Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

Semih Arbatli, Julia Weiss y *Marcos Egea Gutiérrez-Cortines Instituto de Biotecnología Vegetal, Universidad Politécnica de Cartagena

wwww.bibliotecahorticultura.com

2019

Cultivo, Material Vegetal

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

Semih Arbatli, Julia Weiss y *Marcos Egea Gutiérrez-Cortines *marcos.egea@upct.es Instituto de Biotecnología Vegetal, Universidad Politécnica de Cartagena

Índice 1. La época pregenética ............................................................................ 2 2. La irrupción de la Genética ................................................................... 3 3. De la Genética clásica a la Ingeniería Genética .................................... 4 4. Las nuevas tecnologías de edición de genes ........................................ 7 5. Avances en material vegetal desarrollados con CRISPR ....................... 9

Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)

1

www.bibliotecahorticultura.com

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

1. La época pregenética Quizás algo que caracteriza a la agricultura moderna y altamente cualificada es el uso de variedades muy desarrolladas con características concretas relacionadas con una serie de caracteres de interés. Dichos caracteres de interés, dependen de a quién se le pregunte, pueden ser diferentes, y no siempre son lo que parecen. En este primer capítulo de tres, vamos a hacer un repaso de los conceptos de carácter agronómico, y sobre todo de cómo se han mejorado a lo largo de los últimos ocho o nueve mil años. Pero partimos siempre de una base o chasis que es la especie concreta de la que hablamos y que en algunos casos datan sus orígenes a hace más de 45 millones de años.

Hace unos 8000 años, tres civilizaciones alejadas: en el rio Yangze en China, el llamado Creciente Fértil de Siria, Israel, Líbano y en México central, las poblaciones pre agrícolas seleccionaron cuatro tipos de arroz y mijo (Zhang et al., 2012), trigo (Peng et al., 2011) y maíz (Matsuoka et al., 2002) con un carácter común: no perdían la semilla. Este evento nos ha llevado hasta hoy, y, qué duda cabe, que supuso el cambio más importante en los últimos 10000 años y que llevó al desarrollo de urbes, dio paso a la civilización del bronce etc. Y todo se ha debido a mutaciones en genes que en los cuatro cereales tienen el mismo efecto, su pérdida de función impide que el grano se separe de la espiga, permitiendo la recolección en cantidades suficientes para sustentar personas y familias.

Hay varias lecciones sencillas de este ejemplo. La primera es que la agricultura, tiende a tener “intereses comunes” independientemente del cultivo. La segunda es que como los organismos vivos provienen de ancestros comunes, muchos procesos, y lo que nos interesa, caracteres, son comunes y controlados de forma muy similar o idéntica.

www.bibliotecahorticultura.com

2

Cultivo, Material Vegetal

Desde entonces, los agricultores fueron desarrollando métodos intuitivos de “mejorar sus plantas”. Esto fue a base de prueba y error y de una forma bastante eficaz para algunos caracteres. Así aquellos caracteres que tienen una relación directa con los genes que lo controlan y tienen un fenotipo sencillo de discriminar fueron los que inicialmente se fueron imponiendo. Entre estos cabe destacar el aumento de las producciones, los frutos de calidad etc. Sin embargo, otros caracteres muy importantes, pero más difíciles de controlar como pueden ser las resistencias a plagas y hongos o enfermedades del suelo, se mejoraron de forma no dirigida.

Aquellos individuos que dieron buena cosecha se utilizaron, y los que murieron, no.

2. La irrupción de la Genética Todo cambió a partir de 1905 con el primer congreso de Genética. En unos pocos años y gracias a la investigación en agricultura, muchas especies fueron sometidas a un programa de mejora genética dirigida.

Los tres aspectos que han determinado desde entonces el éxito de dicha metodología han sido primero que está basada en un análisis de datos exhaustivo, segundo que se busca variabilidad para introducir mejoras, y por último que permite determinar el componente genético y los efectos ambientales sobre un carácter concreto.

Además, dos aspectos permitieron avanzar mucho. Por un lado se determinó que algunos caracteres poseen una estructura cuantitativa, como la producción, el tamaño de los frutos, las resistencias a plangas y hongos, mientras que otros como puede ser el color de las naranjas sanguinas (Butelli et al., 2012) o la diferencia entre una uva blanca y otra roja (Cavallini et al., 2014), se deben a mutaciones en uno o dos genes.

