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MTD Magazine Trimestrale on line

4 dicembre numero

2017

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INDICE Periodico Trimestrale Gratuito di divulgazione Medico Scientifica DICEMBRE ANNO 2

2017 N. 4

Editore Improve Communications Sede Legale: Via Viticella, 48 - 80010 Quarto (NA) Sede Operativa : Via Giustiniano, 1119 - 80126 Napoli Direttore Responsabile Gianluca Passaretti Direzione e redazione Via Giustiniano, 119 - 80126 Napoli tel: 081 0362332 e-mail: info@improvecommunications.it web: www.improvecommunications.it

3 Sindrome da overlap: lupus eritematoso sistemico/lichen ruben planus in paziente affetta da cirrosi HCV correlata - Clinical case G. D’adamo, B. Fimiani 7 Utilità della risonanza magnetica nella diagnosi di spondiloartrite a coinvolgimento assiale ed in fase preradiografica: descrizione di un caso clinico S. Bello 11 Nuovi approcci terapeutici per il trattamento di pazienti con recidiva di epatite C dopo il trapianto di fegato M. De Luca

Diffusione : Periodico Telematico Service Provider ARUBA S.P.A. Loc. Palazzetto, 4 - 52011 Bibbiena (AR)

42 Bacterial Carbonic Anhydrases V.Carginale, C. Capasso

Hanno collaborato a questo numero: Dott. Giuseppe D’adamo, Basilio Fimiani - P.O. Umberto I 52 Discussione di un caso clinico relativo Dott. Sandro Bello - Policlinico di Bari a terapia della Cirrosi HCV relata Dott. Massimo De Luca - A.O.R.N. Cardarelli A. De Luna Dott. Vincenzo Carginale, Dott. Clemente Capasso - CNR di Napoli Dott. Antonio De Luna - Azienda Sanitaria Salerno

La testata MTD - More Than Drug è registrata presso il Tribunale di Napoli - reg. n° 49 del 17 ottobre 2016

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Sindrome da overlap: lupus eritematoso sistemico/lichen ruben planus in paziente affetta da cirrosi HCV correlata

Giuseppe D’Adamo , Basilio Fimiani U.O.C. Medicina Generale – P.O. Umberto I Nocera Inferiore – ASL Salerno

Clinical case Descriviamo il caso di una donna di razza caucasica, attualmente di anni 66, seguita dall’ambulatorio della nostra unità operativa dal 2003.

La paziente presenta un lieve deficit intellettivo dalla nascita, è nubile e non ha avuto mai gravidanze; non ha mai presentato consumo alcolico significativo e non ha mai fumato.

In anamnesi nel 1996 le viene diagnosticato un linfoma non Hodgkin; relativamente a tale evento clinico, la paziente non ha mai esibito documentazione; tuttavia viene riferito dai familiari che la stessa fu sottoposta a vari cicli di chemioterapia, ottenendo una remissione completa di malattia persistente negli anni e controllata presso centro specialistico di ematologia. Contemporaneamente alla diagnosi di linfoma, si è avuta evidenza di epatite cronica HCV relata che, nel corso degli anni si è manifestata con una persistente ipertransaminasemia, con aumento delle aminotrasferasi di 2-3 volte i valori normali; la paziente ha presentato un progressivo deterioramento della funzionalità epatica con evidenza di viraggio verso una forma di franca epatopatia fibrotica dopo il 2010. Nel corso degli anni la paziente non ha mai accettato di effettuare un trattamento antivirale con interferone pegilato e ribavirina per timore di complicanze. Nel 2012 a seguito di una esofagogastroduodenoscopia effettuata per la valutazione delle complicanze dell’ipertensione portale, le vengono evidenziate delle lesioni sessili della mucosa gastrica che, alla biopsia, mostrano il quadro di una maltoma associato ad infezione da Helicobacter pilori. Viene sottoposta a terapia eradicante con inibitori di pompa e antibiotici che determina la risoluzione dell’infezione e anche della malattia linfoproliferativa, remissione obiettivata con biopsie seriate fino all’agosto 2015; a tali controlli endoscopici la paziente non evidenzia presenza di varici esofagee o altri segni endoscopici di ipertensione portale

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Ai controlli ecografici effettuati per il monitoraggio dell’epatopatia, nel 2013 la paziente presenta idronefrosi destra con litiasi dell’uretere e infezioni delle vie urinarie ricorrenti, per cui viene sottoposta a litotrissia e stenting dell’uretere.

Nel luglio 2015 la paziente si presenta in ambulatorio con una diffusa eruzione cutanea, poco pruriginosa di tipo eritematoso, con vaste macule appena rilevate in parte tendente alla desquamazione e alcune papule più rilevate ubiquitarie su corpo (Fig. 1- 3) non scomparenti alla digitopressione; la paziente non presenta lesioni delle mucose.

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3 4

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La paziente viene inviata presso una unità operativa di Dermatologia con il sospetto di lichen ruben planus/malattia linfoproliferativa cutanea associata ad HCV. La biopsia cutanea descrive tessuto cutaneo con cheratosi e paracheratosi del rivestimento corneo; epidermide con appiattimento corneo e distorsione architetturale, alterazione della linea basale con vacuolizzazione e immagini di squamotizzazione, presenza di corpi eosinofili intraepidermici. Nel derma sono descritti fenomeni di edema, focali stravasi eritrocitari e un infiltrato linfoide, in prevalenza costituito da elementi mononucleati, addensato attorno alle strutture vascolari, in più punti interessante anche lo spessore epidermico, il tutto compatibile con lesione vasculite lupoide, anche variante discoide o con lichen ruben planus.

La paziente nel settembre 2015 dopo trattamento topico con corticosteroidi non mostra segni di miglioramento clinico; il quadro ecografico esclude la presenza di ascite, testimonia un coarse nodular pattern come da cirrosi franca senza lesioni focali, microlitiasi colecistica senza dilatazione delle vie biliari, asse splenoportale ai limiti alti (12 mm all’ilo) e milza di 135 mm; si segnala la presenza di unico linfonodo ilare reattivo. Il quadro ematochimico mostra leucociti 1130/mmc con 37% di neutrofili, piastrine 57.000/mmc emoglobina 11.8 gr/dl, tempo di protrombina 87% con 1.10 di INR, bilirubina totale 1.00 mg/dl con 0.26 di diretta alb 3.35 gr/dl, crea 0.76 mg/dl, glu 126 mg/dl, azo 36 mg/dl, alt 67/65, ast 64/37, gGT 58/55, HCV RNA 3390 UI/ml genotipo 1b, fattore reumatoide assente, ANA 1:1280 con pattern omogeneo/nucleolare, Ab anti SS-A nativo pos e Ab anti P ribosomiale, C3 0.44 gr/l (v.n. 0.9-1.8) C4 0.08 gr/l (0.1- 0.4), es urine normale con un pattern bioumorale suggestivo per una forma di lupus eritematoso.

La paziente, previo consenso informato, viene arruolata nell’ottobre 2015 a trattamento con ombitasvir, paritaprevir, ritonavir, dasabuvir e ribavirina per 12 settimane; sostiene il trattamento senza particolari problemi, senza presentare una anemizzazione clinicamente rilevabile (il nadir dell’emoglobina è stato di rilevato alla 6^ settimana con 10 gr/dl), né altri effetti collaterali e ha completato lo schema terapeutico raggiungendo la risposta virologica già alla quarta settimana; la risposta confermata anche a fine trattamento e a 12 e 24 settimane dalla fine dello stesso.

Nel corso della terapia la paziente ha presentato già alla quarta settimana miglioramento delle manifestazioni cutanee (Fig 4), con completa scomparsa delle stesse a fine trattamento, risultato confermato ai successivi controlli (Fig 5). Agli ultimi controlli a circa 10 mesi dalla fine della terapia la paziente non presenta inoltre segni di scompenso della malattia epatica, aminotrasferasi nella norma e HCV RNA negativo, inoltre una riduzione del titolo degli ANA a 1:160 e normalizzazione del complemento; si conferma un lieve aumento della glicemia a digiuno.

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Fig. 5

Fig. 4

Il caso clinico presentato è paradigmatico nel dimostrare la correlazione fra la presenza del virus C dell’epatite e alcune forme localizzate e sistemiche di malattie autoimmunitarie, quali il lupus eritematoso e il lichen ruben planus (1, 2), raggiungendo, per ciò che riguarda le manifestazioni cutanee; in letteratura la prevalenza di dermatopatie è di circa il 20% in questo gruppo di pazienti (3); tale correlazione è altresì dimostrata dalla remissione di queste manifestazioni cliniche all’ottenimento della risposta virologica. L’era dei nuovi antivirali diretti nella cura di queste patologie extraepatiche da virus C apre degli scenari del tutto innovativi in termini di efficacia e manegevolezza, del tutto impensabili all’epoca dei pregressi trattamenti con interferone e ribavirina, farmaci addirittura controindicati in questi contesti clinici.

Bibliografia 1) HCV-related autoimmune and neoplastic disorders: the HCV syndrome. Ferri C. et al Dig Liver Dis. 2007 Sep;39 Suppl 1:S13-21. Review.

2) Hepatitis C virus syndrome: A constellation of organ- and non-organ specific autoimmune disorders, B-cell non-Hodgkin's lymphoma, and cancer. Ferri C. et al World J Hepatol. 2015 Mar 27;7(3):327-43.

3) Extrahepatic manifestations associated with hepatitis C virus infection. A prospective multicenter study of 321 patients. The GERMIVIC. Groupe d'Etude et de Recherche en Medecine Interne et Maladies Infectieuses sur le Virus de l'Hepatite C. Cacoub P. et al Medicine 2000 Jan;79(1):47-56.

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Utilità della risonanza magnetica nella diagnosi di spondiloartrite a coinvolgimento assiale ed in fase preradiografica: descrizione di un caso clinico

Sandro Bello U.O. Reumatologia Ospedale Policlinico Bari

Clinical case Una donna caucasica di 54 anni giungeva alla nostra osservazione lamentando dolore al fianco destro ed in regione lombosacrale da 8 anni circa e peggioramento dei sintomi negli ultimi 10 mesi;tale sintomatologia presentava solo alcune caratteristiche del dolore infiammatorio ed associava a rigidità mattutina intensa ma di durata non superiore a15 minuti;il dolore aveva mantenuto nel corso degli anni un andamento flussionario e resistente a varie terapie con FANS,steroidi ed infiltrazioni intrarticolari praticate nell’anca destra dopo la diagnosi di coxartrosi; relativamente agli ultimi mesi la paziente riferiva discreta astenia e facile faticabilità degli arti inferiori. La paziente riferiva familiarità per artrite reumatoide da parte della madre; nulla di rilevante risultava dall’anamnesi fisiologica e patologica remota,fatta eccezione per tiroidite autoimmune di cui la paziente soffriva da circa 20 anni. All’esame obiettivo nessuna articolazione risultava tumefatta;dolente e lievemente limitata appariva l’anca destra ai movimenti di rotazione interna ed esterna e dolente risultava la regione trocanterica bilateralmente alla palpazioni ed ai movimenti di abduzione ed intrarotazione della coscia; lievemente dolenti si rivelavano le manovre di sollecitazione dell’articolazione sacroiliaca a sinistra,mentre normali risultavano le valutazioni antropometriche del rachide (distanza trago to wall 11 cm a dx ed a sx; rotazione cervicale 75° a dx e 65 a sx; espansione toracica 4 cm;flessione laterale15 cm a dx ed a sx; test di Schober mod 6 cm; distanza finger to floor 0 cm;massima distanza intermalleolare 90 cm;BASMI 2.3/10);l’esame di cute ed annessi rivelava la presenza di una chiazza psoriasica a livello del solco intergluteo e di onicolisi in alcune dita dei piedi. Tra gli esami della routine ematochimica nella norma risultavano l’esame emocromocitometrico, l’esame standard delle urine, gli enzimi epatici (GOT,GPT,ɣ-GT,ALP),la funzionalità renale (creatinina, azotemia),le indagini metaboliche (glice-

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mia,uricemia,colesterolemia totale e frazionata,trigliceride mia),la funzionalità tiroidea(FT3,FT4,TSH),gli enzimi muscolari (CPK,LDH),la sideremia e la ferritinemia; negativa risultava inoltre la ricerca del FR,degli ANA e degli anticorpi anti CCP ed anti ds-DNA,mentre positiva risultava la ricerca di anticorpi anti-tiroide (anti TG 235 IU/ml; anti TPO 465 IU/ml); nella norma risultavano i markers epatitici B e C,la reazione intradermica di Mantoux e gli indici di flogosi (VES 1°ora 7 mm; PCR 5 mg/L). La tipizzazione HLA evidenziava la presenza dei seguenti antigeni;A2,A24,B18,B35,B50,Cw4,Cw6,DR51, DR52,DQB103,DQB105. Tra gli esami strumentali nulla di rilevante si riscontrava alle radiografie di torace e bacino,tranne che iniziale sclerosi dei tetti acetabolari con spessore della rima conservato in entrambe le articolazioni coxofemorali;la mineralometria ossea eseguita con tecnica DXA riportava presenza di osteoporosi a livello vertebrale (T-Score L1-L4:-2.7) ed osteopenia a livello del femore prossimale (T-Score collo:-1.9). L’esame RMN del rachide in toto e delle articolazioni sacroiliache, eseguito con sequenze in T1,T2 fat saturation e T1 fat saturation dopo gadolinio evidenziava area di edema della spongiosa sul versante sacrale dell’articolazione sacroiliaca sinistra apprezzabile in più di una slices (fig.1),osteoartrite interapofisaria in fase di attiva infiammazione tra L2 ed L4 bilateralmente, osteocondrosi intersomatica tra C5 e C6 e fra D10 e D11 in fase di attiva infiammazione (fig.2).

Fig. 1

RMN articolazioni sacroiliache. Le sequenze assiale e coronale in T2 fat saturation (sopra) mostrano ipersegnale a livello sacrale della porzione anteroinferiore della sacroiliaca sinistra. Le sequenze assiale e coronale in T1fat saturation dopo gadolinio (sotto) mostrano enhancement nella stessa regione (frecce).

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Fig. 2

RMN del rachide dorsale. La sequenza sagittale in T2 fat saturation mostra ipersegnale a livello della porzione angolare posteriore inferiore del soma di D10 ed in sede angolare posteriore superiore del soma di D11. La sequenza sagittale in T1 fat saturation dopo gadolinio mostra enhancement nella stessa sede.

