Microbiologia e Higiene de Alimentos –Teoria e Prática

SOBRE AS ORGANIZADORAS

Muito se avançou no controle das doenças transmitidas por alimentos

Jackline Freitas Brilhante de São José

(DTA), no entanto, dados do Ministério da Saúde ainda evidenciam a

Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

na articulação entre os atores implicados no processo. Se por um lado,

Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduada em Nutrição pela UFV.

necessidade do aperfeiçoamento nas ações intersetoriais, bem como

o Estado precisa aperfeiçoar as ações da vigilância sanitária, ambiental e agropecuária (entre outras), fomentando práticas inovadoras que contemplem planejamento, monitoramento e avaliação permanentes, bem

Monise Viana Abranches

como processos de educação em saúde; por outro lado, a sociedade

Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

civil, representada por empresários da área de alimentos e por cidadãos

Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV.

comuns, precisa estar consciente do seu papel no exercício da Segu-

Graduada em Nutrição pela UFV.

rança Alimentar e Nutricional.

Microbiologia e Higiene de Alimentos: Teoria e Prática tem como objetivo levar ao público informações atualizadas sobre temas que perpassam a microbiologia e a higiene de alimentos no âmbito dos Serviços de Alimentação para Coletividades; e apresentar de maneira didática os conceitos ligados à microbiologia de alimentos, passando pelos princípios gerais de conservação; à higiene de alimentos e dos manipuladores e ao monitoramento das condições microbiológicas no ambiente de produção de refeições, demonstrando situações-problema que podem facilmente ser enfrentadas no dia a dia.

OUTROS TÍTULOS DE INTERESSE

Ciência dos Alimentos – Princípios de Bromatologia Cassiano Oliveira da Silva Érika Maria Marcondes Tassi Grazieli Benedetti Pascoal

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Áreas de interesse Nutrição Microbiologia

Manual de Segurança Alimentar – Boas Práticas para os Serviços de Alimentação, 3a ed.

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Jackline Freitas Brilhante de São José Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduada em Nutrição pela UFV.

Monise Viana Abranches Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV. Graduada em Nutrição pela UFV.

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Organizadoras

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Microbiologia e Higiene de Alimentos | Teoria e Prática Copyright © 2019 Editora Rubio Ltda.

ISBN 978-85-8411-108-4 Todos os direitos reservados. É expressamente proibida a reprodução desta obra, no todo ou em parte, sem autorização por escrito da Editora.

Produção Jaqueline Santos Equipe Rubio Capa Bruno Sales Imagem de capa ©iStock.com / piovesempre / mphillips007 Editoração Eletrônica Elza Ramos

CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO-NA-FONTE SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ J862m Microbiologia e higiene de alimentos – teoria e prática/organizadoras: Jackline Freitas Brilhante de São José/Monise Viana Abranches. – 1. ed. – Rio de Janeiro: Rubio, 2019.

272 p.: il.; 17 cm.

Inclui bibliografia e índice ISBN 978-85-8411-108-4 1. Microbiologia. 2. Ciência dos alimentos. 3. Segurança alimentar. 4. Higiene de alimentos. I. Freitas Brilhante de São José, Jackline. II. Viana Abranches, Monise.

CDD: 647.95068 CDU: 664.049.3

Editora Rubio Ltda.

Av. Franklin Roosevelt, 194 s/l 204 – Castelo 20021-120 – Rio de Janeiro – RJ Telefax: 55(21) 2262-3779 • 2262-1783 E-mail: rubio@rubio.com.br www.rubio.com.br Impresso no Brasil Printed in Brazil

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Alessandra Barbosa Ferreira Machado

Emiliane Andrade Araújo

Pós-Doutora em Microbiologia pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF).

Pós-Doutora em Ciência da Nutrição, Doutora e Mestre em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Nutrição pela UFV.

Doutora e Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Ciência e Tecnologia de Laticínios pela UFV.

Aline Dias Paiva Pós-Doutora em Microbiologia pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Doutora e Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV, com período sanduíche em Utrecht University, Netherlands.

Graduada em Nutrição pela UFV.

Allan Robledo Fialho e Moraes Doutor e Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduado em Engenharia de Alimentos pela UFV.

Ana Íris Mendes Coelho Doutora e Mestre em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Especialista em Docência na Saúde pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRS).

Graduada em Nutrição pela UFV.

Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco Doutora em Ciências dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (USP).

Mestre em Microbiologia e Imunologia pela Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

Graduada em Farmácia e Bioquímica pela USP.

Denes Kaic Alves do Rosário Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).

Técnico em Agropecuária pelo Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo Campus Santa Teresa.

Graduado em Engenheria de Alimentos pela UFES.

Diego Alvarenga Botrel Doutor em Ciência dos Alimentos pela Universidade Federal de Lavras (UFLA).

Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduado em Engenharia de Alimentos pela UFV.

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Gardênia Márcia Silva Campos Mata Pós-Doutora em Microbiologia pela Universidade de São Paulo (USP).

Doutora e Mestre em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Nutrição pela UFV.

Ingrid Annes Pereira Pós-Doutora em Microbiologia de Alimentos pelo Instituto Oswaldo Cruz/Fundação Oswaldo Cruz (IOC/FioCruz).

Doutora e Mestre em Ciências Veterinárias pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ).

Graduada em Medicina Veterinária pela UFRRJ.

Jildete Karla dos Santos Doutora e Mestre em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Ciências Biológicas pela UFV.

Kenia Costa de Souza Moraes Graduada em Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa Campus Rio Paranaíba (UFV).

Lucélia Cristina Alves Mestre em Agronomia (Produção Vegetal) pela Universidade Federal de Viçosa Campus Rio Paranaíba (UFV).