3

www.bibliotecahorticultura.com

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

Este escenario en el que una simple mutación permite obtener un producto nuevo se ve reflejado por ejemplo en el éxito que han tenido los tomates de color oscuro. Todos ellos se deben a una mutación en un gen necesario para la degradación de la clorofila durante la maduración (Barry et al., 2008) y sin cuya función los frutos mantienen un bonito color oscuro muy atractivo para el consumidor.

Esta facilidad de manejo ha sido más bien la excepción que la regla en los proyectos de mejora genética, y eso se debe a la mencionada estructura genética de muchos genes responsables de algunos caracteres y a la estructura cromosómica que hace que cuando nosotros introducimos un gen nuevo, también introducimos todos los genes que se encuentran en dicho cromosoma, normalmente varios miles. Y no siempre los genes introducidos tienen el efecto deseado.

3. De la Genética clásica a la Ingeniería Genética La genética clásica en su aplicación a la mejora tiene como principales limitaciones que algunos procesos parecen estar controlados por varios genes y segundo, y más importante, que los genes que residen en un mismo cromosoma sólo se pueden separar por procesos de recombinación de cromosomas. Esto se produce por azar, y no siempre es posible. Esta situación es especialmente mala cuando un gen que nos interesa para un carácter concreto, como puede ser resistencia a un virus, se encuentra cerca en el cromosoma de otro cuya función no es deseable.

Esto ocurre muy a menudo y es un importante cuello de botella. A veces hay que elegir y en esta tesitura por ejemplos se encuentran las variedades modernas de tomate que portan innumerables resistencias a

www.bibliotecahorticultura.com

4

Cultivo, Material Vegetal

virus, bacterias y hongos, pero también tienen una calidad organoléptica baja.

Si pensamos pues que un genoma tipo tiene entre 24000 y 40000 genes y un número de cromosomas determinado (Tabla 1) podemos entender que no siempre se va a conseguir la variedad ideal de altos rendimientos, resistencias y calidades. Así cuando se hace un cruzamiento entre dos variedades, podemos asumir que un porcentaje alto de genes difiera entre ambas y que la combinación de genes o genotipo, puede ser muy buena, o muy mala. Estas combinaciones se intentan resolver con ensayos de campo, y con cruces adicionales en los que se intenta eliminar algún fragmento de ADN que nos pueda resultar en una reducción de la producción, calidad o cualquier otro carácter. Pero este proceso es muy tedioso y a veces no funciona, porque ese fragmento que no nos interesa se encuentra en el mismo cromosoma y muy cerca del que si nos mejora el producto, y a veces no conseguimos deshacernos de él. Después de 30 años de trabajo.

5

www.bibliotecahorticultura.com

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

Tabla 1. Descripción de algunos genomas de interés agronómico. El tamaño de genomas se da en Megabases (Mb= 1 Millón de bases) o Gigabases (Gb= 1ooo millones de bases). El número de genes se corresponde con el número de genes diferentes inferidos por análisis bioinformático.

Arroz

Tamaño del genoma 430Mb

Trigo

16Gb

Tomate

900Mb

Nº de genes 39045 10789 1 35004

Patata

844Mb

39031

12

Pimiento (guindilla)

3,48Gb

34903

12

(Kim et al., 2014)

Uva

487Mb

30434

19

(Characterization et al., 2007)

265Mb

27852

8

(Verde et al., 2013)

375Mb

27427

12

(Garcia-Mas et al., 2012)

Especie

Prunus (Melocotón ) Melón

Nº de cromosomas 12

(Goff et al., 2002)

21

(Brenchley et al., 2012)

12

(Sato et al., 2012) (The Potato Genome Sequencing Consortium, 2011)

Referencia

Si hay algo que le ha dado su poder de resolución a la genética es precisamente la metodología de análisis basada en pruebas funcionales.

Esto significa que desde hace más de 100 años el análisis genético busca perturbar la actividad de un gen concreto para conocer qué ocurre si su actividad disminuye, aumenta o desaparece. Las formas de obtener versiones de genes con cambios en su actividad se han podido dividir en tres grandes métodos de trabajo. Por un lado, en aquellos sistemas en los que ha sido posible se han desarrollado programas de mutagénesis que han permitido desarrollar una variabilidad inducida muy sustancial.

