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MTD Magazine Trimestrale on line

2 giugno

numero

2017

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INDICE Periodico Trimestrale Gratuito di divulgazione Medico Scientifica GIUGNO ANNO 2

2017 N. 2

Editore Improve Communications Sede Legale: Via Viticella, 48 - 80010 Quarto (NA) Sede Operativa : Via Giustiniano, 1119 - 80126 Napoli Direttore Responsabile Gianluca Passaretti

3 Ruolo dell’asse intestino-fegato nella patogenesi della steato-epatite non alcoolica R. Caruso, R. Gioia, M. Persico 26 Bacterial Carbonic Anhydrases as drug target for obtaining new antiinfectives.

C.T. Supuran , V. Carginale, C. Capasso 37 Rianimazione Aperta P. Zannetti

Direzione e redazione Via Giustiniano, 119 - 80126 Napoli tel: 081 0362332 e-mail: info@improvecommunications.it web: www.improvecommunications.it

42 Quale sarà il futuro terapeutico di questo paziente con Cirrosi epatica da HCV genotipo 3a: caso clinico R. Di Sarno

Diffusione : Periodico Telematico Service Provider ARUBA S.P.A. Loc. Palazzetto, 4 - 52011 Bibbiena (AR)

48 Razionale Find out Consensus Meeting (Congress report) I. Gentile

Hanno collaborato a questo numero: 50 Razionale - Progetto Hepar Dott.ssa Rosa Caruso, Dott. Renato Gioia, Prof. Marcello Persico (Event Report) Università di Salerno Comitato scientifico - Improve Srl Prof. Claudiu T. Supuran - Università di Firenze Dott. Vincenzo Carginale, Dott. Clemente Capasso - CNR di Napoli Dott. Pio Zannetti - P.O. S.M. degli Incurabili ASL Na 1 - Napoli Dott. Raffaele Di Sarno - Ospedale D. Cotugno - Napoli Prof. Ivan gentile - Unversita degli Studi di Napoli - Federico II Comitato Scientifico Improve Srl

La testata MTD - More Than Drug è registrata presso il Tribunale di Napoli - reg. n° 49 del 17 ottobre 2016

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Ruolo dell’asse intestino-fegato nella patogenesi della steato-epatite non alcoolica

Rosa Caruso, Renato Gioia, Marcello Persico Medicina Interna ed Epatologia Università di Salerno

Introduzione

La NAFLD è una condizione clinica patologica caratterizzata dalla presenza di almeno il 5% di macro(o micro) vescicole di steatosi negli epatociti di soggetti che non hanno una storia di abuso di alcool, o che non hanno altre cause di epatopatia cronica [1].

Si può classificare nelle seguenti categorie istologiche: NAFL, che include i pazienti con steatosi epatica isolata e con steatosi e lieve infiammazione non specifica, e NASH, che si distingue dalla prima per la presenza aggiuntiva di caratteristiche lesioni epatocellulari con o senza fibrosi (Fig. 1). La steatoepatite non alcolica NASH è considerata il sottotipo progressivo della NAFLD; tuttavia, i dati suggeriscono che steatosi epatica con l'infiammazione ha una storia naturale distinta e più progressiva della steatosi epatica isolata [2]. A causa dell’impatto di questa malattia, è importante identificare quali pazienti hanno più probabilità di avere un aumento della morbilità e mortalità correlata a NAFLD.

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Fig. 1

Epidemiologia

La NAFLD è la più comune causa di malattia del fegato in tutto il mondo con stime di prevalenza dal 25% al 45% in molti studi, aumentando in parallelo con quella dell’obesità e del diabete [12-13]; la maggior parte delle stime attuali suggeriscono che il 68% degli adulti americani sono sovrappeso o obesi; si stima quindi che tra i 75 milioni e 100 milioni di individui negli Stati Uniti probabilmente hanno una NAFLD. La NAFLD è quindi la più comune causa dell’aumento dei livelli sierici di transaminasi sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo. Attualmente la NASH è la seconda causa di epatopatia tra gli adulti in attesa di trapianto epatico negli Stati Uniti. La prevenzione primaria e secondaria della NAFLD può richiedere strategie aggressive per la gestione dell’obesità, del diabete e della sindrome metabolica.

L'incidenza della malattia è in realtà sconosciuta e ulteriori studi sono necessari per chiarire la reale incidenza di NAFLD. La prevalenza della NAFLD cambia in relazione allo stile di vita nelle differenti aree geografiche, ed è maggiore negli Stati Uniti, Europa, Medio Oriente, America Latina, Australia, Giappone e Cina [14].

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Le differenze tra l’incidenza e la prevalenza nelle diverse aree geografiche sono dovute all’etnia e alla genetica, nonché alla diversa distribuzione dei fattori di rischio sopra indicati.

Infatti, alcuni studi confermano la differente prevalenza di NAFLD nelle comunità di immigrati: negli Stati Uniti, i casi di NAFLD sono molto più frequenti tra gli Indiani che tra gli Afro-Americani, nonostante questi ultimi costituiscano una percentuale maggiore della popolazione [15].

L’età più colpita dalla NAFLD è tra i 40 e i 65 anni [16-18]; tuttavia un aumento dei casi di NAFLD è stato riscontrato in età infantile [19]. Per quanto riguarda la distribuzione del sesso, in passato è stata segnalata una maggiore prevalenza nelle donne che negli uomini, ma le ultime evidenze segnalano un’inversione di tendenza [20].

Patogenesi

La teoria storicamente più accettata sulla genesi della NAFLD è stata definita “the two-hit theory”, suddividendo in due fasi la genesi della patologia. Il primo “hit”, che può essere considerato una conseguenza dell’insulino-resistenza, può solo determinare l’accumulo di trigliceridi negli epatociti; il secondo “hit”, determinato da diversi fattori scatenanti, può essere in grado di indurre il processo infiammatorio. Tra le varie ipotesi sul secondo hit, è stata sottolineata l’importanza dell'alterazione dell'asse dell'intestino-fegato, in particolare la flora batterica intestinale può ricoprire il ruolo di innesco per l’infiammazione.

Questa teoria si basa su una serie di osservazioni dirette in modelli animali e nell’uomo: 1.La sostanziale sovrapposizione di immagini istologiche della steatoepatite alcolica e della NASH suggerisce, qualunque sia il fattore eziologico, una via patogenetica comune.

2.La somministrazione orale di neomicina nei topi geneticamente obesi, riduce significativamente i livelli di etanolo espirato.

3.Gli antibiotici (metronidazolo e tetracicline) riducono il danno epatico nei topi in cui è stata indotta una sovracrescita batterica [22].

4.Il metronidazolo o la resezione chirurgica dell’ansa afferente dell’intestino previene e reverte la steatosi indotta dal bypass ileo-digiunale nell’uomo [23].

5.Nel bypass ileo-digiunale il riscontro di NASH si manifesta rapidamente nel fegato trapiantato, ma questo non avviene se il bypass viene rimosso con il trapianto.

Il gold standard diagnostico per la NAFLD è rappresentato dalla biopsia epatica, tuttavia non tutti i pazienti con NAFLD hanno un rischio di progressione tale da giustificare una simile tecnica invasiva. Sebbene la NAFLD sia molto spesso una patologia epatica non progressiva, questa condivide i suoi fattori di rischio con le patologie cardiovascolari che possono mettere a rischio la vita del paziente [24]. Per questi motivi è di grande interesse poter identificare approfonditamente la patogenesi della NAFLD.

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Istologia I pazienti con NASH sono a rischio di sviluppare una patologia epatica progressiva e necessitano di opzioni di trattamento efficaci. La presenza di fibrosi epatica è il determinante più importante per l’evoluzione; utilizzando il sistema di punteggio Metavir è possibile classificare la fibrosi con un punteggio che va da: assente (F0), cirrosi (F4). Lo spettro istologico della NAFLD si estende dalla steatosi isolata o NAFL alla NASH connessa con la cirrosi. Sebbene l’epatopatia alcolica condivida spesso con la NAFLD caratteristiche istologiche simili, le linee guida correnti raccomandano di utilizzare, come criteri per la valutazione, l’assunzione di meno di 30g/die per l’uomo e meno di 20g/die per la donna, tra i criteri per la diagnosi di NAFLD.

Diagnosi La maggior parte degli individui sono asintomatici o hanno sintomi non specifici come l’astenia. Quindi la diagnosi di NAFLD è spesso fatta incidentalmente sull’ imaging ecografico, nel momento in cui un paziente si sottopone a un test diagnostico per un sintomo non correlato. Non ci sono elementi caratteristici all'esame obiettivo, ma l’obesità centrale e l’epatomegalia sono comuni. In alcuni studi l’acanthosis nigricans, che è correlata con l’insulino-resistenza e la presenza di un gibbo dorso-cervicale sono state associate con la presenza di steatoepatite non alcolica. Una volta sviluppatasi la cirrosi possiamo identificare altri reperti come l’eritema palmare, gli spider naevi, la ginecomastia, o la prominenza delle vene superiori dell’addome (caput medusae). Nei pazienti con cirrosi scompensata questi elementi diventano più pronunciati e possono essere presenti segni aggiuntivi, come l’ascite, l’ittero, alterazioni delle unghie (unghie di Terry o Lindsay), la splenomegalia o l’asterixis. La scarsa consapevolezza dei pazienti a rischio di progressione, insieme con la mancanza di un affidabile test diagnostico di screening, spiega perché lo sviluppo di una progressiva steatoepatite non alcolica possa passare inosservato in molti pazienti fino a quando non viene fatta diagnosi di cirrosi [3]. Fin quando alcuni test non saranno disponibili, i medici di medicina generale e gli specialisti, che molto probabilmente vedono una popolazione di pazienti con una elevata prevalenza di NASH (cioè, endocrinologi, cardiologi), necessitano di essere a conoscenza dei fattori di rischio per la progressione della malattia per consentire un intervento precoce.

Storia naturale e predittori di evoluzione

Poiché la maggior parte dei pazienti che progrediscono a uno stadio avanzato di fibrosi aveva in origine una NASH, questo sottotipo è considerato come la vera e propria patologia poiché questi pazienti hanno un rischio stimato di progressione verso la cirrosi approssimativamente

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del 20% [4]. Al contrario, la NAFL si pensa abbia un decorso molto più benigno con una stima di rischio di progressione verso la cirrosi di meno del 4% con la precisazione che un sottogruppo meno caratterizzato di pazienti con la diagnosi di NAFL (cioè quelli con infiammazione che non soddisfano i criteri istologici per NASH) possono comunque avere un rischio aumentato di progressione verso una stadio più avanzato della malattia [4].

Fattori di rischio clinici, come la presenza della sindrome metabolica e le sue caratteristiche (glicemia a digiuno ≥ 100 mg/dl o diabete di tipo2; ipertensione arteriosa; colesterolo HDL < 40 mg/dl nell’uomo e <50 mg/dl nella donna; ipertrigliceridemia: ≥ 150 mg/dl; obesità centrale: circonferenza vita > 102 cm nell’uomo e > 88 cm nella donna), così come marcatori di funzionalità epatica possono aiutare a scegliere i pazienti per la biopsia epatica e identificare quelli a più alto rischio di NASH e malattia epatica avanzata. I pazienti con NAFLD generalmente, e quelli con NASH in particolare, hanno un aumentato rischio di mortalità per patologia epatica (13%), e più comunemente per malattie cardiovascolari (25%) e neoplasie (28%) [5]. Sebbene la presenza di steatosi sia un requisito per la steatoepatite non alcolica, i meccanismi specifici che portano un paziente a sviluppare la steatoepatite non alcolica e un altro a sviluppare solo una steatosi non sono ancora ben delineati.

Il tessuto adiposo viscerale genera più segnali che alterano i lipidi e il metabolismo del glucosio e portano all’accumulo del grasso epatico creando un contesto pro-infiammatorio che innesca lesioni cellulari nel fegato e in altri tessuti. L'incapacità di spegnere il processo dannoso, come lo stress ossidativo, la lipotossicità, la via apoptotica, contribuiscono ai danni epatici, alla progressiva fibrosi, che può portare alla cirrosi, e lo sviluppo di epatocarcinoma in alcuni pazienti.

Due ampi studi di coorte hanno sottolineato l’importanza della presenza della sindrome metabolica per la progressione della steatoepatite, dimostrando che il 66% dei pazienti di età superiore a 50 anni, con diabete o obesità, aveva una steatoepatite non alcolica con fibrosi avanzata alla la biopsia epatica [6].