Graduada em Ciências de Alimentos pela UFV Campus Rio Paranaíba.

Maike Paulino da Silva Doutor em Ciências, área de Microbiologia, pela Universidade de São Paulo (USP), com período sanduíche na Ostrow School of Dentistry of University of Southern California (USC).

Mestre em Odontologia pela Universidade Guarulhos, (UNG).

Especialista em Periodontia pela UNG. Graduado em Odontologia pela UNG.

Mariza Landgraf Doutora em Ciências Biológicas (Microbiologia) e Mestre em Ciência dos Alimentos pela Universidade de São Paulo (Unesp) .

Graduada em Ciências Farmacêuticas pela Unesp.

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Colaboradores

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Meire de Oliveira Barbosa

Regiane Lopes de Sales

Pós-Doutorado, Doutora e Mestre em Bioquímica Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Nutrição pela UFV.

Pós-Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Mestre em Ciências da Nutrição pela UFV. Especialista em Nutrição Esportiva pelo Instituto Cristina Martins.

Graduada em Nutrição pela UFV.

Milene Theresinha das Dores Doutora e Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos e Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Ciência e Tecnologia de Laticínios pela UFV.

Natan de Jesus Pimentel Filho Pós-Doutorado em Microbiologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Doutor e Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV, com período sanduíche no Institut für Mikrobiologie da Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Alemanha.

Graduado em Ciência e Tecnologia de Laticínios pela UFV.

Patrícia Campos Bernardes Doutora e Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduada em Ciência e Tecnologia de Laticínios pela UFV.

Paulo Sérgio Monteiro Doutor em Bioquímica Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela UFV. Graduado em Ciência e Tecnologia de Laticínios pela UFV.

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Regiane Victória de Barros Fernandes Doutora e Mestre em Ciência dos Alimentos pela Universidade Federal de Lavras (UFLA).

Especialista em Tecnologia e Qualidade de Alimentos Vegetais pela UFLA. Graduada em Engenharia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Uelinton Manoel Pinto Doutor em Microbiologia pela Universidade de Cornell, EUA. Mestre em Microbiologia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

Graduado em Engenharia de Alimentos pela UFV.

Virgínia Souza Santos Doutora em Atenção à Saúde pela Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos pelo Instituto Federal do Triângulo Mineiro.

Especialista em Nutrição e Saúde pela Universidade Federal de Lavras (UFV).

Graduada em Nutrição pelo Centro Universitário de Patos de Minas.

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Aos colegas, colaboradores deste livro, que aceitaram o desafio e se dispuseram a trilhar conosco essa jornada, agradecemos todo o empenho.

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Agradecimentos

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As principais legislações brasileiras que abordam o controle higiênico-sanitário em ambientes de manipulação de alimentos foram instituídas ao final da década de 1990 e início dos anos 2000. Muitos materiais de apoio acadêmico produzidos têm por foco a higiene em indústrias de alimentos, sendo frequentes a extrapolação e a aplicação dessas informações em Unidades Produtoras de Refeições. Todavia, estas Unidades apresentam particularidades que precisam ser consideradas e que diferem das indústrias.

Diante do exposto, Microbiologia e Higiene de Alimentos: Teoria e Prática tem o objetivo de levar ao público informações atualizadas

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sobre temas que perpassam a microbiologia e a higiene de alimentos no âmbito dos Serviços de Alimentação para Coletividades. Esta obra emergiu a partir de inquietações de suas organizadoras na prática docente. Isto porque, a compreensão dos temas apresentados e discutidos em sala de aula necessitam de ferramentas facilitadoras do processo ensino-aprendizagem nessa área, atualmente escassas no mercado de livros didáticos. Esta obra tem a finalidade de reunir as principais informações sobre o tema e atualizar o leitor sobre novas práticas e métodos, ampliando a discussão sobre a microbiologia e a higiene, em especial, no âmbito da alimentação para coletividades.

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Apresentação

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Microbiologia e Higiene de Alimentos: Teoria e Prática representa a concretização de esforços de diferentes profissionais na produção de um material que auxilie o exercício das atividades acadêmicas na área da alimentação coletiva.

Nos capítulos iniciais da obra, são apresentados conceitos básicos da microbiologia, sua inserção no cotidiano das pessoas e suas interações ambientais (benéficas e danosas). Ressalto a importância deste material considerando-se a escassez de livros brasileiros na área de higiene de alimentos. É perceptível a preocupação dos autores em apresentar de maneira didática os conceitos ligados à microbiologia de alimentos, passando pelos princípios gerais de conservação; à higiene de alimentos e dos manipuladores e ao monitoramento das condições microbiológicas no ambiente de produção de refeições, demonstrando situações-problema que podem facilmente ser enfrentadas no dia a dia e que nos proporcionam uma reflexão. A expressão “qualidade alimentar”, inserida na conceituação de Segurança Alimentar e Nutricional,* assume destaque em um país com dimensões continentais como o Brasil, em que 41,2% dos indivíduos adquirem seus alimentos fora do lar por questões de conveniência, praticidade e agilidade, como aponta Bezerra et al. (2017).** Muito se avançou no controle das doenças transmitidas por alimentos (DTA), desde 1999, quando se deu início à vigilância de surtos*** no país. No entanto, dados do Ministério da Saúde

ainda evidenciam a necessidade do aperfeiçoamento nas ações intersetoriais, bem como na articulação entre os atores implicados no processo. Se por um lado, o Estado precisa aperfeiçoar as ações da vigilância sanitária, ambiental e agropecuária (entre outras), fomentando práticas inovadoras que contemplem planejamento, monitoramento e avaliação permanentes, bem como processos de educação em saúde; por outro lado, a sociedade civil, representada por empresários da área de alimentos e por cidadãos comuns, precisa estar consciente do seu papel no exercício da Segurança Alimentar e Nutricional.