L’esame RMN delle articolazioni coxofemorali eseguito con sequenze STIR documentava ipersegnale da edema osseo a livello del versante esterno della cavità acetabolare destra,modesto versamento articolare bilaterale e segni di entesite all’inserzione tendinea dei muscoli glutei sul grande trocantere bilateralmente; l’esame ecografico delle anche confermava la presenza di modico versamento articolare bilaterale più evidente a destra (fig.3). I dati anamnestici, clinici,bioumorali e strumentali consentivano sia la diagnosi di artrite psoriasica classificata secondo i criteri CASPAR,sia di spondiloartrite assiale classificata secondo i criteri ASAS. Veniva quindi avviata terapia a base methotrexato 15 mg sc/settimana,6metilprednisolone 4 mg/die per os con tapering fino a sospensione e etoricoxib 90 mg OD, in associazione a bisfosfonati e vitamina D. A distanza di 3 mesi la paziente riferiva solo lieve migliora! mento della sintomatologia e la clinimetria indicava la malattia in fase di attività (BASDAI: 4.47; ASDAS pcr: 2.8; ASDAS ves: 2.4);ciò motivava quindi l’avvio della terapia biologica;la diagnosi di artrite psoriasica e di spondiloartrite assiale in fase preradiografica incoraggiavano la scelta di adalimumab,l’unico anti TNF con indicazione per ambedue le diagnosi.

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Fig. 3 A sinistra:RMN articolazioni coxofemorali;la sequenza coronale in STIR documenta ipersegnale da edema osseo a livello del versante esterno della cavità acetabolare destra e modesto versamento articolare bilaterale.

A destra:ecografia comparativa delle anche documenta versamento articolare maggiormente evidente a destra.

Bibliografia 1) Taylor W, Gladman D, Helliwell P, et al. Classification criteria for psoriatic arthritis: development of new criteria from a large international study. Arthritis Rheum.

2006;54:2665-2673.

2) Rudwaleit M, Landewè R, van der Heyde D, et al. “The development of Assessment of SpondyloArthritis international Society classification criteria for axial spondyloarthritis (part I): classification of paper patients by expert opinion including uncertainty appraisal”. Ann Rheum Dis. 2009 june; 68(6): 770-6 3) Rudwaleit M, van der Heyde D, Landewè R. et al. “The development of Assessment of SpondyloArthritis international Society classification criteria for axial spondyloarthritis (part II): validation and final selection”. Ann Rheum Dis. 2009 june; 68(6): 777-83.

4) Haibel H, Rudwaleit M, Listing J. et al. “Efficacy of adalimumab in the treatment of axial spondylarthritis without radiographically defined sacroiliitis: results of a twelve-week randomized, double-blind, placebo-controlled trial followed by an open-label extension up to week fifty-two”. Arthritis Rheum. 2008 Jul; 58(7): 1981-91 5) Sieper J, Rudwaleit M, Baraliakos X. et al. “The assessment of spondyloarthritis international society (ASAS) handbook: a guide to asses spondyloarthritis”. Ann. Rheum.Dis. 2009; 68(II): 1-44.

6) Sieper J1, van der Heijde D, Dougados M et al. Efficacy and safety of adalimumab in patients with non-radiographic axial spondyloarthritis: results of a randomised placebo-controlled trial (ABILITY-1). Ann Rheum Dis. 2013 Jun;72(6):815-22.

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Nuovi approcci terapeutici per il trattamento di pazienti con recidiva di epatite C dopo il trapianto di fegato Massimo De Luca Epatologia – Dipartimenti dei Trapianti - AORN “A. Cardarelli” La cirrosi epatica dovuta ad infezione cronica da Virus dell’epatite C (HCV) rappresenta una delle principali indicazioni per il trapianto di fegato in tutto il mondo e quella più frequente nel nostro Paese. Infatti, tra le cause che rendono necessario un trapianto di fegato, quella più frequente è imputabile a infezioni virali (31% virus dell’epatite C, 18% virus dell’epatite B), seguite dall’abuso alcolico (cirrosi alcolica, 12%) e poi da altre quali le malattie metaboliche o genetiche [Thomas D.L., 2013]. La recidiva di epatite C dopo il trapianto è universale. Ciò determina una malattia epatica cronica de novo e il rapido sviluppo di cirrosi, con una progressione accelerata rispetto a quanto accada nei pazienti non-trapiantati. Le manifestazioni istologiche dell’epatite C cronica si osservano in circa il 70-90% dei pazienti dopo un anno dal trapianto, e nel 90-95% di essi dopo cinque anni. [Vinaixa C. et al., 2013]. Lo sviluppo di cirrosi, inoltre, determina una rapida progressione verso l’insufficienza epatica e la morte o un ulteriore trapianto. Per queste ragioni, la recidiva di epatite C dopo il trapianto rappresenta la principale causa di mortalità nei pazienti che ricevono un trapianto di fegato, e l’eradicazione virale nei pazienti trapiantati rappresenta la strategia principale per migliorare la loro aspettativa di vita [Picciotto F.P. et al., 2007].

Prima dell’introduzione dei nuovi farmaci antivirali ad azione diretta, la terapia antivirale adottata nei pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C era basata sull’utilizzo combinato di interferone alfa-2 pegilato e ribavirina. Tuttavia, questo approccio terapeutico è risultato poco efficace e scarsamente tollerato nei pazienti epatotrapiantati, costantemente sottoposti a terapia antirigetto con farmaci immunosoppressori, rispetto ai pazienti non-trapiantati, come dimostrato in uno studio condotto su pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C dal nostro gruppo (Epatologia-Centro Trapianti, AORN A. Cardarelli, Napoli) [Picciotto F.P. et al., 2007].

Alla luce delle nuove terapia antivirali abbiamo quindi valutato l’efficacia della nuova terapia antivirale basata sull’utilizzo dei nuovi farmaci antivirali ad azione diretta (Direct Antiviral Agents – DAA) in pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C in cura presso il nostro Centro.

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Infezione da virus dell’epatite C L’infezione da virus dell’epatite C (Hepatitis C Virus, HCV), rappresenta un problema importante per la sanità pubblica mondiale, sia perché l’infezione è estremamente diffusa sia perché l’80% dei soggetti HCV-positivi manifesta una cronicizzazione dell’infezione con lo sviluppo di cirrosi e/o epatocarcinoma, in circa 15-20% dei casi dopo 20-30 anni dall’infezione.

I notevoli progressi raggiunti nella comprensione del meccanismo che regola la replicazione di HCV hanno consentito lo sviluppo di una nuova classe di farmaci antivirali ad azione diretta contro HCV (Directly Acting Antivirals - DAA).

Nonostante tutti i progressi compiuti nella gestione della malattia, lo sviluppo di un vaccino per HCV rimane ancora un traguardo sfuggente [Preciado M.V. et al., 2014].

Il virus dell’epatite C Il genoma di HCV Il virus dell’epatite C appartiene alla famiglia Flaviviridae, i cui membri sono classificati in tre generi: Flavivirus, Pestivirus ed Hepacivirus. Sulla base di analisi di sequenza, HCV è classificato nel genere Hepacivirus, insieme al GB-virus B e ai virus recentemente identificati NPHV (Non Primate Hepacivirus), RHV (Rodent Hepacivirus) e BHV (Bat Bepaciviruses) [Scheel et al., 2013].

Si tratta di un virus di dimensioni assai ridotte, il cui virione presenta una morfologia sferoidale con diametro di 50-80 nm. È composto da un nucleocapside a simmetria icosaedrica, costituito da copie multiple della proteina core e dal genoma virale, e da un involucro pericapsidico detto envelope (E), ovvero un doppio strato fosfolipidico di origine cellulare in cui sono inserite le glicoproteine virali E1 ed E2 [Figura 1].

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Figura 1. La struttura dell’Hepatitis C Virus (HCV) (modificata da Goossens et al., 2016).

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Il genoma di HCV è costituito da una molecola di RNA a singolo filamento positivo composta da circa 9.600 nucleotidi (nt), con una open reading frame (ORF) che codifica per una poliproteina di circa 3000 aminoacidi (aa).

Le proteine strutturali sono codificate dalla regione N-terminale dell'ORF, mentre la restante parte dell’ORF codifica per le proteine non strutturali. L'ORF è affiancata al 5' e al 3' da regioni non trascritte (UTR), che svolgono un ruolo importante nella traduzione della poliproteina e nella replicazione dell’RNA. La poliproteina codificata dall’ORF di HCV viene processata in tre proteine strutturali (C, E1, E2) e sette proteine non strutturali (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [Figura 2].

Figura 2.

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Struttura ed organizzazione del genoma di HCV. In alto è rappresentato il genoma di 9.6 kb di RNA a singo-

lo filamento positivo. La traduzione porta alla sintesi di una poliproteina in cui sono indicati i siti di taglio: i rombi indicano i siti riconosciuti dalle peptidasi del segnale; le frecce indicano i siti di scissione fra le proteine non strutturali. Nella parte più bassa della figura è rappresentato il prodotto del processamento della poliproteina; i punti sulle proteine E1 ed E2 ne indicano la glicosilazione (modificata da Moradpour D. et al., 2007).

Il core di HCV è una proteina altamente conservata che costituisce il nucleocapside virale e svolge un ruolo nella patogenesi. E1 e E2 sono proteine altamente glicosilate che partecipano all'ingresso nella cellula. E2 contiene tre regioni ipervariabili (HVR), note come HVR 1-3, che subiscono una continua pressione di selezione esercitata dal sistema immunitario dell’ospite. P7 è un polipeptide di 63 aa che funge da sequenza segnale per la traslocazione di NS2 nel lume del reticolo endoplasmatico per un ulteriore clivaggio. P7 è anche essenziale per l'assemblaggio delle particelle e il rilascio di virioni infettivi. NS2 è una proteina transmembrana richiesta per la replicazione virale, mentre NS3 è la proteasi e NTPasi/elicasi di HCV. La proteasi di HCV interferisce con le vie di segnalazione dell'interferone (IFN) e dei recettori toll-like 3 (TLR3) attraverso il clivaggio delle proteine dell'ospite, incluso il dominio di reclutamento delle caspasi della proteina di segnalazione antivirale mitocondriale

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(MAVS), e la proteina TRIF (TIR-domain containing adapter-inducing interferon-β). NS4A agisce come un cofattore per la proteasi NS3, mentre NS4B è una piccola proteina idrofobica richiesta per il reclutamento di altre proteine virali.

NS5A è una fosfoproteina idrofila necessaria per la replicazione virale. Infine, NS5B è l’RNA-polimerasi RNA-dipendente di HCV (RdRp), che è priva di proofreading e di meccanismi di correzione degli errori, il che risulta in un processo di replicazione con un’elevata tendenza a commettere errori [Preciado M.V. et al., 2014].

Tutti questi aspetti di virologia molecolare sono importanti anche per la comprensione dei meccanismi di azione con cui agiscono i nuovi farmaci antivirali ad azione diretta sul virus.

I genotipi di HCV La natura dell’eterogeneità genetica dell'HCV fu scoperta nei primi anni ‘90, e da allora sono stati utilizzati diversi metodi per la classificazione delle sue varianti.

Il metodo di classificazione più comune a livello internazionale prevede la suddivisione in 6 differenti genotipi, ciascuno dei quali contiene un numero variabile di "sottotipi".

I genotipi presentano differenze nell’ordine del 31-33% a livello di sequenza nucleotidica, rispetto al 20-25% di differenza che si osserva tra i sottotipi. Nonostante la diversità sequenziale di HCV, tutti i genotipi condividono un identico complemento di geni co-lineari di dimensioni simili o identiche nella grande ORF, e le interrelazioni genetiche tra di loro sono coerenti per tutto il genoma. Ciò ha permesso di classificare molte delle varianti attualmente ! riconosciute di HCV, basate su sequenze parziali di regioni subgenomiche come il core/E1 o NS5B. Le regioni più conservate del genoma di HCV sono la regione 5'-UTR e le ultime 99 basi della regione 3'-UTR. Anche la sequenza aminoacidica derivata dal gene del core è relativamente conservata tra i genotipi. La regione più variabile del genoma di HCV è la regione ipervariabile di E2, che, con un grande numero di variazioni amminoacidiche probabilmente selezionate in modo immunitario, risulta la più influente nel determinare la filogenesi di HCV. Ogni genotipo di HCV comprende diverse varianti più strettamente correlate tra di loro, con differenze attorno al 20-25% dei nucleotidi, se confrontate con le differenze di oltre il 30% nella sequenza nucleotidica che ci sono tra i diversi genotipi. Le varianti più comuni trovate nei paesi occidentali sono state classificate con l’aggiunta del sottotipo, come 1a e 1b nel genotipo 1, e 2a, 2b e 2c nel genotipo 2 [Simmonds P. et al., 2005].

I genotipi di HCV mostrano una distribuzione caratteristica in diverse regioni geografiche. I genotipi 1, 2 e 3 sono distribuiti in tutto il mondo. I genotipi 1 e 2, inoltre, sono endemici in Africa occidentale, mentre il genotipo 3 è endemico nel subcontinente indiano. I genotipi 4 e 5 sono presenti principalmente in Africa, e il genotipo 4 è endemico soprattutto in Egitto e Africa centrale. Il genotipo 6, infine, è endemico in Asia.

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Il genotipo 2 è quello con la discendenza più antica, seguito dai genotipi 3, 5 e 6, mentre i genotipi 1 e 4 sono emersi più recentemente. I genotipi distribuiti a livello globale sono indicati come epidemici, e la loro rapida diffusione nel corso del secolo scorso è attribuita principalmente alle modalità di trasmissione, tra cui l'uso di droghe per via endovenosa, trasmissione nosocomiale e trasfusioni di sangue. I genotipi endemici sono generalmente molto divergenti e limitati a regioni geografiche ben definite [Preciado M.V. et al., 2014].

Meccanismo d’azione Ingresso nella cellula. HCV viaggia in circolo con differenti componenti sierici, quali immunoglobuline e diverse classi di lipoproteine. I virioni circolanti possono legarsi direttamente alle LDL (Low Density Lipoprotein) e alle VLDL (Very Low Density Lipoprotein) nel sangue, oppure interagire con le componenti delle lipoproteine durante l’assemblaggio del virus ed essere secrete insieme alle VLDL. Le particelle altamente infettive di HCV che sono associate a VLDL, sono chiamate “particelle lipovirali” (LVPs). Esse sono composte da lipoproteine ricche di trigliceridi contenenti le apolipoproteine ApoB, ApoE e ApoC1, nucleocapsidi virali e le glicoproteine dell’envelope E1 e E2.

HCV circolante entra nel fegato attraverso il sangue sinusoidale. Le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSECs) e le cellule di Kupffer esprimono rispettivamente i recettori L-SIGN (liver/lymph-node-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing integrin) e DC-SIGN (dendritic-cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin).

Sia L-SIGN che DC-SIGN legano la proteina E2 di HCV con elevata affinità, suggerendo che possano catturare le particelle virali dal sangue e trasmettere il virus agli epatociti.

L’attraversamento dall'endotelio consente al virus di interagire con gli epatociti. Si ritiene che i glicosaminoglicani (GAGs) e il recettore dell’LDL (LDLR) contribuiscano a concentrare le particelle di HCV sulla superficie cellulare. Negli epatociti, i GAGs altamente solfati (HS GAGs) fungono come primi siti di attacco.