Il rischio della progressione a cirrosi per la NASH non è stata ancora chiaramente delineato, ma è stato stimato in un range tra il 21% e il 26% in un lasso di tempo di 8,2 anni [7]. Fino al 30% dei pazienti affetti da NASH con una cirrosi compensata svilupperanno uno scompenso epatico in 8-10 anni [8]. Sebbene il rischio di sviluppare la cirrosi tra i pazienti con NAFLD aumenti il rischio di sviluppare complicanze correlate alla cirrosi come l’epatocarcinoma e lo scompenso epatico, anche un precoce stato di fibrosi può portare ad un outcome peggiore [9-10].

Lo stato di fibrosi è il migliore predittore della mortalità nella NAFLD. Il rischio di sviluppare l’epatocarcinoma è approssimativamente del 7% in 6,5 anni [7-8].

Le tre principali cause di mortalità nel paziente con NASH includono: patologie cardiovascolari, (con un range di mortalità del 13-30%), tutti i tipi di neoplasie (range di mortalità del 6-8%) e morte connessa alla disfunzione epatica (range di mortalità 2,8-19%) [8].

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La NAFLD e l’epatopatia alcolica posso coesistere nel paziente con sindrome metabolica che fa uso di una quantità di alcool maggiore di 60g/die per l’uomo e 40 g/die per la donna, questo può contribuire a peggiorare la progressione della storia naturale della patologia. [11]

Il microbiota intestinale

Il possibile ruolo del microbiota intestinale (MI) e l’applicazione terapeutica o preventiva dei probiotici in alcune patologie ha raccolto una grande attenzione negli ultimi anni. Il MI è un complesso sistema ecologico composto da più di 500 differenti specie batteriche con variazioni anatomiche nella composizione e nel numero: nello stomaco è stato riscontrato un basso numero di batteri, principalmente composto da lattobacilli, streptococchi, stafilococchi, enterobatteri e lieviti. Questo scarso numero è dovuto principalmente al basso pH gastrico. Nei successivi tratti intestinali c’è un incremento quantitativo della flora da 0-105 CFU ( colony forming units) per grammo nel duodeno, 108 CFU nell’ileo fino a 1010 CFU nel colon, favorito dal pH neutro intestinale, dal tempo di transito rallentato e dalla disponibilità di nutrienti. Nel colon più del 99% dei microrganismi sono anaerobi stretti come il bifidobatterio, bacterioidi spp, clostridi spp, eubacteri spp, fusobacteri spp e peptostreptococchi [25-26].

(Fig. 2) Il microbiota intestinale svolge alcune importanti funzioni per l’ospite, inclusa la produzione di vitamine, degradazione degli acidi biliari e la digestione di nutrienti.

In particolare è importante a livello del colon prossimale, la fermentazione saccarolitica dei carboidrati non assorbibili e indigeribili da parte dei batteri intestinali per la produzione di acidi grassi a catena corta (ad esempio acetato, propinato e butirrato). Il butirrato è la principale fonte di energia per le cellule epiteliali intestinali, promuove la proliferazione cellulare e la differenziazione, aumenta la secrezione di muco e riduce l’infiammazione [27]. La fermentazione batterica proteolitica ha luogo principalmente nella parte distale del colon, dove i carboidrati non sono più disponibili e determina la formazione di componenti tossiche come l’ammoniaca, fenoli, cresoli e para-cresoli [28]. La colonizzazione dell’intestino da parte di batteri commensali è importante per lo sviluppo e il funzionamento del sistema immunitario. Negli animali privati della flora intestinale si trovano meno linfociti, plasmacellule e cellule mononucleate, nonché una riduzione dello sviluppo di strutture linfoidi. Inoltre sono stati osservati bassi livelli di IgA e ridotta produzione di mucina [25-26]. Infine, insieme alla mucosa intestinale, la flora endogena forma un’importante barriera contro i patogeni attraverso il meccanismo della resistenza alla colonizzazione.

Alcune delle funzioni del microbiota intestinale possono essere influenzate positivamente dai probiotici. Sebbene questi esercitino i loro effetti attraverso diversi meccanismi, la loro abilità di aumentare la funzione di barriera intestinale e prevenire la traslocazione batterica è più rilevante rispetto al loro ruolo nella patologia epatica, sulla quale esercitano un effetto benefico attraverso meccanismi indiretti. Oltre alle sue importanti funzioni fisiologiche, il micro-

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biota può anche esercitare azioni dannose sul fegato. Infatti, le endotossine derivate dall’intestino, possono contribuire all’evoluzione della NAFLD in NASH e fibrosi, nonché all'insorgenza dell’ipertensione portale [30-32]. Alcuni studi hanno dimostrato che il trattamento con antibiotici a basso assorbimento o con i probiotici possono inibire il passaggio da NAFLD a NASH negli animali con obesità e migliorare l’emodinamica della circolazione portale nei pazienti con ipertensione portale [33-35].

Fig. 2

La composizione del gut microbiota > 90 % è costituito da due Phyla dominanti: B acte roidetes e F irmicut es < 10 % è costituito da 5 phyla sub-dominanti: Actinoba ct eria , Prote obacter ia, F uso ba cter ia, C ya nobact eria e Verrucom icrobia

Gwee KA, et al. Gut, 2003 Verdu EF, et al. Gut, 2006

Asse Intestino-Fegato

L’intestino e il fegato rappresentano un sistema interconnesso che ha diverse funzioni: assorbimento, metabolismo e smistamento dei differenti nutrienti. L’interconnessione tra questi ! due organi è deducibile dallo studio anatomico. In particolare, il fegato riceve il sangue da due sistemi vascolari: il primo è costituito dalla vena porta che fornisce approssimativamente il 75% del volume totale di sangue che perviene all’organo; il secondo consiste nelle arterie epatiche che forniscono il rimanente 25%. Il sistema portale trasporta il sangue che deriva dall’intestino, il quale contiene non solo i nutrienti assorbiti, ma anche le molecole di segnale e i prodotti batterici, come i lipopolisaccaridi (LPS), il DNA batterico, i peptidoglicani (molecole appartenenti alla classe dei PAMPs) e in alcuni casi, batteri intatti [36].

L’epitelio intestinale è composto da differenti tipi di cellule organizzate in villi e cripte. Il rapporto tra gli enterociti adiacenti regola la permeabilità intestinale (PI). Questo rapporto è

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mediato dalle tight junctions (TJS) che, occupando una posizione paracellulare, modulano l’ampiezza di questo spazio, permettendo il normale passaggio di ioni e piccole molecole e bloccando il passaggio dei microrganismi che vivono nell’intestino [37]. Le tight junctions sono strutture dinamiche che si rinnovano continuamente, sensibili alla composizione dietetica e batterica. In questo modo entrambi questi fattori possono essere responsabili della regolazione della permeabilità intestinale [38].

Asse intestino-fegato nella patogenesi della NAFLD

Il passaggio da NAFL a NASH può essere rilevato dall’aumento delle transaminasi, che a sua volta può essere correlato alla comparsa di infiammazione del tessuto epatico causato da specie reattive dell’ossigeno, prodotti batterici derivati dall’intestino e sintesi di fattori solubili da parte del tessuto adiposo e dal sistema immunitario [39-40]. Come precedentemente descritto, spesso la NAFL ed in particolare la NASH, rappresentano la manifestazione di una patologia epatica connessa a una patologia sistemica: la sindrome metabolica. Questa patologia è caratterizzata da una infiammazione cronica definita di “basso grado” anche detta “meta infiammazione” o “parainfiammazione” [41]. I meccanismi che supportano questa infiammazione non sono ancora completamente chiari, ma probabilmente hanno un ruolo importante nell’evoluzione da NAFL a NASH [42]. Il rilascio di citochine dovuto all’infiammazione locale e sistemica, contribuisce a peggiorare la resistenza insulinica che riduce la sintesi epatica di VLDL, contribuendo all’accumulo di grasso nel fegato.

Il principale stimolo infiammatorio epatico è rappresentato dai prodotti batterici di origine intestinale, riconosciuti tramite I toll-like receptors (TRL) [43].

I TRL sono presenti in differenti tipi di cellule epatiche, come le cellule di Kupffer, le cellule epatiche stellate (HSC), gli epatoci, le cellule epiteliali biliari e le cellule endoteliali [44].

In condizioni normali questi tipi di cellule esprimono bassi livelli di TRL mRNA, così che il fegato sia tollerante a bassi livelli di ligandi dei TRL derivati dall’intestino e fisiologicamente presenti nel sangue portale. La via correlata all’attivazione dei TRL include il reclutamento e l'attivazione delle proteine citosoliche come il fattore di differenziazione mieloide 88 e la sua interazione con il dominio toll del recettore dell’interleuchina 1 [83-85]. Quando l’infiammazione avviene nella NAFLD, vengono attivati NF-kB (nuclear trascriptional factors Kappa-B) e AP-1 che stimolano la produzione di TNF-α (tumor necrosis factor α) e IL 10, in particolare dalle cellule di Kupffer [48-50].

TNF-α e NF-kB sono due delle principali citochine che supportano l’infiammazione nella NAFLD/NASH come dimostrano diversi studi: -Geoffrey et al., usando un modello animali, hanno dimostrato che TNF-α è fondamentale per l’insorgenza della steatoepatite [51].

-Leclercq et al. hanno dimostrato che la curcumina protegge il fegato prevenendo l’infiammazione mediata dallo stress ossidativo dovuto all’attivazione di NFkB [52].

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-Koca et al. hanno dimostrato che la somministrazione dell’antisiero di TNF-α in modelli sperimentali di steatosi indotta da dieta deficitaria di metionina e colina (MCD), protegge dal danno epatico [53].

Il ruolo che la permeabilità intestinale e il microbiota hanno nella determinazione dell’insorgenza di differenti patologie, fu proposto nel 1890 da Lewllyn Jones con la “teoria dell’autointossicazione da batteri intestinali” [54].

In molti studi è stato dimostrato che i pazienti con NAFLD hanno un aumento della permeabilità intestinale, che può spiegare il ruolo dell’asse intestino-fegato nella patogenesi di malattie epatiche. Per esempio, le lesioni intestinali delle IBD, spiegano l’ipotesi della correlazione tra malattie infiammatorie intestinali (IBD)e colangite sclerosante primitiva (CSP), sottolineando il ruolo dell’aumento della permeabilità intestinale e del microbiota nella patogenesi.

Queste lesioni possono determinare un enorme passaggio nel sangue portale di prodotti di origine batterica, come peptidi ed endotossine che possono causare un processo infiammatorio nel fegato. L’aumento della permeabilità intestinale e la possibile concomitante alterazione nella composizione della flora intestinale, come la crescita eccessiva di batteri nell’intestino tenue (SIBO), può determinare una endotossiemia di basso livello, in particolare nel sangue portale e nel fegato, capace di generare infiammazione e fibrosi nei pazienti con NAFLD. A supporto di questa teoria è stato dimostrato che l’obesità, un importante fattore di rischio per NAFLD, contribuisce all’alterazione del microbiota intestinale a causa dell’influenza sul rapporto tra le specie di Bacterioides e Firmicutes [56], promuovendo la tossiemia e quindi il danno epatico, come dimostrato da studi sia su modelli animali che nell’uomo.

L’endotossiemia può inoltre avere un effetto sulla resistenza insulinica nei pazienti con NAFLD, creando un circolo vizioso che promuove questa patologia [57-58].