Meus sinceros cumprimentos à equipe envolvida na produção desta obra, especialmente às organizadoras Jackline Freitas Brilhante de São José e Monise Viana Abranches, pelo legado que deixam aos estudantes no campo da microbiologia de alimentos, ao mesmo tempo em que atualizam profissionais do segmento food service, reforçando a importância da aplicação de conceitos teóricos à realidade.

Tatiana Coura Oliveira Nutricionista, Especialista em Gestão: Alimentos e Alimentação Coletiva pela Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

Doutora em Ciências na área de Epidemiologia em Saúde Pública pela Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz).

Mestre em Ciência da Nutrição pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

*Segurança Alimentar e Nutricional é a garantia do direito de todos ao acesso a alimentos de qualidade, em quantidade suficiente e de modo permanente, com base em práticas alimentares saudáveis e respeitando as características culturais de cada povo, manifestadas no ato de se alimentar. **Bezerra IN et al. Consumo de alimentos fora do lar no Brasil segundo locais de aquisição. Rev Saúde Pública.

2017; 51:15. *** Entre 2000-2017, houve a notificação de 12.503 surtos de DTA com 2.340.201 de expostos e 182 óbitos.

(SINAN/SVS/Ministério da Saúde; disponível em: http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2018/janeiro/17/Apresentacao-Surtos-DTA-2018.pdf.).

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Prefácio

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15-ADON

15-acetildesoxinivalenol

3-ADON

3-acetildesoxinivalenol

Aa

atividade de água

ABIA

Associação Brasileira da Indústria e Alimentação

ABNT

Associação Brasileira de Normas Técnicas

Anvisa

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

e-CAM

Electronic Compilation of Analytical Methods

ECDC

European Centre for Disease Prevention and Control

EFSA

European Food Safety Authority

Eh

potencial de oxirredução

EPEC

Escherichia coli enteropatogênica

ETEC

E. coli enterotoxigênica

FAO

Food and Agriculture Organization

FDA

Food and Drug Administration

FoodNet

Foodborne Diseases Active Surveillance Network

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

APHA

American Public Health Association

APPCC

Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle

FUS-X

fusarenona X

ASO

Atestado de Saúde Ocupacional

Gb3

globotriasilceramida

GC-C

domínio C da guanilato ciclase

BAM

Bacteriological Analytical Manual

BPF

Boas Práticas de Fabricação

BSI

British Standards

CCAB

Comitê do Codex Alimentarius no Brasil

CDC

Centers for Disease Control and Prevention

CH

colite hemorrágica

GRAS

generally recognized as safe

IARC

International Agency for Research on Cancer

ICMSF

International Commission on Microbiological Specifications for Foods

IDF

International Dairy Federation

IL

interleucina

INF-γ

interferona gama

CLBVB

caldo lactosado bile verde brilhante

Inmetro

CNA

Confederação Nacional da Agricultura

Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia

ISO

CNC

Confederação Nacional do Comércio

International Organization for Standardization

MAPA

CNI

Confederação Nacional da Indústria

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MCT

DTA

doenças transmitidas por alimentos

Ministério da Ciência e Tecnologia

MF

Ministério da Fazenda

EAEC/ EAggEC

E. coli enteroagregativa

MHC

complexo de histocompatibilidade principal

EAST-1

enteroaggregative heat-resistant toxin 1

MicroVal

European Validation and Certification Organisation

EC

Escherichia coli

MJ

Ministério da Justiça

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Lista de Siglas e Abreviaturas

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MRE

Ministério das Relações Exteriores

MS

Ministério da Saúde

MUG

4-metilumbeliferil-β-Dglicuronídeo

STEC

E. coli produtora de toxina Shiga

SUS

Sistema Único de Saúde

THM

trialometanos

TMA

trimetilamina

TMAO

óxido de trimetilamina

TNF-α

fator de necrose tumoral alfa

UAN

unidades de alimentação e nutrição

UFC

unidades formadoras de colônia

USDA

United States Department of Agriculture

NMP

número mais provável

OMS

Organização Mundial da Saúde

ONPG

ortonitrofenil-β-Dgalactopiranosídeo

OPAS

Organização Pan-Americana da Saúde

PCC

controle em pontos críticos

PCMSO

Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional

VDRL

Venereal Disease Research Laboratory

Sat

secreted autotransporter toxin

VNC

viáveis não cultiváveis

SEls

enterotoxinas estafilocócicas like

VPN

valor preditivo negativo

SEs

enterotoxinas estafilocócicas

VPP

valor preditivo positivo

ShET1

Shigella enterotoxina 1

VTEC

SHU

síndrome hemolítica-urêmica

E. coli produtora de verocitotoxina

SINAN

Sistema de Informação de Agravos de Notificação

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WHO

World Health Organization

ZON

zearalenona

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1 Microbiologia de Alimentos...........................1

9 Métodos de Detecção de Microrganismos em

Monise Viana Abranches  Jackline Freitas Brilhante de São José

Alimentos Convencionais e Rápidos......... 135

2 Fatores Intrínsecos, Extrínsecos e Implícitos

Natan de Jesus Pimentel Filho  Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Milene Therezinha das Dores

Relacionados ao Desenvolvimento Microbiano em Alimentos.............................11

Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Ingrid Annes Pereira  Jackline Freitas Brilhante de São José  Ana Íris Mendes Coelho