Data l'associazione tra HCV e lipoproteine nel sangue del paziente, il recettore LDLR è stato proposto come un altro potenziale fattore di attacco per HCV. Tuttavia, nonostante le particelle di HCV si leghino all’LDLR, sembra che questa interazione non contribuisca al processo d’ingresso.

Dopo l'attacco iniziale alla superficie della cellula ospite, il virus interagisce con corecettori e altri fattori di ingresso specifici, il che porta a dei riarrangiamenti molecolari della membrana plasmatica e, successivamente, provoca l'internalizzazione virale. I dati attuali supportano che l’ingresso di HCV avvenga grazie ad una complessa interazione tra le glicoproteine E1 e E2 codificate da HCV e quattro recettori: SR-BI (scavenger receptor class B type 1), CD81 (tetraspanina) e le tight junction proteins CLDN1 (claudina-1) e OCLN (occludina). Inoltre,

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. il recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR), NPC1L1 (cholesterol transporter Niemann-Pick C1-like 1) e il recettore della transferrina (TfR1) sono anch’essi importanti cofattori per l'ingresso di HCV [Figura 3].

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Figura 3.

Ingresso di HCV nell’epatocita. HCV si attacca alla superficie cellulare mediante interazioni deboli con glico-

samminoglicani (GAG) e/o LDLR; successivamente, stabilisce un legame ad alta affinità con un recettore specifico come CD81 ed SR-B1; infine, il complesso virus-recettore trasloca alle giunzioni strette, dove Claudina ed Occludina1 inducono l‟endocitosi mediata da recettore (modificata da Zhu Y.Z. et al., 2014)

1.L’LVP del virus dell’epatite C (HCV) si lega ai glicosamminoglicani (GAGs) e ai recettori delle LDL (LDLR), che hanno elevata affinità con ApoE. Il recettore SRBI svolge un ruolo importante, sia nel legame che nei passaggi post-legame, attraverso l'interazione con la lipoproteina associata al virione o E2.

2.Il legame tra SRBI e le particelle di HCV consente l'esposizione di siti di legame del recettore CD81 su E2 e il trasferimento delle particelle virali su CD81. In seguito all'interazione con E2, CD81 attiva i membri della famiglia delle Rho GTPasi che promuovono il rimodellamento dell'actina, permettendo che il complesso E2-CD81 entri in contatto con CLDN1.

Due RTK (recettori tirosin chinasici), quali il recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR) ed EphA2, facilitano la formazione del complesso CD81-CLDN1 tramite la via di segnalazione EGFR/Shc1/Grb2/HRas attivata da EGFR. L'associazione CD81-CLDN1 è inoltre regolata dalla PKA (protein-chinasi A) in maniera cAMP-dipendente, per trattenere CLDN1 sulla membrana plasmatica. Recentemente è stato rilevato anche il coinvolgimento di MKNK1, che agisce a valle di EGFR come fattore per l’ingresso di HCV. 3.Il virione è innescato dall'attività di fusione a basso pH di CD81 e CLDN1 e trasloca verso le giunzioni occludenti (tight junctions) per essere endocitato. L'internalizzazione virale è

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. dipendente dall'endocitosi mediata da clatrina; l’occludina (OCLN) può contribuire a questo processo. TfR1 svolge un ruolo nell'infezione da HCV a livello dell’ingresso mediato da glicoproteine, agisce dopo CD81 ed è possibile che sia coinvolto nell'internalizzazione delle particelle di HCV. Anche le vie di segnalazione di PI3K-AKT e PI4K sono impegnate nella fase finale dell'ingresso di HCV, ma con meccanismi che devono ancora essere studiati.

4.Dopo l'internalizzazione, la fusione di HCV avviene negli endosomi precoci. Per il processo di fusione sono necessari un ambiente a basso pH e il colesterolo associato al virione.

NPC1L1 può svolgere un ruolo nel processo tramite il trasporto del colesterolo. Dopo la fusione tra l’envelope virale e la membrana endosomiale, il genoma virale viene rilasciato nel citosol e avviene la replicazione [Zhu Y.Z. et al., 2014].

Trascrizione dell’RNA e processamento post-trascrizionale.

La rimozione dei nucleocapsidi virali libera le molecole di RNA genomico nel citoplasma cellulare, dove vengono utilizzate per la sintesi della poliproteina di HCV. La traduzione del genoma di HCV è sotto il controllo dell'IRES, dei domini da II a IV della regione 5'-UTR e dei primi nucleotidi della regione che codifica per il core. L’IRES di HCV ha la capacità di formare un complesso di pre-inizio stabile legando direttamente la subunità ribosomiale 40S senza la necessità dei fattori di inizio canonici della traduzione; due consecutive idrolisi di GTP consentono l’associazione anche della subunità ribosomiale 60S, formando così un ribosoma 80S funzionale che inizia la sintesi proteica virale.

La traduzione del genoma di HCV genera un grande precursore della poliproteina, che è diretto alla membrana del reticolo endoplasmatico per la traslocazione di E1 nel lume, un processo mediato da una sequenza di segnale interna interposta tra le sequenze del core e di E1. Il clivaggio della sequenza di segnale da parte delle peptidasi del segnale dell’ospite produce la forma immatura della proteina del core (P23). Il peptide di segnale viene ulteriormente processato da un peptidasi di segnale dell’ospite (SPP, una proteina che si trova nella membrana del reticolo endoplasmatico) per ottenere la forma matura della proteina del core (P21). La peptidasi del segnale dell’ospite assicura anche la scissione del legame E1-E2 nel lume del reticolo. E1 e E2 successivamente subiscono diversi passaggi di maturazione, inclusa la N-glicosilazione, la conformazione e l'assemblaggio di eterodimeri E1-E2.

L'auto-proteasi zinco-dipendente NS2-3 assicura la scissione in cis di NS3 da NS2. NS3 deve assemblarsi con il suo cofattore NS4A per catalizzare la scissione in cis del legame NS3-NS4A e la scissione in trans di tutti i legami a valle, tra cui NS4A-NS4B, NS4B-NS5A e NS5A-NS5B [Chevaliez S. et al., 2006].

Replicazione L'infezione con un virus a RNA a singolo filamento positivo come HCV comporta il riarran-

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. giamento delle membrane intracellulari, un presupposto per la formazione di un complesso di replicazione che associa proteine virali, componenti cellulari e filamenti nascenti di RNA. La proteina NS4B di HCV sembra essere sufficiente per indurre la formazione di una rete membranosa, derivata da membrane del reticolo endoplasmatico, e che è ricca di colesterolo e di acidi grassi, il cui grado di saturazione (che influenza la fluidità della membrana) modula la replicazione dell’HCV. Nel complesso, la rete membranosa è costituita da piccole vescicole incorporate in una matrice di membrana, formando un complesso multiproteico associato che contiene tutte le proteine non strutturali di HCV. Il meccanismo preciso con cui avviene la replicazione dell'HCV non è ancora del tutto compreso, ma, per analogia con altri virus a RNA a singolo filamento positivo, la replicazione dell'HCV è ritenuta semi-conservativa e asimmetrica con due fasi, entrambe catalizzate dall’RNA-polimerasi RNA-dipendente di HCV, NS5B (RdRp). L’RNA genomico a filamento positivo serve durante il primo passaggio come stampo per la sintesi di un intermedio di replicazione a filamento negativo. Nel secondo passaggio, l’RNA a filamento negativo serve come stampo per produrre numerosi filamenti a polarità positiva che saranno successivamente utilizzati per la traduzione della poliproteina, la sintesi di nuovi intermedi di replicazione o per l’imballaggio in nuove particelle virali. Inizialmente era stato ipotizzato che NS5B-RdRp catalizzasse l'inizio della sintesi di RNA dipendendo da un primer ibridato allo stampo di RNA; più recentemente, l'RdRp di HCV si è dimostrata essere in grado di avviare de novo la sintesi di RNA in determinate condizioni sperimentali [Chevaliez S. et al., 2006].

Assemblaggio e rilascio L'assemblaggio inizia sul lato citosolico della membrana del reticolo endoplasmatico [Figura 4] e la maturazione completa avviene nel lume del reticolo prima del rilascio dalla cellula.

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Figura 4. Assemblaggio e rilascio di HCV (modificata da Jones D.M. et al., 2010) 18

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•Nelle prime fasi dell'assemblaggio, le proteine del core bersagliano le gocce lipidiche (lipid droplet, LD), ricoprendo la superficie dell'organello. I complessi della replicazione virali (replication complex, RC) vengono reclutati sulla superficie delle LD in maniera core-dipendente e NS5A-dipendente, per consentire il trasferimento dell’RNA replicato dagli RC e l'incapsidazione del genoma. Durante questa fase, NS3 è necessaria per la formazione di particelle contenenti il core, che si presume rappresentino virioni non infettivi che subiranno ulteriori fasi di maturazione [Figura 4].

•Le fasi più avanzate dell’assemblaggio comportano l'acquisizione di un envelope lipidico e l'incorporazione delle glicoproteine E1 ed E2 in virioni. NS2 sembra conferire infettività ai virioni, forse mediando un'interazione tra i complessi glicoproteici (E1 ed E2) e le particelle immature. Durante la maturazione, le particelle virali nascenti si combinano con delle pre-VLDL, con lipidi sotto forma di LD luminali, e con altri componenti lipoproteici come ApoE, per generare infine le particelle lipovirali (LVPs) [Figura 4] [Jones D.M. et al., 2010].

Modalità di trasmissione La trasmissione dell’HCV avviene soprattutto attraverso vie parenterali. L'uso di droghe per via endovenosa e pratiche sanitarie non sicure hanno portato ad un gran numero di infezioni da HCV nel corso del XX secolo. L'uso di droghe endovenose illegali e pratiche sessuali non sicure, facilitano in modo significativo la trasmissione del virus, e creano condizioni ottimali per l'evoluzione molecolare rapida dell'HCV. Tuttavia, le vie di trasmissione dell'HCV sono difficili da identificare per diversi motivi. Il lungo periodo d’incubazione rende difficile collegare i vari casi ad una determinata modalità di infezione. Inoltre, le infezioni acute da HCV sono di solito asintomatiche, rendendo difficile l'identificazione dei casi [Preciado et al., 2014].

Di seguito sono indicate le principali modalità di trasmissione dell’epatite C. •Trasfusioni di sangue e trapianti d’organo: la trasfusione di prodotti sanguigni è il più comune fattore di rischio tra i pazienti infetti, e determinava un rischio d’infezione del 10% prima che venisse introdotto lo screening dei donatori di sangue e organi. I miglioramenti nei test per la rilevazione degli anticorpi anti-HCV hanno ridotto il rischio d’infezione ad una frequenza di circa 1:100.000 unità. L’introduzione di nuove tecnologie, come il Nucleic Acid Amplification Testing (NAT), ha ridotto ulteriormente il rischio residuo. Tuttavia, una significativa porzione dei pazienti infetti non ha una storia personale di trasfusioni di sangue o utilizzo di droghe iniettabili; questi casi sono stati correlati principalmente all’impiego di pratiche sanitarie non sicure, quali, ad esempio, l’uso di siringhe di vetro non sterilizzate in maniera adeguata.

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•Utilizzo di droghe per via endovenosa: l'uso di aghi e accessori contaminati è una delle più efficaci modalità di trasmissione dell’HCV. È stato dimostrato che il 65% degli utilizzatori di droghe per via endovenosa acquisisce l'infezione da HCV durante il primo anno di utilizzo. Anche i tatuaggi eseguiti con attrezzature non sterili rientrano in questa via di trasmissione.

•Trasmissione sessuale: l'infezione da HCV non è trasmessa in maniera efficiente per via sessuale. Il rischio di trasmissione tra partner sessuali stabili è trascurabile. Il rischio aumenta concretamente nel caso di partner sessuali coinfettati da HCV e HIV. •Trasmissione domestica: l'esposizione percutanea o della mucosa attraverso strumenti per l'igiene personale, come spazzolini da denti e rasoi, rappresenta un possibile meccanismo di trasmissione nel caso ci siano perdite di sangue, pertanto richiedono una particolare cautela.

•Trasmissione verticale: la trasmissione verticale dell'infezione da HCV avviene al momento della nascita in circa il 5% dei bambini nati da una madre infetta, con il rischio che raddoppia per i neonati nati da madri con coinfezione HIV-HCV. Non sembra che la modalità con cui avvenga il parto, sia esso per via vaginale che tramite taglio cesareo, abbia influenza sulla trasmissione.

•Operatori sanitari: l'infezione da HCV può essere trasmessa tramite aghi o altre lesioni percutanee, e raramente per esposizione della mucosa, negli operatori sanitari. La maggior parte degli incidenti si verificano con siringhe monouso, seguite da aghi di sutura e bisturi. Il rischio di acquisire l'infezione da HCV dopo un incidente con un ago è di circa 1.8% [Soza A. et al., 2010].

Epidemiologia Le stime epidemiologiche riguardo alla diffusione dell’epatite C sono spesso variabili da lavoro a lavoro, sia per la carenza di dati, che per la selezione di popolazioni che non sono del tutto rappresentative della popolazione generale.

L’incidenza dell’epatite C è aumentata notevolmente attorno alla metà del XX secolo, a causa del largo uso di procedure parenterali e di droghe per via endovenosa. A partire dalla scoperta dell’HCV, l’incidenza della malattia è diminuita, grazie all'introduzione di test per lo screening di HCV nel sangue, al miglioramento nella gestione dell'infezione e a pratiche di iniezione più sicure tra i tossicodipendenti, come dimostrano i dati del Sistema Epidemiologico Integrato dell’Epatite Virale Acuta (SEIEVA, Istituto Superiore di Sanità, 2015) dell’Istituto Superiore di Sanità che registra e pubblica ogni anno i dati relativi ai casi notificati di epatite vbirale acuta sul sito www.iss.it/seieva/. La figura mostra l’andamento dei tassi di incidenza per 100,000 abitanti di epatite virale acuta in Italia negli ultimi 30 anni [Figura 5]. Come si evince dalla figura 5, negli ultimi 30 anni l'infezione da HCV è notevolmente

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diminuita in Italia con una riduzione dei nuovi casi di infezione acuta negli ultimi 10 anni da 0,5 a 0,2 ogni 100.000 abitanti, con un tasso di mortalità collegata alla patologia di circa 8-10 mila persone/anno. Ciò è attribuibile sia ad una maggior sicurezza nelle trasfusioni di sangue (oggi considerabili del tutto innocue da questo punto di vista) sia per il miglioramento delle condizioni sanitarie, pur essendoci una continua espansione dell'uso di droghe per via endovenosa ed un incremento del fenomeno dell’ immigrazione di persone che vivono in aree ad elevata diffusione del virus, quali i Paesi dell’Est dell’Europa ed i Paesi del Nord Africa.

