial formulations.

Electrophoresis 2005; 26:1106. PMid:15765483. http:// dx.doi.org/10.1002/elps.200410097

analysis of ibuprofen in human plasma by anionic cyclodextrin-modified electrokinetic chromatography.

Electrophoresis 2002; 23:3041. http://dx.doi. org/10.1002/1522-2683(200209)23:17%3C3041::AIDELPS3041%3E3.0.CO;2-Q

19 Chiang MT, Chang SY, Wang CW. Chiral analysis of

27 Ywata YT, Inoue H, Kuwayama K, Kanamori T,

baclofen by alpha-cyclodextrin-modified capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. Electrophoresis 2001; 22:3281. http://dx.doi. org/10.1002/1522-2683(200101)22:1%3C123::AIDELPS123%3E3.0.CO;2-4 20 Toussaint

B, Palmer M, Chiap P. On-line coupling of partial filling-capillary zone electrophoresis with mass spectrometry for the separation of clenbuterol enantiomers.

Electrophoresis 2001; 22:1363. http://dx.doi. org/10.1002/1522-2683(200105)22:7%3C1363::AIDELPS1363%3E3.0.CO;2-Q

21 Gübitz G, Schmid MG. Recent progress in chiral

separation principles in capillary electrophoresis.

Electrophoresis 2000; 21:4112. http://dx.doi. org/10.1002/1522-2683(200012)21:18%3C4112::AIDELPS4112%3E3.0.CO;2-T 22 De Boer T, De Zeeuw RA, De Jong GJ, Ensing

K. Recent innovations in the use of charged cyclodextrins in capillary electrophoresis for chiral separations in pharmaceutical analysis. Electrophoresis 2000; 21:3220. http://dx.doi.org/10.1002/15222683(20000901)21:15%3C3220::AIDELPS3220%3E3.0.CO;2-X 23 Juvancz Z, Jicsinszky L, Markides KE. Phosphated

cyclodextrins as new acidic chiral additives for capillary electrophoresis. Journal of Microcolumn Separation 1997; 9:581. http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1520667X(1997)9:8%3C581::AID-MCS1%3E3.0.CO;2-Y 24 Cucinotta V, Contino A, Giuffrida A, Maccarrone

G, Messina M. Application of charged single isomer derivatives of cyclodextrins in capillary electrophoresis for chiral analysis. Journal of Chormatography A 2010; 1217:953. PMid:20022327. http://dx.doi. org/10.1016/j.chroma.2009.11.094 25 Musenga A, Mandrioli R, Morganti E, Fanali S, Raggi

MA. Enantioselective analysis of amisulpride in pharmaceutical formulations by means of capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and

244

Análise enantiosseletiva por CE

Tsujikawa K, Miyaguchi K et al. Forensic application of chiral separation of amphetamine-type stimulants to impurity analysis of seized methamphetamine by capillary electrophoresis. Forensic Science International 2006; 161:92. PMid:16870377. http:// dx.doi.org/10.1016/j.forsciint.2006.01.018 28 Mandrioli R, Pucci V, Sabbioni C, Bartoletti C,

Fanali S, Raggi MA. Enantioselective determination of the novel antidepressant mirtazapine and its active demethylated metabolite in human plasma by means of capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 2004; 1051:253. PMid:15532581. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2004.05.020 29 De

Santana FJM, Lanchote VL, Bonato PS. Capillary electrophoretic chiral determination of mirtazapine and its main metabolites in human urine after enzymatic hydrolysis.

Electrophoresis 2008; 29:3924. PMid:18850661. http://dx.doi.org/10.1002/elps.200800053

30 Horstkötter

C, Blaschke G. Stereoselective determination of ofloxacin and its metabolites in human urine by capillary electrophoresis using laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B 2001; 754:169. http://dx.doi. org/10.1016/S0378-4347(00)00595-8

31 Marak J, Mikus P, Marakova K, Kaniansky D,

Valaskova I, Havranek E. Enantioselective analysis of pheniramine in urine by charged CD-mediated CZE provided with a fiber-based DAD and an on-line sample pretreatment by capillary ITP. Electrophoresis 2007; 28:2738. PMid:17600843. http://dx.doi. org/10.1002/elps.200600748 32 Chou

YW, Huang WS, Ko CC, Chen SH. Enantioseparation of cetirizine by sulfated-betacyclodextrin-mediated capillary electrophoresis Journal of Separation Science 2008; 28:3542.

33 Bunke A, Jira T. Chiral capillary electrophoresis using

a cationic cyclodextrin. Pharmazie 1996; 51:672.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Análise enantiosseletiva por CE

De Oliveira, ARM

34 Bunke A, Jira T. Use of cationic cyclodextrin for

44 Hou J, Zheng J, Shamsi SA. Separation and

enantioseparation by capillary electrophoresis.

Journal of Chromatography A 1998; 798:275. http:// dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(97)01197-7

determination of warfarin enantiomers in human plasma using a novel polymeric surfactant for micellar electrokinetic chromatography-mass spectrometry.

Journal of Chromatography A 2007; 1159:208. http:// dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2007.04.037

35 Liu Q, Inoue T, Kirchhoff JR, Huang C, Tillekeratne

LMV, Olmstead K et al. Chiral separation of highly negatively charged enantiomers by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 2004; 1033:349. PMid:15088757. http://dx.doi. org/10.1016/j.chroma.2004.01.023 36 Van Eeckhaut A, Michotte Y. Chiral separations by capillary

electrophoresis: Recent developments and applications.

Electrophoresis 2006; 27:2880. PMid:16688697. http:// dx.doi.org/10.1002/elps.200500375 37 Tanaka Y, Terabe S. Enantiomer separation of acidic

racemates by capillary electrophoresis using cationic and amphoteric beta-cyclodextrins as chiral selectors.

Journal of Chromatography A 1997; 781:151. http:// dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(97)00489-5

45 Peng XJ, Sternberg E, Dolphin D. Chiral separation

of benzoporphyrin derivative mono- and diacids by laser induced fluorescence-capillary electrophoresis.