3 Deterioração Microbiana de Alimentos......33 Uelinton Manoel Pinto  Mariza Landgraf  Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco

4 Microrganismos Indicadores........................53 Paulo Sérgio Monteiro  Jildete Karla dos Santos

5 Microrganismos Patogênicos

Causadores de Infecções Alimentares........63

Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Natan de Jesus Pimentel Filho  Maike Paulino da Silva  Milene Therezinha das Dores

6 Microrganismos Patogênicos

Causadores de Intoxicações Alimentares......................................................85

Maike Paulino da Silva  Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Natan de Jesus Pimentel Filho

7 Princípios Gerais de Conservação

dos Alimentos............................................... 105

Regiane Victória de Barros Fernandes  Diego Alvarenga Botrel  Jackline Freitas Brilhante de São José

8 Critérios Microbiológicos para

Avaliação da Qualidade de Alimentos..... 121

Aline Dias Paiva  Alessandra Barbosa Ferreira Machado

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10 Higiene de Alimentos | Aspectos Gerais....... 149 Monise Viana Abranches  Virgínia Souza Santos  Lucélia Cristina Alves

11 Formação de Biofilmes Microbianos........ 167 Patrícia Campos Bernardes  Emiliane Andrade Araújo  Denes Kaic Alves do Rosário

12 Higiene de Superfícies e do Ambiente de

Manipulação de Alimentos........................ 175

Monise Viana Abranches  Jackline Freitas Brilhante de São José  Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Meire de Oliveira Barbosa

13 Higiene de Manipuladores

de Alimentos................................................. 193

Meire de Oliveira Barbosa  Monise Viana Abranches  Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Jackline Freitas Brilhante de São José

14 Higienização de Alimentos........................ 207 Jackline Freitas Brilhante de São José  Allan Robledo Fialho e Moraes

15 Monitoramento das Condições

Microbiológicas no Ambiente de Produção de Refeições.................................................. 217

Jackline Freitas Brilhante de São José

16 Estratégias para Capacitação de

Manipuladores de Alimentos.................... 229

Monise Viana Abranches  Regiane Lopes de Sales  Kenia Costa de Souza Moraes

Índice.............................................................. 247

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Sumário

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Microbiologia de Alimentos Monise Viana Abranches  Jackline Freitas Brilhante de São José

INTRODUÇÃO

HISTÓRICO

A microbiologia é a ciência que estuda os microrganismos que podem ser encontrados no ambiente, tanto como células únicas quanto em agrupamentos celulares. São também considerados microrganismos os vírus, seres microscópicos e acelulares. Essa ciência estuda a diversidade e a evolução de seres microscópicos, avaliando seu surgimento e a relação existente entre eles e o ambiente, o organismo humano, de animais e de plantas. A microbiologia pode ser estudada sob dois aspectos importantes: como ciência biológica básica ou como ciência aplicada.

No caso da microbiologia como ciência biológica básica, podem-se incluir estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares. Ao considerar a ciência biológica aplicada, destaca-se a busca de soluções para problemas práticos da medicina, da agricultura, em processos industriais, controle de pragas, produção de alimentos, entre outros.1 Essa ciência se insere no dia a dia dos indivíduos, e cabe aos microbiologistas compreender a interação dos microrganismos com o ambiente na busca por otimização dos efeitos benéficos e minimização dos efeitos danosos.1,2 Entre as grandes áreas da microbiologia, destaca-se a microbiologia de alimentos, que trata dos processos em que os microrganismos influenciam as características dos produtos alimentícios de consumo humano ou animal.1

É muito difícil definir o momento no qual os seres humanos tiveram conhecimento da existência de microrganismos nos alimentos e passaram a compreender a sua importância. Há milhares de anos, o homem utilizava os recursos disponíveis na natureza. Desde essa época, já havia consumo de carnes, obtidas a partir da criação de animais, e de vegetais, obtidos a partir do cultivo de diferentes plantas.2 Desde então, surgiram os primeiros problemas relacionados à qualidade dos alimentos; consequentemente, iniciou-se a intensa busca por estratégias com o intuito de entender a relação microrganismo–alimento.

A partir do surgimento dos alimentos preparados, houve intensificação da transmissão de doenças e da deterioração dos alimentos.

Essas alterações relacionavam-se à conservação inadequada.3 Ao longo do tempo, o homem aprendeu a manusear e a controlar o fogo e conseguiu utilizá-lo como estratégia para modificar características sensoriais como a textura e o sabor dos alimentos. Além disso, o fogo também possibilitou reduzir a contaminação microbiana, reduzindo a perecibilidade dos gêneros.

Exemplo disso foi a utilização da defumação e da dessecação, que possibilitaram o consumo dos alimentos por maior período.4 Os progressos no entendimento da natureza das doenças causadas pelo consumo de determinados alimentos ocorreram lentamente.

