Análisis de 34 micotoxinas mediante Agilent 6460C LC-MS/MS

ANÁLISIS DE 34 MICOTOXINAS MEDIANTE AGILENT 6460C LC-MS/MS

Hunor Farkaš, Jog Raj*, Svetlana Ćujić, Zdenka Jakovčević y Marko Vasiljević PATENT CO, DOO., Vlade Ćetkovića 1A, 24 211, Mišićevo, Serbia *jog.raj@patent-co.com

1

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por especies fúngicas en alimentos y piensos.

La mayoría están producidas por

Aspergillus, Fusarium y Penicillium sp.

Normalmente, la mayoría de la gente piensa en las seis principales micotoxinas que contaminan los piensos: Aflatoxinas (AF) Deoxinivalenol (DON) Toxina T-2 Fumonisinas (FB) Ocratoxina Zearalenona (ZEN) Los principales efectos de estas toxinas sobre el rendimiento y la salud de los animales de producción son conocidos, y existen directrices reglamentarias sobre los niveles umbral de estas toxinas en los alimentos y piensos.

Sin embargo, aunque las pruebas y los informes sobre la prevalencia de micotoxinas en los piensos han aumentado en los últimos años, muchas

Una categoría cada vez

micotoxinas siguen sin detectarse.

más preocupante son las micotoxinas emergentes.

Al igual que el DON, la toxina T-2 y la zearalenona, las micotoxinas emergentes también son producidas habitualmente por diversos mohos Fusarium.

Además, como los mohos producen múltiples micotoxinas bajo los mismos factores de estrés ambiental, es probable que las micotoxinas emergentes sean cocontaminantes frecuentes en los piensos junto con las micotoxinas principales.

Este artículo describe un método de preparación y análisis de

Por tanto, es muy deseable disponer de un

muestras de múltiples micotoxinas

método de análisis de micotoxinas totales,

en el LC-MS/MS Agilent 6460c.

incluidas las micotoxinas emergentes.

2

PROCEDIMIENTOS 1. Preparación de muestras La muestra de laboratorio debe molerse finamente y mezclarse a fondo utilizando un molino y un mezclador antes de extraer una porción de prueba para su análisis.

Transfiera 5 g de muestra homogeneizada y finamente molida con una precisión de 0,1 g a un tubo cónico de 50 ml y proceda al paso de extracción.

5 g muestra

2. Procedimiento de adición de estándar a la muestra Si es necesario determinar la recuperación, realice lo siguiente por duplicado:

5 g muestra Transferiera 5 g de muestra homogeneizada y finamente molida a un tubo cónico de 50 ml.

Transfiera 5 g de muestra homogeneizada y finamente molida a un tubo cónico de 50 ml y añada 200 µl de la solución de enriquecimiento multimicotoxina.

5 g muestra + 200 µl solución multimicotoxina

Proceda al paso de extracción.

3

3. Extracción Añada 20 ml de mezcla de extracción y cierre el tubo.

Agite la mezcla en un agitador orbital a 250 rpm durante 90 minutos a temperatura ambiente.

Tras la extracción, centrifugue a 4200 x g durante 5min.

Transfiera 450 μl de sobrenadante a un vial

20 ml solución de extracción

de vidrio y añada 750 μl de agua ultrapura

250 rpm 90 min

al sobrenadante.

450 µl sobrenadante

750 µl agua ultrapura

Agite en el vórtex y analice la muestra mediante LC-MS/MS. Agite bien en el vórtex.

Filtre una alícuota de 1200 µL del extracto de muestra preparado a través de un filtro de jeringa de membrana en un vial de vidrio.

120 µl extracción de la muestra

Matrices: maíz, piensos compuestos, trigo, cebada, harina de soja, salvado de trigo, harina de girasol, ración mixta total (TMR).

4

RESULTADOS La Tabla 1 muestra las micotoxinas analizadas junto con sus correspondientes Límites de Cuantificación (LOQ).