Ejemplos incluyen maíz, muchas ornamentales, trigo, etc. El segundo ha

www.bibliotecahorticultura.com

6

Cultivo, Material Vegetal

sido en aquellos sistemas en los que la mutagénesis y los cruzamientos dirigidos no son posibles como el estudio de humanos o especies de ecosistemas naturales en los que se ha buscado la variabilidad natural: individuos con características concretas para su estudio. Por último, tenemos el desarrollo a partir de los años 60 de tecnologías de transgénesis para perturbar un solo gen. Primero en bacterias y moscas y luego en plantas y animales superiores. El principio es que modificar un solo gen es un método más sencillo y eficaz que el mezclar 25 o 30.000 genes y luego volver a separarlos para quedarnos con las combinaciones que mejor funcionan.

4. Las nuevas tecnologías de edición de genes El trabajo desarrollado por el investigador Francisco Mójica de la Universidad de Alicante sobre bacterias permitió descubrir un sistema de defensa frente a virus (Mojica et al., 2005). A partir de dicho descubrimiento, se ha desarrollado una metodología novedosa con las primeras publicaciones datando de 2013, en la que los genes de defensa de bacterias se han utilizado para provocar cambios puntuales en un gen de interés en especies diversas como puede ser tomate, arroz, trigo, patata etc. (Adli, 2018).

El sistema CRISPR se basa en la proteína CAS, una enzima, de las que existen varias versiones. Dicha proteína se puede expresar en una célula huésped y en principio no tiene actividad por sí misma. Pero en presencia de un ARN que tenga la conformación correcta, conocido como ARN guía, la proteína CAS se une a un cromosoma en la posición exacta determinada por el ARN guía y corta el cromosoma en un punto concreto (Figura 1).

7

www.bibliotecahorticultura.com

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

Figura 1. Representación esquemática de la proteína CAS9 unida al ADN por el ARN guía

Si hay algo que provoca una reacción de “pánico” en una célula es un cromosoma roto. El sistema de reparación de ADN se pone manos a la obra a reparar el cromosoma. Existen dos rutas divergentes de reparación, una de ellas suele introducir algunas bases en el punto de rotura para poder pegar. Esto que parece irrelevante es en realidad lo que produce un cambio en el gen diana del experimento con CRISPR/Cas, pues en una zona codificante el cambio de una sola letra o la inclusión/pérdida de algunas letras, producirá un cambio irreversible, y normalmente destructivo para el gen concreto (Figura 2).

www.bibliotecahorticultura.com

8

Cultivo, Material Vegetal

Figura 2. Corrección de roturas cromosómicas por los sistemas de recombinación homóloga y recombinación por unión de extremos no homólogos.

5. Avances en material vegetal desarrollados con CRISPR El principal avance de la tecnología CRISPR, se debe al conocimiento acumulado en sistemas modelo como Arabidopsis, Petunia y en especies industriales como arroz, tomate, maíz o patata. A partir de dichos sistemas, se tiene a nuestra disposición una panoplia muy grande de caracteres sobre los que se puede obtener una modificación de un gen candidato por CRISPR. El primer ejemplo fue un champiñón al que se le produjo una pérdida de función del enzima Polifenol Oxidasa (PPO). Dicho enzima es un viejo conocido de la poscosecha ya que se le ha imputado una relación causal con el pardeamiento en muchos alimentos. Efectivamente, los champiñones sin PPO no pardean y en cuestión de meses se han convertido en casi monopolio del mercado (Waltz, 2016). Cuando se desarrolló en 2015, la tecnología estaba recién implantada pero tanto

9

www.bibliotecahorticultura.com

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

FDA como USDA han decidido posteriormente que un organismo vegetal desarrollado por CRISPR/Cas, no se puede considerar un organismo transgénico. Las razones son puramente técnicas, ya que una mutación provocada por CRISPR, en la que se han modificado unas pocas bases de un gen endógeno, no se puede discriminar de una mutación acaecida de forma natural en muchas poblaciones. De hecho, muchas mutaciones naturales tienen una base molecular más dramática que cualquier alelo, o nueva forma de gen, creada por CRISPR. Algunas mutaciones naturales son roturas y empalmes de cromosomas en las que se pierden fragmentos, o deleciones (pérdida de un fragmento de ADN de un cromosoma), mucho más grandes que las observadas en CRISPR, llegando a cientos de miles de bases. Otras son lo contrario, introducción o inserciones de elementos que pueden venir de otra zona del genoma, o ser un antiguo virus que forma parte del mismo. En esta situación, legislar contra algo que no es demostrable se puede considerar un brindis al astro rey.