-Farhadi et al. [59] hanno dimostrato che c’è una differenza nella permeabilità intestinale tra i pazienti affetti da NAFLD e quelli con NASH. In particolare, questo studio ha mostrato che ci sono cambiamenti irregolari della permeabilità intestinale durante il naturale decorso della NASH dovuto a fattori ancora non ben chiari e che i pazienti con NASH possono avere una suscettibilità maggiore all’endotossiemia rispetto ai paziento con NAFL. -Miele et al. [60] hanno dimostrato un’associazione tra NAFLD e SIBO, rilevando un incremento della permeabilità intestinale correlata all’alterazione delle Tight Junctions in questi pazienti. In particolare gli autori hanno studiato 86 pazienti, 35 con NAFLD, 27 con celiachia non trattata (usati come modello di aumentata permeabilità intestinale) e 24 volontari sani, mostrando che i pazienti con NAFLD avevano un’alta prevalenza di permeabilità intestinale e sovracrescita di batteri nell’intestino tenue (SIBO) rispetto ai soggetti sani, sebbene entrambi i parametri fossero più bassi rispetto ai pazienti con celiachia non trattata. Inoltre sia la IP che la SIBO erano correlate con l’intensità della steatosi, anche se non con la presenza di NASH. A supporto dell’importanza dell’alterazione delle TJS nella genesi dell’aumento della permeabilità intestinale, una ricerca immunoistochimica ha dimostrato che l'intensità della colora-

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zione dei zonula occludens (ZO-1), una componente importante del complesso proteico delle Tight Junctions, è nettamente inferiore nei pazienti NAFLD, lasciando supporre che questa possa essere una delle cause dell’aumento dell’IP [60].

-Giorgio et al. [61] in un recente studio basato su bambini con NAFLD hanno dimostrato un aumento della permeabilità intestinale maggiore del gruppo di controllo. Nel gruppo dei pazienti con NAFLD, la IP era maggiore nei bambini con NASH rispetto a quelli con una semplice steatosi, inoltre questi bambini avevano livelli maggiori di lipopolisaccardi (LPS).

La composizione del microbiota intestinale è differente in relazione al tipo di dieta, ma è anche correlata al peso corporeo.

-Bachhed et al. hanno studiato questa correlazione in un modello murino, concludendo che i topi nutriti in maniera tradizionale e con un normale sviluppo del microbiota, avevano una più alta quantità di grasso corporeo, tessuto adiposo e grasso epatico rispetto ai topi privi di flora. Questa osservazione sembra essere confermata da un altro lavoro sulla valutazione del grasso corporeo in topi senza flora intestinale, dopo l’inoculazione intestinale del microbiota presa dal tratto distale dell’intestino di topi che avevano un microbiota intestinale fisiologico.

Dopo l’inoculazione è stato dimostrato un aumento del 57% del grasso corporeo, associato con una riduzione dell’espressione intestinale di FIAF (fattore adiposo indotto dal digiuno), un inibitore circolante della lipoproteine lipasi endoteliali (LPL) [62]. La riduzione dei livelli di FIAF è correlata ad un aumento dell’attività della LPL endoteliale, che degrada le molecole di trigliceridi contenute nelle lipoproteine e promuove il loro immagazzinamento negli adipociti, che a loro volta aumentano il grasso corporeo. La marcata riduzione di FIAF può rappresentare un importante meccanismo patogenetico nel mantenimento della sindrome metabolica, dell’obesità e dell’insulino-resistenza, dovuto al fatto che i suoi livelli sono condizionati dalla quantità e qualità della composizione del microbiota.

In altri studi, è stato dimostrato come la somministrazione orale di Lactobacillus paracasei possa avere la capacità di indurre un aumento dell’espressione intestinale di FIAF nei topi senza microrganismi con un aumento dei livelli di FIAF circolante.

Sebbene ora sia riconosciuto universalmente che la produzione di tossine di derivazione intestinale possa agire come trigger per l’attivazione dell’infiammazione epatica, così come si può dedurre da un ampio numero di lavori pubblicati sull’argomento [59,60,63,64], rimane un importante interrogativo: qual è il livello di endotossiemia capace di determinare l’infiammazione epatica?

Diversi studi condotti da Imajo et al. hanno cercato di dare una risposta a questa domanda dimostrando che l’iper-responsività dei pazienti con NAFLD/NASH alle endotossine è più importante dei livelli di endotossiemia per l’attivazione dell’infiammazione epatica.

In un primo studio i ricercatori hanno dimostrato l’aumento della responsività alla LPL nei topi alimentati con una dieta ad alto contenuto di colesterolo [65].

Uno studio successivo ha indagato il possibile meccanismo molecolare che sottende questo incremento nei modelli murini in cui era stata indotta la steatosi con una dieta ad alto conte-

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nuto di grassi. Questi autori hanno dimostrato un aumento dell’espressione di CD14 nel fegato, un marcatore delle cellule di Kupffer, che può essere responsabile dell’ipersensibilità alle endotossine [66]. Quindi CD14 può rappresentare un importante fattore di regolazione nell’infiammazione epatica [67-68]. Gli stessi ricercatori hanno anche studiato la correlazione tra i livelli epatici di CD14 e la quantità di leptina circolante. A questo scopo hanno utilizzato due modelli murini: uno composto da topi knock-out per il gene della leptina e un altro composto da topi con un deficit del recettore della leptina. Entrambe i modelli hanno mostrato una riduzione dei livelli epatici di CD14 e anche una riduzione della responsività ai lipopolisaccaridi. Inoltre la somministrazione esogena di leptina nei topi non obesi e senza steatosi causa un incremento dell’espressione di CD14 e della suscettibilità ai LPS. Quindi, poiché i livelli di leptina sono aumentati nei pazienti obesi, è facile ipotizzare un ruolo centrale di questa molecola nella patogenesi della NAFLD/NASH. Imajo et al. hanno osservato un aumento dei livelli nel siero di leptina e di CD14 epatico nei pazienti con NAFLD rispetto ai pazienti di controllo sani, e maggiori nella NASH rispetto alla NAFLD [66].

Asse intestino-fegato e fibrosi/cirrosi epatica

L’asse intestino-fegato è coinvolto nella patogenesi della NAFLD e nella sua evoluzione, cioè la fibrosi e la cirrosi epatica [69-70]. Un danno epatico di ogni eziologia induce una reazione riparativa mediata da differenti tipi di cellule [71]. Il fegato è in grado di riparare le proprie lesioni grazie alla proliferazione degli epatociti, ma nel corso di tale processo può verificarsi la formazione di tessuto fibrotico che rimpiazza il normale parenchima epatico [72]. Le cellule epatiche stellate (HSCs) sono le principali responsabili di questo avvenimento, dovuto al fatto che acquisiscono un fenotipo miofibroblastico e producono collagene, il principale componente della fibrosi tissutale [73]. Le endotossine di derivazione intestinale (LPS batterico, DNA, RNA e lipopeptidi) hanno un effetto pro-infiammatorio sul fegato [69-74]. Questa infiammazione è responsabile del deposito di tessuto fibrotico nel fegato, infatti nel paziente cirrotico e nei modelli sperimentali di fibrosi sono stati dimostrati elevati livelli di LPS nella circolazione sistemica [69,70].

-Szabo et al. e Ricera et al. [75-76] hanno studiato il ruolo di TLR2 e TLR4 nella patogenesi della fibrosi epatica nei modelli murini: nei topi TLR2 -/- è stato dimostrato un aumento del danno indotto da NASH, suggerendo un ruolo protettivo di questo recettore nella patologia.

La matrice extracellulare è prodotta dalle cellule stellate (HSCs), le quali sono stimolate da citochine pro-infiammatorie e profibrogeniche sintetizzate dalle cellule di Kupffer che hanno un elevato numero di TLR4 sulla superficie [77-78]. E’ stato inoltre dimostrato che il ligando di TLR4 agisce direttamente sulle HSCs inducendo fibrosi epatica [70]. La più potente citochina che attiva le cellule stellate HSCs e la fibrogenesi è il TGF-β. È stato messo in evidenza che TLR4 aumenta sia produzione di TGF-β da parte delle cellule di Kupffer che la suscetti-

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bilità delle HSCs al TGF-β. Il segnale dipendente da LPS-TLR4 determina la down regulation di alcune proteine che sono implicate nel blocco della trasduzione di TGF-β mediato dal segnale. (Fig. 3) Fig. 3

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Tra questi, lo pseudo-recettore BMP e BAMBI giocano un ruolo importante nella down-regulation del segnale post-recettoriale di TGF-β [79-80]. Un ulteriore importante fattore in questo quadro di fibrosi epatica nella NAFLD è rappresentato dalla disregolazione dell’espressione dei microRNA (miRNA). I miRNA sono polimeri di singoli filamenti contenenti approssimativamente 20 nucleotidi che hanno funzioni regolatorie nell’espressione genetica della trascrizione, traduzione e degradazione dell’RNA. In particolare un miRNA chiamato miR-29c, coinvolto nell’espressione del collagene [81], è stato trovato ridotto nei campioni di fegato prelevati da pazienti con NAFLD e fibrosi epatica. Inoltre l’attivazione della via metabolica di TLR9 gioca un ruolo importante nella genesi della fibrosi epatica in vivo. Il ligando di TLR9 è rappresentato da una sequenza di citosine-guanine non metilate di DNA batterico, il suo legame con il recettore determina l’attivazione del sistema dell’immunità innata. Il pathways di attivazione include la produzione di IL-1 che a sua volta attiva le cellule stellate HSCs con una up-regulation di geni fibrogenetici come il pro-collagene di tipo I e metallo proteinasi-1 inibitrici del tessuto. In aggiunta è stato dimostrato TLR9 sono espressi sulle membrane citoplasmatiche delle cellule stellate HSCs. Per questo motivo, studi sperimentali su topi con deficit di TLR9 e IL-1 hanno dimostrato un basso sviluppo di fibrosi rispetto ai topi wild-type di controllo [82].

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Dopo l’azione di ogni noxa patogena, il sistema immunitario agisce attraverso l’attivazione dei neutrofili per la rimozione cellulare e la riparazione delle lesioni. Una eccessiva infiltrazione di neutrofili determina, però, il peggioramento dell’infiammazione generando un danno epatico indotto dal sistema immunitario [83-84]. In questo caso l’infiammazione, definita “infiammazione sterile del fegato”, è dovuta al rilascio nel fegato di DAMPs “patterns molecolari associati al danno”. I DAMPs sono riconosciuti dai TLR allo stesso modo dei PAMPs e agiscono insieme per sostenere l’infiammazione. Per esempio, TLR4 riconosce non solo LPS ma anche HMGB1, un DAMP che è ubiquitariamente espresso dalle cellule e regola l’attività di fattori trascrizionali [85]. Nel corso del danno epatico, HMGB1, dopo essere rilasciato dagli epatociti, direttamente durante l’apoptosi e indirettamente durante la necrosi, agisce supportando l’infiammazione e determinando la progressione della patologia [86-87]. La traslocazione batterica è una delle manifestazioni della cirrosi. I meccanismi alla base della nascita della BT nella cirrosi sono principalmente quattro: 1.La sovracrescita batterica (IBO) 2.La disfunzione immunitaria 3.L’alterazione dei fattori luminali 4.L’alterazione della permeabilità intestinale La sovracrescita si verifica frequentemente in corso di cirrosi e sembra essere correlata al grado di disfunzione epatica [88].

In particolare è stato dimostrato che c’è una massiva sovracrescita batterica nell’intestino tenue (SIBO) e che questa è correlata alla presenta di endotossiemia. Pochi sono gli studi in merito; tra questi, il più rappresentativo è quello di Madrid et al., in cui i pazienti con patologia epatica mostravano un’alterazione della motilità intestinale, in particolare del tenue. Il grado di questa alterazione è direttamente correlato con lo score Child-Pugh della patologia epatica di ogni eziologia, ciò nonostante il meccanismo patogenetico che sottende all’alterazione della motilità intestinale non è ancora chiaro [89-90].

In un recente studio è stata dimostrata una anomala propagazione dell’onda peristaltica nei pazienti con ipertensione portale che non era stata riscontrata nei pazienti in cui questa condizione era assente; dunque sembra che l’ipertensione portale possa essere significativamente connessa a queste anomalie della motilità [91].

Durante il naturale corso delle cirrosi c’è un’ampia varietà di anomalie immunologiche, sia sistemiche (ipergammaglobulinemia policlonale, produzione di auto-anticorpi, depressione di cellule immuni e natural killer, riduzione dell’attività del reticolo endoteliale) e localizzate nell’intestino. Il sistema reticolo-endoteliale (RES) è il principale meccanismo di difesa contro le infezioni e la batteriemia. Le cellule di Kupffer rappresentano la componente principale del RES; tuttavia, la loro attività nel corso della cirrosi è ridotta sia per quanto riguarda la riduzione della funzione di fagocitosi o per la presenza di shunt porto-sistemici che

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. bypassano il fegato [92]. In particolare l’alterazione delle difese immunologiche intestinali colpisce principalmente la distribuzione e la funzione dei linfociti intraepiteliali (IELs), come dimostrato in modelli sperimentali di ratti con cirrosi [92]. Il sistema linfatico associato alla mucosa intestinale ha una funzione cruciale nel mantenimento dell’equilibrio tra la flora batterica intestinale e l’ospite, prevenendo l’inizio dell’infezione.