Electrophoresis 2002; 23:93. http://dx.doi. org/10.1002/1522-2683(200201)23:1%3C93::AIDELPS93%3E3.0.CO;2-H 46 Nishi H, Fukuyama T, Matsuo M, Terabe S. Chiral

separation of diltiazem, trimetoquinol and related compounds by micellar electrokinetic chromatography with bile salts. Journal of Chromatography A 1990; 515:133. http://dx.doi.org/10.1016/S00219673(01)89318-3 47 Peterson AG, Ahuja ES, Foley JP. Enantiomeric

Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries. Analytical Chemistry 1984; 56:111. http://dx.doi.org/10.1021/ac00265a031

separations of basic pharmaceutical drugs by micellar electrokinetic chromatography using a chiral surfactant, N-dodecoxycarbonylvaline. Journal of Chromatography B 1996; 683:15. http://dx.doi. org/10.1016/0378-4347(96)00188-0

39 Gübitz G, Schmid MG. Chiral separation by

48 Armstrong DW, Rundlett K, Reid III GL. Use

38 Terabe S, Otsuka K, Ichikawa K, Tsuchya A, Ando T.

capillary electromigration techniques. Journal of Chromatography A 2008; 1204:140. http://dx.doi. org/10.1016/j.chroma.2008.07.071 40 Otsuka K, Terabe S. Enantiomer separation of drugs

by micellar electrokinetic chromatography using chiral surfactants. Journal of Chromatography A 2000; 875:163. http://dx.doi.org/10.1016/S00219673(99)01167-X 41 Dey J, Ghosh A. Chiral separations by micellar

electrokinetic chromatography. In: Van Eeckhaut A, Michotte Y, edtors. Chiral Separations by Capillary Electrophoresis. CRC Press; 2010. cap. 8, p. 195-234.

42 Rizvi SAA, Zheng J, Apkarian RP, Dublin SN, Shamsi

SA. Polymeric sulfated amino acid surfactants: A class of versatile chiral selectors for micellar electrokinetic chromatography (MEKC) and MEKC-MS. Analytical Chemistry 2007; 79:879. http://dx.doi.org/10.1021/ ac061228t 43 Hefnawy

MM, Micellar electrokinetic capillary chromatography determination of (+)S and (-)R arotinolol in serum using UV detection and solid phase extraction. Chirality 2002; 14:67. PMid:11748803. http://dx.doi.org/10.1002/chir.888

of a macrocyclic antibiotic, rifamycin B, and indirect detection for the resolution of racemic amino alcohols by CE. Analytical Chemistry 1994; 66:1690. PMid:8030783. http://dx.doi.org/10.1021/ ac00082a015 49 Fanali S, Aturki Z, D’Orazio G, Rocco A. Macrocyclic

antibiotics as chiral selectors. In: Van Eeckhaut A, Michotte Y, edtors. Chiral Separations by Capillary Electrophoresis. CRC Press; 2010. cap. 5, p. 109-137.

50 Prokhorova AF, Shapovalova EN, Shpigun OA.

Chiral analysis of pharmaceuticals by capillary electrophoresis using antibiotics as chiral selectors.

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2010; 53, 1170. PMid:20675089. http://dx.doi. org/10.1016/j.jpba.2010.07.005 51 Desiderio C, Porcaro CM, Padiglioni P, Fanali S.

Enantiomeric separation of acid herbicides by capillary electrophoresis using vancomycin as chiral selector. Journal of Chromatography A 1997; 781:503. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(97)00586-4 52 Hui F, Ekborg-Ott KH, Armstrong DW. High-

performance liquid chromatography and capillary electrophoretic separation of plant growth regulators and related indole compounds using

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247 245

De Oliveira, ARM

Análise enantiosseletiva por CE

macrocyclic antibiotics as chiral selectors. Journal of Chromatography A 2001; 906:91. http://dx.doi. org/10.1016/S0021-9673(00)00954-7 53 Ward TJ, Dann III C, Brown AP. Separation of

of drugs, metabolites, and biomarkers in biological samples. Electrophoresis 2009; 30:2773. PMid:19653234. http://dx.doi.org/10.1002/elps.200900173

enantiomers using vancomycin in a countercurrent process by suppression of electroosmosis. Chirality 1996; 8:77. http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1520636X(1996)8:1%3C77::AID-CHIR13%3E3.0.CO;2-P

62 Haginaka J. Enantiomer separation of drugs by

54 Armstrong DW, Rundlett KL. CE resolution of neutral

63 Haginaka J. Chiral separations using proteins and

and anionic racemates with glycopeptides antibiotics and micelles. Journal of Liquid Chromatography 1995; 18:3659. PMCid:1176066. http://dx.doi. org/10.1080/10826079508014617 55 Arai T, Nimura N, Kinoshita T. Investigation of

enantioselective separation of quinolonecarboxylic acid by capillary zone electrophoresis using vancomycin as chiral selector. Journal of Chromatography A 1996; 736:303. http://dx.doi. org/10.1016/0021-9673(95)01368-7 56 Bednar P, Aturki Z, Stransky Z, Fanali F. Chiral

analysis of UV nonabsorbing compounds by capillary electrophoresis using macrocyclic antibiotics. 1.

Separation of aspartic and glutamic acid enantiomers.

Electrophoresis 2001; 22:2129. http://dx.doi. org/10.1002/1522-2683(20017)22:11%3C2129::AIDELPS2129%3E3.0.CO;2-J 57 Ward TJ, Dann III C, Blaylock A. Enantiomeric

resolution using the macrocyclic antibiotics rifamycin B and rifamycin SV as chiral selectors in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 1995; 715:337. http://dx.doi.org/10.1016/00219673(95)00608-P 58 Gasper MP, Bethod A, Nair UB, Armstrong DW.

Comparison, modeling study of vancomycin, ristocetin A, and teicoplanin for CE enantioseparations.

Analytical Chemistry 1996; 68:2501. PMid:8694258. http://dx.doi.org/10.1021/ac960154q 59 Fanali F, Desiderio C. Use of vancomycin as chiral

selector in capillary electrophoresis. Optimization and quantitation of loxiglumide enantiomers in pharmaceuticals. Journal of High Resolution Chromatography 1996; 19:322. http://dx.doi. org/10.1002/jhrc.1240190604 60 Kuhn

Enantiomeric separation by capillary electrophoresis using crown ether as chiral selector.

Electrophoresis 1999; 20:2605. http://dx.doi.org/10.1002/ (SICI)1522-2683(19990901)20:13%3C2605::AIDELPS2605%3E3.0.CO;2-M

246

61 Mikus P, Marakova K. Advanced CE for chiral analysis

R.

capillary electrophoresis using proteins as chiral selectors. Journal of Chromatography A 2000; 875:235. http://dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(99)01168-1 peptides as chiral selectors. In: Van Eeckhaut A, Michotte Y, edtors. Chiral Separations by Capillary Electrophoresis. CRC Press; 2010. cap. 6, p. 139-161.

64 Servais A-C, Crommen J, Fillet M. Factors influencing

cyclodextrin-mediated chiral separations. In: Van Eeckhaut A, Michotte Y, edtors. Chiral Separations

by Capillary Electrophoresis. CRC Press; 2010. cap. 7, p. 87-107.

65 Fillet M, Hubert P, Crommen J. Enantiomeric

separations of drugs using mixtures of charged and neutral cyclodextrins. Journal of Chromatography A 2000; 875:123. http://dx.doi.org/10.1016/S00219673(00)00084-4 66 Terabe S, Miyashita Y, Shibata O, Barnhart ER,

Alexander LR, Patterson DG et al. Separation of highly hydrophobic compounds by ciclodextrinsmodified micellar electrokinetic chromatography.