[ISTAT, Le principali cause di morte in Italia, 2012].

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Figura 5.

Tassi di incidenza per 100.000 abitanti delle epatiti virali, per anno (SEIEVA 1985-2015).

Fino al 2013 si riteneva che in tutto il mondo ci fossero circa 185 milioni di persone con una storia di infezione da HCV (positive alla presenza di anticorpi anti-HCV), di cui circa 130-150 milioni affette da infezione cronica (positive alla presenza di HCV-RNA) [WHO, 2016].

Stime più recenti indicano che la prevalenza dell’epatite C ed il numero totale di persone positive ai test sierologici siano in realtà molto più bassi. La prevalenza di persone anti-HCV positive è stata stimata essere di circa 1.6%, corrispondente a circa 110 milioni di persone con una storia di infezione da HCV; la prevalenza di persone HCV-RNA positive è stata stimata essere di circa 1.1%, corrispondente a circa 80 milioni di persone affette da infezione cronica da HCV, con un'ampia variabilità di distribuzione geografica [Gower E. et al., 2014].

L'OMS ha stimato che le prevalenze maggiori si registrano nell’Africa occidentale, Est Europa e Asia Centrale (>2.5%), e che le persone dipendenti da droghe per via endovenosa rappresentino il gruppo a più alta prevalenza (fino al 67%). Bisogna, tuttavia, sottolineare che tali dati potrebbero rappresentare una sottostima del reale quadro epidemiologico globa-

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le dell'epatite C, che decorre spesso in modo asintomatico in quanto chi contrae l'infezione può non manifestare anche per molti anni alcun segno della malattia.

Al momento attuale, in Europa, l'uso di droghe per via endovenosa è diventato il principale fattore di rischio per la trasmissione di HCV. L’Europa settentrionale presenta una prevalenza (la proporzione di individui di una popolazione che, in un dato momento, presentano la malattia) globale tra 0,1 e 1%. Nell’Europa centrale la prevalenza è intermedia, e varia dallo 0,2% nei Paesi Bassi all’1,2% in Francia; infine, nell'Europa meridionale e orientale, la prevalenza stimata dall’OMS è pari o superiore al 2,5% [Figura 6].

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Figura 6.

Prevalenza dell'HCV nel mondo (Gower E. et al., 2014).

L'infezione cronica interessa soprattutto la popolazione più anziana (> 60 anni) perché, in passato, la fonte principale di infezione era dovuta alle trasfusioni di sangue infetto e all'uso di strumenti medici non sterilizzati. Oggi, grazie all’introduzione dei test di screening sui donatori di sangue, la trasmissione per via trasfusionale è stata virtualmente eliminata, mentre rimangono attive la trasmissione con alcuni strumenti medici, la trasmissione sessuale (per lo più tra gli MSM – Men who have Sex with Men) ed alcuni comportamenti a rischio come tatuaggi, piercing e soprattutto lo scambio di aghi e siringhe per l'uso di droga per via endovenosa.

In Italia, la percentuale di soggetti infettati dall'HCV riportata dai principali studi è di circa il 2% della popolazione generale, con un gradiente che aumenta dal Nord verso il Sud e le isole, e con l'età (il 60% dei pazienti con epatite C, verosimilmente, ha più di 65 anni). Tuttavia, tali dati appaiono piuttosto obsoleti (ricavati da ricerche effettuate 20-25 anni fa), diso-

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mogenei per effetto della metodica di analisi utilizzata (studio di piccole ed isolate realtà) e, di conseguenza, verosimilmente non affidabili o comunque non più veritieri.

Nonostante i progressi compiuti nel prevenire la trasmissione della malattia, ed il costante e significativo calo dei tassi di incidenza, il numero di decessi all'anno per malattie connesse con l'HCV continua ad aumentare. Secondo le stime dello studio Global Burden of Disease, il numero di decessi dovuti all'epatite C è stato di 333.000 nel 1990, 499.000 nel 2010 e 704.000 nel 2013. L'aumento del numero di decessi riflette l'alta incidenza di epatite C durante la metà del XX secolo. Infatti, un elevato numero di persone che si sono infettate in quel periodo, stanno morendo a causa di cirrosi epatica ed epatocarcinoma correlati ad HCV, dato che queste complicazioni spesso richiedono decenni per svilupparsi. Per queste ragioni, si prevede che l'aumento del numero di decessi possa continuare ancora per alcuni anni [WHO, 2016].

Storia naturale dell’infezione da HCV L’epatite C esordisce come infezione acuta, che, tuttavia, è raramente diagnosticata perché la maggior parte degli individui con un’infezione acuta non presenta sintomi. Nell'ambito dei casi trasfusionali, in cui l'infezione acuta da HCV è stata meglio documentata, è stato stimato che il 70-80% dei casi risulta asintomatico. Solo il 20-30% circa degli adulti con infezione acuta di HCV può sviluppare sintomi clinici, che possono presentarsi da 3 a 12 settimane dopo l'esposizione. I sintomi possono comprendere malessere, debolezza, anoressia e ittero. I livelli di alanina aminotransferasi (ALT) e di HCV-RNA nel sangue cominciano ad aumentare considerevolmente dopo l'esposizione, raggiungendo il proprio picco poco prima dell'insorgenza dei sintomi.

Nei casi di epatite C acuta che guariscono spontaneamente, i sintomi possono durare diverse settimane e diminuire nel momento in cui i livelli di ALT e HCV-RNA diminuiscono. L'infezione acuta di HCV può essere grave, ma molto raramente causa un’epatite fulminante.

L'epatite C cronica è caratterizzata dalla persistenza dell'HCV-RNA nel sangue per almeno 6 mesi dopo l'inizio dell'infezione acuta. Solo il 15-25% dei pazienti guarisce spontaneamente, con l'HCV-RNA che diventa non rilevabile nel sangue e i livelli di ALT che ritornano alla normalità. Il restante 75-85% dei pazienti infetti sviluppa l'epatite cronica.

Il tasso di cronicizzazione dell’infezione da HCV è influenzato soprattutto da età al momento dell'infezione, sesso, etnia e sviluppo di ittero durante l'infezione acuta. Le persone con infezione da HCV in età giovanile, inferiore a 25 anni, hanno meno probabilità di sviluppare epatite C cronica rispetto a quelli infetti in età avanzata. Il tasso di cronicizzazione sembra, inoltre, essere più basso nelle donne, in particolare in quelle più giovani. Per quanto riguarda l’etnia, ci sono differenze significative nel tasso di cronicizzazione, nella risposta al trattamen-

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to e per lo sviluppo di complicanze; per ragioni non ancora chiare, sembra che gli afroamericani abbiano un tasso di cronicizzazione più elevato rispetto ai bianchi caucasici e agli ispanici. Infine, il tasso di cronicizzazione è più basso nei pazienti che sviluppano ittero o altri sintomi durante la fase acute dell'infezione da HCV, rispetto a quelli che sono anitterici.

Terapia L'obiettivo fondamentale per il trattamento dell'epatite C è l'eradicazione permanente del virus. La terapia antivirale inibisce la replicazione virale, riduce l'infezione di nuove cellule e/o accelera l’eliminazione delle cellule già infette. Anche nei casi in cui non si riesce ad ottenere l’eradicazione del virus, il trattamento può rallentare la progressione della malattia e ritardare le complicanze dell'infezione cronica da HCV [Palumbo E., 2011].

In seguito alla scoperta dell’agente eziologico responsabile dell’epatite C, l’attenzione della comunità scientifica si è da subito focalizzata sullo sviluppo di un vaccino. L'assenza di progressi nello sviluppo di un vaccino ha spostato l'attenzione sullo sviluppo di farmaci.

La terapia dell’epatite C ha subito un’evoluzione significativa negli anni [Figura 7].

Figura 7.

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Storia dei trattamenti standard dell’epatite C e miglioramenti dei tassi di SVR (modificata da Webster D.P. et al., 2015).

Inizialmente il trattamento consisteva in una monoterapia con interferone, ma pochi pazienti riuscivano ad ottenere una risposta virologica sostenuta (sustained virological response -

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SVR), ossia livelli di HCV RNA non rilevabili nel siero dopo 24 settimane dalla sospensione del trattamento [Ward J.W. et al., 2014]. I tassi di SVR sono notevolmente migliorati con l’introduzione della terapia basata sulla combinazione di interferone alfa-pegilato (IFN-PEG) e ribavirina (RBV), passando dal 5-15% circa, utilizzando l’interferone da solo, al 40-60% utilizzando la combinazione IFN-PEG/RBV [Ward R.P. et al., 2005].

Quindi, fino all’introduzione e all’approvazione dei DAA, il trattamento standard per l'epatite C cronica è stato la combinazione di IFN-PEG e RBV. L’IFN-PEG è un coniugato covalente di IFN α-2b ricombinante con monometossi polietilenglicole (PEG), che viene prodotto tramite la tecnica del DNA ricombinante, mediante la quale un clone del gene dell’interferone di leucociti umani viene inserito ed espresso in Escherichia coli [Palumbo E., 2011]. L'aggiunta di una catena laterale di polietilenglicole (PEGilazione) all'interferone, conferisce ad esso una biodisponibilità molto più lunga, consentendo di ridurre la frequenza delle iniezioni e raddoppiare il tasso di SVR [Ward R.P. et al., 2005].

Quando è in combinazione con l'interferone pegilato, la ribavirina migliora i tassi di risposta per la maggior parte dei pazienti, e, per questa ragione, la monoterapia basata sulla somministrazione del solo interferone non è più stata utilizzata, tranne che per gli individui per i quali la ribavirina fosse controindicata [Ward R.P. et al., 2005].

La ribavirina è un analogo della guanosina, e viene assorbita dal tratto gastrointestinale; una volta nel plasma, la RBV viene trasportata attraverso la membrana cellulare dai trasportatori nucleosidici, e si distribuisce in tutti i tessuti, inclusi il liquido cerebrospinale e il cervello. La maggior parte dell’attività chinasica, che converte il farmaco nella sua forma nucleotidica attiva, è fornita dall’enzima adenosina chinasi, che è più attivo nelle cellule infette da virus. La ribavirina ha un effetto inibitore dose-dipendente sulla replicazione del genoma virale, oltre ad avere altri effetti sull'espressione genica [Palumbo E., 2011].

Le problematiche legate alla terapia basata su IFN-PEG/RBV, oltre ad un basso tasso di SVR con il genotipo 1 di HCV, con tassi ancor più bassi nei pazienti epatotrapiantati, sono legate ai numerosi effetti collaterali causati da questi farmaci.

L'interferone pegilato può causare complicazioni potenzialmente fatali, quali emergenze neuropsichiatriche, reazioni autoimmuni, ischemia e infezioni. Inoltre, può causare la soppressione del midollo osseo, e conseguente anemia, leucopenia e piastrinopenia. L'interferone può causare anche depressione, o accentuando dei sintomi preesistenti o causandone comparsa di nuovi in pazienti in precedenza sani.

La ribavirina può causare difetti di nascita, anemie emolitiche gravi e un peggioramento delle condizioni cardiache, oltre ad essere potenzialmente cancerogena.

In alcuni casi, queste complicazioni non si risolvono nemmeno quando viene interrotta la somministrazione del farmaco. Inoltre, proprio la comparsa di determinati effetti collatera-

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li comporta spesso la riduzione delle dosi di farmaco assunte, e i tassi di risposta sono significativamente inferiori per i pazienti che non completano l'intero corso del trattamento o che ricevono meno dell'80% della dose totale prevista [Ward R.P. et al., 2005].

La terapia basata sulla combinazione di interferone alfa pegilato e ribavirina, pur costituendo un passo in avanti rispetto alla monoterapia con interferone non pegilato, consente di ottenere tassi di SVR ben lontani da quanto desiderato, soprattutto in pazienti con i genotipi più difficile da trattare, quale il genotipo 1. Questi farmaci agiscono su una serie di vie di segnalazione, non specifiche per il virus dell’epatite C, che influenzano la risposta immunitaria all'infezione. Oltre ad essere inefficaci in una percentuale significativa di pazienti, IFN-PEG α-2b e RBV sono difficili da tollerare per l’organismo, e molti pazienti trattati con questi farmaci sono costretti ad interrompere la terapia o a ridurre i dosaggi a causa degli effetti collaterali.

Per queste ragioni, si è resa necessaria la ricerca di nuovi farmaci che producessero tassi di SVR più elevati e che fossero più tollerabili per i pazienti. L’obiettivo dello sviluppo della nuova generazione di farmaci si è focalizzato sul bersagliare il ciclo vitale del virus, per inibire direttamente la sua replicazione. Si tratta di composti ad attività antivirale diretta e specifica su HCV denominati farmaci antivirali ad azione diretta (DAA).

Il ciclo vitale di HCV fornisce potenziali bersagli terapeutici ad ogni passaggio [Figura 8].

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Figura 8.

Ciclo vitale di HCV (modificata da Jazwinski A.B. et al., 2011).

L'infezione da HCV ha una caratteristica peculiare: non viene generato DNA in nessun passaggio del ciclo vitale del virus. Il virus dell’epatite C, quindi, non si incorpora nel DNA dell’ospite ed è possibile ottenere una corretta eradicazione virale con un effetto continuo.Lo sviluppo dei DAA si è focalizzato sull’interferire con varie fasi del ciclo vitale del virus, quali l’ingresso nella cellula e la traduzione del suo genoma, ma i risultati più rilevanti sono

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stati ottenuti riguardo al processamento post-trascrizionale e al processo di replicazione.

Una volta che il genoma virale è stato tradotto, la poliproteina di HCV subisce un processamento post-trascrizionale. Gli enzimi principali coinvolti in questo processo sono le proteasi NS2/NS3 e NS3/NS4A. Gli inibitori della proteasi NS3/NS4A, in particolare, sono stati i più studiati e di successo tra i DAA di prima generazione. Per il trattamento dell’epatite C cronica sono stati approvati nel 2011 due inibitori della proteasi NS3/NS4A, boceprevir e telaprevir, entrambi chetoamidi ad attività peptidomimetica. Dato che la struttura della proteasi NS3/NS4A differisce tra i genotipi di HCV, gli inibitori della proteasi hanno un'efficacia antivirale variabile per i diversi genotipi; i migliori effetti antivirali di boceprevir e telaprevir sono stati osservati nei pazienti con genotipo 1, mentre sono risultati meno efficaci per i genotipi 2, 3 e 4. Gli inibitori della proteasi di prima generazione hanno portato all’aumento dei tassi di risposta al trattamento nei pazienti infetti da genotipo 1 dal 40% circa a più del 60%. Tuttavia, gli studi clinici hanno mostrato che gli inibitori della proteasi, se assunti singolarmente, portano al rapido sviluppo di mutazioni e, di conseguenza, alla farmacoresistenza virale. Per questa ragione, boceprevir e telaprevir, pur rappresentando un miglioramento dal punto di vista dei tassi di risposta alla terapia, non hanno consentito di superare la necessità di inserire l’interferone nel regime terapeutico, che prevedeva, in questo caso, la triplice terapia con un inibitore della proteasi, IFN-PEG e RBV [Jazwinski A.B. et al., 2011]. I ricercatori hanno quindi diretto lo sviluppo di nuovi farmaci verso altri obiettivi, mirando al raggiungimento di un regime terapeutico privo di interferone, con tassi di SVR più elevati e una durata più breve del trattamento fino ai recenti DAA di III generazione.