Solo pochi batteri bypassano i linfonodi mesenterici e, in presenza di un sistema immunologico intatto, non sopravvivono. La riduzione dell’interferone γ (INF-γ) nella cirrosi può portare a una riduzione della fagocitosi macrofagica. Questo consente ai batteri di proliferare e bypassare i linfonodi mesenterici. I fattori che agiscono nel lume intestinale sono: acidi biliari, IgA, mucine, defensine, lisozima, fosfolipasi A2, ecc. Tra questi gli acidi biliari hanno un ruolo importante: un effetto trofico sulla mucosa intestinale e una inibizione della proliferazione batterica, in particolare dei batteri anaerobi [93]. La somministrazione di acidi biliari coniugati in ratti cirrotici con ascite porta alla riduzione della sovracrescita batterica intestinale, una riduzione della traslocazione batterica e della endotossiemia, così come un aumento della sopravvivenza [94]. Inoltre un incremento della permeabilità intestinale è stato associato alla cirrosi [95]. La congestione vascolare, la proliferazione dei miociti, la riduzione dei villi e del rapporto villi/cripte e l’ispessimento della muscolaris mucosae sono i possibili fattori responsabili. Un meccanismo funzionale che può causare un aumento del IP coinvolge l’ossido nitrico. Infatti la sua iperproduzione nella cirrosi e nell’ipertensione portale determina una alterazione dell’integrità della mucosa intestinale tramite l’espansione delle Tigh Junctions, la distruzione del citoscheletro di actina e la riduzione dell’adenosina trifosfato (ATP).

I probiotici

L’uso dei probiotici nella NASH è una acquisizione recente nella pratica clinica. I primi studi in tale direzione sono stati avviati in risposta alle prove di una possibile modulazione della flora endogena in molte malattie intestinali [96]e all’impossibilità di usare antibiotici intestinale per lungo tempo. I primi studi su modelli animali che mostrarono la validità dei probiotici nella NASH derivano da Li et al., i quali hanno mostrato, attraverso altre dimostrazioni, l’influenza di VSL3 sui livelli di alanina aminotrasferasi (ALT) e TNF-α nei pazienti con NAFLD [34]. Inoltre nel 2005, Chen et al. [97] dimostrarono l’effetto protettivo del Lactobacillus arricchito con Selenio sul danno epatico indotto da CCI4, in particolare migliorando i livelli di ALT, malonilaldeide (MDA), superossido dismutasi (SDO), glutatione (GSH). In conclusione, nonostante vi siano sempre maggiori evidenze in merito a un possibile ruolo dei probiotici nella NASH, un lavoro della Cochrane del 2007, a causa della mancanza di trial clinico randomizzato, sconsiglia il suo impiego nel corso di NASH. Il coinvolgimento della flora batterica nella patogenesi delle complicanze della cirrosi ha gettato le basi per una possibile strategia terapeutica finalizzata alla modifica di batteri intestinali, sia da un punto di vista quantitativo che qualitativo, con l'obiettivo finale di contenimento

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. e / o riduzione del verificarsi della traslocazione batterica. L’uso di diversi microrganismi, detti probiotici, sembra adatta a questo scopo attraverso le seguenti funzioni: per preservare il naturale equilibrio biologico del tratto intestinale e modulare la crescita di altri gruppi di batteri; per stabilizzare la barriera della mucosa intestinale e stimolare la resistenza dell’ospite alle infezioni. Sebbene vi siano dati promettenti su alcune casistiche sia su animali da esperimento che su esseri umani, i probiotici sono ancora considerati, forse a giusta ragione, poco più che degli integratori alimentari. La difficoltà del loro utilizzo risiede nell’enorme mole di batteri presenti nel microbiota, che possono generare interazioni non prevedibili da soggetto a soggetto. Sicuramente, però, il miglioramento delle conoscenze dei meccanismi alla base di queste interazioni prospetta delle possibilità terapeutiche interessanti nel futuro.

Conclusioni

L’importanza della endotossiemia e il ruolo dei TRL nella promozione dell’infiammazione attraverso l’interazione con DAMPs e PAMPs ed l’attivazione delle cellule di Kupffer sono stati evidenziati da diversi ricercatori. Le cellule di Kupffer possono attivare le cellule stellate HSCs per promuovere la progressione della malattia a fibrosi e cirrosi.

Inoltre è stata dimostrata una diretta attivazione delle HSCs da parte dei prodotti batterici intestinali. I pazienti con NAFLD hanno anche una diversa composizione del microbiota intestinale che causa, attraverso i meccanismi precedentemente descritti, lo sviluppo di un circolo vizioso che promuove l’attivazione di fattori di rischio per la patologia. In fine è stata dimostrata in questi soggetti una iperattività epatica alle endotossine.

In conclusione la fisiologica e patologica connessione tra intestino e fegato può essere considerata un interessante obiettivo di studio che potrà portare all'elaborazione di approcci terapeutici futuri eventualmente basati sulla modulazione quantitativa e / o qualitativa della microflora intestinale e la riduzione di permeabilità intestinale e dell’endotossiemia, in questo modo è possibile interferire con il complesso patogenetico di cross-talk tra intestino e fegato che può essere una delle principali cause di danno epatico nella sindrome metabolica.

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Bacterial Carbonic Anhydrases as drug target for obtaining new antiinfectives.

Claudiu T. Supuran * , Vincenzo Carginale **, Clemente Capasso ** * Università degli Studi di Firenze, Dipartimento Di Chimica Università degli Studi di Firenze, Dipartimento Neurofarba, Florence, Italy. **Istituto di Bioscienze e Biorisorse, CNR, Napoli, Italy.

Abstract The conversion of carbon dioxide (CO₂) to bicarbonate (HCO₃�) and protons (H+) is a physiologically relevant reaction in all life kingdoms. The uncatalyzed hydration-dehydration reaction CO₂ + H₂O ⇋ HCO₃ˉ + H+ is slow at physiological pH and thus, in biological systems, the reaction is accelerated by enzymatic catalysts, called carbonic anhydrases (CAs, EC 4.2.1.1). CA isozymes have been found in all mammalian tissues and cell types, where they function in CO₂ transport and other processes. The CA superfamily is an interesting example of a convergent/divergent evolution phenomenon with seven known families: α-, β-, γ-, δ-, ζ -, η- and θ-CAs. Prokaryotes include several kinds of microorganisms, such as Archaea, bacteria and cyanobacteria. s. It has been demonstrated that CAs are enzymes encoded by the genome of many pathogenic organisms. Bacteria, for example, encode for enzymes belonging to the α-, β- and γ-CA classes. Recently, CAs started to be investigated in detail in several pathogenic bacteria, in the search for antibiotics with a novel mechanism of action, since it has been demonstrated that in many bacteria, CAs are essential for the life cycle of the organism.

CAs from pathogens were biochemically characterized and extensively studied for their inhibition profiles towards the classical CAs inhibitors, such as sulfonamides and anions.

Keywords: Carbonic anhydrase, Bacteria, pathogens, inhibitor, sulfonamides, anions, phylogeny

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1. Introduction 1.1 Carbonic anhydrases Carbonic anhydrases (CAs, EC 4.2.1.1) are metalloenzymes catalyzing a common reaction in all life domains: the carbon dioxide hydration to bicarbonate and protons (CO₂ + H₂O⟺ HCO₃ˉ + H+) ¹. CAs are found in the three domains of life (Eubacteria, Archaea and Eukarya) and represent a very interesting example of convergent/divergent evolution phenomenon with seven known families: α-, β-, γ-, δ-, ζ-, η- and θ-CAs.²ˉ⁴ These macromolecules are grouped in different classes mainly on the basis of their structural fold and arrangement of the active site residues. The α-, β-, δ-, η- and, perhaps θ-CAs are characterized by a Zn(II) ion in the active site. γ-CAs are probably Fe(II) enzymes, although this family is active also with bound Zn(II) or Co(II) ions⁵�¹². ζ-CAs are cambialistic enzymes, active both with Cd(II) or Zn(II) bound within the active site.¹³�¹⁵ The metal ion from the CA active site is coordinated by three His residues in the α-, γ-, δ- and, probably, θ-classes; by one His, and two Cys residues in β- and ζ-CAs or by two His and one Gln residues in the η-class, with the fourth ligand being a water molecule/hydroxide ion acting as nucleophile in the catalytic cycle of the enzyme. ¹�²,¹⁶�¹⁹ Some of the catalytically active α-CAs also catalyze the hydrolysis of esters/thioesters, (for example 4-nitrophenyl acetate (4-NpA) hydrolysis, as well as other hydrolytic reactions).

However, no esterase activity was detected so far for enzymes belonging to the other five CA genetic families. The 3D fold of the five CA classes is very different: α-CAs are normally monomers and rarely dimers; β-CAs are dimers, tetramers or octamers; γ-CAs are trimers.⁶�⁷,¹⁰,²⁰ The only ζ-CA crystallized so far has three slightly different active sites on the same polypeptide chain, whereas no X-ray crystal structures of δ- and ζ-and CAs are available so far. All CAs identified in animal systems belong to α-class.²¹,²² CAs identified in plants and algae belong to the α-, β-, γ-, δ- and θ-classes; fungi encode for α- and β-CAs; protozoa encode for α-, β- or η-CAs; bacteria encode for enzymes belonging to the α-, β- and γ-CA classes.¹,¹⁶,¹⁸,²³�²⁶ Our groups investigated the biochemical properties, kinetic constants and inhibition profiles with sulfonamides and anions of numerous classes of CAs in different species of pathogenic and non-pathogenic bacteria (Table I).

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Table I. !"#$%&'"()*+,)#-"&"#$%&'.%/)01)23&)4&235,)"6/)'67%,$'4"$%/)82&)$-%'&)9'6%$'#)#26,$"6$,)"6/)'6-'0'$'26)5&28'(%,:

Bacterium

Vibrio cholerae

27-29

Helicobacter pylori 30-32 Streptococcus mutans 16, 33-34 Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria sicca Porphyromonas gingivalis 16, 35-38 Legionella pneumophila 39 Clostridium perfringens Brucella suis 41-43

40

Burkholderia pseudomallei 44-46 Salmonella enterica 47-48 49

Streptococcus pneumonie Mycobacterium tuberculosis 50-52 Methanobacterium thermoautotrophicum 53 Methanosarcina thermophila 54

Class ! " # ! " " " ! ! " # " " " " " " # " " " " " " "

CA Acronym VchCA! VchCA" VchCA# hp!CA hp"CA SmuCA HICA NgoCA NsiCA PgiCA " PgiCA # LpCA1 LpCA2 CpeCA bsCA I BsCA II Bps"CA Bps#CA stCA 1 stCA 2 PCA mtCA 1 mtCA 2 mtCA 3 Cab

Characteristics Pathogenicity Disease + Cholera +

+

Gastritis, gastric ulcers Caries Influenza Gonorrhea Septicemia Periodontitis, rheumatoid arthritis Legionellosis

+ +

Food poisoning Brucellosis

+

Melioidosis

+

Salmonellosis

+ +

Pneumonia Tuberculosis

+ + + + +

Inhibition Sulfonamides Anions + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

-

-

Sulfurihydrogenibium yellowstonense 10,

# # !

Zn-Cam Co-Cam SspCA

-

-

+ + +

+ + +

Sulfurihydrogenibium azorense 58-61 Colwellia psychrerythraea 62-63 Pseudoalteromonas haloplanktis 64-65