Journal of Chromatography A 1990; 516:23. http:// dx.doi.org/10.1016/S0021-9673(01)90201-8 67 Jira T, Bunke A, Karbaum A. Use of chiral and

achiral ion-pairing reagents in combination with cyclodextrins in capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 1998; 798:281. http://dx.doi. org/10.1016/S0021-9673(97)01168-0 68 Dai R, Nie X, Li H, Saeed MK, Deng Y, Yao, G.

Investigation of beta-CD-derivatized erythromycin as chiral selector in CE. Electrophoresis 2007; 28:2566. PMid:17577196. http://dx.doi.org/10.1002/ elps.200600651 69 De

Oliveira ARM, Cardoso CD, Bonato PS. Stereoselective determination of hydroxychloroquine and its metabolites in human urine by liquid-phase microextraction and CE. Electrophoresis 2007; 28:1081. PMid:17295421. http://dx.doi.org/10.1002/ elps.200600420

70 Soetebeer UB, Schierenberg MO, Schulz H, Andresen

P, Blaschke G. Direct chiral assay of tramadol and detection of the phase II metabolite O-demethyl tramadol glucuronide in human urine using capillary

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247

Anรกlise enantiosseletiva por CE

electrophoresis with laser-induced native fluorescence detection. Journal of Chromatography B 2001; 765:3. http://dx.doi.org/10.1016/S0378-4347(01)00366-8 71 Benh F, Michels S, Laer S, Blaschke J. Separation of

carvedilol enantiomers in very small volumes of human plasma by capillary electrophoresis with laserinduced fluorescence. Journal of Chromatography B 2001; 755:111. http://dx.doi.org/10.1016/S03784347(01)00045-7 72 Masetto de Gaitani C, Martinez AS, Bonato PS.

Study on thioridazine 5-sulfoxide epimerization and degradation by capillary electrophoresis.

Electrophoresis 2003; 24:2723. PMid:12900889. http:// dx.doi.org/10.1002/elps.200305480 73 Lorin M, Delepee R, Morin P, Ribet JP. Quantification

of very low enantiomeric impurity of efaroxan using a dual cyclodextrin system by capillary electrophoresis.

Analytica Chimica Acta 2007; 592:139. PMid:17512818. http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2007.04.018 74 Danel C, Chaminade P, Odou P, Bartemely, Azarzar

D, Bonte JP et al. Enantioselective analysis of the antipsychotic 9-hydroxyrisperidone, main metabolite of risperidone, by chiral capillary EKC using dual CDs. Electrophoresis 2007; 28:2683. PMid:17600845. http://dx.doi.org/10.1002/elps.200600837

De Oliveira, ARM

the simultaneous determination of impurities of escitalopram including the R-enantiomer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2008; 46, 959.

PMid:17629435.

http://dx.doi.org/10.1016/j.

jpba.2007.05.029 76 Wan Ibrahim WA, Hermawan D, Sanagi MM.

On-line preconcentration and chiral separation of

propiconazole

by

cyclodextrin-modified

micellar electrokinetic chromatography. Journal of Chromatography A 2007; 1170:107. PMid:17915239. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2007.09.003 77 Cai J, Li P. Chemical separation of bioactive licorice

compounds using capillary electrophoresis. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies 2007;

30:2805.

PMCid:1176066.

http://dx.doi.

org/10.1080/10826070701588489 78 Kodama S, Yamamoto A, Sato A, Suzuki K,

Yamashita T, Kemmei, T et al. Enantioseparation of isoxanthohumol in beer by hydroxypropyl-gammacyclodextrin-modified

micellar

electrokinetic

chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2007; 55:6547.

75 Sungthong B, Jac P, Scriba GKE. Development and

Recebido: 14/07/2011

validation of a capillary electrophoresis method for

Aceito: 01/08/2011

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):231-247 247

No Compromises It's finally possible to have speed, accuracy, and resolution in a single instrument and at the same time

High Resolution TOFMS (HRT) Acquisition speeds up to 200 spectra/second • Dynamic range of 4 orders magnitude or more • Mass resolution up to 100,000 FWHM • Mass accuracy less than 1 ppm • Accurate isotopic abundance • ChromaTOF-HRT™ software with Automated Peak Find and True Signal Deconvolution® for seamless data handling

Citius™ LC-HRT [Shown here] Offers the versatility of ESI, APCI, and DESI (desorption electrospray) ionization source options, all capable of in-source CID (isCID).

Pegasus® GC-HRT [Not shown] This high performance mass spectrometer offers the ultimate GCMS solution. Accurate mass data provides information for confident identification and is compatible with the NIST Library.

GCMS | GCxGC-MS | GCxGC | LCGC

Years of Delivering the Right Results Tel.: 21-2538-4250 | leco@lecobrasil.com.br | www.leco.com | © 2011 LECO Corporation

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261 Instituto Internacional de Cromatografia

QUALIDADE

DOI: 10.4322/sc.2011.015 ISSN 1984-4433

Desvendando a medição nos ensaios químicos: 1. A curva analítica ou de calibração Oscar Bahia Filho1,*, Patrícia Regina Prada2, Carla Meneghesso2, Fernando Mauro Lanças2 TQW Consultoria em Química e Qualidade e-mail: oscarbfilho@terra.com.br 2 Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo Cep 13560-970, São Carlos, SP, Brasil 1

Resumo Nos ensaios químicos, o modelo matemático utilizado como base de quantificação é o responsável pela transformação de uma unidade de medida na unidade de quantificação de interesse. Por tratar de uma série de operações, a possibilidade de propagação de erros é preocupante e, nesse sentido, a confiabilidade de todas essas operações deve ser estabelecida e conhecida. O presente trabalho, o primeiro de uma série, visa discutir a contribuição da etapa de construção da curva analítica ou de calibração no processo do ensaio com base na sua estimativa da incerteza conforme preconizado pelas diretrizes das normas ISO e BPL. A aplicação desses conceitos culminou na elaboração de um procedimento operacional e foi aplicado na determinação de fluazuron em tecidos animais por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS).

Palavras-chave Estimativa da incerteza; curva de calibração ou analítica; HPLC; sistema de gestão da qualidade; ISO 17025; BPL.

Unraveling measurement in chemical analysis: 1. The analytical or calibration curve Abstract In a typical quantitative chemical analysis, the mathematical model used for the quantification process is responsible for the transformation of a measured unit into the quantity of interest. Once dealing with a series of operations, the possibility of propagation of errors is a real concern; the trustworthiness of all these operations must be well established and be known. The present work, the first one of a series, aims to present and discuss the contribution of the stage of construction of the analytical or calibration curve in the process of the assay by estimating its uncertainty based upon the ISO 17025 and GLP guidelines. The application of these concepts culminated in the elaboration of an operational procedure that was applied to the determination of fluazuron in animal tissues using liquid chromatography coupled to mass spectrometer (LC-MS/MS).

Keywords Measurement uncertainty; analytical or calibration curve; HPLC; LC-MS/MS; quality system management; ISO 17025; GLP guidelines.