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Figura 9.

Storia dei trattamenti dell’epatite C con i DAA. 1Inibitori della proteasi, 2Inibitori di NS5A, 3Inibitori di

NS5B. (modificata da Webster D.P. et al., 2015]

Le problematiche legate alla terapia antivirale nei pazienti epatotrapiantati La recidiva di epatite C in pazienti che si sottopongono a un trapianto di fegato è universale nei pazienti che hanno una carica virale di HCV rilevabile all'epoca del trapianto, e la

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reinfezione si manifesta entro poche ore dall’operazione. L'infezione acuta si manifesta in una percentuale significativa di pazienti, ed è caratterizzata da cariche virali elevate, modificazioni istologiche caratteristiche e aumento variabile dei livelli di transaminasi in circolo.

L’eradicazione spontanea del virus non si verifica nei pazienti con recidiva di epatite C, che avanza inevitabilmente verso l'infezione cronica. La recidiva grave di epatite C può manifestarsi in due modi: come epatite C cronica recidiva e come epatite colestatica fibrosante (FCH).

La prognosi della FCH è generalmente infausta, determinando un rapido deterioramento e la morte, con o senza il trapianto di fegato.

Il corso dell’epatite C cronica recidiva in pazienti epatotrapiantati, sottoposti a terapia immunosoppressiva, è più aggressivo rispetto ai pazienti immunocompetenti, con tassi di epatite cronica e cirrosi, a 5 anni di distanza dal trapianto, rispettivamente dell’80-95% e del 10-28%. In seguito all'insorgenza della cirrosi, il rischio di sviluppare una cirrosi scompensata dopo 1 anno è del 42%, e, nel momento in cui questa progressione avviene, il tasso di sopravvivenza a 1 anno è inferiore al 41%.

Oltre a causare notevoli morbilità e mortalità, la recidiva di epatite C pone ulteriore pressione sulla già scarsa disponibilità di donatori di fegato; l’epatite C, infatti, è responsabile del 27-41% dei ritrapianti di fegato [Mitchell O. et al., 2015].

L’influenza della terapia immunosoppressiva nella risposta alla terapia antivirale nei pazienti epatotrapiantati La terapia immunosoppressiva in pazienti che si sono sottoposti a un trapianto di fegato è inevitabile, ed è stata associata ad una maggiore severità della malattia nella recidiva di epatite C post-trapianto.

Due dei più comuni farmaci immunosoppressori somministrati nei pazienti epatotrapiantati sono gli inibitori della calcineurina (calcineurin inhibitors, CNI) e, in particolare, la ciclosporina A (CsA) e il tacrolimus (Tac). Numerosi studi hanno esaminato i risultati post-trapianto di fegato tra questi due farmaci. Nella popolazione generale degli epatotrapiantati, l'uso del tacrolimus è risultato associato a tassi inferiori di mortalità e di rigetto acuto. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che il tipo di CNI utilizzato non influenza in maniera differente il rischio di recidiva di epatite C [Mitchell O. et al., 2015]. Il tacrolimus esercita la sua azione legandosi alla FK binding protein 12 (FKBP12), mentre la ciclosporina si lega alla ciclofilina A. Entrambi questi complessi inibiscono la calcineurina, un enzima chiave nella segnalazione e nell'attivazione del recettore delle cellule T, che defosforila il fattore di trascrizione NF-AT (nuclear factor activating T cell). NF-AT regola l'attività dei geni che codificano per l'IL-2 e altre citochine nelle cellule T, e, di conseguenza, l'ini-

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bizione della calcineurina impedisce l'attivazione delle cellule T. Inoltre, sono stati notati anche effetti su altre cellule immunitarie; ad esempio, sia la CsA che il Tac possono alterare la funzione delle cellule T regolatorie [Ciesek S. et al., 2012]. La terapia immunosoppressiva post-trapianto rappresenta uno dei motivi della scarsa risposta alla terapia con IFN-PEG e RBV nelle recidive di epatite C. Gli inibitori della calcineurina, infatti, influenzano la segnalazione dell’IFN negli epatociti.

L’IFN-α, dopo il legame con i suoi recettori, stimola la cascata di segnalazione intracellulare dell’IFN, incluse la via JAK-STAT, la fosforilazione di STAT-1 e STAT-2, e la formazione di ISGF-3 (IFN-stimulated gene factor 3), costituito da STAT-1, STAT-2 e p48. ISGF-3 trasloca nel nucleo e si lega all’ISRE (IFN-stimulated regulatory element) nelle sequenze di promotori di una serie di geni inducibili dall’ IFN, comprese proteine antivirali come PKR (double-stranded RNA-dependent protein kinase). Gli inibitori della calcineurina si sono dimostrati entrambi regolatori negativi della segnalazione dell’interferone nell'epatocita.

Le cause principali di questo fenomeno sono l’interferenza con la fosforilazione di STAT-1, e l'inibizione della sua traslocazione nucleare. Il disturbo della fosforilazione di STAT-1, ad opera del tacrolimus, causa la diminuzione dell'attività dei promotori contenenti ISRE, come PKR e STAT-1, e una riduzione dell'espressione delle proteine antivirali; inoltre, sia il tacrolimus che la ciclosporina hanno dimostrato di interferire con la traslocazione di STAT-1. Tutto ciò influenza negativamente la risposta alla terapia antivirale con IFN-PEG nei pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C [Hirano K. et al., 2008].

La triplice terapia con IFN-PEG/RBV e un inibitore della proteasi di prima generazione, pur risultando più efficace della terapia con IFN-PEG/RBV, è risultata anch’essa problematica nei pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C. L'uso di boceprevir e telaprevir, oltre ad essere limitato dal loro profilo di effetti collaterali, comporta problematiche strettamente legate alla terapia post-trapianto; questi farmaci, infatti, interagiscono sia con la ciclosporina che con il tacrolimus, richiedendo un attento monitoraggio dei loro livelli circolanti e conseguente regolazione delle dosi [Mitchell O. et al., 2015].

La terapia con i farmaci DAA di II e di III generazione è risultata un deciso miglioramento rispetto alla triplice terapia, sia per un migliore profilo di effetti collaterali che per quanto riguarda le interazioni con la terapia immunosoppressiva. In uno studio riguardo le interazioni sofosbuvir-ciclosporina o sofosbuvir-tacrolimus, non sono state rilevate interazioni farmacocinetiche significative dal punto di vista clinico. Il SOF è risultato ben tollerato quando somministrato assieme a CsA o Tac, senza mostrare significative variazioni dei parametri farmacocinetici; dall’altro lato, anche i parametri farmacocinetici di CsA o Tac non sono variati in maniera rilevante dal punto di vista clinico quando somministrati assieme al SOF. Di conseguenza, il sofosbuvir può essere co-somministrato con la ciclosporina o il tacrolimus in regimi terapeutici post-trapianto, senza richiedere aggiustamenti delle dosi [Mathias A. et al., 2012].

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Monitoraggio e valutazione della risposta alla terapia L’obiettivo finale della terapia antivirale dell’epatite C è quello di ottenere una risposta virologica sostenuta (SVR), definita come HCV RNA non rilevabile nel siero dopo 12 settimane dalla sospensione del trattamento, e che coincide con l’eradicazione dell’infezione.

Dato che le manifestazioni cliniche dell’infezione da HCV si mostrano molto lentamente nel tempo, ciò che si utilizza per monitorare la risposta alla terapia è la cinetica virale. Durante l’intero periodo di trattamento, i livelli di HCV RNA nel sangue del paziente devono essere costantemente monitorati, tramite la rilevazione dell’HCV RNA a livello sierico a 4, 12, 24 settimane dall’inizio della terapia, e infine 3-6 mesi dopo il termine del trattamento.

I pazienti che restano positivi alla presenza di HCV RNA nel sangue dovrebbero esser considerati non responsivi allo schema terapeutico utilizzato.

In base alla rilevazione dei valori di HCV RNA misurati, le risposte alla terapia possono essere classificate come segue: •risposta virologica rapida (Rapid Virological Response, RVR), definita come HCV RNA non rilevabile alla quarta settimana di trattamento; •risposta virologica precoce (Early Virological Response, EVR), definita come una riduzione dei livelli di HCV RNA pari ad almeno 2 log, rispetto ai valori misurati al baseline (ovvero prima dell’inizio del trattamento), alla dodicesima settimana di trattamento; , •risposta virologica sostenuta (Sustained Virological Response, SVR), definita come HCV RNA non rilevabile nel siero dopo 24 settimane dalla sospensione del trattamento; •breakthrough, definito come HCV RNA non rilevabile in corso di trattamento, ma successivamente positivo prima che la terapia sia terminata; •relapse, definito come HCV RNA negativo al termine del trattamento ma nuovamente positivo durante il follow up; •non response, definito come HCV RNA rilevabile 24 settimane dopo la sospensione del trattamento; •null response, definito come riduzione di HCV RNA inferiore a 2 log dopo 12 settimane di trattamento; •partial response, definito come HCV RNA ancora rilevabile dopo la sospensione del trattamento nonostante il precedente ottenimento di EVR. Stime recenti dell’Organizzazione Mondiale della Sanità indicano che oltre 170 milioni di persone sono infette da HCV. L’infezione primaria cronicizza nell’80-85% dei casi e può

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rimanere asintomatica, da un punto di vista clinico, anche per decenni. In una quota variabile di soggetti portatori del virus, l’epatite C cronica può poi evolvere verso la cirrosi epatica e l’epatocarcinoma.

Fino alla recentissima approvazione dei nuovi farmaci antivirali ad azione diretta, il gold standard della terapia antivirale era rappresentato dalla somministrazione di interferone ! alfa pegilato in combinazione con ribavirina. La terapia interferonica determina la normalizzazione dei livelli ematici di transaminasi, l’abbattimento della carica virale nel sangue ed un miglioramento del quadro istologico a livello epatico. Tuttavia, una percentuale significativa di pazienti, variabile a seconda del genotipo di HCV, non raggiunge una risposta virologica sostenuta dopo il trattamento interferonico o presenta una recidiva della malattia in seguito alla sospensione della terapia. Inoltre, il trattamento prolungato con interferone è associato a pesanti effetti collaterali [Picciotto F.P. et al, 2007] e ad una risposta immunitaria aspecifica [Palumbo E., 2011].

Queste problematiche si accentuano nei pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C, nei quali i tassi di SVR risultano notevolmente più bassi rispetto ai pazienti non-trapiantati, e, inoltre, gli effetti collaterali associati alla terapia si manifestano più frequentemente e in misura tale da determinare l’interruzione del trattamento. Ciò è spiegato, almeno in parte, dall’interazione tra l’IFN-PEG e i farmaci immunosoppressivi somministrati a vita ai pazienti epatotrapiantati nell’ambito della terapia antirigetto [Hirano et al., 2008].

Nel 2011, sono stati introdotti i primi farmaci ad azione diretta contro il virus dell’epatite C. I primi DAA sono stati due inibitori della proteasi NS3/NS4A, boceprevir e telaprevir.

Entrambi, tuttavia, richiedevano ancora l’associazione con IFN-PEG e RBV; di conseguenza, anche la triplice terapia è risultata problematica nei pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C, anche perché i DAA di prima generazione, come riportato in letteratura [Mitchell et al., 2015; Hulskotte E. et al., 2012] interagiscono anch’essi con i farmaci immunosoppressori.

Una potenziale svolta è stata rappresentata dall’approvazione, nel 2013, di un DAA di seconda generazione, il sofosbuvir. Quest’ultimo è un inibitore della RNA polimerasi NS5B, e può essere somministrato con ribavirina o con un altro DAA, consentendo quindi di adottare un trattamento privo di interferone. Il sofosbuvir ha mostrato meno effetti collaterali, e, al contrario dei suoi predecessori, non comporta interazioni farmacocinetiche significative dal punto di vista clinico con i farmaci immunosoppressori [Mathias et al., 2012]. Alla luce di queste considerazioni abbiamo ritenuto opportuno effettuare presso il nostro Centro una valutazione empirica della efficacia e tollerabilità dei nuovi trattamenti antivirali, in particolare con sofosbuvir e ribavirina, in pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C, sottoposti a terapia antirigetto con farmaci immunosoppressori. Abbiamo quindi valutato alcuni pazienti con recidiva di epatite C dopo il trapianto di fegato, in cura presso l’Ambulatorio Trapianti Epatici diretto dal Dr Francesco Paolo Picciotto della Epa-

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tologia dell’Azienda Ospedaliera “A. Cardarelli” di Napoli (comunicazione personale), nel periodo compreso tra giugno 2014 e febbraio 2016.

In particolare sono stati perseguiti i seguenti obiettivi: •valutare la risposta alla terapia in termini di SVR; •valutare la presenza di un’eventuale correlazione tra risposta alla terapia e fattori quali genotipo di HCV, genotipo dei polimorfismi dell’IL28B, carica virale misurata prima dell’inizio del trattamento, stadio di fibrosi, presenza di HCC prima del trapianto di fegato, tipo di farmaco immunosoppressore assunto, e precedente trattamento con IFN-PEG e ribavirina; •confrontare i risultati ottenuti nel presente studio con i dati relativi ad uno studio del 2006 [Picciotto F.P. et al, 2007], condotto su pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C, sottoposti a trattamento con IFN-PEG e ribavirina presso la stessa U.O.S.C..

Sono stati analizzati 29 pazienti (dati cortesemente forniti dal Dr. Francesco Paolo Picciotto). Tutti i pazienti sono stati trattati con sofosbuvir e ribavirina. La dose prescritta di sofosbuvir è stata di 400 mg (1 compressa giornaliera assunta per via orale). La dose di ribavirina, somministrata per via orale, è stata prescritta in base al peso corporeo del paziente, ed è stata ridotta e/o aumentata periodicamente in alcuni pazienti durante il trattamento, in base alla variazione dei parametri ematologici. La durata del trattamento prevista è stata di 24 settimane per tutti i pazienti.Sette pazienti sono stati trattati con eritropoietina per una parte o per tutta la durata del trattamento, per contrastare l’anemia. Per quanto riguarda il sesso, 25 erano di sesso maschile e 4 di sesso femminile. L’età dei pazienti, all’inizio della terapia, era compresa tra 47 e 77 anni, con una media di 63 anni. Tutti i pazienti erano di nazionalità italiana. il genotipo maggiormente rappresentato era il genotipo 1b (25 pazienti [86,2%], seguito dal genotipo 1a (6,9%), dal genotipo 2 (6,9%) e dal genotipo 3 [Figura 10]. I genotipi del polimorfismo rs12979860 del gene IL28B presentavano la seguente distribuzione: 3 pazienti (10,3%) presentavano il genotipo C/C (variante), 21 pazienti (72,4%) il genotipo T/C (eterozigote) e 5 pazienti (17,2%) il genotipo T/T (ancestrale) [Figura 10].