! # #

SazCA CpsCA PhaCA#

-

-

+ + +

+ + +

55-57

1.2 CA inhibitors The metal complexing anions and the sulfonamides, which bind to the Zn(II) ion of the enzyme either by substituting the non- protein zinc ligand or add to the metal coordination sphere, generating trigonal–bipyramidal species, are the most frequently investigated CA inhibitors (CAIs).¹⁸ˉ¹⁹,²⁵ˉ²⁹ Sulfonamides, sulfamates, and sulfamides are the most impor tant class of carbonic anhydrase inhibitors (CAIs). Derivatives 1-24 and AAZ-HCT (Figure 1) are either simple aromatic/heterocyclic sulfonamides widely used as building blocks for obtaining new families of such pharmacological agents, or they are clinically used agents, among which acetazolamide AAZ, methazolamide MZA, ethoxzolamide EZA and dichlorophenamide DCP, are the classical, systemically acting antiglaucoma CA inhibitors (CAIs). Dorzolamide DZA and brinzolamide BRZ are topically acting antiglaucoma agents, benzolamide BZA is an orphan drug belonging to this class of pharmacological agents, whereas topiramate TPM, zonisamide ZNS and sulthiame SLT are widely used antiepileptic drugs. Sulpiride SLP and indisulam IND were also shown by our group to belong to this class of pharmacological agents, together with the COX2 “selective” inhibitors celecoxib CLX and valdecoxib VLX. Saccharin and the diuretic hydrochlorothiazide HCT are also known to act as CAIs. Interesting to note that, a compound, discovered by Supuran’s group and indicated with the acronym SLC-0111, is in Phase I clinical trials as an antitumor/antimeta static agent. Sulfonamides and their bioisosteres bind in a tetrahedral geometry to the Zn(II)

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ion in deprotonated state, with the nitrogen atom of the sulfonamide moiety coordinated to Zn(II) and an extended network of hydrogen bonds, involving amino acid residues Thr199 and Glu106 (numbering system used for the human CA, isoform I), ¹⁸,²⁵ˉ²⁶,²⁹ also participating to the anchoring of the inhibitor molecule to the metal ion. The aromatic/heterocyclic part of the inhibitor interacts with hydrophilic and hydrophobic residues of the cavity. ¹⁹,²⁷ˉ²⁸ Other CA inhibitors include compounds anchoring to the zinc-coordinated water molecule/hydroxide ion (phenols, polyamines, sulfocoumarins, etc.); compounds occluding the entrance of the active site (coumarins and their isosteres); compounds binding in an unknown manner (secondary/tertiary sulfonamides, imatinib, nilotinib, etc.).

Figure 1. Derivatives 1-24 and AAZ-HCT as CA inhibitors

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2. Results 2.1 Carbonic anhydrase as drug target Recently, the possibility to develop new antibacterial agents raised much interest. In fact, at present, infectious diseases are the second-leading cause of death in the world and the emergence of antibiotic-resistant microorganisms is an inevitable and widespread phenomenon, inherent to most drugs.³⁰ˉ³¹ In prokaryotes, the existence of genes encoding CAs from at least three classes (α-, β- and γ-class) suggests that these enzymes play an important role in the prokaryotic physiology.³² Recently, CAs started to be investigated in detail in pathogens such us bacteria, in the search for antibiotics with a novel mechanism of action, since it has been demonstrated that in many microorganisms, CAs are essential for the life cycle of microbes and that their inhibition leads to growth impairment or growth defects of the pathogen (Table II). ²⁶,³³ˉ³⁶ Bacterial CAs, in fact, are involved in the transport of CO₂ or HCO₃ˉ, in supplying CO₂ or HCO₃ˉ for the biosynthetic reactions (and thus metabolisms); in pH regulation and also in cyanate degradation (at least in E. coli), as well as in the survival of intracellular pathogens within their host. ³²,³⁷ˉ³⁹ Within the Bacteria domain, the enzymes from Neisseria gonorrhoeae, Neisseria sicca, Helicobacter pylori and Vibrio cholerae belong to the α-class.⁴⁰ˉ⁴³ α-CAs from Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori and Vibrio cholerae have been cloned and characterized in detail in the last few years. ⁴⁴ˉ⁴⁵ A common feature of all bacterial α-CAs known to date is that they have an N-terminal signal sequence indicating a periplasmic or extracellular location and a possible physiological role in CO₂ uptake processes.⁴⁶ CAs belonging to the β-class were cloned, purified, and characterized from Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Streptococcus pneumoniae, Salmonella enterica, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae, Porphyromonas gingivalis and from other pathogens.⁴⁷ In the Archaea domain, a γ-CA from Methanosarcina thermophila was the first reported by Ferry’s group.⁴⁸ The presence of both the β and γ-CA classes in thermophilic chemolithoautotrophs suggests that ancient CO₂-fixation pathways depended on this enzyme for efficient CO₂ fixation. Recently, it has been shown the involvement of CAs in the life cycle of the bacteria. For example, Helicobacter pylori lives in the highly acidic environment of the stomach. Its genome encodes for a periplasmic α-CA and a cytoplasmic β-CA.⁴⁶,⁴⁹ˉ⁵² The crucial role played by these CAs present in H. pylori is the acid acclimatization of the pathogen within the stomach. ⁵³ˉ⁵⁴ This role is corroborated by the in vivo inhibition studies carried out using inhibitors of H. pylori α- and β-CAs. The inhibition of these two enzymes, in fact, led to the death of the bacteria and a possible eradication of H. pylori from the stomach and has been used clinically for the treatment of gastric ulcers. ⁴⁶,⁴⁹ Again, the genome of the Gram-negative bacterium Vibrio cholerae, the causative agent of cholera, ⁵⁵ˉ⁵⁷ encodes for putative CAs belonging to each bacterial class: α, β and γ. In Vibrio cholerae it has been recently shown that sodium bicarbonate induces cholera toxin expression.⁵⁸ˉ⁵⁹

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It has been demonstrated that bicarbonate ions, present at a high concentration in the upper small intestine colonized by V. cholera, stimulates virulence gene expression by enhancing ToxT, a regulatory protein that directly activates transcription of the genes encoding CT (cholera toxin). ⁵⁹ Intriguingly, the addition of CA inhibitors caused a significant reduction in virulence gene! expression.

Table II. In vivo inhibition studies of bacterial carbonic anhydrases using sulfonamides and phenols.

2.2 Phylogenetic analysis Recently, we have conducted a thorough phylogenetic analysis to better understand the evolutionary relationship among the bacterial CA classes (α-, β- and γ-CAs). ⁵⁷,⁶⁰ˉ⁷¹ The results of the phylogenetic analysis showed the presence of well-supported nodes characterizing two distinct clades: a clade including the bacterial γ-CAs, and a clade containing β- and α-CAs (Figure 2). This inferred phylogenetic analysis has evidenced that the three bacterial CA classes are evolutionarily distinct, in spite of the rather high level of the structural similarity that characterizes the CA protein family (at least considering the active site architecture). α-CAs, in fact, formed a distinct cluster, which was positioned in the same cluster of the β-CAs. We hypothesized that these two classes have arisen from the γ-CAs cluster. Probably,

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the common ancestor was subject to an event of gene duplication, which separated γ-CAs from β-CAs. Subsequently, another duplication event led to the α-CAs starting from β-CAs. In fact, although the γ class is widely distributed among all three domains of life, it is the only CA class mainly identified in Archaea, the most ancient microorganisms that exist on earth. The phylogenetic analysis is corroborated by the promiscuity theory, which is a key factor in the evolution of a new protein function. ⁷²�⁷³ Looking at the substrate used by γ-, β- and α-CAs, we noticed that γ-CAs use only CO₂ as substrate, β-CAs can hydrolyze CO₂, COS, and CS₂, whereas the α-CAs not only hydrate CO₂, CS₂, COS, cyanamide, cyanate but also possess esterase activity, with a range of esters of carboxylic, sulfonic or phosphate esters.⁶²,⁶⁷,⁷⁴�⁷⁹ Thus, α-CA is the class, which acquire a high catalytic versatility resulting the most recent form as suggested by the phylogenetic analysis.

Figure 2. Phylogenetic analysis of the -, - and -CAs from Gram- negative and -positive bacteria. Microorganisms, accession numbers and cryptonym are given in Table.

3. Conclusions

In last year, a multitude of new CAs were identified, cloned and characterized in many pathogenic bacteria, such as Helicobacter pylori, Bacillus suis, Vibrio cholerae, Salmonella typhimurium, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Clostridium perfringens, Porphyromonas gingivalis, etc. Enzymes belonging to the α-, β- and/or γ-CA classes were detected in

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these pathogens. Many of these enzymes were shown to possess a significant catalytic activity for the CO₂ hydration reaction, and furthermore, it has been demonstrated that in some of these pathogens they are crucial for the life cycle of the bacterium. In vitro inhibition studies were performed for many of these enzymes with sulfonamides and inorganic anions, small molecules such as boronic acids, phenylarsonic acid, sulfamic acid, sulfamide, sulfonamides, and dithiocarbamates. In many cases effective inhibitors were detected, some of which also inhibited the bacterial growth in vivo. However, very few of the detected inhibitors were also selective for the bacterial over the human, such as hCA II isoform. This is in fact one of the main challenges in proposing CAIs as novel anti-infective with a new mechanism of action.

Moreover, we deduced that the γ-class has arisen first, followed by the β-class, while the α-class was the last originated CAs, as suggested by the phylogenetic analysis.

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50. Nishimori, I.; Minakuchi, T.; Kohsaki, T.; Onishi, S.; Takeuchi, H.; Vullo, D.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem Lett 2007, 17, 3585.

51. Nishimori, I.; Vullo, D.; Minakuchi, T.; Morimoto, K.; Onishi, S.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem Lett 2006, 16, 2182.

52. Nishimori, I.; Minakuchi, T.; Morimoto, K.; Sano, S.; Onishi, S.; Takeuchi, H.; Vullo, D.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. J Med Chem 2006, 49, 2117.

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56. Del Prete, S.; De Luca, V.; Scozzafava, A.; Carginale, V.; Supuran, C.T.; Capasso, C. J Enzyme Inhib Med Chem 2014, 29, 23.

57. Del Prete, S.; Isik, S.; Vullo, D.; De Luca, V.; Carginale, V.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T.; Capasso, C. J Med Chem 2012, 55, 10742.

58. Cobaxin, M.; Martinez, H.; Ayala, G.; Holmgren, J.; Sjoling, A.; Sanchez, J. Microb Pathog 2014, 66, 5.

59. Abuaita, B.H.; Withey, J.H. Infect Immun 2009, 77, 4111.

60. Vullo, D.; De Luca, V.; Del Prete, S.; Carginale, V.; Scozzafava, A.; Capasso, C.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem Lett 2015, 25, 3550.

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61. De Luca, V.; Vullo, D.; Del Prete, S.; Carginale, V.; Scozzafava, A.; Osman, S.M.; AlOthman, Z.; Supuran, C.T.; Capasso, C. Bioorg Med Chem 2015, 23, 4405.

62. Dedeoglu, N.; De Luca, V.; Isik, S.; Yildirim, H.; Kockar, F.; Capasso, C.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem 2015, 23, 2995.

63. Dedeoglu, N.; DeLuca, V.; Isik, S.; Yildirim, H.; Kockar, F.; Capasso, C.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem Lett 2015, 25, 2291.

64. Alafeefy, A.M.; Ceruso, M.; Al-Tamimi, A.M.; Del Prete, S.; Supuran, C.T.; Capasso, C. J Enzyme Inhib Med Chem 2015, 30, 592.

65. Prete, S.D.; Vullo, D.; Osman, S.M.; Scozzafava, A.; AlOthman, Z.; Capasso, C.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem 2014, 22, 4537.

66. Del Prete, S.; Vullo, D.; De Luca, V.; Supuran, C.T.; Capasso, C. J Enzyme Inhib Med Chem 2014, 29, 906.

67. Vullo, D.; Sai Kumar, R.S.; Scozzafava, A.; Capasso, C.; Ferry, J.G.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem Lett 2013, 23, 6706.

68. Del Prete, S.; Vullo, D.; De Luca, V.; Carginale, V.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T.; Capasso, C. Bioorg Med Chem Lett 2013, 23, 4067.

69. Luca, V.D.; Vullo, D.; Scozzafava, A.; Carginale, V.; Rossi, M.; Supuran, C.T.; Capasso, C. Bioorg Med Chem 2013, 21, 1465.

70. Vullo, D.; De Luca, V.; Scozzafava, A.; Carginale, V.; Rossi, M.; Supuran, C.T.; Capasso, C. Bioorg Med Chem Lett 2012, 22, 7142.

71. Vullo, D.; Luca, V.D.; Scozzafava, A.; Carginale, V.; Rossi, M.; Supuran, C.T.; Capasso, C. Bioorg Med Chem 2013, 21, 1534.