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CAPÍTULO 1

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2 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

O ergotismo, doença causada pelo fungo Claviceps purpurea, foi um grave problema na Idade Média e ocasionou a morte de milhares de pessoas sem o conhecimento de que se tratava de uma intoxicação provocada pela ingestão de cereais contaminados, como o centeio.2 Apesar de a existência de criaturas diminutas ter sido indagada há anos, a descoberta está associada à invenção do microscópio. Em 1658, Kircher foi o primeiro a sugerir a existência da relação entre a deterioração de carnes e de leite e a presença de possíveis ‘’vermes’’ invisíveis a olho nu. Em 1664, Robert Hooke descreveu a estrutura de fungos filamentosos e, em 1684, Antoni van Leeuwenhoek foi a primeira pessoa a observar os microrganismos em detalhes, utilizando um microscópio.1,2 Em 1765, Lazzaro Spallanzani derrubou a teoria da geração espontânea ao demonstrar que o cozimento de caldo de carne e, em seguida, seu armazenamento em recipiente fechado contribuiriam para manutenção das características do produto por determinado tempo. Em 1809, Nicolas Appert comprovou tal achado e descreveu um processo de conservação de carnes em recipientes de vidro mantidos fechados e submetidos a condições de fervura por diferentes tempos. Anos depois, essa técnica foi patenteada e recebeu o nome de Apertização, sendo precursora de métodos aplicados atualmente no tratamento térmico de alimentos enlatados.2 Ainda no século XIX, um dos maiores cientistas e oponentes à teoria da geração espontânea, o químico francês Louis Pasteur, desenvolveu trabalhos mais precisos e convincentes.

Pasteur deduziu que, se um alimento fosse tratado, sendo destruídas todas as formas vivas que nele se formavam, este não sofreria deterioração. Para comprovar essa hipótese, o cientista utilizou o calor como método de conservação dos alimentos. Os princípios estudados por ele são aplicados, desde então, no envasamento e na preservação de diferentes tipos de alimentos.1 Um breve resumo do histórico da microbiologia de alimentos é apresentado na Figura 1.1.1,2,6-10

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RELEVÂNCIA DA MICROBIOLOGIA PARA A PRODUÇÃO DE ALIMENTOS O processamento de alimentos realizado na indústria emprega uma grande variedade de tecnologias que visam preservar a qualidade do alimento, desde a sua produção até o seu consumo. Nesse contexto, a fermentação é uma das tecnologias mais antigas. Ela é definida como processo bioquímico de modificação de matérias-primas alimentares pelas atividades biológicas de microrganismos, as quais produzem uma gama de metabólitos que podem suprimir o crescimento e a sobrevivência de microrganismos indesejáveis.5,11 Além de contribuir para a qualidade microbiológica, a fermentação pode evitar a deterioração dos alimentos. Assim, algumas culturas específicas de microrganismos, como leveduras, fungos e bactérias, vêm sendo utilizadas para a produção de pães, cerveja, vinho, vinagre, iogurte e queijo, além de peixe, carnes e vegetais, aumentando a consistência e a qualidade do produto final.5,10 Esse processo biológico também agrega características sensoriais específicas, como sabor, aroma, textura e cor, além de melhorar a estabilidade e o valor nutricional dos produtos.12 Após a Segunda Guerra Mundial, a indústria alimentícia passou a desenvolver e a utilizar a biotecnologia para produzir uma grande variedade de alimentos, com maior segurança, reprodutibilidade, economia e em condições controladas, com o intuito de garantir o alto padrão de qualidade aos alimentos produzidos.12 Atualmente, os microrganismos apresentam importante relação com o setor alimentício. No mercado, já estão disponíveis mais de 3.500 produtos fermentados. Porém, o consumo varia de acordo com a localização geográfica e depende da disponibilidade de matériasprimas, dos hábitos alimentares, do tempo gasto para realizar a fermentação e dos padrões sociais.

Por exemplo, na Europa, é comum a ingestão de queijos e pães; na África, os produtos fermentados são produzidos a partir de cereais e da mandioca; e na Ásia, a soja e os peixes fermentados constituem a base da alimentação.10,11

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6000 AC

Produção de queijo no Iraque dada a domesticação de animais

4000 AC

Egípcios descobriram como usar leveduras para fazer pão e vinho

Kircher 1658

Robert Hooke 1664

Antoni van Leeuwenhoek 1684

Lazzaro Spallanzani 1765

Nicolas Appert 1809

1822 Louis Pasteur a 1887

W. Gilbert e F. Sanger 1977

3

Deterioração de carnes e leite vs. presença de ''vermes'' invisíveis

Descrição da estrutura de fungos

Observação de microrganismos em microscópio

Contrapôs a teoria da geração espontânea

Descreveu um processo de conservação de carnes

Contrapôs a teoria da geração espontânea Conservação de alimentos pela destruição das formas vivas (explicação da produção da cerveja e do vinagre) Teoria germinal das doenças Uso de formas enfraquecidas de microrganismos como agente imunizante

Desenvolvimento de método para sequenciar o DNA

Kary Mullis 1983

Invenção da reação em cadeia da polimerase

Institute for Genomic 1997 Research

Completadas as sequências genômicas das bactérias E. coli K-12 e S. cerevisiae

Figura 1.1  Histórico da microbiologia de alimentos Fonte: adaptada de Madigan et al., 2010;1 Franco e Landgraf, 1996;2 Ross et al., 2002;5 Arroio, 2006;6 Kiser, 2008;7 American Society for Microbiology, 2015;8 Pillsbury, 2015;9 EFFCA, 2015.10

Em locais onde há dificuldade de utilizar o armazenamento a frio ou empregar técnicas de processamento a quente, dada a falta de combustíveis para cozinhar e reaquecer, a fermentação é uma alternativa para salvaguardar a qualidade dos alimentos. Além disso, ela pode proporcionar alguns benefícios nutricionais, como: redução do

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conteúdo de carboidratos digeríveis e não digeríveis, diminuição da distensão abdominal, aumento da disponibilidade de vitaminas do complexo B, pH ótimo para a degradação enzimática de fitato durante a fermentação e redução do conteúdo de tatino, o que favorece a absorção de minerais como ferro, zinco e cálcio.11

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Capítulo 1  Microbiologia de Alimentos

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Tabela 1.1 Principais doenças causadas por alimentos e seus agentes etiológicos Categoria

Infecções e intoxicações

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6 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

Sequela

Manifestação clínica

Agente etiológico (exemplo)

Aguda

Gastrenterite

Campylobacter sp.