Figura 10

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I pazienti presentavano una carica virale plasmatica, misurata prima dell’inizio della terapia, compresa tra 1.5x104 e 1.0x108 UI/mL. Uno stadio di fibrosi grave (stadio F3-F4) è stato riscontrato in 22 pazienti (75,8%) (5 F3, 17 F4), mentre i restanti 7 soggetti non avevano un quadro clinico di fibrosi o la presentavano con un grado minore (stadio F0-F2).

Il farmaco immunosoppressore assunto è stato la Ciclosporina A in 16 pazienti (55,1%), il Tacrolimus in 11 pazienti (37,9%), l’Everolimus in 1 paziente (3,4%) e il Sirolimus in 1 paziente (3,4%). In 15 pazienti (51,7%) era presente un epatocarcinoma prima del trapianto di fegato.

Per quanto riguarda la terapia, 20 pazienti erano stati precedentemente sottoposti a trattamento con IFN-PEG e ribavirina, senza raggiungere l’SVR. Risposta alla terapia con Sofosbuvir e Ribavirina Tutti i pazienti hanno completato regolarmente il trattamento pianificato, senza richiedere variazioni delle dosi di sofosbuvir, e con lievi aggiustamenti delle dosi di ribavirina.

Alla fine del trattamento 28 pazienti (28/29 pazienti, 96.5%) erano HCV RNA-negativi (ETR). Tra i 28 pazienti risultati HCV RNA-negativi, 22 (78.5%) hanno ottenuto risposta SVR, 5 (17.9%) hanno avuto un relapse; uno dei pazienti (3.6%) HCV RNA-negativo al termine del trattamento, è deceduto 2 mesi dopo la fine della terapia per recidiva di cirrosi, non consentendo di completare il follow up previsto e di verificare l’ottenimento dell’SVR. Dei 25 pazienti con infezione da HCV genotipo 1b, 19 (76%) hanno ottenuto l’SVR. Tutti e 2 i pazienti infetti con genotipo 1a di HCV hanno ottenuto l’SVR (100%), mentre dei 2 pazienti infetti con genotipo 3 solo 1 ha ottenuto l’SVR (50%).

Per quanto concerne i parametri di laboratorio maggiormente correlati alla funzionalità epatica (AST, ALT e bilirubina diretta), i valori prima di iniziare la terapia erano in tutti i casi nettamente superiori ai rispettivi range di normalità. Dopo una sola settimana di trattamento, i valori medi di transaminasi e bilirubina diretta sono calati significativamente, rientrando nella maggior parte dei casi nei rispettivi range di normalità, e assestandosi a tali livelli per la restante durata della terapia.

La terapia è stata in genere ben tollerata; effetti collaterali di rilievo durante il trattamento sono stati osservati solo in 2 pazienti (6,8%): in 2 casi è stata osservata anemia grave (6,8%), in 1 caso astenia (3,4%), e in 1 caso emorragia da varici (3,4%).

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Risposta alla terapia con PEG-IFN e Ribavirina in pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C I risultati ottenuti su descritti sono stati poi messi a confronto con quelli precedentemente ottenuti presso lo stesso Centro dieci anni prima, nel 2006, sulla stessa tipologia di pazienti epatotrapiantati con recidiva da HCV. In questo studio erano stati arruolati 61 pazienti con trapianto epatico e recidiva di epatite C per il trattamento antivirale con PEG-IFN/Ribavirina nel periodo compreso tra Luglio 2001 e Maggio 2004. PEG-IFN era somministrato per via sottocutanea alla dose settimanale di 1µg/kg di peso corporeo; la RBV somministrata per via orale in dose giornaliera iniziale di 800 o 600mg, a seconda del peso corporeo del paziente. La durata pianificata del trattamento era di 24 settimane per il genotipo 2, e 48 settimane per il genotipo 1 (Picciotto FP, et al, 2007. Sustained virological response to antiviral therapy reduces mortality in HCV reinfection after liver transplantation. J Hepatol., 46: 459–465).

52 pazienti su 61 (85.2%) ebbero completato il trattamento pianificato, sebbene le dosi fossero state ridotte nella maggior parte dei casi (79%). La dose totale pianificata di IFN-PEG e Ribavirina era stata tollerata rispettivamente dal 48% e dal 34% dei pazienti.

9 pazienti non erano riusciti a completare la terapia per anemia grave (3), recidiva di epatocarcinoma (2), neutropenia grave (1), rigetto acuto del trapianto (1), paralisi di Bell (1), e infarto del miocardio (1). Tutti questi pazienti erano positivi alla presenza di HCV RNA nel siero quando il trattamento era stato interrotto.

Tra i 52 che avevano completato il trattamento pianificato, 31 pazienti (51%) erano risultati HCV RNA-positivi, e quindi non rispondenti alla terapia, mentre 21 pazienti (34%) erano HCV RNA-negativi. Tra i 21 pazienti che avevano risposto alla terapia antivirale alla fine del trattamento, 4 ebbero recidiva entro 24 settimane, mentre 17 (28%) ottennero l’SVR. Il rigetto fu osservato in 1 caso durante il trattamento, e in altri 3 pazienti durante il follow-up: il primo era HCV RNA positivo, gli ultimi ebbero raggiunto l’SVR. Il 41% dei pazienti riportò astenia. In 22 pazienti (35%) si registrò anemia di grado da medio a moderato. In 3 pazienti (5%) si osservò un’anemia tale da richiedere trasfusione (Hb < 8 g/dL) e l’interruzione del trattamento. La neutropenia (conta neutrofili < 750 x 109 /L) si presentò in 19 casi (31%) e in un caso era grave (< 500 x 109/ L). In media, i pazienti riuscirono a tollerare il 77% della dose pianificata di IFN-PEG e il 72% di quella di RBV. Nessuno dei pazienti con cirrosi scompensata (grado F4) ottenne l’SVR. Al contrario, il tasso di SVR non risultò significativamente differente nei pazienti con un grado di fibrosi da F1 a F3.

In conclusione, solo il 28% dei pazienti trattati ottenne l’SVR, un tasso di risposta molto più basso di quello ottenuto nei pazienti con epatite C cronica non sottoposti a terapia immunosoppressiva, e simile a quello riportato in studi precedenti su pazienti epatotra-

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piantati. I pazienti con genotipo 2 mostrarono un tasso di SVR significativamente più alto (87,5%) se confrontato con quello dei pazienti con genotipo 1 (17,9%). Come visto in studi precedenti, le dosi di IFN-PEG e Ribavirina risultarono importanti per la riuscita del trattamento antivirale. Considerando solo i pazienti che ricevettero la dose totale prevista di IFN-PEG e Ribavirina, il tasso di SVR saliva al 57.1%. Questi dati indicavano che l’impossibilità di assumere le dosi totali di farmaco pianificate, in particolare di IFN-PEG, fosse il principale fattore di fallimento terapeutico tra i pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C.

Discussione L’epatite cronica C è un problema sanitario di rilevanza mondiale con più di 170 milioni di persone infette nel mondo. Negli ultimi decenni, la terapia dell’epatite cronica ha compiuto una rapida evoluzione, passando dall’interferone in monoterapia, all’interferone-pegilato associato alla ribavirina, fino all’avvento dei DAA di nuova generazione, che hanno aperto l’era della terapia anti-HCV “IFN-free”. In particolare, l’introduzione nella pratica clinica dei DAA ha determinato significativi cambiamenti nell’approccio al paziente con epatite cronica C. Oggi l’infezione cronica è curabile: i farmaci antivirali ad azione diretta sul virus dell’epatite C hanno permesso il raggiungimento dell’eradicazione virale nella gran parte dei pazienti che ricevono il trattamento. Questa innovazione è stata resa possibile dallo studio del ciclo vitale di HCV e dallo sviluppo di modelli di replicazione di HCV in vitro, che hanno portato alla scoperta di momenti chiave nel ciclo vitale del virus che possono essere punti aggredibili per arrestare la replicazione virale.

Rispetto alla terapia con IFN-PEG e RBV, che per oltre un decennio ha rappresentato il punto di riferimento nel trattamento dell’epatite C, e anche in confronto alla triplice terapia con IFN-PEG/RBV ed un DAA di prima generazione, la terapia con DAA di II e di III generazione ha permesso di incrementare in maniera clinicamente significativa i tassi di SVR in una categoria di pazienti particolarmente a rischio di evoluzione e/o complicanze come quella costituita dai pazienti epatotrapiantati con recidiva di epatite C. La popolazione degli epatotrapiantati ha da sempre ottenuto tassi di SVR significativamente inferiori rispetto ai pazienti non-trapiantati, principalmente per due ragioni: il trattamento antivirale determinava interazioni farmacocinetiche negative con i farmaci immunosoppressori che i pazienti epatotrapiantati sono costretti ad assumere a vita; inoltre, la frequente comparsa di effetti collaterali durante il trattamento costringeva spesso a ridurre la durata della terapia e/o le dosi di farmaco assunte.

Queste problematiche sono state confermate ed evidenziate dal nostro studio del 2006

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[Picciotto F.P. et al., 2007] ha infatti mostrato che il tasso complessivo di SVR è stato solo del 28%, una percentuale ben più bassa rispetto al 40-60% circa che era registrato nella popolazione globale dei pazienti con epatite C trattata con IFN-PEG/RBV. L’efficacia della terapia antivirale nei pazienti epatotrapiantati si è andata notevolmente ampliando con l’introduzione dei nuovi farmaci DAA come confermato dalla nostra esperienza su 29 pazienti con recidiva di epatite C dopo il trapianto di fegato. Venti dei 29 pazienti oggetto dello studio erano, inoltre, stati sottoposti a precedente trattamento con IFN-PEG/RBV, senza riuscire ad ottenere l’SVR e l’eradicazione del virus.

La risposta alla terapia, sia nella popolazione naive che in quella sottoposta a precedente trattamento con PEG-IFN/RBV, si è rivelata nettamente migliore rispetto allo studio del 2006, sia in termini di SVR che di tollerabilità del trattamento. Il tasso di SVR complessivamente è risultato pari al 76%, ovvero quasi il triplo di quello registrato nello studio del 2006. Il tasso di SVR, inoltre, è risultato inalterato anche nei pazienti infetti con genotipo 1 di HCV, il cui tasso di SVR era risultato circa quattro volte inferiore nello studio del 2006.

La tollerabilità della terapia è risultata nettamente migliore rispetto allo studio del 2006: solo il 7% dei pazienti ha manifestato effetti collaterali di rilievo durante il trattamento, contro il 50% circa registrato nello studio precedente; inoltre, a differenza di quanto rilevato nello studio del 2006, tutti i pazienti hanno portato a termine il trattamento pianificato, senza richiedere aggiustamenti nelle dosi dei farmaci, ma solo periodici aggiustamenti nelle dosi di ribavirina.

Nella nostra casistica, con le riserve legate all’esiguo numero del campione, il genotipo di HCV, l’esposizione a precedenti trattamenti, il genotipo dell’interleuchina 28B, la carica virale misurata prima dell’inizio della terapia, e il tipo di farmaco immunosoppressore assunto, non hanno influenzato i tassi di SVR. Per quanto concerne la correlazione tra risposta al trattamento e grado di fibrosi, nel nostro studio il 70% dei pazienti con grado di fibrosi F4 ha ottenuto l’SVR, al contrario di quanto emerso dallo studio del 2006 in cui nessuno dei pazienti con cirrosi scompensata (grado F4) aveva ottenuto l’SVR; tuttavia, è stata confermata la tendenza dei pazienti con grado di fibrosi F4 a ottenere un tasso di SVR inferiore rispetto ai pazienti con un grado di fibrosi inferiore (da F0 a F3).

Pertanto dalla nostra analisi si possono trarre le seguenti conclusioni: •Il trattamento con DAA di II e di III generazione ha consentito di ottenere, nei pazienti epatotrapiantati, un tasso di SVR significativamente superiore a quanto rilevato dagli studi precedenti relativi al trattamento con IFN-PEG/RBV e, successivamente, alla triplice terapia con IFN-PEG, RBV ed un DAA di prima generazione; •L’uso dei DAA, con o senza la associazione con la ribavirina, ha permesso di ottenere, nella particolare categoria dei pazienti epatotrapiantati, un tasso di SVR quasi comparabi-

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le a quello emerso dagli studi precedenti sulla popolazione globale dei pazienti affetti da epatite C.; •L’uso del sofosbuvir ha, inoltre, consentito di ridurre significativamente la comparsa di effetti collaterali di rilievo durante il trattamento; questa evidenza, oltre ad essere importante dal punto di vista solidale nei confronti dei pazienti, è risultata decisiva per il raggiungimento di un maggiore successo terapeutico rispetto agli studi eseguiti sui regimi terapeutici precedenti all’introduzione del sofosbuvir; in quest’ultimi, soprattutto relativamente alla particolare categoria dei pazienti epatotrapiantati, la frequente comparsa di effetti collaterali di rilievo durante il trattamento era stata causa della sua interruzione e/o della riduzione delle dosi di farmaco pianificate, in entrambi i casi un fattore decisivo nell’influenzare negativamente l’ottenimento dell’SVR. •L’uso del sofosbuvir ha mostrato di non essere influenzato dal genotipo di HCV o dal genotipo dei polimorfismi del gene dell’IL28B, contrariamente a quanto emerso dagli studi eseguiti sui regimi terapeutici precedenti.

•Il trattamento con sofosbuvir e ribavirina, pur consentendo di ottenere, rispetto agli studi eseguiti sui regimi terapeutici precedenti, un significativo miglioramento del tasso di SVR anche nei pazienti con uno stadio terminale di fibrosi, ha mostrato di essere comunque influenzato negativamente sia da questo fattore che dalla presenza di epatocarcinoma prima del trapianto di fegato.

•Tutti questi risultati sono stati ottenuti con un trattamento della durata di 24 settimane per tutti i pazienti oggetti dello studio. I regimi terapeutici precedenti all’introduzione del sofosbuvir prevedevano una durata complessiva di 48 settimane per i pazienti infetti con i genotipi di HCV più difficili da eradicare, come quelli presenti nella popolazione oggetto dello studio (genotipi 1a¸1b e 3).