Bahia Filho O

1 Introdução A internacionalização do mercado, aliada à adoção crescente das regras de mercado justo, trouxeram para as empresas de produtos e de serviços dois importantes parâmetros: a comparabilidade e a rastreabilidade[1,2]. Ambos os termos, hoje bastante comuns, fazem parte de um trabalho sistemático e organizado, geralmente controlado por um sistema que busca constância e diferenciação no que a organização produz ou oferece. A manutenção da constância dos produtos ou serviços está associada à ideia de garantia da qualidade resultante da aplicação do sistema de gestão, denominado sistema de gestão da qualidade (SGQ). Já a diferenciação está associada à conquista ou domínio de segmento do mercado.

Como os negócios são quase sempre baseados em quantificação, a confiabilidade da medição é um ponto nevrálgico. Desta forma, em algum momento do processo, deve haver pelo menos uma etapa responsável pela medida de uma determinada característica do produto ou serviço que caracteriza sua especificação antes da sua comercialização. Tal etapa é denominada de controle da qualidade. Para assegurar que todas as atividades deste controle sejam executadas em conformidade com procedimentos definidos, são realizadas ações que garantam a sua qualidade. Via de regra, a etapa do controle da qualidade é feita utilizando equipamentos que são responsáveis pelas medições inerentes; consequentemente, para fins de comparabilidade, este deve estar calibrado em relação a um padrão de referência.

A garantia da confiabilidade da medição é baseada em quatro parâmetros: (i) procedimentos operacionais padrão (POPs ou SOPs), que devem ser conduzidos por (ii) pessoal habilitado utilizando (iii) equipamentos calibrados instalados ou mantidos em (iv) local e condi252

Desvendando a medição nos ensaios químicos

ções ambientais adequadas[3]. Como todo SGQ é elaborado para atender a critérios específicos de um escopo, ou faixa de cobertura, as organizações utilizam as diretrizes das normas de gestão ABNT NBR ISO/IEC 17025[4], ABNT NBR ISO 9001[5] e das Boas Práticas de Laboratório[6] (BPL ou GLP) para estabelecer a confiabilidade e adequabilidade de seus produtos ou serviços, no que se refere ao item equipamentos.

Embora as diretrizes destas diferentes normas sejam direcionadas a aspectos diferentes da conformidade da qualidade, a calibração, nas três, é citada de maneira a atender a cada uma delas. Enquanto a ISO 17025 tem foco no cliente e é usada para atestar a competência da empresa em realizar ensaios em escopos definidos, a ISO 9001, também com foco no cliente, é usada para garantir a conformidade de um produto. Já a BPL visa atender à legislação pertinente, e é usada para descrever a condução de estudos específicos. Para a ISO 17025, este assunto é tratado no item 5.5; já para a ISO 9001 o mesmo assunto é apresentado no item 7.6 e na BPL no item 4.

O elemento da norma ISO 17025 no item 5.5, de forma geral, estabelece que devem existir programas de calibração para os instrumentos críticos antes de serem colocados em uso e que o certificado de calibração deve ser avaliado criticamente quanto à tolerância do instrumento na faixa especificada. Quando em uso, se um determinado equipamento produzir resultados de ensaios suspeitos ou fora das especificações, este deverá ser claramente marcado como fora de serviço até que a causa do desvio seja identificada e seja demonstrado por meio de calibração ou verificação que o equipamento encontra-se em condições adequadas de uso. No caso em que um equipamento saia do controle direto da organização, verificações devem ser utilizadas para garantir que o equipamento continue funcionando de maneira correta.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261

Desvendando a medição nos ensaios químicos

A ISO 9001 define, no item 7.6, que, para assegurar resultados válidos, os equipamentos devem ser calibrados e/ou verificados de forma periódica ou antes do uso. Recomenda que estas calibrações/verificações sejam feitas contra padrões de medição rastreáveis a padrões internacionais, mas permite o uso de padrões não rastreáveis, desde que não exista um padrão de medição de referência e seja registrada qual foi a base de comparação utilizada. É necessário manter os registros dos resultados de calibração e verificação bem como a avaliação destes dados, que devem ser analisados conforme critérios previamente definidos. A organização deve ter, ainda, mecanismos para identificar rapidamente a necessidade de ajuste ou reajuste no equipamento, para que possa tomar as ações apropriadas.

Já as diretrizes preconizadas pelo documento normativo BPL trata a calibração de forma mais abrangente que os documentos ISO. A norma NIT-DICLA-035, que rege os Princípios das Boas Práticas de Laboratório, estabelece que os equipamentos utilizados em um estudo devem ser periodicamente inspecionados, ter programas de manutenção e calibração de acordo com procedimentos, e os registros destas atividades devem ser mantidos. A preocupação desta abordagem é impedir que equipamentos críticos não calibrados interfiram adversamente com os sistemas teste.

O termo comum nas três normas é que todos os equipamentos críticos devem ser calibrados e periodicamente verificados antes dos ensaios.

Contudo, não está claro o período entre as calibrações, nem os mecanismos de verificação periódica da calibração. Entretanto, para assegurar a confiabilidade da medida, a calibração dos equipamentos críticos é apenas um dos parâmetros, embora seja o parâmetro de partida. Assim, se pode tomar a seguinte premissa: toda medida

Bahia Filho O

obtida com equipamentos calibrados tem maior probabilidade de ser confiável, enquanto que, se essa for feita em equipamentos não calibrados, a medida dificilmente será confiável. Assim, o ponto de partida para uma medida confiável e comparável é utilizar equipamentos calibrados.

Aqui cabe salientar que se pode dividir as medidas em dois grupos[7]: no primeiro, as medições são diretas, isto é, o resultado do equipamento é dado na mesma unidade da medida do mensurando, por exemplo, a medida da espessura de peça utilizando um paquímetro. No segundo, as medidas são indiretas, ou seja, o resultado do equipamento deve ser transformado para a unidade de interesse, por exemplo, o teor de ferro em uma formulação farmacêutica utilizando um procedimento de mineralização do comprimido e, posteriormente, a medida em um espectrômetro de absorção atômica. Este último é representado pela quase totalidade dos ensaios químicos.

Como a medição nos ensaios químicos é indireta, a transformação da medida do equipamento na unidade de interesse do mensurando é feita utilizando uma comparação direta de uma série de soluções padrão de concentração conhecidas contra os valores medidos, seguida de transformações matemáticas até a obtenção do resultado final. A essa relação estabelecida, se dá o nome de curva de calibração ou curva analítica. Entretanto, o equipamento utilizado para estabelecer esta relação deve, segundo as diretrizes das normas, ser calibrado. Assim, para garantir a confiabilidade da medida, o SGQ deve considerar a incerteza herdada da calibração do equipamento e somar as incertezas da faixa da curva analítica oriunda do modelo matemático e a incerteza oriunda da preparação das concentrações das soluções padrão da curva analítica. É importante frisar que para garantir a confiabilidade do resultado do ensaio, deve-se conhecer as incertezas do processo como um todo, e que a

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261 253

Bahia Filho O

construção da curva analítica ou de calibração é apenas uma das etapas.