72. Sanchez-Tarin, M.; Swiderek, K.; Roca, M.; Tunon, I. J Phys Chem B 2015, 119, 1899.

73. Alderson, R.G.; De Ferrari, L.; Mavridis, L.; McDonagh, J.L.; Mitchell, J.B.; Nath, N. Curr Top Med Chem 2012, 12, 1911.

74. Tanc, M.; Carta, F.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T. ACS Med Chem Lett 2015, 6, 292.

75. Scozzafava, A.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem 2003, 11, 2241.

76. Guerri, A.; Briganti, F.; Scozzafava, A.; Supuran, C.T.; Mangani, S. Biochemistry 2000, 39, 12391.

77. De Luca, V.; Del Prete, S.; Vullo, D.; Carginale, V.; Di Fonzo, P.; Osman, S.M.; AlOthman, Z.; Supuran, C.T.; Capasso, C. J Enzyme Inhib Med Chem 2016, 31, 810.

78. De Luca, V.; Vullo, D.; Del Prete, S.; Carginale, V.; Osman, S.M.; AlOthman, Z.; Supuran, C.T.; Capasso, C. Bioorg Med Chem 2016, 24, 835.

79. Del Prete, S.; Vullo, D.; Osman, S.M.; AlOthman, Z.; Capasso, C.; Supuran, C.T. Bioorg Med Chem Lett 2015, 25, 5194.

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Rianimazione Aperta Pio Zannetti U.O.C. di Anestesia e Rianimazione – P.O. SMdP degli Incurabili Asl Na1 Centro

“APRITE, ANZI SPALANCATE LE PORTE………” (cit. Giovanni Paolo II) Partiamo da una semplice considerazione: Un ricovero in Rianimazione ( o Terapia Intensiva, sono sostanzialmente sinonimi), rappresenta per l’intero nucleo familiare del paziente (oltre che per il paziente stesso se in grado di comprendere) uno degli eventi più traumatici che possa accadere.

Per certi versi addirittura più della patologia causa del ricovero : un trauma maggiore, un arresto cardiaco, una insufficienza respiratoria, un qualsiasi altro evento che porti alla necessità di ricorrere a cure intensive viene vissuto dal nucleo familiare come un torto, un accidente, oppure come l’evoluzione di una malattia cronica, ma rappresenta appunto un evento, un fatto circoscritto.

La degenza in Rianimazione rappresenta invece un percorso, un tunnel, nel quale si entra e dal quale non si sa come, quando, e soprattutto se si uscirà.

Contestualizziamo per un istante i due percorsi: quello del paziente e quello del nucleo familiare.

Un uomo, una donna, un ragazzo, un essere umano, viene improvvisamente messo in un letto ultratecnologico con (almeno) 5 tubi di varia natura che ti entrano o ti escono dal corpo : un accesso venoso centrale, uno arterioso, un catetere vescicale, un tubo in trachea, un sondino nello stomaco. Sei a letto supino, magari con gli arti superiori immobilizzati (per evitare che provi a strapparti uno dei suddetti tubi), sedato a vari livelli, spesso in un ambiente freddo. E’ stato calcolato che in una Rianimazione di 8 posti letto suoni un allarme ogni 45 secondi : il nostro paziente, se sveglio, non sa se quell’allarme appartenga a lui, cosa significhi e se sta preannunciando la sua morte.

Questo paziente, in questa prima fase è in genere sedato (appunto a vari livelli di coscienza), ma il nostro obbiettivo è quello di svezzarlo (Weaning), nel più breve tempo possibile : è oramai acclarato che una ventilazione prolungata (il 40 % è intubato e ventilato), peggiori l’outcome.

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E quindi il nostro “pentaintrodotto” dovrà attraversare questa fase in cui cerca disperatamente di combattere con questo mostro che è il ventilatore, di capire dove si trova, di sopportare il freddo, la nudità, il tocco di mani estranee, i rumori, il dolore ……..! Spesso si riesce a riportarli ad un respiro spontaneo, ad una interazione con l’ambiente, a fargli eseguire ordini semplici (cacci la lingua, mi stringa la mano, chiuda due volte gli occhi…).

Ogni essere umano è diverso da un altro. Questo evidente assioma della vita ordinaria acquista maggiore evidenza in un ambito estremizzato quale quello di una terapia intensiva: La paura, la rabbia, la violenza, la intolleranza, ogni aspetto dell’animo umano vengono ingigantite ed amplificate in questo contesto.

Se le cose vanno bene il paziente resterà a letto per un numero variabile di giorni, sveglio, cosciente, nudo, lavato due o più volte al giorno da mani estranee, senza sapere con precisione che ora è, talvolta nemmeno se è giorno o notte, senza sapere come sta il padre, il figlio, la compagna che stava in auto con lui, cosa è accaduto nel mondo….

Ora brevemente affrontiamo l’altra parte del problema: il nucleo familiare.

Improvvisamente ti viene strappato tuo figlio, tuo padre, tua moglie. Fino a un’ora prima hai condiviso idee, sogni, amore, rabbia, lavoro ed improvvisamente tra te e lui c’è una porta invalicabile, blindata.

Non conosci i medici e gli infermieri che lo/la stanno curando (questa è una peculiarità dell’urgenza/emergenza: non puoi sceglierti il medico cui affidarti. Magari hai speculato su internet per un mese per decidere da chi farti togliere una cisti di 8 mm, ma non puoi scegliere chi tratterà il tuo periarresto cardiaco…..).

Viviamo in un periodo dove la figura dell’operatore della Sanità è denigrata senza posa: aprire un giornale e trovare l’articolo sulla malasanità, sulle formiche nei reparti, sulle lenzuola sporche, sulle infermiere assassine o sui medici corrotti……è fin troppo facile. Peccato che rappresentino lo 0,1% di quello che accade ogni giorno negli ospedali. Ma siccome il 99,9% non fa notizia, il nucleo familiare di cui sopra teme, e spesso si autoconvince, che al di la di quella porta tutti gli eventi avversi possibili della Sanità si concentrino sul congiunto.

E quanto più le occasioni di contatto, di verifica dello stato clinico del paziente si fanno rare, tanto più la paura, il risentimento dei familiari cresce, soprattutto se le condizioni non migliorano.

Un antidoto a questa duplice congiuntura negativa esiste, ma ha un costo importante.

SI CHIAMA RIANIMAZIONE APERTA. Sin dalla fine degli anni 90 alcuni pionieri hanno cominciato ad evidenziare quanto un contatto tra il paziente critico e il suo contesto familiare migliorasse l’outcome e il rischio di contenziosi medico legali.

Nel periodo 2010 – 2014, presso la UOC di Rianimazione del P.O. San Paolo di Napoli, che ho avuto il privilegio di dirigere, abbiamo provato ad attuare una politica di apertura parzia

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le: dalle ore 11 alle 19, per i pazienti capaci di relazionarsi, un visitatore poteva restare vicino al degente e collaborare alle attività di tipo alberghiero (lavarsi, bere, alimentarsi).

Il risultato è stato una riduzione dei casi di delirio (un evento frequentissimo –dal 25 all’80% in vari studi -nei ricoverati in Rianimazione (2)), la assenza di contenziosi medico legali e un clima generale di maggior fiducia verso le equipe sanitarie.

Ma la Rianimazione aperta non si limita ad avere un certo numero di “laici” che gironzola per il reparto. Vuol dire costruire un senso di normalità intorno al paziente: dalla possibilità di avere un orologio, un tablet, il telefonino, un giornale. Nella possibilità e nel diritto di avere una rasatura quotidiana della barba in un maschio o una pulizia dei capelli fatta con cura.

Questo e altro definisce una Rianimazione aperta.

E i problemi?

Analizziamo alcune delle più fiere obiezioni portate dai detrattori delle Rianimazioni Aperte: 1) Aumento delle infezioni in relazione a microbi che entrerebbero insieme ai visitatori. In realtà è stato dimostrato il contrario (5). Il rischio infettivo è essenzialmente legato alla possibilità che gli operatori trasmettano patogeni da un paziente all’altro senza un adeguato lavaggio mani (unica procedura certificata come utile). E’ improbabile che il papà di Marco, dopo aver carezzato il figlio vada poi a toccare il signor Luigi nel letto accanto. E quindi basta che all’ingresso del reparto sia posizionata una soluzione disinfettante idonea e venga chiesto a chi entra di lavarsi le mani e di non toccare altri pazienti 2) Difficoltà ad accettare persone non preparate in Terapia Intensiva: “e se capita una emergenza, se dobbiamo fare una rianimazione cardio polmonare??”. Rianimazione aperta non vuol dire Rianimazione senza regole. Chi entra va educato sulla necessità di accomodarsi fuori se sorgessero evenienze che lo rendessero necessario. In cinque anni di esperienza non abbiamo avuto il minimo problema in merito.

3) Come faccio a relazionarmi con un parente che ogni tre minuti mi chiede perché suona l’allarme? Ecco , il vero nocciolo del problema è questo: Una adeguata formazione degli operatori sanitari che sappia comunicare con i parenti dei degenti in modo chiaro , onesto e autorevole (che è l’esatto contrario di autoritario). L’Italia è purtroppo agli ultimi posti in questa “apertura” verso il mondo esterno: meno del 2% applica politiche di ingresso avanzate in Terapia Intensiva, contro il 23% delle ICU francesi e il 70% di quelle scandinave. Va però rilevato che un questionario anonimo somministrato agli operatori delle ICU Italiane “aperte”, dopo 3 anni di esperienza, ha evidenziato.

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4) l’ UNANIMITA’ nel ritenere l’esperienza fortemente positiva e la assoluta contrarietà a ridurre gli orari di accesso. Per contro questionari somministrati ai parenti, evidenziavano come primo riconoscimento all’equipe, la COMPETENZA. Inoltre I nuclei familiari “anziani” (ovvero quelli già presenti da tempo in reparto), tendevano a fungere da ponte, da facilitatori tra i parenti dei nuovi ricoverati e l’equipe sanitaria.

5) Se il paziente peggiora, come posso gestire l’ansia del congiunto? E’ stato dimostrato l’esatto contrario. La presenza durante l’intero ciclo terapeutico con partecipazione alle varie fasi prognostiche e decisionali rendono il nucleo familiare molto più recettivo alle variazioni.

La permanenza del nucleo familiare in reparto ingenera la consapevolezza che sia stato fatto tutto il possibile, tutto “il giusto”, senza nascondere o omettere nulla. Poi le cose possono andare bene o male, ma nulla potrà essere imputato ad una equipe che lavora in trasparenza.

6) La presenza dei parenti limita la normale relazione tra gli operatori sanitari. Ennesima considerazione sbagliata. Nel Capodanno del 2013 facemmo entrare i parenti di due ragazzi (affetti da ARDS da virus H1N1) in reparto e brindarono con noi. Uno dei due ragazzi morì tre giorni dopo e la madre ci ringraziò, piangendo, per averle dato quell’ultima gioia. La moglie di un ragazzo morto con la SLA ha partecipato alla rianimazione cardiopolmonare del marito, ha collaborato con gli infermieri a comporre il cadavere e ha chiesto di poter tornare in reparto come volontaria per assistere altri nuclei familiari.

7) I pazienti vivono con stress, con tensione, la presenza dei familiari al loro capezzale. Su quest’ultima affermazione esiste una robusta letteratura scientifica che mostra l’esatto contrario: il livello del cortisolo circolante è ridotto in maniera statisticamente significativa nel gruppo “aperto” e le complicanze cardiovascolari si riducono del 50% (1) Queste ed altre evidenze scientifiche hanno ampiamente dimostrato che non esiste alcun limitazione valida ad una Rianimazione Aperta. L’unico limite è culturale, di disponibilità degli operatori a mettersi in discussione, nella scelta di porre al centro del percorso assistenziale il paziente.

Nei contesti nei quali tale esperienza è stata implementata i risultati sono stati positivi e gli stessi operatori sono diventati i più ferventi sostenitori della Rianimazione Aperta.

PERCHE’ NON FARLO OVUNQUE?????

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Bibliografia 1.

Fumagalli S., et al (2006) Reduced cardiocirculatory complications with unrestrictive policy in an intensive care unit. Circulation 2006; 113: 946-52.

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Knutsson SE et al. Visits of children to patients being cared for in adult ICUs: policies, guidelines and recommendations. Intensive and Critical Care Nursing 2004;20:264-74; 5.