L’introduzione dei nuovi farmaci antivirali “interferon-free”, cosiddetti DAA, ha rappresentato una svolta significativa da tutti i punti di vista per il trattamento dell’epatite C, un settore che da oltre un decennio era rimasto povero di aggiornamenti davvero rilevanti.

Oltre alla naturale importanza del miglioramento della risposta alla terapia in termini di SVR, è di particolare rilevanza il dato che la risposta alla terapia con DAA ha mostrato di non essere influenzata dal genotipo di HCV e dal genotipo dei polimorfismi del gene dell’IL28B, entrambi ritenuti importanti fattori predittivi di risposta alla terapia nei regimi terapeutici precedenti all’introduzione dei DAA. Questa evidenza suggerisce che, in un futuro non troppo lontano, la determinazione di questi due fattori potrebbe non essere più richiesta per la definizione del regime terapeutico da adottare. Questa considerazione consentirebbe di snellire, almeno in parte, il gravoso iter diagnostico cui devono sottoporsi i pazienti affetti da epatite C alleviando ulteriormente il carico psico-fisico sui pazienti, come già risultato da altre osservazioni quali il dimezzamento della durata del trattamento

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e la significativa riduzione degli effetti collaterali nel corso della terapia. Questo obiettivo assume una maggiore e particolare importanza nella categoria dei pazienti epatotrapiantati, che, oltre al carico portato dall’epatite C, devono anche fronteggiare costantemente le conseguenze derivanti da un trapianto di fegato.

La sfida più grande per la lotta contro l’epatite C è ora rappresentata dal garantire, a tutti i pazienti affetti, la possibilità di accedere indistintamente al giusto trattamento. Per quanto concerne l’Italia, fino al 2017 solo una modesta percentuale dei malati ha ottenuto l’accesso al trattamento, a causa dei costi molto onerosi di ogni singolo regime terapeutico. Per questa ragione, l’accesso al trattamento è stato riservato esclusivamente ai pazienti che presentassero quadri clinici più gravi, costringendo gli altri pazienti a dover aspettare che le proprie condizioni di salute peggiorassero per poter accedere al trattamento; come emerso dal nostro studio, oltretutto, iniziare il trattamento antivirale con uno stadio di fibrosi terminale o con un precedente di epatocarcinoma può anche compromettere la possibilità di ottenere la risposta alla terapia. Questa politica è stata senz’altro poco lungimirante, perchè garantire a tutti i pazienti di accedere indistintamente al trattamento e ottenere una guarigione completa avrebbe consentito un risparmio cospicuo sia in termini economici, sgravando il Servizio sanitario nazionale dal dover seguire per anni pazienti affetti da una patologia cronica, ma soprattutto in termini di vite umane salvate, e di tumori e trapianti di fegato evitati. Inoltre, ciò ha determinato la pericolosa diffusione del cosiddetto “turismo farmaceutico”, spingendo i malati che non rientrassero nei criteri di trattamento ad acquistare in paesi esteri i farmaci antivirali, con tutti i rischi che ne potessero conseguire.

Alla fine del Marzo 2017 c’è stata finalmente la svolta tanto attesa. L’AIFA (Agenzia Italiana del Farmaco) ha, infatti, annunciato l’attivazione del piano di eradicazione dell’HCV, ridefinendo i criteri di trattamento in maniera tale che tutti i pazienti con epatite C potranno essere trattati. Questo traguardo storico è stato ottenuto grazie alla collaborazione dell’AIFA con società scientifiche e associazioni dei pazienti, e soprattutto grazie al cospicuo stanziamento di fondi da parte del Ministero della Salute, e mira all’eradicazione dell’HCV sul territorio nazionale nei prossimi anni a venire.

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Abbreviazioni •ALT: alanina amino transferasi

•LDLR: recettore delle LDL

•CNI: calcineurin inhibitors

•LVP: lipoviral particle

•CsA: ciclosporina A

•NANBH: epatite virale non-A, non-B

•DAA: farmaci antivirali ad azione diretta

•ORF: open reading frame

•GAGs: glicosamminoglicani

•QS: quantitation standard

•HCC: epatocarcinoma

•RBV: ribavirina

•HCV: Hepatitis C Virus

•RC: replication complex

•HVR: hypervariable region

•SOF: sofosbuvir

•IFN: interferone

•SVR: risposta virologica sostenuta

•IFN-PEG: interferone alfa- pegilato

•Tac: tacrolimus

•IRES: internal ribosome entry site

•UTR: untranslated region

•LD: lipid droplet

•VLDL: very low density lipoprotein

•LDL: low density lipoprotein

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Bacterial Carbonic Anhydrases Vincenzo Carginale, Clemente Capasso Istituto di Bioscienze e Biorisorse (IBBR) Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), via Pietro Castellino 111 80131 Napoli, Italy

Abstract In the time of emerging antibiotic resistance, the improvement of the pharmacological arsenal against the bacterial pathogens is of pivotal importance [1,2]. Among the strategies adopted for fighting antibiotic resistance, the effectiveness is a structural upgrade of the current clinical drugs for generating novel antibiotics [1,2]. The limit of this strategy is that the newly generated drugs could have a limited lifespan for the possible resistance that they will develop sooner or later. Fortunately, in the last years, the DNA sequencing approach applied to the bacterial genome allowed the discovery of numerous genes encoding for enzymes which catalyze metabolic pathways essential for the life cycle and/or the virulence of these microbes [3]. In this context, the superfamily of carbonic anhydrases (CAs, EC 4.2.1.1) represents a valuable member of such new macromolecules affecting the growth of microorganisms or making them vulnerable to the host defense mechanisms [4-8].

These metalloenzymes catalyze the simple but physiologically crucial reaction of carbon dioxide hydration to bicarbonate and protons: CO₂ + H₂O ⇋ HCO₃ˉ + H+ [4,8-14] and they are involved in the transport and supply of CO₂ or HCO₃ˉ, in the pH homeostasis, secretion of electrolytes, biosynthetic processes, photosynthesis [15,16]. Moreover, CAs are target molecules of some antibacterial drugs, such as sulfanilamide. Bacteria encode carbonic anhydrases (CAs, EC 4.2.1.1) belonging to three different genetic families, the α-, βand γ-classes.

1. Introduction 1.1. Classification and structure of the bacterial CAs The CAs make up a widely distributed class of metalloenzymes with the catalytically active species represented by a metal hydroxide derivative [4-8]. CAs are grouped in seven genetically distinct families, named α-, β-, γ-, δ-, ζ-, η- and ɵ-CAs, with different folds, structures

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but a common CO₂ hydratase activity, coupled to low sequence similarity. Bacteria encode for enzymes belonging to α-, β- and γ-CA classes [8,17-22]. Bacteria have a very intricate CAs distribution pattern because some of them encode CAs belonging only to one family, others from two or even three different genetic families. The α- and β-CAs are metalloenzymes, which use as catalytic metal the Zn(II) ion; γ-CAs are Fe(II) enzymes, but they are active also with bound Zn(II) or Co(II) ions [23-30]. The metal ion from the CA active site is coordinated by three His residues in the α- and γ-classes, and by one His and two Cys residues in β-class. The fourth ligand is a water molecule/hydroxide ion acting as a nucleophile in the catalytic cycle of the enzyme [8,19,20,31-34]. The rate-determining step of the entire catalytic process is the formation of the metal hydroxide species of the enzyme by the transfer of a proton from the metal-coordinated water molecule to the surrounding solvent, possibly via proton-shuttling residues [5,8,17,19,20].

1.2. α-CA structure Bacterial α-CAs have been only poorly characterized with respect to the mammalian α-CAs. In fact, the CAs from Neisseria gonorrhoeae, Sulfurihydrogenibium yellowstonense, Sulfurihydrogenibium azorense, and Thermovibrio ammonificans are the only bacterial α-CAs with a known three-dimensional structure [25,28,35,36]. An example of the typical structural organization of a bacterial α-CAs is offered by the X-ray crystal structure of the CA identified in the thermophilic bacterium Sulfurihydrogenibium yellowstonense YO3AOP1 [25,28]. This three-dimensional structure generally resembles those of the human α-CAs and it was obtained in presence of the classical inhibitor of CAs, the sulfonamaide acetazolamide (AAZ). In particular, it shows a homodimeric arrangement stabilized by a large number of hydrogen bonds and several hydrophobic interactions. The crystallized α-CAs are active as monomers and dimers. The active site is located in a deep cavity, which extends from the protein surface to the center of the molecule, and is characterized by hydrophilic and hydrophobic regions. The hydrophilic part assists the transfer of the proton from the Zn-bound water to the solvent, while the hydrophobic district is involved in the in CO₂ binding and in ligand recognition. The catalytic zinc ion is located at the bottom of this cavity and is tetrahedrally coordinated by three histidine residues and by the N atom of the sulfonamide moiety of the inhibitor (or probably by the water molecule in the uninhibited enzyme).

1.2. β-CA structure X-ray crystal structures are available for several of β-CAs, such as those from Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Salmonella enterica and Vibrio cholerae [24,37-40]. The 3-D folds of these enzymes are rather conserved, although some of them

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are dimers whereas others are tetramers. All crystallized bacterial β-CAs so far are active as dimers or tetramers, with two or four identical active sites. Their shape is that of a rather long channel at the bottom of which the catalytic zinc ion is found, tetrahedrally coordinated by two cysteines, one-histidine e one-aspartic amino acid residue (the so called “closed active site”). Interesting, the enzyme structure from Vibrio cholerae (VchCAβ) was determined in its closed active site form at pH values <8.3 [24]. The “closed active site” is names in this way as these enzymes are not catalytically active (at pH values <8.3). Interesting, in its inactive form, the bicarbonate is bound in a pocket close to the zinc ion [24].

However, at pH values >8.3, the “closed active site” is converted to the “open active site” (with gain of catalytic activity), this being associated with a movement of the Asp residue from the catalytic Zn(II) ion, with the concomitant coordination of an incoming water molecule approaching the metal ion [24]. This water molecule (as hydroxide ion) is, in fact, responsible for the catalytic activity, as shown above for the α-CAs. 1.3. γ-CA structure CAM (Carbonic Anhydrase Methanosarcina) from Methanosarcina thermophila is the prototype of the γ-class carbonic anhydrase and the only enzyme from this class that has been crystallized so far [41]. This enzyme adopts a left-handed parallel β-helix fold and crystallizes as a trimer with three zinc-containing active sites, each located at the interface between two monomers. The metalloenzyme is only active as trimer [41]. Interesting, in this class of enzyme instead of a histidine (as in α-CAs) there is a glutamic acid residue acting as proton shuttle residue. In fact, the high-resolution crystal of CAM showed that Glu89 has two orientations, similar with those of His64 in α-CAs [41].

2. CA inhibitors Different types of CA inhibitors (CAIs) exist [42,43] and they can be grouped in 1) the metal ion binders (anion, sulfonamides and their bioisosteres, dithiocarbamates, xanthates, etc.); 2) compounds which anchor to the zinc-coordinated water molecule/hydroxide ion (phenols, polyamines, thioxocoumarins, sulfocumarins); 3) compounds occluding the active site entrance, such as coumarins and their isosteres; and 4) compounds binding out of the active site [43]. This subdivision has been made considering the way that the inhibitors bind the catalytic metal ion, the metal coordinated-water molecule, and the occlusion of the active site [43]. The most investigated CAIs are anions and sulfonamides [31,43-45].

Sulfonamides were discovered by Domagk in 1935 [46], which were the first antimicrobial drugs. The first sulfonamide showing effective antibacterial activity was Prontosil, a sulfanilamide prodrug isosteric/isostructural with p-aminobenzoic acid (PABA) [47]. In the following years, a range of analogs constituting the so-called sulfa drug class of anti-bacte-

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rials entered into clinical use, and many of these compounds are still widely used. Anions, such as inorganic metal-complexing anions or more complicated species such as carboxylates, are also known to bind to CAs [42,43]. These anions may bind either the tetrahedral geometry of the metal ion or as trigonal–bipyramidal adducts. Anion inhibitors are important both for understanding the inhibition/catalytic mechanisms of these enzymes fundamental for many physiologic processes, and for designing novel types of inhibitors which may have clinical applications for the management of a variety of disorders in which CAs are involved [42,43].

3. Activators An interesting feature of the CA superfamily is that they can bind within the middle-exit part of the active site molecules known as “activators” (CAA). They are biogenic amines (histamine, serotonin, and catecholamines), amino acids, oligopeptides, or small proteins [48-51]. By means of electronic spectroscopy, X-ray crystallography, and kinetic measurements, it has been demonstrated that CAAs do not influence the binding of CO₂ to the CA active site, but mediates the rate-determining step of the catalysis hurrying the transfer of protons from the active site to the environment. The final result is an overall increase of the catalytic turnover. Thus, the CA activators enhance the kcat of the enzyme, with no effect on KM [48,50,51].

4. Physiological role A common feature of all bacterial α-CAs known to date is the presence of an N-terminal signal peptide, which suggests a periplasmic or extracellular location. From these finding, we have speculated that in Gram-negative bacteria, the α-CA are able to convert the CO₂ to bicarbonate diffused in the periplasmic space ensuring the survival and/or satisfying the metabolic needs of the microorganism [20,52]. In fact, several essential metabolic pathways require either CO₂ or bicarbonate as a substrate and probably, the spontaneous diffusion of CO₂ to the outer membrane and the conversion to bicarbonate inside the cell are not sufficient for the metabolic needs of the microorganism. On the contrary, β- or γ-classes have a cytoplasmic localization and are responsible for CO₂ supply for carboxylase enzymes, pH homeostasis and other intracellular functions [20,52]. Not all the Gram-negative bacteria, however, have α-CAs. Probably the α-CAs are not required when the Gram-negative bacteria colonize habitats defined not metabolic limiting or adverse to their survival [52]. Recently, we noted that the primary structure of some β-CAs identified in the genome of some pathogenic Gram-negative bacteria, such as such as HpyCA (from Helicobacter pylori), VchCA (from Vibrio cholerae), NgonCA (from Neisseria gonorrhoeae), SsalCA (from Streptococcus salivarius), present a pre-sequence of 18 or more amino acid residues at the N-terminal part, which resulted in a secretory signal peptide [20,52]. Intriguing, also

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the CAM enzyme, which is a γ-CA, contained a short putative signal peptide at its N-terminus. Since the signal peptide is essential for the translocation across the cytoplasmic membrane in prokaryotes, it has been suggested that the β- and/or γ-CAs found in Gram-negative bacteria and characterized by the presence of a signal peptide might have a periplasmic localization and a role similar to that described previously for the α-CAs [20,52]. In the past ten years, the understanding of the function of the bacterial CAs has increased significantly [20,52]. We suggested that the activity of CAs is connected to the survival of the microbes because the metabolic reaction catalyzed by CA is essential for supporting numerous physiological functions involving dissolved inorganic carbon. For example, in the non-pathogenic bacteria such as Ralstonia eutropha (Gram-negative bacterium found in soil and water), and Escherichia coli (a facultative Gram-negative bacterium) it has been in vivo demonstrated that the bacterial growth at ambient CO₂ concentration is dependent on CA activity [53,54].