O presente artigo visa propor uma discussão acerca da definição das variáveis críticas inerentes à construção da curva analítica e seus controles para dar maior segurança na expressão das medidas e que possam estar em conformidade com as três normas citadas.

2 Experimental e resultados Das três normas referenciadas, a ISO 17025 é a mais restritiva no que se refere à calibração dos equipamentos e à confiabilidade do método ou procedimento utilizado, por tratar dos requisitos gerais para a competência da organização na condução de ensaios e/ou calibração do escopo de interesse. Os elementos da norma estabelecem que o método do ensaio/calibração seja normalizado ou que se deve estabelecer regras para validação do método quando não normalizado ou estiver sendo utilizado fora das condições em que foi validado.

Se o procedimento de validação do método for conduzido seguindo diretrizes[8] e se os experimentos tiverem sido planejados, pode-se utilizar os resultados obtidos para estimar a incerteza da medida. Neste sentido, duas classes de fatores podem influenciar a estimativa da incerteza da medida, os fatores indiretos representados principalmente pela infraestrutura da organização e a qualificação do pessoal; e os fatores diretos representados pela (i) representatividade e integridade da amostra no que tange a retirada e transporte até o local do ensaio e sua manipulação, pelo (ii) método do ensaio, pelas (iii) substâncias ou materiais de referência e pelo (iv) equipamento utilizado na construção da curva analítica.

254

Desvendando a medição nos ensaios químicos

A confiabilidade da medida inclui: (i) a calibração do instrumento, (ii) a tolerância do ensaio e (iii) a frequência das verificações periódicas. Assim, o que é conhecido como curva de calibração ou curva analítica se constitui para a norma em um conjunto de operações que representam a verificação da manutenção da calibração do instrumento entre períodos de calibração, que é denominado de qualificação instrumental ou conformidade do sistema quando o equipamento é um conjunto de instrumentos. Como as soluções padrão diluídas são preparadas, é necessária a confirmação das operações de preparo delas no estabelecimento da curva de calibração. Assim, é comum utilizar substâncias de referência de diferentes lotes ou fabricantes e utilizar uma delas para estabelecer a curva analítica e outra como amostra de controle. Alternativamente, é recomendada a utilização de amostra-testemunha ou matriz com adição de concentração conhecida, em um lote pré-definido de amostras e submetê-la a todas as etapas do ensaio e os resultados dessa amostra controle são mostrados em carta controle[9].

2.1 Estabelecendo a exatidão da calibração No processo analítico, o equipamento responsável pela medida da resposta de interesse deve estar calibrado, isto é, o seu erro em relação a um padrão de referência deve ser estabelecido. O erro obtido, somado à incerteza padrão do procedimento de calibração, resulta na tolerância do equipamento. Como regra, a tolerância do equipamento deve ser menor que a tolerância do processo. O cálculo da tolerância do equipamento e sua comparação com a tolerância do processo constituem o que nas normas ISO é chamado de análise crítica do certificado de calibração. Já a incerteza padrão do certificado de calibração, a ISO 9001 denomina de incerteza Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261

Desvendando a medição nos ensaios químicos

herdada. Uma importante consideração, nem sempre seguida, é que o erro utilizado no cálculo deve ser do ponto de calibração mais próximo da medida a ser efetuada.

2.2 Estabelecendo a precisão da operação em termos da incerteza Para a construção da curva de calibração ou analítica, uma série de soluções padrão em concentrações crescentes deve ser preparada para ser medida. Via de regra, para esta operação, é tomada uma massa ou volume da substância de referência e avolumada com um solvente.

Posteriormente, são tomadas várias alíquotas dessa solução padrão estoque e diluídas na proporção desejada. As soluções padrão diluídas são então submetidas à medida, geralmente em triplicata. A estimativa da incerteza deve levar em conta a exatidão dos equipamentos utilizados nesta etapa, como balança, recipientes volumétricos, por exemplo, e a precisão da operação de seu uso, como preenchimento do balão volumétrico, tomada de massa.

As concentrações esperadas contra as concentrações obtidas são submetidas a uma equação polinomial para obtenção de um modelo matemático que represente a curva de calibração.

2.3 Parâmetros para avaliação dos estimadores da curva de calibração ou curva analítica Antes da construção da curva é aconselhável aplicar o teste de Grubbs e o teste de Cochran no conjunto de medidas obtidas. Tais testes devem ser aplicados para avaliar a ausência de valores discrepantes para cada nível de concentração e a homocedasticidade dos dados, respectivamente.

Como as concentrações das soluções padrão trazem uma propagação de erros, desde a concentração da substância de referência até a pre-

Bahia Filho O

paração das soluções padrão diluídas propriamente ditas, as concentrações esperadas não são exatas. Assim, não é razoável usar interpolação, ou seja, exigir que os resultados satisfaçam exatamente os valores esperados. Desta forma, em vez de recorrer a um polinômio que passe exatamente por todos os pares de valores (xi, f(xi)),

i = 0,...,n), a melhor abordagem será ajustar a função, g(x), o mais próximo possível dos pontos (xi, f(xi)), i = 0,...,n). O modelo mais simples que relaciona as variáveis x (concentração) e y (resposta) é dada pela equação de uma reta expressa pela equação: y = β0 + β1 x (1)

onde β0 e β1 são os parâmetros do modelo.

A concentração xi é denominada valor da variável explicativa ou independente e a imagem de xi pela reta y = β0 + β1x é chamado de valor predito, ^yi, e yi é o valor da variável resposta ou dependente. A diferença entre yi e ^yi é o desvio representado pela distância vertical do ponto à linha reta. Quando se considera a soma dos quadrados dos desvios, obtém-se uma medida do desvio total dos pontos observados à reta estimada.

Um modo de estimar os coeficientes β0 e β1 é determinar o mínimo da função D (β0 e β1) em relação a β0 e β1. Tal modo é conhecido como método dos mínimos quadrados, uma vez que se quer minimizar uma função quadrática. Assim, a melhor reta usando o método dos mínimos quadrados que melhor se ajusta aos dados do diagrama de dispersão é dada por: y = a + bx (2)

onde o estimador b, denominado coeficiente angular, representa a inclinação da curva e o estimador a, denominado coeficiente linear, representa a interseção da reta no eixo y.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261 255

Bahia Filho O

Desvendando a medição nos ensaios químicos

O valor dos estimadores a e b são calculados usando as equações a seguir: b=

a=

n∑ ( xi yi ) − ∑ xi ∑ yi n∑ ( xi ) − ∑ xi 2

∑ yi − b ∑ xi n

Soma quadrada dos erros (resíduos) (8)

(3)

Soma quadrada da regressão (9)

(4)

onde n representa o número de pontos ou níveis das soluções padrão.