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Quale sarà il futuro terapeutico di questo paziente con Cirrosi epatica da HCV genotipo 3a: caso clinico Raffaele Di Sarno 1°U.O.C Neuropatie Infettive ed Emergenze Infettivologiche Ospedale Cotugno L’infezione cronica da virus dell’epatite C è un grave problema sanitario a livello mondiale.

Secondo le stime dell’OMS (Organizzazione Mondiale della Sanità) circa 170 milioni di persone nel mondo sono portatori cronici dell’infezione, mentre in Italia si stima che vi siano almeno 300.000 casi già diagnosticati e molti altri ancora da scoprire per un totale di circa 900.000 persone infette. Esistono 7 genotipi del virus della epatite C, che si presentano con frequenze diverse a seconda delle zone geografiche. Nel nostro Paese è prevalente il genotipo 1 (in particolare 1b), che si riscontra in circa il 50% delle persone infette. Anche i genotipi 2, 3 e 4, più comuni in aree geografiche dove la prevalenza dell’infezione è elevata (Paesi asiatici, Est Europa ed Egitto), mostrano una frequenza in aumento in Italia a causa dei flussi migratori.

Nella storia naturale dell’infezione, in una certa percentuale di pazienti ( stimata intorno al 20-25% ) la malattia evolve verso la cirrosi, l’epatocarcinoma e lo scompenso epatico in un tempo variabile tra i 20 ed i 30 anni, in funzione non solo della replicazione del virus ma anche di eventuali co-fattori (abuso alcolico, diabete, obesità, altre infezioni virali). Per anni le nostre capacità di cura sono state limitate dalla scarsa efficacia dei farmaci, dalla loro limitata tollerabilità e dall’impossibilità d'impiego nei pazienti con malattia scompensata (interferone, IFN-pegilato, antivirali ad azione diretta ( DAAs ) di prima generazione quali Telaprevir e Boceprevir).

Dall’avvento dei DAAs di seconda ondata, ben tollerati e sicuri, si è aperta una “nuova era” nel trattamento dei pazienti e l’obiettivo finale è di eradicare completamente il virus C in tutti i soggetti infetti. L’avvento di queste nuove molecole, ha completamente rivoluzionato il trattamento dei pazienti con epatite C, scrivendo una pagina storica della medicina che, sulla più importante rivista medica al mondo, il New England Journal of Medicine, Raymond Chung ha definito “ l’arco di un trionfo medico “. I nuovi farmaci hanno permesso di semplificare drasticamente le terapie e portare i tassi di eradicazione a quasi il 100%, permettendo di trattare tutti i pazienti, indipendentemente dal genotipo, patologie associate, cirrosi, e ridurre la durata del trattamento in maniera straordinaria, fino anche a 8 settimane, con effetti collaterali trascurabili. Oggi in Italia sono disponibili diversi farmaci e combinazioni terapeutiche, fornite in maniera gratuita da SSN a tutti i pazienti affetti da Epatite C.

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Da gennaio 2014 sono stati commercializzati in Europa una lunga serie di nuovi DAAS: sofosbuvir (inibitore nucleotidico della RNA polimerasi NS5B e prodotto dalla ditta americana Gilead Sciences) che agisce su tutti i genotipi del virus; simeprevir (Janssen-Cilag) che appartiene alla stessa classe di boceprevir e telaprevir ed e’ efficace solo nei confronti dei genotipi 1 e 4 di HCV; daclatasvir (BMS) inibitore della proteina NS5A da associare al sofosbuvir ed anch’esso pangenotipico; l’associazione precostituita di sofosbivir + ledipasvir (inibitore della proteina NS 5A (Gilead Sciences) attivo sul genotipo 1; l’associazione precostituita di paritaprevir/ritonavir/ombitasvir da associare quando necessario a dasabuvir (AbbVie), attiva nel genotipo 1 e 4. Inoltre nuove combinazioni sono di imminente arrivo, così come interessantissime sono alcune future applicazioni delle combinazioni già disponibili, basti pensare all’utilizzo in età pediatrica. Infine, altre molecole sono in fase di sperimentazione molto avanzata.

Nel caso clinico in questione giunge alla nostra osservazione il sig. N.M., maschio, di anni 46 anni, altezza 180 cm e peso 80 Kg ; riferisce i C.E.I. l’anamnesi non evidenzia patologie e/o affezioni degne di nota se non una storia di tossicodipendenza con abuso di sostanze illecite ed alcol all'età di 20 anni e per sei anni. Successiva disintossicazione grazie a 5 anni vissuti in una Comunità per «riabilitazione etica – sociale». Attualmente impegnato in attività commerciale-settore abbigliamento. In anamnesi epatopatia cronica attiva evolutiva da HCV genotipo 3a. Nell’anno 2004 dopo una stadiazione della sua affezione epatica inizia trattamento antivirale con PEG-IFN + Ribavirina sospeso per intolleranza soggettiva ed effetti collaterali ( astenia, artromialgie). Nell’anno 2007 nuovo ciclo terapeutico con PEG-IFN + Ribavirina sospeso al 6° mese per intolleranza soggettiva ed effetti collaterali (astenia, artromialgie).

Nell’anno 2013 ripete determinazione HCV-RNA che risulta essere 1.800.00 UI/ml e del genotipo 3a (eseguito presso virologia di un noto ospedale del centro storico di Napoli).

Nell’aprile 2015 rivalutazione ematochimica, clinica e strumentale dell’infezione cronica da virus C al fine di trattare il paziente con DAAS di 2 generazione secondo lo schema terapeutico Daclatasvir+ Sofosbuvir in combinazione con Ribavirina per 24 settimane. Esegue elastometria epatica con una liver stiffness di 22 Kpa ed esami ematochimici di routine che evidenziano solo una lieve alterazione delle transaminasi che risultano essere circa 2,5 x v.n. Viremia al basale HCV-RNA: 2.600.000 UI/ml . Inizia la terapia, prevista per 24 settimane, in data 07/06/2015 con Daclatasvir+ Sofosbuvir in combinazione con Ribavirina peso-dosata di 1200 mg/die. Al primo controllo, effettuato alla quarta settimana di trattamento, si rileva buona aderenza terapeutica e gli esami di routine risultano essere essenzialmente nella norma con lieve diminuizione delle transaminasi (AST-ALT 1,5 x ULN). Non riferisce effetti collaterali ma solo lieve astenia. La determinazione dell’ HCV-RNA è 200 UI/ml (pari a 3,44 log).

In un successivo controllo alla ottava settimana, in data 06 agosto 2016, gli esami di routine evidenziano normalizzazione delle transaminasi

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sieriche e degli indici di colestasi epatica (GGT ed ALP) ed HCV-RNA plasmatico non rilevabile con la RT-PCR. Il paziente riferisce ottima aderenza alla terapia, assenza di effetti collaterali e benessere soggettivo. Ai successivi controlli con cadenza mensile, costante normalizzazione degli indici di citolisi epatica con viremia non rilevabile. Alla fine del ciclo terapeutico alla 24 settimana transaminasi nella norma e viremia non rilevabile. I successivi controlli, effettuati come da protocollo alla quarta settimana post-trattamento, alla dodicesima e ventiquattresima settimana post-trattamento, per valutare l’avvenuta Risposta Virologica Sostenuta, Sustained Virological Response, SVR ), al controllo della ventiquattresima settimana si evidenziava un incremento delle transaminasi (AST 79, ALT 105) e la determinazione dell’HCV-RNA plasmatico mostrava una carica virale di 237000 UI/ml.

Il caso in esame ci imponeva di fare alcune considerazioni: 1) Il test del genotipo effettuato presso la struttura ospedaliera era correttamente eseguito?

2) Il paziente si era reinfettato con un altro genotipo?

3) Il trattamento antivirale ha generato ceppi resistenti?

Riesegue il test di genotipizzazione mediante Inno-Lipa presso il nostro ambulatorio che conferma il genotipo 3a ed il test di farmaco resistenza con sequenziamento del genoma per i geni: NS3 - NS5A e NS5B polimerasi: tale test va eseguito al momento del fallimento terapeutico di un primo ciclo con i nuovi DAAS; il test di resistenza va effettuato su quello stoccato e su un campione di plasma prelevato quando si decide di ritrattare il paziente con altri DAAS ciò in quanto la polimerasi del virus dell'epatite C, non essendo munita di un sistema di proof-reading nell'atto di replicarsi o riprodursi, compie una serie di errori: in altre parole, non riesce a replicare una copia perfetta di se stesso, ed il risultato di questo "errore di trascrizione" sono miliardi di virus diversi l'uno dall'altro che identificano le “quasispecies “ virali , che persistono nel sangue del paziente. Se tra questi mutanti virali – così simili ma diversi uno dall'altro – ne esiste una specifica tipologia con caratteristiche tali da renderlo capace di replicarsi anche in presenza di un farmaco antivirale, questo ceppo si riprodurrà, e si amplificherà per selezione a tal punto da rendere la maggioranza del virus circolante resistente al farmaco. Lo sviluppo di resistenze può avvenire per varie cause: potenza e posologia del farmaco inadeguata, incompleta aderenza terapeutica, resistenze preesistenti ed imprevedibili, insorgenza di mutazioni che rendono il farmaco inattivo su quel particolare tipo di virus. Gli studi con daclatasvir hanno evidenziato che nei trattamenti con daclatasvir più sofosbuvir +/- ribavirina sono state osservate frequentemente mutazioni sull’NS5A già presenti prima del trattamento, approssimativamente nell'11% di infezione da genotipo 1, nel 50% di infezione da genotipo 2, nell'8% di infezione da genotipo 3 e nel 71% di infezione da genotipo 4.Tali mutazioni sull’NS5A, presenti all’inizio della terapia, non hanno avuto

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un impatto negativo sui tassi di cura dei pazienti trattati con sofosbuvir + daclatasvir +/ribavirina, ad eccezione della mutazione Y93H nell'infezione da genotipo 3 (osservata in 16/192 [8%] dei pazienti) nei quali il tasso di SVR12 è ridotto, specialmente nei pazienti con cirrosi. Il tasso complessivo di cura per i pazienti infetti da genotipo 3 che sono stati trattati per 12 settimane con sofosbuvir + daclatasvir (senza ribavirina) in presenza e in assenza della mutazione Y93H erano rispettivamente 7/13 (54%) e 134/145 (92%). Per i pazienti infetti da genotipo 3 trattati per 12 settimane con sofosbuvir + daclatasvir + ribavirina non c'era nessuna presenza della mutazione Y93H prima del trattamento e pertanto i risultati di SVR non possono essere valutati.

La mutazione S282T, che è associata alla resistenza a sofosbuvir, è emersa solo in 1 paziente infetto con genotipo 3. In pazienti trattati con daclatasvir e sofosbuvir con/senza ribavirina non sono disponibili dati sulle mutazioni associate alla resistenza a daclatasvir oltre i 6 mesi successivi al trattamento.Al contrario, le mutazioni emergenti associate alla resistenza a daclatasvir così come ad altri inibitori dell’NS5A, sono state osservate persistere per almeno 2 anni dopo il trattamento. In sostanza si può affermare che lo sviluppo di resistenze assumendo daclatasvir è molto raro e pertanto il farmaco presenta una buona barriera genetica e la terapia combinata con il sofosbuvir (con o senza ribavirina) presenta elevatissimi tassi di successo anche in presenza di pre-esistenti mutazioni di resistenza al farmaco. Nel caso in esame il test di resistenza sull’NS5A ha evidenziato la presenza della mutazione Y93H presente nel genotipo 3. Un ritrattamento a breve, pertanto, non è possibile. E’ opportuno quindi precisare che un secondo trattamento con i nuovi DAA prima di 6 mesi dal fallimento di un primo ciclo di terapia, può essere preso in considerazione se sono soddisfatti entrambi i seguenti criteri: urgenza clinica definita come la presenza di 1 o più dei seguenti criteri: pazienti in lista di trapianto - MELD > 13 - Child B - Rapido peggioramento clinico rispetto al termine della terapia (passaggio da child A a B o peggioramento di 2 punti di MELD). Disponibilità di un trattamento potenzialmente efficace (da definire in base all’anamnesi farmacologica e al profilo di resistenza) Un secondo trattamento con i nuovi DAA in un paziente clinicamente stabile può essere preso in considerazione trascorsi 6 mesi dal fallimento di un primo ciclo di terapia, nel rispetto dei criteri AIFA e delle regole concordate a livello regionale al fine di applicare una strategia di trattamento equa avendo verificato la disponibilità di un trattamento potenzialmente efficace (da definire in base all'anamnesi farmacologica e/o al profilo di resistenza) ed in particolare nei pazienti con HCC eradicato (in assenza di recidiva) non candidabili al trapianto. Nella scelta della strategia terapeutica per un ritrattamento si dovranno inoltre considerare la/e opportunità terapeutiche di prossima commercializzazione I pazienti con fallimento terapeutico ad un DAA non debbono essere ritrattati con farmaci dello stesso tipo. Le eventuali mutazioni selezionate probabilmente non sono simili come accade per BOC e TVR significato clinico di queste variantipotrebbe essere sconosciuto. Il virus wild type per riemer

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gere come specie dominante impiega circa 2 anni e questo processo è più lento nei genotipo 1 ed in particolare nel genotipo 1a°. In corso di fallimento terapeutico bisogna seguire la stopping rules. La questione dei fallimenti e ritrattamento con farmaci ad azione antivirale diretta di nuova generazione è una tematica ancora ricca di interrogativi, in funzione dell’assenza di dati certi. In linea generale, i dati disponibili suggeriscono che pazienti che hanno fallito terapie contenuti daclatasvir potrebbero aver sviluppato mutazioni a carico dell’NS5A, su cui il farmaco agisce. Dati consistenti indicano che mutazioni di questo tipo scompaiono nel tempo.