5. Conclusions In the last years the cloning, purification and characterization of many representatives, belonging to all three genetic families present in Bacteria, led to crucial advances in the field. The role of CAs in many pathogenic as well as non-pathogenic bacteria starts in this way to be better understood. Apart pH regulation and adaptation to various niches in which bacteria live, CAs probably participate to biosynthetic processes in which bicarbonate or CO₂ are substrates, as in the case of other organisms for which these roles are demonstrated. Inhibitors of such enzymes may lead to antibiotics with a new mechanism of action, devoid of the drug resistance problems encountered with the various classes of clinically used agents. Moreover, CAAs may have pharmacologic applications in therapy memory, neurodegenerative diseases (Alzheimer’s disease), or the treatment of genetic CA deficiency syndromes.

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nale, V.; Supuran, C.T.; Capasso, C.; Di Fiore, A. Crystal structure of the most catalytically effective carbonic anhydrase enzyme known, sazca from the thermophilic bacterium sulfurihydrogenibium azorense. Bioorg Med Chem Lett 2015, 25, 2002-2006.

26.Zolnowska, B.; Slawinski, J.; Pogorzelska, A.; Chojnacki, J.; Vullo, D.; Supuran, C.T. Carbonic anhydrase inhibitors. Synthesis, and molecular structure of novel series n-substituted n'-(2-arylmethylthio-4-chloro-5-methylbenzenesulfonyl)guanidines and their inhibition of human cytosolic isozymes i and ii and the transmembrane tumor-associated isozymes ix and xii. European journal of medicinal chemistry 2014, 71, 135-147.

27.De Luca, L.; Ferro, S.; Damiano, F.M.; Supuran, C.T.; Vullo, D.; Chimirri, A.; Gitto, R. Structure-based screening for the discovery of new carbonic anhydrase vii inhibitors. European journal of medicinal chemistry 2014, 71, 105-111.

28.Di Fiore, A.; Capasso, C.; De Luca, V.; Monti, S.M.; Carginale, V.; Supuran, C.T.; Scozzafava, A.; Pedone, C.; Rossi, M.; De Simone, G. X-ray structure of the first `extremo-alpha-carbonic anhydrase', a dimeric enzyme from the thermophilic bacterium sulfurihydrogenibium yellowstonense yo3aop1. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2013, 69, 1150-1159.

29.Supuran, C.T. Structure-based drug discovery of carbonic anhydrase inhibitors. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2012, 27, 759-772.

30.Supuran, C.T. Carbonic anhydrases--an overview. Current pharmaceutical design 2008, 14, 603-614.

31.Supuran, C.T. Structure and function of carbonic anhydrases. Biochem J 2016, 473, 2023-2032.

32.Buzas, G.M.; Supuran, C.T. The history and rationale of using carbonic anhydrase inhibitors in the treatment of peptic ulcers. In memoriam ioan puscas (1932-2015). Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2016, 31, 527-533.

33.Carta, F.; Supuran, C.T.; Scozzafava, A. Sulfonamides and their isosters as carbonic anhydrase inhibitors. Future medicinal chemistry 2014, 6, 1149-1165.

34.Supuran, C.T. Carbonic anhydrases: Novel therapeutic applications for inhibitors and activators. Nature reviews. Drug discovery 2008, 7, 168-181.

35.James, P.; Isupov, M.N.; Sayer, C.; Saneei, V.; Berg, S.; Lioliou, M.; Kotlar, H.K.; Littlechild, J.A. The structure of a tetrameric alpha-carbonic anhydrase from thermovibrio ammonificans reveals a core formed around intermolecular disulfides that contribute to its thermostability. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 2014, 70, 2607-2618.

36.Huang, S.; Xue, Y.; Sauer-Eriksson, E.; Chirica, L.; Lindskog, S.; Jonsson, B.H. Crystal

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structure of carbonic anhydrase from neisseria gonorrhoeae and its complex with the inhibitor acetazolamide. Journal of molecular biology 1998, 283, 301-310.

37.Cronk, J.D.; O'Neill, J.W.; Cronk, M.R.; Endrizzi, J.A.; Zhang, K.Y. Cloning, crystallization and preliminary characterization of a beta-carbonic anhydrase from escherichia coli. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 2000, 56, 1176-1179.

38.Rowlett, R.S.; Tu, C.; Lee, J.; Herman, A.G.; Chapnick, D.A.; Shah, S.H.; Gareiss, P.C. Allosteric site variants of haemophilus influenzae beta-carbonic anhydrase. Biochemistry 2009, 48, 6146-6156.

39.Covarrubias, A.S.; Bergfors, T.; Jones, T.A.; Hogbom, M. Structural mechanics of the ph-dependent activity of beta-carbonic anhydrase from mycobacterium tuberculosis. The Journal of biological chemistry 2006, 281, 4993-4999.

40.Nishimori, I.; Minakuchi, T.; Vullo, D.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. Inhibition studies of the beta-carbonic anhydrases from the bacterial pathogen salmonella enterica serovar typhimurium with sulfonamides and sulfamates. Bioorganic & medicinal chemistry 2011, 19, 5023-5030.

41.Kisker, C.; Schindelin, H.; Alber, B.E.; Ferry, J.G.; Rees, D.C. A left-hand beta-helix revealed by the crystal structure of a carbonic anhydrase from the archaeon methanosarcina thermophila. The EMBO journal 1996, 15, 2323-2330.

42.Supuran, C.T. How many carbonic anhydrase inhibition mechanisms exist? Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2016, 31, 345-360.

43.Supuran, C.T. Advances in structure-based drug discovery of carbonic anhydrase inhibitors. Expert opinion on drug discovery 2017, 12, 61-88.

44.Supuran, C.T. Carbonic anhydrase inhibition and the management of neuropathic pain. Expert Rev Neurother 2016, 16, 961-968.

45.Supuran, C.T. Drug interaction considerations in the therapeutic use of carbonic anhydrase inhibitors. Expert opinion on drug metabolism & toxicology 2016, 12, 423-431.

46.Otten, H. Domagk and the development of the sulphonamides. The Journal of antimicrobial chemotherapy 1986, 17, 689-696.

47.Achari, A.; Somers, D.O.; Champness, J.N.; Bryant, P.K.; Rosemond, J.; Stammers, D.K. Crystal structure of the anti-bacterial sulfonamide drug target dihydropteroate synthase. Nat Struct Biol 1997, 4, 490-497.

48.Licsandru, E.; Tanc, M.; Kocsis, I.; Barboiu, M.; Supuran, C.T. A class of carbonic anhydrase i - selective activators. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2017, 32, 37-46.

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49.Supuran, C.T. Carbonic anhydrase inhibitors and activators for novel therapeutic applications. Future medicinal chemistry 2011, 3, 1165-1180.

50.Supuran, C.T. Carbonic anhydrases: From biomedical applications of the inhibitors and activators to biotechnological use for co(2) capture. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2013, 28, 229-230.

51.Vullo, D.; Del Prete, S.; Capasso, C.; Supuran, C.T. Carbonic anhydrase activators: Activation of the beta-carbonic anhydrase from malassezia globosa with amines and amino acids. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2016, 26, 1381-1385.

52.Supuran, C.T.; Capasso, C. New light on bacterial carbonic anhydrases phylogeny based on the analysis of signal peptide sequences. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2016, 31, 1254-1260.

53.Kusian, B.; Sultemeyer, D.; Bowien, B. Carbonic anhydrase is essential for growth of ralstonia eutropha at ambient co(2) concentrations. Journal of bacteriology 2002, 184, 5018-5026.

54.Merlin, C.; Masters, M.; McAteer, S.; Coulson, A. Why is carbonic anhydrase essential to escherichia coli? Journal of bacteriology 2003, 185, 6415-6424.

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Discussione di un caso clinico relativo a terapia della Cirrosi HCV relata

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Antonio De Luna Dipartimento Strutturale delle Dipendenze Azienda Sanitaria di Salerno

Introduzione Il virus dell’epatite C rappresenta una delle più comuni cause di epatite cronica nel mondo.

L’epatite cronica a sua volta può portare allo sviluppo di cirrosi e all’insorgenza di epatocarcinoma.[1] Il meccanismo fisiopatologico che porta allo sviluppo della cirrosi è innescato dall’infiammazione dovuta alla persistenza del virus e alla conseguente risposta immunitaria, la quale induce progressivamente la fibrosi. Essa interessa inizialmente gli spazi periportali, successivamente coinvolge le strutture vascolari, ed infine arriva a sovvertire completamente l’architettura lobulare, compromettendo la funzionalità epatica ed innescando i meccanismi di compenso alla base della successiva comparsa della cirrosi e delle sue complicanze.

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Una delle più importanti alterazioni che si possono verificare in corso di cirrosi è lo sviluppo di ipertensione portale. L’ipertensione portale è emodinamicamente definita da un aumento della pressione nella vena porta superiore ai normali 6-10 mmHg. Valori superiori a 10-12 mmHg sono clinicamente rilevanti, potendo dare origine a svariate complicanze: sanguinamento da rottura di varici gastrointestinali, ascite, encefalopatia porto-sistemica e sindrome epatorenale. Nella cirrosi epatica l’ipertensione portale è caratterizzata dall’aumento delle resistenze al flusso portale a livello intraepatico e sinusoidale. Si stima che nel fegato cirrotico le resistenze al flusso portale siano determinate per il 60-70% da fattori meccanici/ strutturali e per il 30% da fattori emodinamici. [2] Tra i fattori strutturali che generano resistenza al flusso portale i più importanti sono rappresentati dalla presenza di noduli di rigenerazione, dalla presenza di microtrombi e dalla capillarrizzazione dei sinusoidi epatici. [3] Nel fegato cirrotico inoltre si assiste ad uno squilibrio tra i fattori vasocostrittori quali endotelina 1 (ET1), Trombossano A2 (TXA2) e Prostaglandina H2 (PGH2) e gli agenti vasodilatatori tra cui il Monossido di Azoto (NO), la Prostaciclina I2 (PGI2) e il monossido di Carbonio (CO) con conseguente aumento del tono vascolare.

[4-6] Una risposta virologica sostenuta al trattamento anti HCV con regimi terapeutici basati sull’utilizzo di Interferone si è dimostrata avere un effetto positivo sul decorso della malattia HCV correlata sia in termini di riduzione delle complicanze che della mortalità. [7, 8] Tale effetto positivo sembra essere esercitato anche sulla fibrosi, che sembra regredire alla scomparsa del virus. Per esempio, uno studio retrospettivo effettuato su 593 pazienti con epatite cronica HCV correlata ha dimostrato che una risposta virologica sostenuta era associata, alla biopsia epatica, ad una riduzione media dello score di fibrosi calcolata con il sistema METAVIR di 0,6 ± 0,07 nei pazienti seguiti per 3 anni e di 0,88 ± 0.08 nei pazienti che erano stati seguiti per più di 3 anni.[9] Si è a lungo discusso, negli ultimi anni, se la regressione della fibrosi possa interessare anche i suoi ultimi stadi, ovvero la cirrosi. Dati contrastanti ed incompleti sono stati prodotti negli anni a causa della difficoltà di reperire un ampia casistica di pazienti cirrotici che raggiungessero la risposta virologica sostenuta, a causa dei bassi tassi di risposta ottenuti con le terapie a base di interferone e alla necessità di effettuare biopsie seriate.

La biopsia epatica è ancora oggi ritenuta il gold standard per la stadiazione della fibrosi.

Tuttavia la sua natura invasiva e la possibilità di errori di campionamento hanno portato alla ricerca di metodiche alternative. Tra queste l’elastometria transitoria mediante Fibroscan è una delle tecniche che per la sua attendibilità e facilità di utilizzo ha trovato maggiore impiego.[10] I valori rilevati mediante fibroscan si sono dimostrati significativamente associati con lo staging istopatologico effettuato mediante biopsia e hanno una maggiore accuratezza rispetto a score biochimici quali il rapporto AST/ Piastrine o i marker di fibrosi come l’acido ialuronico o il collagene di tipo IV [12, 13]

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Negli ultimi anni, lo sviluppo degli agenti antivirali diretti (direct-acting antiviral agents-DAAs) ha rivoluzionato il trattamento dellâ&#x20AC;&#x2122;infezione da HCV, portando alla possibilitĂ di eradicazione del virus in piĂš del 90% dei pazienti trattati, ed offrendo una reale prospettiva di cura completa anche nei pazienti cirrotici.

Anamnesi e presentazione clinica !

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[3]S.L. Friedman. Cellular sources of collagen and regulation of collagen production in liver, Semin Liver Dis 10 (1990) 20-29.

[4]M. Pinzani, S. Milani, R. De Franco, C. Grappone, A. Caligiuri, A. Gentilini, C. Tosti-Guerra, M. Maggi, P. Failli, C. Ruocco, P. Gentilini. Endothelin 1 is overexpressed in human cirrhotic liver and exerts multiple effects on activated hepatic stellate cells, Gastroenterology 110 (1996) 534-548.

[5]M. Van De Casteele, J.F. Van Pelt, F. Nevens, J. Fevery, J. Reichen. Low NO bioavailability in CCl4 cirrhotic rat livers might result from low NO synthesis combined with decreased superoxide dismutase activity allowing superoxide-mediated NO breakdown: A comparison of two portal hypertensive rat models with healthy controls, Comp Hepatol 2 (2003) 2.

[6]N. Goda, K. Suzuki, M. Naito, S. Takeoka, E. Tsuchida, Y. Ishimura, T. Tamatani, M. Suematsu. Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation, J Clin Invest 101 (1998) 604-612.

[7]A.C. Cardoso, R. Moucari, C. Figueiredo-Mendes, M.P. Ripault, N. Giuily, C. Castelnau, N. Boyer, T. Asselah, M. Martinot-Peignoux, S. Maylin, R.J. Carvalho-Filho, D. Valla, P. Bedossa, P. Marcellin. Impact of peginterferon and ribavirin therapy on hepatocellular carcinoma: incidence and survival in hepatitis C patients with advanced fibrosis, J Hepatol 52 (2010) 652-657.

[8]A.G. Singal, T.D. Dharia, P.F. Malet, S. Alqahtani, S. Zhang, J.A. Cuthbert.

Long-term benefit of hepatitis C therapy in a safety net hospital system: a cross-sectional study with median 5-year follow-up, BMJ Open 3 (2013) e003231.

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[13]P. Calès, J. Boursier, V. de LÊdinghen, P. Halfon, Y. Bacq, V. Leroy, N. Dib, F. Oberti, A. Sawadogo, M.C. Rousselet, F. Lunel. Evaluation and improvement of a reliable diagnosis of cirrhosis by blood tests, Gastroenterol Clin Biol 32 (2008) 1050-1060.

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