O coeficiente de determinação (R2) que é uma maneira de medir a qualidade do ajuste linear, é dado por:

2.3.2 Desvio padrão da curva O desvio padrão da curva de calibração ou curva analítica, DPcurva, é dada por:

2

n  n  1 n  ∑ xi yi − ∑ xi ∑ yi  n i =1 i =1   i =1 (5) R2 = 2  2  n n n n      ∑ x2 − 1  ∑ x   ∑ y2 − 1  ∑ y    i =1 i n  i =1 i    i =1 i n  i =1 i     

com 0 ≤ R2 ≤ 1 e quanto mais próximo da unidade, melhor é o ajuste.

Finalmente, os resíduos do modelo são calculados por:

(10)

onde b é a inclinação da reta, n representa o número de níveis da curva, p o número de repetições da medida, Y é a concentração média espe^ rada e Y é a concentração média predita, DPx,y e DPx,x representam os desvios padrão dos desvios dados por:

(6)

2.3.1 Teste de hipóteses para a curva Para garantir que o modelo reduzido pode ser utilizado, ao invés do completo, deve ser provado que o valor do estimador a seja equivalente a zero com grau de confiança estabelecido. O teste de hipótese estabelecido é H0: a = 0 e H1: a ≠ 0.

Para que a H0 seja verdadeira, a Soma Quadrada dos Erros (SQE) deve ser menor ou igual à Soma Quadrada da Regressão (SQR).

Caso contrário, rejeita-se H0. As somas quadradas são dadas por: Soma quadrada total n

SQT = ∑ ( yi − Y )2 (7) i =1

256

(11)

onde N = p × n.

DPx , x = ∑ (xi − X )2 (12)

2.3.3 Estimativa da incerteza da curva No cálculo da estimativa da incerteza da curva de calibração ou analítica, é levada em consideração a incerteza padrão associada ao preparo das soluções padrão diluídas e do modelo matemático, sendo possível analisar as contribuições individuais. A incerteza padrão combinada é dada por: (13)

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261

Desvendando a medição nos ensaios químicos

Bahia Filho O

centração foi medido em triplicata. Os resultados

3 Procedimento operacional padrão

foram submetidos ao teste de Grubbs e os resulNo Laboratório de Cromatografia - CROMA da USP de São Carlos foi elaborado um procedimento operacional padrão que teve como objetivo estabelecer a contribuição da incerteza da curva analítica ou de calibração sobre a medida do ensaio. A seguir, é descrito e comentado um exemplo de como foi aplicado este procedimento na determinação de fluazuron em tecidos animais por HPLC-MS/MS.

tados são mostrados na Tabela 1.

Os resultados de Gcalculado foram menores que

Gcrítico, em todos os casos estudados; portanto,

não há valores discrepantes no conjunto. Desta forma, todos os valores devem ser usados.

3.2 Teste de Cochran O mesmo conjunto de dados foi utilizado

para o teste de Cochran. Os resultados são mos-

3.1 Teste de Grubbs

trados na Tabela 2.

Os resultados de Ccalculado foram menores que

Foram preparados seis níveis de concentração do analito fluazuron a partir de diluições sucessivas de uma solução padrão estoque obtida da substância de referência. Cada nível de con-

Ccrítico, em todos os casos estudados e, portanto,

as variâncias dos resultados são homogêneas, mostrando a homocedasticidade entre os dados.

Tabela 1 Teste de Grubbs para as medidas das soluções padrão diluídas de fluazuron.

Medida 1

Medida 2

Medida 3

Média

Desvio padrão

Gmedida1

Gmedida2

Gmedida3

Nível 1

27,0

25,5

27,3

26,6

1,0

0,415

-1,141

0,726

Nível 2

55,5

56,9

57,3

56,6

1,0

-1,134

0,378

0,756

Nível 3

116,5

119,7

118,7

118,3

1,7

-1,091

0,873

0,218

Nível 4

255,5

242,1

236,6

244,7

9,7

1,107

-0,270

-0,837

Nível 5

378,6

385,8

382,2

382,2

3,6

-1,000

1,000

0,000

Nível 6

468,8

461,6

458,0

462,8

5,5

1,091

-0,218

-0,873

Para n = 6 e 95% de confiança, o valor máximo permitido de G é 1,887.

Tabela 2 Teste de Cochran para as medidas das soluções padrão diluídas de fluazuron.

Medida 1

Medida 2

Medida 3

Média

Desvio padrão

Variância

Nível 1

27,0

25,5

27,3

26,6

1,0

0,8

Nível 2

55,5

56,9

57,3

56,6

1,0

0,1

Nível 3

116,5

119,7

118,7

118,3

1,7

0,6

Nível 4

255,5

242,1

236,6

244,7

9,7

17,2

Nível 5

378,6

385,8

382,2

382,2

3,6

4,3

468,8

461,6

458,0

462,8

5,5

6,3

Nível 6

Para p = 3 e n= 6 (95%), o Ccrítico = 0,616.

∑

Ccalculado

0,5858

29,3

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261 257

Bahia Filho O

Desvendando a medição nos ensaios químicos

3.3 Estimativa da incerteza do preparo das soluções padrão diluídas A Figura 1 mostra as etapas críticas do processo de preparação das soluções diluídas, bem como as fontes de incerteza. Para a estimativa da incerteza padrão combinada desta etapa, foi calculada a incerteza padrão do preparo de uma

solução padrão estoque, duas diluições subsequentes para atingir um nível de concentração adequado, e outras seis diluições, com fortificação da amostra testemunha nos níveis de concentração da curva analítica.

A equação para a estimativa da incerteza padrão combinada para o preparo das soluções padrão diluídas foi:

(14)

Com os dados obteve-se uma incerteza de 0,002 ng.g–1 para a preparação das soluções padrão. É importante destacar que o objetivo do presente trabalho não é o cálculo da estimativa da incerteza para esta etapa. A maneira de obter estes cálculos foi descrita por Meyer[10] e Ratola et al.[11].

Figura 1

258

3.4 Cálculo do Desvio Padrão e estimativa da incerteza da Curva Analítica ou de Calibração Os estimadores a e b foram calculados a partir do conjunto de medidas obtidas, e a equa-

Fluxograma das etapas do preparo de solução padrão diluída a partir da substância de referência.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261

Desvendando a medição nos ensaios químicos

Bahia Filho O

É importante frisar que os valores dos resíduos obtidos pela aplicação da fórmula foram similares aos valores obtidos pelo ANOVA do Excel. O gráfico de resíduo é mostrado na Figura 3.

Figura 2 Curva analítica obtida utilizando o conjunto de dados no programa Excel.

A análise do gráfico de resíduo permite concluir que a variabilidade situa-se próximo de zero e, consequentemente, o que denota um comportamento aleatório dos resíduos e magnitude bastante pequena, reforçando a premissa de que o modelo se ajusta bem para predizer as concentrações de amostras desconhecidas.