Salmonella sp.

Cryptosporidium Giardia sp.

Shigella sp.

Norovírus Toxinas bacterianas Yersinia sp.

Cyclospora sp.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) Biotoxinas marinhas (p. ex., intoxicação diarreica por moluscos)

Meningite

Listeria monocytogenes Salmonella sp.

Septicemia

Brucella Salmonella typhi Listeria monocytogenes

Sintomas neurológicos

Clostridium botulinum Biotoxinas marinhas Príons

Perda perinatal

Listeria monocytogenes Toxoplasma gondii

Hepatite aguda

Hepatites A e E

Síndrome urêmica-hemolítica Falência renal aguda

Escherichia coli

Crônica

Artrite reativa (dor nas articulações, Salmonella sp. irritação nos olhos, dor ao urinar) Campylobacter sp.

Yersinia sp.

Síndrome Guillain Barré

Campylobacter sp.

Salmonella sp.

Cryptosporidium sp.

Giardia sp.

Síndrome do intestino irritável

Taenia solium

Epilepsia

Toxoplasma gondii

Retinopatia Falência renal

Toxina Shiga, produzida por Escherichia coli (STEC)

Câncer

Helicobacter pylori Opisthorchis viverrini

Falência de múltiplos órgãos

Trichinella spiralis Mycobacterium bovis

Retardo mental, paralisia, cegueira ou surdez Doenças cardiovasculares

Listeria monocytogenes

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Escherichia coli Salmonella typhimurium (continua)

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7

Tabela 1.1 Principais doenças causadas por alimentos e seus agentes etiológicos (continuação)

Agentes químicos

Categoria

Sequela

Manifestação clínica

Agente etiológico (exemplo)

Aguda

Gastrenterite

Organofosfatos

Crônica

Distúrbios no desenvolvimento neurológico

Chumbo Metilmercúrio

Câncer

Aflatoxina Arsênio Acrilamida Dioxinas

Doença renal

Cádmio

Fonte: adaptada de WHO, 2006;16 WHO, 2014,22 Long-Term Effects, 2015;25 Lindsay, 1997.27

pertencentes à esfera municipal; Centro de Vigilância Sanitária e Centro de Vigilância Epidemiológica, pertencentes à esfera estadual; e na esfera federal, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária e o Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis, este pertencente à Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde.

BREVE APRESENTAÇÃO DOS MICRORGANISMOS DETERIORADORES A deterioração reduz a qualidade sensorial e nutricional dos alimentos, e promove um grande prejuízo econômico em todo o mundo. Nas etapas de colheita, processamento e distribuição dos alimentos, muitos microrganismos podem contaminá-los. Especialmente na etapa de armazenamento, pode haver o crescimento de uma parcela desses microrganismos, provocando um sério processo de deterioração da matéria-prima.29 A definição de quais microrganismos crescerão ou quais reações químicas ocorrerão depende das características dos alimentos e das condições às quais estes estão expostos.29-31 A deterioração dos alimentos é causada por reações físicas e químicas (enzimáticas ou não) e pela ação de microrganismos. Sua ocorrência depende de propriedades próprias dos alimentos, como a presença de enzimas, nutrientes e sensibilidade à luz e ao oxigênio, e das condições ambientais, como espécies de microrganismos contaminantes, temperatura, entre outras.29

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A deterioração microbiana pode ser resultante do metabolismo dos microrganismos e da associação deste com reações químicas da própria matriz do alimento. Como resultado, tem-se a produção de compostos que alteram a qualidade organoléptica dos produtos, como mudanças no odor, sabor, na cor e textura dos alimentos.30 Esses compostos provocam odor desagradável, expansão de embalagens (especialmente daquelas a vácuo), formação de limo ou de exsudato, além de mudanças na cor dos alimentos.31 Vale ressaltar que um mesmo grupo de microrganismos pode apresentar espécies que são utilizadas para fins tecnológicos na indústria de alimentos, como a fermentação, e espécies que atuam como deterioradores de insumos alimentícios, como as bactérias do ácido lático.31 Na Tabela 1.2 são apresentados alguns microrganismos e as alterações que podem provocar nos alimentos.

Tanto na indústria de alimentos quanto em unidades produtoras de refeições, as matérias-primas devem ser manipuladas em condições controladas e submetidas a procedimentos de higiene que minimizem a contaminação, visando reduzir o risco de deterioração e de ocorrência de doenças veiculadas pelos alimentos.

O crescimento dos microrganismos nos alimentos depende de sua fisiologia e capacidade de resistir ao estresse provocado pelas condições de armazenamento e processamento, bem como das interações entre o microrganismo e o microambiente que o circunda.31

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Capítulo 1  Microbiologia de Alimentos

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8 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática Tabela 1.2 Microrganismos e o tipo de deterioração causada nos alimentos Microrganismo

Exemplo de alimento Substância produzida

Alteração

Bactérias do ácido lático

Produtos lácteos Produtos cárneos

Histamina, tiramina, putrescina

Lactobacillus curvatus

Salsichas

Tiramina, putrescina, cadaverina, feniletilamina

Produção de aminas biogênicas

Enterococcus malodoratus

Queijo de cabra

Histamina, tiramina

Shewanella putrefaciens

Camarão Pescado

Putrescina, cadaverina

Serratia liquefaciens Serratia marcescens

Vegetais

Cadaverina

Photobacterium phosphoreum

Peixe

Histamina

Carnobacterium viridans

Mortadela

Peróxido de hidrogênio (coloração verde)