Familia de micotoxinas

Aflatoxinas

Zearalenona + Metabolito

A-Tricotecenos

B-Tricotecenos

Fumonisinas + Metabolito

Ocratoxina

Micotoxinas emergentes

Toxinas de Penicillium Alcaloides ergóticos Toxina de Alternaria

Micotoxina

Abreviatura

LOQ (μg/kg)

Aflatoxina B1

AFB1

< 0,4

Aflatoxina B2

AFB2

< 0,4

Aflatoxina G1

AFG1

< 0,4

Aflatoxina G2

AFG2

< 0,4

α – Zearalenol

α -ZEL

< 10

β – Zearalenol

β -ZEL

< 10

Zearalanona

ZAN

< 10

Zearalenona

ZEN

<5

Diacetoxiscirpenol

DAS

<3

Toxina HT-2

HT-2

< 9,6 < 9,6

Toxina T-2

T-2

Neosolaniol

NEO

< 10

3-Acetil Deoxinivalenol

3-ADON

< 20

15- Acetil Deoxinivalenol

15-ADON

< 20

Deoxinivalenol

DON

< 20

Nivalenol

NIV

< 20

Deoxinivalenol -3-Glucosido

D3G

< 30

Fumonisina B1

FB1

< 25

Fumonisina B2

FB2

< 25

Fumonisina B3

FB3

< 25

Ácido Fusárico

FA

<3

Moniliformina

MON

<3

Fusarenon X

FX

< 40

Ocratoxina A

OTA

< 1,6

Beauvericina

BEA

<1

Enniatina A

ENN A

<1

Enniatina A1

ENN A1

<1

Enniatina B

ENNI B

<1

Enniatina B1

ENN B1

<1

Citrinina

CIT

< 50

Patulina

PAT

< 100

Ergosina

ES

<1

Ergocriptinina

ECR

<1

Alternariol

AOH

< 20

Tabla 1. Micotoxinas analizadas y sus LOQ.

5

La Tabla 2 muestra la recuperación (%) de micotoxinas analizadas en maíz, trigo y cebada.

RECUPERACIÓN (%) Analito MAÍZ

TRIGO

CEBADA 90

1.

Moniliformina

82

91

2.

Nivalenol

85

89

88

3.

Deoxinivalenol

103

108

105

4.

Ácido Fusárico

102

96

109

5.

3-Acetil Deoxinivalenol

80

88

90

6.

15- Acetil Deoxinivalenol

83

92

91 99

7.

Aflatoxina G2

99

99

8.

Aflatoxina G1

98

98

92

9.

Aflatoxina B2

93

96

96

10.

Aflatoxina B1

96

93

104

11.

Diacetoxiscirpenol

96

101

103

12.

Toxina HT-2

92

93

99

13.

Fumonisina B1

103

96

94

14.

β – Zearalenol

101

96

89

15.

α – Zearalenol

87

104

99

16.

Toxina T-2

98

103

90

17.

Zearalanona

103

103

95

18.

Ocratoxina A

94

97

98

19.

Zearalenona

102

101

91

20.

Fumonisina B2

82

91

101

21.

Fumonisina B3

86

99

93

22.

Enniatina B

86

98

96

23.

Beauvericina

85

89

88

24.

Enniatina B1

81

89

82

25.

Enniatina A1

84

95

96 94

26.

Enniatina A

81

98

27.

Citrinina

84

88

81

28.

Patulina

72

75

71

29.

Fusarenon X

89

85

82

30.

Neosolaniol

94

90

85

31.

Ergosina

103

99

98

32.

Ergocriptinina

96

92

94

33.

Alternariol

79

84

81

34.

Deoxinivalenol -3-Glucosido

83

82

80

Tabla 2. Porcentaje de micotoxinas recuperadas en muestras de maíz, trigo y cebada.

6

CONCLUSIONES El análisis de 34 micotoxinas utilizando la columna CORTECS C18 en el LC-MS/MS Agilent 6460c presentó una recuperación del 71-109% para varias micotoxinas.

Esto demuestra que se trata de un método robusto para el análisis de 34 micotoxinas.

La detección de micotoxinas en muestras de alimentos y piensos es una cuestión de gran importancia debido a su toxicidad inherente.

Estos contaminantes inevitables no pueden eliminarse y, por tanto, la aplicación de programas de control eficaces y de normativas legales estrictas puede contribuir significativamente a la reducción y arrastre de estas micotoxinas en la cadena alimentaria.

7