In particolare il fallimento sofosbuvir + daclatasvir: per questi pazienti è opportuno effettuare esami specifici per accertare l’eventuale insorgenza di mutazioni che possono causare la resistenza all’azione di altri eventuali farmaci. In particolare, considerato che mutazioni a carico dell’NS5B su cui agisce sofosbuvir, sono meno frequenti, sarà importante determinare il quadro delle mutazioni su tutti i segmenti (NS3, NS5A, NS5B) in modo da impostare una nuova terapia con combinazione farmacologica appropriata.

Tra i nuovi farmaci la combinazione di elbasvir e grazoprevir da poco in commercio in Italia, risulta essere sicura, tollerabile ed efficace nell'eradicare l'epatite C ed attivo sul genotipo 1 e 4 : ulteriori prove sono state presentate ad Amsterdam, in occasione del 52° congresso della European Association for the Study of the Liver (Easl). L'azione combinata dei due antivirali diretti offre una nuova opzione terapeutica che da pochissimo è disponibile in Italia, ampliando in tal modo il ventaglio di armi a disposizione per curare l'epatite C. Due nuovi farmaci Glecaprevir e Pinbretasvir costituiscono un regime pan-genotipico ormai uscito dalla fase sperimentale, sviluppato dalla multinazionale AbbVie, che combina due agenti antivirali quali un inibitore dell’NS3-4° ( Glecaprevir ) ec unn inibitoredell’NS5A ( Pibrentasvir ).Questi due farmaci sono somministrati oralmente una volta al giorno sotto forma di tre compresse. I risultati degli studi, sulla combinazione glecaprevir/pibrentasvir sottolineano l’elevata efficacia e la buona tollerabilità di questi farmaci nel trattamento del virus dell'epatite C di genotipo 1 in pazienti che in precedenza hanno fallito il trattamento con antivirali ad azione diretta (DAA) e tra pochi mesi saranno commercializzati in Italia.

E’ stata inoltre appena approvata la commercializzazione e a breve la rimborsabilità in Italia di due differenti molecole, Velpatasvir e Sofosbuvir, che rappresenta il primo trattamento pangenotipico in unica compressa e che può fornire un ciclo di durata breve, di 12 settimane, a pazienti con differente genotipo e differente severità di malattia. I risultati sono in termini di successo elevati, sopra il 90% in qualsiasi sottogruppo di pazienti. Nel caso in esame, Il futuro terapeutico di questo paziente, alla luce della recente commercializzazione dei nuovi DAAS e di quelli che da qui a poco saranno approvati e delle raccomandazioni AISF, per il ritrattamento dei pazienti che non hanno risposto a DAAS di II generazione, di seguire un concetto virologico di base che è quello di ritrattare i pazienti con una combina zione di farmaci che non abbia cross-resistenza con i farmaci usati in precedenza ed utilizza

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re almeno un farmaco di un’altra classe assieme ad un farmaco di alta barriera genetica di resistenza. Si consiglia, inoltre, in questi casi di trattare i pazienti tutti come cirrotici per quel che riguarda la durata del trattamento e la necessità di utilizzare la ribavirina. L’auspicio è che l’ingresso di nuove molecole agevoli il lavoro del medico e contribuiscano alla eradicazione del virus e stimoli la concorrenza, strumento indispensabile perché il mercato si arricchisca di prodotti innovativi, a un prezzo sempre più basso, consentendo la sostenibilità del Servizio Sanitario Nazionale e la possibilità terapeutica a tutti.

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Razionale - Find out Consensus Meeting Ivan Gentile - Department of Clinical Medicine and Surgery University of Naples "Federico II"

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Consensus Meeting

Congress Report Nonostante il progredire tumultuoso delle conoscenze su numerosi aspetti dell’infezione da HCV, la maggior parte dei Paesi non possiede dati robusti circa la prevalenza di tale infezione.

I dati noti si basano su stime che oscillano molto a seconda delle fonti consultate. Alcune stime riportano un totale di 185 milioni di persone al mondo cronicamente infette di cui 13 milioni in Europa. In Italia non vi sono programmi di screening nazionali e la prevalenza stimata dell’infezione da HCV è del 2% con picchi nelle regioni del Sud Italia. I dati disponibili sono concordi nel segnalare un basso tasso di nuove infezioni, legato alla disponibilità di mezzi di profilassi universale (in particolare siringhe monouso) nelle ultime decadi. Tuttavia, la prevalenza dell’infezione rimane relativamente alta nelle coorti di età > 45 anni. In particolare, negli USA è stata identificata la generazione dei “baby boomers”, ossia dei nati tra il 1945 e il 1965, in cui si stima una prevalenza di soggetti anti-HCV positivi di circa il 3%. Tale dato, relativamente alto, trova riscontro anche nelle fasce di età >45 anni di diversi paesi europei, Italia inclusa.

Poiché l’infezione cronica da HCV è spesso asintomatica, tali pazienti spesso accedono a cure mediche specifiche solo in fase avanzata di malattia. Questo ritardo diagnostico ed il conseguente ritardo terapeutico comportano maggiori spese per il Servizio Sanitario. A fronte della disponibilità delle nuove terapie antivirali interferon-free, associate ad un elevatissimo tasso di guarigione e della progressiva riduzione dei costi di tali farmaci, un obiettivo che la comunità scientifica si pone è quello di individuare i soggetti affetti da epatite cronica C per poterli eventualmente trattare in fase precoce, evitando così la progressione verso gli stadi avanzati di malattia. Come individuare tali soggetti che in massima parte sono asintomatici? Le linee guida attuali raccomandano lo screening in popolazioni a rischio (ad esempio soggetti che hanno fatto o fanno uso di droghe per via sistemica, che hanno ricevuto sangue o prodotti della coagulazione prima del 1990, soggetti che hanno ricevuto trapianti d’organo prima del 1992, soggetti attualmente conviventi o che hanno convissuto con individui con infezione da HCV, sog

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getti con attività sessuale promiscua che presentano una storia di malattie sessualmente trasmesse). Negli Stati Uniti lo screening è allargato alla generazione dei baby boomers. Tuttavia, molti pazienti con infezione da HCV non presentano alcun fattore di rischio noto! Ciò comporta una sottostima della prevalenza dell’infezione e l’impossibilità di intercettare e poter trattare tali individui con le nuove terapie prima che si raggiungano fasi avanzate di malattia.

Come si effettua lo screening? Oltre al classico test effettuato su siero, vi è la possibilità di ricercare gli anticorpi anti-HCV con metodiche rapide immunoenzimatiche che utilizzano una goccia di sangue o la saliva. Esse permettono di rilevare la presenza degli anticorpi anti-HCV con una sensibilità del 99,4% ed una specificità del 100% rispetto al test tradizionale. Il risultato del test è ottenuto già dopo venti minuti dall’effettuazione.

Ciò che rimane sconosciuto è il setting migliore su cui effettuare lo screening. Sarebbero necessari studi sulla popolazione generale ben condotti, in modo da identificare la reale prevalenza dell’infezione e conoscere i gruppi a rischio su cui concentrare gli sforzi per far emergere il sommerso.

Un altro problema è rappresentato dall’identificazione del percorso più virtuoso ed appropriato che il paziente deve compiere per accedere ad un Centro Specializzato in modo da poter effettuare i test di secondo livello ed eventualmente la terapia. Cioè la migliore strategia di “linkage to care”.

In conclusione, molti aspetti dello screening dell’infezione da HCV rimangono incerti. Durante gli eventi, verranno analizzate, confrontate e discusse varie strategie di screening per HCV.

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Razionale - Progetto Hepar Comitato scientifico - Improve Srl

Event Report L’infezione da HCV, in particolar modo nei paesi occidentali, è la principale causa o concausa di epatopatie croniche; ha un impatto sulla salute pubblica devastante in termini di bisogno assistenziale e costituisce, non solo un problema di ordine medico-clinico, ma anche di natura sociale per la qualità e l’aspettativa di vita delle persone affette.

L’infezione presenta, nel suo essere silente, una particolarità che la rende ancora più subdola; basti pensare che la maggior parte dei portatori cronici non presenta sintomi o segni evidenti della malattia, pertanto la percentuale di pazienti non identificati (il cosiddetto sommerso) è estremamente difficile da valutare.

“Dulcis in fundo”, dal punto di vista epidemiologico, l’infezione cronica da virus dell’epatite C presenta un’altissima variabilità geografica rispetto ai tassi di incidenza e di prevalenza, anche all’interno del nostro stesso territorio nazionale con una prospettiva di modifica negli anni a venire ancor più dinamica.

Si evince da tutto ciò, un’oggettiva difficoltà nell’ identificazione dei soggetti HCV+ e quindi nella formulazione di una stima quantitativa verosimile soprattutto in assenza di un metodo di individuazione mirato (case finding) e basato cioè su uno screening selettivo operato su gruppi di soggetti con particolari fattori di rischio.

Metodologia A questo punto, va da se che una buona ed efficace tecnica di screening dei pazienti affetti da Hcv, non possa prescindere da quanto esposto fin ora e l’evento pilota, destinato a 6 comuni da noi identificati, dovrà prevedere i seguenti step: 1.

Coinvolgimento di un Responsabile Scientifico locale a garanzia della valenza clinico-scientifica della manifestazione.

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2. Coinvolgimento di un’Associazione Pazienti riconosciuta al fine di garantire al paziente trasparenza e qualità del servizio.

3. Affluenza copiosa dei soggetti elencati nella tabella 1 ottenibile mediante una campagna divulgativa a mezzo stampa e tv locali mirata e attraverso una diffusione capillare dell’evento, utilizzando le più moderne tecniche di strategia pubblicitaria.

4. Posizionamento degli screening-point nelle aree geografiche più interessate dal fenomeno infettivo onde evitare inutile sprechi di risorse .

5. Utilizzo di una tecnica analitica dal responso veloce e fruibile per tutti.

Seguendo questo percorso, confidiamo nell’idea di poter garantire un’affluenza giornaliera, verso ogni screening-point, di un valido numero di soggetti con l’auspicio che appartengano soprattutto alle categorie a rischio di cui sopra.

E’ ovvio che tale numero sarà funzionale al valore della campagna di diffusione del progetto che intendiamo mettere in campo; va da se che maggiore sarà il numero di soggetti che riusciamo a screenare tanto più alta sarà la possibiltà di ottenere risultati che potrebbero confermare i dati di prevalenza della malattia sopra citati.

Tutto ciò, coniugato con l’arrivo sul mercato dei nuovi farmaci anti HCV ad azione antivirale che promettono in termini di adesione al trattamento e di guarigioni percentuali superiori al 95%, si tradurrebbe in un servizio alla comunità senza pari il cui successo garantirebbe senza dubbio il ripetersi dell’iniziativa allargandola ad un numero maggiore di comuni con alta incidenza del fenomeno infettivo.

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Edizioni Improve Communications Sede Legale - Via Viticella, 48 - Quarto (NA) Sede Operativa - Via Giustiniano, 119 -Napoli P.I. 06828451218

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