Pseudomonas fluorescens

Queijo

Pigmentos fluorescentes azul e verde

Weissella viridescens Leuconostoc mesenteroides

Embutido à base de Hexanal, ácido acético, etanol, sangue suíno e arroz diacetil e acetoína

Produção de gás, limosidade, redução do pH, exsudato, alteração do odor

Brochothrix thermosphacta

Carnes e derivados Salmão Camarão

Acetoína, 3-metilbutanol, diacetil, 2-heptanona, 2-hexanona, 3-metil1-butanal, 2,3-butanediona

Alteração do odor e da cor

Shewanella putrefaciens Shewanella baltica Shewanella hafniensis

Pescado

Trimetilamina, gás sulfeto de hidrogênio

Alteração do odor

Pseudomonas fragi

Produtos lácteos

Proteases, lipases

Alteração de sabor, aroma e textura

Leveduras

Vinho

Ácido acético

Alteração de sabor, aroma e textura, e aumento da acidez

Alicyclobacillus spp.

Sucos de frutas

2-metoxifenol (guaiacol), compostos fenólicos (p. ex., 2,6-diclorofenol e 2,6-dibromofenol)

Alteração do odor, formação de sedimentos

Alteração da cor

Fonte: adaptada de Remenant et al., 2015;31 Steyn et al., 2011;32 Luo et al., 2012.33

CONSIDERAÇÕES FINAIS O estudo dos microrganismos e suas relações com os alimentos são relatados há muitos anos. Os microrganismos podem ser utilizados com finalidade tecnológica, para o desenvolvimento de produtos alimentícios, ou com aplicação funcional, promovendo efeitos benéficos à saúde de quem os ingere.

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Todavia, algumas espécies podem deteriorar os insumos alimentícios ou até mesmo causar doenças, em situações nas quais o armazenamento e/ou as etapas do processamento sofrem falhas. Por esses motivos, conhecer as condições que influenciam o crescimento microbiano, os problemas que os microrganismos podem causar e como evitá-los é de suma importância.

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Microrganismos Indicadores Paulo Sérgio Monteiro  Jildete Karla dos Santos

INTRODUÇÃO Diferentes tipos de microrganismos patogênicos, como os vírus, algumas bactérias e protozoários, podem estar presentes e/ou se disseminar pela água e pelos alimentos que consumimos,1,2 provocando as doenças de origem alimentar, consideradas o principal problema de saúde pública mundial.3,4 Esses patógenos podem estar presentes na água e nos alimentos, como resultado da contaminação dos mesmos por fezes humanas e de animais. Desse modo, técnicas de detecção, direta ou indireta, desses microrganismos se tornam importantes ferramentas para a segurança alimentar e, consequentemente, para a saúde humana.3,5 A Organização Mundial da Saúde (OMS) define doenças alimentares como de natureza infecciosa ou tóxica, causadas por agentes que entram no corpo humano por meio da ingestão dos alimentos. Embora a incidência global de doenças alimentares seja difícil de estimar, somente em 2005, 1,8 milhão de pessoas morreram de doenças diarreicas e uma grande proporção desses casos pode ser atribuída à contaminação de alimentos e água potável.6 De acordo com dados do Centers for DIsease Control and Prevention (CDC), nos EUA, aproximadamente 48 milhões de pessoas contraem, anualmente, doenças de origem alimentar, representando um em cada seis norteamericanos.7 Na Europa, a European Food Safety Authority (EFSA) e o European Centre for

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Disease Prevention and Control (ECDC) registraram, em 2011, 5.648 surtos de doenças de origem alimentar na União Europeia, os quais atingiram 69.553 pessoas e resultaram em 7.125 internações hospitalares e 93 óbitos.8 Como o número de diferentes patógenos presentes na água e nos alimentos pode ser muito grande, não é possível ou viável, técnica e financeiramente, o isolamento e a detecção de cada patógeno.1,9 Para se avaliarem a qualidade sanitária e a segurança microbiológica de alimentos, são utilizados, com frequência, indicadores microbiológicos, que, genericamente, podem ser definidos como microrganismos cuja ausência ou presença, em determinados níveis, indicam ou fornecem evidência indireta da higiene e da segurança alimentar.10,11 O termo microrganismo indicador foi inicialmente sugerido por Ingram, em 1977, para designar aqueles microrganismos cuja presença indicasse a possível presença de um patógeno de mesma origem ecológica.11 Em geral, os microrganismos não são patogênicos e podem ser usados para indicar, indiretamente, a presença de microrganismos patogênicos (ICMSF, 2011), dos quais se destacam as bactérias Escherichia coli e outros membros da Família Enterobacteriaceae, que por mais de 100 anos têm sido usados como indicadores de poluição fecal.1 Os indicadores de qualidade microbiológica e de validade de produtos alimentícios incluem não só os microrganismos, mas também

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CAPÍTULO 4

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54 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

os produtos de seu metabolismo, que, em determinados níveis, mesmo na ausência do microrganismo, podem ser utilizados para avaliar ou predizer a vida de prateleira do produto.

Atualmente os microrganismos indicadores são mais utilizados para avaliar a higiene e a segurança alimentar do que a qualidade,10,11 pois é raro que um organismo ou grupo de organismos possam ser usados para avaliar, simultaneamente, segurança e qualidade dos alimentos.10 De acordo com Jay (2005),10 um microrganismo indicador deve apresentar as seguintes características: • Ser fácil e rapidamente detectável.

• Ser facilmente distinguido dos outros membros da flora microbiana do alimento.