Contudo, a variabilidade do último nível denota que a resposta do detector utilizado neste ensaio pode estar próxima do limite de saturação do sinal. Neste caso, é aconselhável a construção de duas faixas de concentração para aproveitar adequadamente a melhor capacidade de medida do equipamento usado.

O teste de hipótese foi aplicado ao conjunto de dados e os resultados obtidos foram SQE = 2797 e SQR = 480 260. Portanto, a hipótese nula, ou a de que o estimador a é equivalente a zero é válida, pois a soma quadrada dos resíduos ou erros é muito menor que a soma quadrada total, denotando que a equação reduzida pode ser usada.

Figura 3 Gráfico de resíduos encontrados entre o valor esperado e o valor predito para cada nível de concentração.

ção da reta resultante é y = 277,17 x + 5135,5.

A Figura 2 mostra o gráfico das respostas contra concentração. É importante frisar que os valores dos estimadores determinados pela aplicação das fórmulas foram obtidos no programa Excel.

Com a equação da reta obtida, foram calculadas as concentrações preditas das soluções utilizando suas medidas. Com as soluções preditas calculadas, foi possível estabelecer os resíduos.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261

Usando o módulo de análise de dados, na caixa de dados do programa Excel, e selecionando regressão com os valores de concentração esperada como variável x e os de concentração predita como variável y com significância estatística de 95%, é possível estabelecer uma nova relação das variáveis e estimar os intervalos de confiança dos estimadores a e b. Os dados são mostrados na Figura 4.

O cálculo do desvio padrão da curva analítica ou de calibração foi determinado utilizando-se as fórmulas descritas anteriormente. Os valores encontrados são mostrados na Tabela 3. É importante frisar que os valores obtidos pela aplicação da equação foram similares aos valores do ANOVA do Excel.

259

Bahia Filho O

Desvendando a medição nos ensaios químicos

Figura 4 Gráfico obtido através do Excel relacionando as concentrações estimadas e esperadas, com estimadores a = 1,2327 e b = 0,9936, com erros padrão de 5,137 e 0,019; Intervalos de confiança (95%) inferior de -9,6574 e 0,9532 e superior de 12,1227 e 1,0338, respectivamente.

são. A incerteza da curva obtida foi 0,443 ng.g–1, sendo 0,441 ng.g–1 relativa ao modelo da curva e 0,002 ng.g–1 da preparação da solução.

Finalmente, foi possível estabelecer a contribuição de cada um dos parâmetros na incerteza combinada do processo. O resultado é mostrado na Figura 5.

Figura 5 Gráfico de colunas que mostra a incerteza padrão combinada do processo de construção da curva e as contribuições parciais de cada uma das etapas.

Tabela 3 Valores encontrados das variáveis para o cálculo do desvio padrão da reta. y

^ Y

DPx,x

DPy,x

215 215 477450 172,7444

b

DPcurva

277,17

0,441

Com os dados, foi possível estabelecer a contribuição do uso do modelo na incerteza da curva analítica ou de calibração. O desvio padrão da curva analítica calculado foi 0,441 ng.g–1.

A incerteza padrão combinada da construção da curva analítica ou de calibração foi feita somando-se a incerteza oriunda do preparo das soluções com a aplicação do modelo de regres260

4 Conclusão A discussão promovida neste artigo utiliza conceitos de cunho matemático aplicados em ensaios químicos sem, contudo, entrar em detalhes teóricos, abordando mais o contexto prático de como utilizar tais conceitos em conformidade com as diretrizes das normas de gestão da qualidade.

A aplicação dos conceitos estabelecidos por documento orientativo, portarias e legislações em conformidade às diretrizes das normas ISO 17025, ISO 9001 e BPL visa dar maior confiabilidade e rastreabilidade ao conjunto de dados medidos e ao resultado expresso no relatório de ensaios, aplicando conceitos estatísticos para tomada de decisão e evitando, desta forma, julgamentos subjetivos. Além de consistência, a comparabilidade é o principal objetivo dessa aplicação.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261

Desvendando a medição nos ensaios químicos

Neste artigo foi demonstrada a viabilidade do uso dessas orientações em um exemplo prático. Assim, foi possível verificar no exemplo que a contribuição na incerteza padrão combinada do modelo matemático simplificado que representa a curva de calibração é muito mais significativa que a incerteza da etapa de preparo das soluções. Contudo, para cada aplicação, sugere-se que essas contribuições sejam demonstradas, pois os dados utilizados neste trabalho representam apenas uma aplicação específica. Na prática, tem-se observado que, em outras aplicações, a etapa de preparo das soluções tem maior contribuição na incerteza padrão combinada. Por essa razão, recomenda-se que para cada aplicação seja executado procedimento similar para avaliar as contribuições e, consequentemente, ações corretivas que possam minimizar o impacto dessa etapa na incerteza padrão do ensaio como um todo.

Referências 1

Bahia Filho O. A importância da metrologia química nos resultados das análises de resíduos. Scientia Chromatographica 2009; 1(4):49-54.

2

González FJE, Torres MEH, Frenich AC, Vidal JLM, Campana AMC. Internal quality-control and laboratory-management tool for enhancing the stability of results in pesticide multi-residue analytical methods. Trends in Analytical Chemistry 2004; 23(5):361-369.

3

International Laboratory Accreditation Cooperation ILAC. ILAC-P14:12/2010: ILAC policy for uncertainty in calibration. ILAC, 2010.

Bahia Filho O

4

Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT. NBR ISO/IEC 17025: Requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração.

Rio de Janeiro: ABNT, 2005.

5

Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT. NBR ISO 9001:2008: Sistemas de gestão da qualidade Requisitos. Rio de Janeiro: ABNT, 2009.

6

Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial - INMETRO. NIT-DICLA-035: Requisitos gerais para laboratórios segundo os princípios das boas práticas de laboratório (BPL).

INMETRO, 2009. Revisão 01.

7

González AG, Herrador MA. A pratical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and accuracy profiles. Trends in Analytical Chemistry 2007; 26(3):227-238.

8

Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial - INMETRO. DOQ-CGCRE-008: Orientação sobre validação de métodos analíticos.

INMETRO, 2011. Revisão 04.

9

Thompson M, Wood R. Harmonized guidelines for internal quality control in analytical chemistry laboratories (Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 1995; 67(4):649-666. http://dx.doi. org/10.1351/pac199567040649

10 Meyer VR. Measurement uncertainty. Journal of

Chromatography A 2007; 1158(1-2):15-24. http:// dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2007.02.082 11 Ratola N, Santos L, Herbert P, Alves A. Uncertainty

associated to the analysis of organochloride pesticides in water by solid-phase microextraction/ gás chromatography-electron capture detection Evaluation using two different approaches. Analytica Chimica Acta 2006; 573-574:202-208. http://dx.doi. org/10.1016/j.aca.2006.03.065

Recebido: 28/07/2011 Aceito: 03/08/2011

Scientia Chromatographica 2011; 3(3):251-261 261

Você está pronto?