Bibliografía Adli, M. (2018) The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.

Nature Communications, 9: 1911.

Barry, C.S., McQuinn, R.P., Chung, M.-Y., Besuden, A.; Giovannoni, J.J. (2008) Amino Acid Substitutions in Homologs of the STAY-GREEN Protein Are Responsible for the green-flesh and chlorophyll retainer Mutations of Tomato and Pepper. Plant Physiology, 147: 179–187.

www.bibliotecahorticultura.com

10

Cultivo, Material Vegetal

Brenchley, R., Spannagl, M., Pfeifer, M., et al. (2012) Analysis of the bread wheat genome using whole-genome shotgun sequencing.

Nature, 491: 705–710.

Butelli, E., Licciardello, C., Zhang, Y., Liu, J., Mackay, S., Bailey, P., Reforgiato-Recupero, G.; Martin, C. (2012) Retrotransposons control fruit-specific, cold-dependent accumulation of anthocyanins in blood oranges. The Plant cell, 24: 1242–55.

Cavallini, E., Zenoni, S., Finezzo, L., Guzzo, F., Zamboni, A., Avesani, L.; Tornielli, G.B. (2014) Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & cell physiology, 55: 517–34.

Characterization, T.F.-I.P.C. for G.G., Jaillon, O., Aury, J.-M., et al. (2007) The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature, 449: 463– 467.

Garcia-Mas, J., Benjak, A., Sanseverino, W., et al. (2012) The genome of melon (Cucumis melo L.). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109: 11872–7.

Goff, S.A., Ricke, D., Lan, T.H., et al. (2002) A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296: 92–100.

Kim, S., Park, M., Yeom, S.-I., et al. (2014) Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species. Nature genetics, 46: 270–8.

11

www.bibliotecahorticultura.com

Tendencias en biotecnología aplicada a la agricultura. La revolución de editado de genes por CRISPR/Cas

Matsuoka, Y., Vigouroux, Y., Goodman, M.M., G, J.S., Buckler, E.; Doebley, J. (2002) A single domestication for maize shown by multilocus microsatellite genotyping. PNAS, 99: 6080–6084.

Mojica, F.J.M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J.; Soria, E. (2005) Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements. J Mol Evol, 60: 174–182.

Peng, J.H., Sun, D.; Nevo, E. (2011) Domestication evolution, genetics and genomics in wheat. Mol Breeding, 28: 281.

Sato, S., Tabata, S., Hirakawa, H., Asamizu, E., Shirasawa, K., Isobe, S., Tomato, T.; Consortium, G. (2012) The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature, 485: 635–41.

The Potato Genome Sequencing Consortium (2011) Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature, 475: 189–195.

Verde, I., Abbott, A.G., Scalabrin, S., et al. (2013) The high-quality draft genome of peach (Prunus persica) identifies unique patterns of genetic diversity, domestication and genome evolution. Nature genetics, 45: 487–94.

Waltz, E. (2016) Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation.

Nature, 532: 293–293.

Zhang, J., Lu, H., Gu, W., Wu, N., Zhou, K., Hu, Y., Xin, Y.; Wang, C. (2012) Early Mixed Farming of Millet and Rice 7800 Years Ago in the Middle Yellow River Region, China. PLOS ONE, 7, e52146.

www.bibliotecahorticultura.com

12

ESPECIALISTES EN SERVEIS PER A LA PRODUCCIÓ EDITORIAL, SL Doctor Manuel Candela 26, 11ª 46021 VALENCIA – ESPAÑA Tel.: +34-649 48 56 77 / info@poscosecha.com NIF: B-43458744

www.poscosecha.com www.postharvest.biz www.bibliotecahorticultura.com www.tecnologiahorticola.com www.actualfruveg.com