Próxima geração de sistemas de Cromatografia Líquida e Cromatografia de Íons

Cromatógrafo Líquido UHPLC+ Focused Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 Com detecção Corona CAD

Cromatógrafo de Íons Capilar Thermo Scientific Dionex ICS5000

Os produtos Dionex são reconhecidos mundialmente como o estado da arte em cromatografia líquida (HPLC, UHPLC) e Cromatografia de Íons (IC), incluindo a exclusiva tecnologia de Cromatografia de Íons Capilar, preparo de amostras e software de automação cromatográfica (Chromeleon).

Uma nova era chegou e traz consigo mais recursos e novas possibilidades, aliando a liderança dos produtos Dionex à força e presença global da Thermo Fisher Scientific.

A Dionex Brasil continua a operar com toda a linha de produtos Dionex.

Conheçam todas nossas soluções e aproveitem esse momento especial.

revista@dionex.com.br www.dionex.com.br

www.thermoscientific.com/dionex

INSTITUTO INTERNACIONAL DE CROMATOGRAFIA

O Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) é parte da Associação Internacional de Cromatografia, entidade de direito privado, sem fins lucrativos.

Os objetivos dos cursos do IIC são o aprimoramento/formação/ atualização dos usuários das técnicas cromatográficas e afim (Preparo de Amostras, Espectrometria de Massas, Gestão da Qualidade, dentre outras), tanto do ponto de vista teórico quanto prático.

A filosofia educacional do IIC é: “ao invés de ensinar apenas como operar um equipamento específico (dar o peixe) o IIC ensina a técnica (como pescar)”.

Os cursos do Instituto Internacional de Cromatografia são coordenados pelos Diretores do IIC, e ministrados pelos coordenadores, auxiliados por uma equipe técnica e científica altamente qualificada, constituída de docentes pós-graduados nos melhores centros do país na área, e pós‑graduandos em fase de conclusão de suas teses. Na época em que cada curso for oferecido, uma relação dos instrutores é disponibilizada no website do IIC. O programa detalhado de cada curso pode ser obtido através de contacto com o IIC. Os cursos são ministrados com auxílio de recursos audiovisuais modernos (datashow‑computador; vídeos, demonstrações, resolução de problemas e outros recursos instrucionais). Os alunos recebem um livreto contendo cópia de todos os slides apresentados pelos instrutores, além de material bibliográfico de apoio. Em vários cursos também são fornecidos livros de autoria dos próprios docentes dos cursos. A maior parte dos cursos também tem aulas práticas de laboratório, conforme anunciado no folheto explicativo de cada curso.

Observações: • O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

Scientia Chromatographica 2011; 3(3) 265

BOOKSTORE

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, filmes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele produzido. Esses materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografia Líquida Moderna - Fernando M. Lanças Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografia Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou atualizar-se nesta técnica.

Cromatografia em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografia Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Validação de Métodos Cromatográficos - Fernando M. Lanças Livro de autoria do Prof. Lanças, descreve os princípios da validação de métodos cromatográficos com detalhes. Enfoque também a validação de instrumentação e a adequação dos sistemas (“system suitability”) frente aos requisitos dos órgãos regulamentadores de resultados analíticos. O livro é acompanhado de um software, denominado Validate – versão demonstração – desenvolvido em colaboração com o Dr. Vitor Hugo P. Pacces, o qual auxilia no processo de validação.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças

De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

266

Scientia Chromatographica 2011; 3(3)

CALENDÁRIO DE CURSOS DO I.I.C.

2º SEMESTRE 2011 Mês

Dias

Curso

06 a 08

Cromatografia Gasosa Básica (GC)

20 a 22

Cromatografia Liquida Básica (HPLC/CLAE)

15 a 18

Introdução às Técnicas Cromatográficas

22 e 23

Como Prever, Evitar e Resolver Problemas em LC:TS (Teoria e Prática)

Julho

267 Agosto

24 a 26

Cromatografia Líquida Moderna

30 e 31

Validação de Métodos Cromatográficos

20 a 23

Acoplamento GC-MS e GC-MS/MS

28 a 30

Preparo de Amostras

20 e 21

Avanços Recentes em HPLC - Teoria

25 a 28

Acoplamento LC-MS e LC-MS/MS

23 a 25

Cromatografia Líquida Básica (HPLC/CLAE)

29 e 30

Como Desenvolver e Otimizar Método HPLC

07 a 09

Cromatografia Gasosa Básica (GC)

Setembro

Outubro

Novembro

Dezembro

• O I.I.C. oferece também cursos “in-house” (“in-company”). Interessados nesta modalidade devem contatar o IIC para obter mais detalhes.

• Com exceção dos cursos da área da qualidade (ISO, Validação e Auditoria) todos os demais possuem aulas teóricas e práticas de laboratório.

• O oferecimento efetivo de um curso depende de um número mínimo de inscritos no mesmo.

• O número de vagas dos cursos que envolvem laboratório está sendo limitado para melhor ­aproveitamento dos participantes.

• Visite o website www.iicweb.org para obter mais informações.

CALENDÁRIO GERAL

EVENTOS 2011 Chirality 2011 Data: 10-13 de julho Local: Liverpool, UK Informações: www.liv.ac.uk 8th International Congress of Pharmaceutical Sciences - CIFARP 2011 Data: 21-24 de agosto Local: Centro de Convenções de Ribeirão Preto – Ribeirão Preto, SP, Brasil Informações: www.cifarp.com.br Analitica Latin América Data: 20-22 de setembro Local: Transamerica Expo Center – São Paulo, SP, Brasil Informações: http://www.analiticanet.com.br/ 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia 2011 Data: 2-6 de outubro Local: Foz do Iguaçu, PR, Brasil Informações: http://www.biotec.org.br/?p=3967 XI Encontro Regional Sul de Ciência e Tecnologia de Alimentos Data: 9-11 de outubro Local: Curitiba, PR, Brasil Informações: http://www.xierscta.com.br 23rd International Symposium on Pharmaceutical & Biomedical Analysis Data: 09-12 de outubro Local: João Pessoa, PB, Brasil Informações: http://www.pba2011.com/index.php 51º Congresso Brasileiro de Química Data: 9-13 de outubro Local: São Luís, MA, Brasil Informações: http://www.abq.org.br/cbq/ 16º ENQA - Encontro Nacional de Quimica Analítica 2011 Data: 23-26 de outubro Local: Campos do Jordão Convention Center – Campos do Jordão, SP, Brasil Informações: http://www.usp.br/enqa2011/index.asp 3º Brazilian Mass Congress - BrMASS Data: 12-15 de dezembro Local: Campinas, SP, Brasil Informações: www.brmass.com.br/congresso

268

Scientia Chromatographica 2011; 3(3)