• Ser histórica e frequentemente associado ao patógeno cuja presença deve indicar.

• Estar sempre presente quando o patógeno, cuja presença deve indicar, estiver presente.

• Estar presente em números que sejam correlacionados às quantidades do patógeno de interesse.

• Apresentar taxa de crescimento equivalente à do patógeno de interesse.

• Apresentar taxa de mortalidade equivalente à do patógeno de interesse e que persista, de preferência, por mais tempo do que o mesmo.

• Estar ausente ou em quantidades mínimas no alimento quando o patógeno de interesse estiver ausente.

Como os principais indicadores da possível presença de patógenos intestinais são microrganismos de origem fecal, Jay (2005)10 destaca ainda as seguintes características: • Demonstrar especificidade, restringindo-se apenas a intestinos humanos e de outros animais.

• Estar presentes em altas concentrações nas fezes e ser detectados mesmo em altas diluições.

• Apresentar alta resistência aos ambientes extraentéricos.

Os testes microbiológicos que usam microrganismos indicadores são aplicados à segurança alimentar e à gestão da qualidade por diversas

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razões, incluindo desenvolvimento, acompanhamento e verificação do controle do processo, investigação das causas da perda de controle e, em algumas situações, para avaliar diretamente a qualidade microbiológica dos produtos.12,13 Esses testes também têm importância em estudos epidemiológicos, podendo ter implicações importantes para responsabilidade, comércio e potencial identificação da causa original.12 Embora, historicamente, os principais microrganismos indicadores sejam de origem intestinal, com destaque para as bactérias da família Enterobacteriaceae, outros grupos podem ser utilizados em situações diversas, como enterococos e bacteriófagos.1,5,11 De qualquer modo, é importante reconhecer que as relações entre patógenos e indicadores não são universais, podendo ser influenciadas pelo produto e por métodos de processamento; por isso, deve-se ter cuidado na escolha do microrganismo indicador.12 Atualmente ainda não foi identificado um microrganismo indicador que, além de apresentar todas as características listadas anteriormente, possa ser usado na análise de todo e qualquer alimento; porém, um grupo de bactérias, genericamente denominadas coliformes, tem sido amplamente utilizado como indicador universal de higiene para os mais diversos alimentos.

COLIFORMES COMO INDICADORES Há mais de 100 anos, cientistas descobriram que fezes humanas continham bactérias que, se presentes na água, indicavam que a mesma não era segura para consumo. Em 1885, Escherich observou dois tipos de microrganismos nas fezes, um dos quais ele denominou Bacterium coli (atualmente Escherichia coli) e correlacionou sua presença à contaminação da água. Este conceito foi rapidamente adotado. Na verdade, Klebsiella foi, anteriormente à E. coli, identificada como bactéria entérica e usada como indicador;14 porém, quando em 1892, Shardinger propôs o uso de E. coli como indicador de contaminação fecal recente,15 esta se tornou o principal microrganismo indicador. Isso se deve ao fato de que, além de estar abundantemente presente nas fezes humanas e de outros animais, E. coli não é,

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usualmente, encontrada em outros ambientes e pode ser detectada por sua capacidade de fermentar lactose, sendo, assim, mais fácil detectar a E. coli do que os patógenos intestinais.1,11,15 Posteriormente ao uso de E. coli como indicador de contaminação fecal, com base em testes de fermentação da lactose com produção de ácido e gás, em 48h, a 35oC, identificaramse outras bactérias entéricas, como Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter, com características fenotípicas semelhantes às da E. coli e a mesma habilidade de fermentar lactose a 35oC. Por não ser possível distinguir, neste teste, E. coli das demais bactérias, adotou-se o termo coliformes ou coliformes totais, sem valor taxonômico, para se referir a este grupo de bactérias.15,16 Os coliformes totais incluem, portanto, bacilos gram-negativos não esporulantes, que fermentam lactose formando ácido e gás, em 48h, a 35°C15 ou 32°C para produtos lácteos.17 Em 1904, Eijknam propôs um teste de fermentação da lactose a 45°C para distinguir, inicialmente, E. coli de outras bactérias não fecais,16 introduzindo o termo coliformes fecais. Entretanto, novamente foram identificadas outras bactérias, como a Klebsiella, que podem ser encontradas em outros ambientes (não apenas o intestinal) e também são capazes de fermentar lactose a 45°C. Por esse motivo, o termo coliformes fecais foi substituído pelo termo coliformes termotolerantes, sendo considerado pela American Public Health Association (APHA) (2001)16 como o mais apropriado. De qualquer maneira, os testes para coliformes totais e coliformes termotolerantes tendem a ser substituídos por testes para a família Enterobacteriaceae, pois os dois primeiros baseiam-se na fermentação da lactose em diferentes temperaturas, mas ignoram ou subestimam os membros fermentadores de glicose, mas não de lactose, entre eles as bactérias patogênicas Salmonella e Yersinia.15,16 Essas bactérias pertencem à família Enterobacteriaceae e são caracterizadas por serem bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, fermentadores de glicose, oxidase negativos e, usualmente, catalase positivos e nitratorredutores. Os membros dessa família, embora geralmente associados a infecções intestinais, podem ser encontrados em

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muitos habitats naturais. Um resumo das características de coliformes, coliformes termotolerantes e da família Enterobacteriaceae é apresentado na Tabela 4.1. À semelhança do preconizado pela APHA (2001),16 neste capítulo será adotado o termo Enterobacteriaceae para referência a todos os membros da família Enterobacteriaceae. Os coliformes totais e coliformes termotolerantes serão identificados, respectivamente, por coliformes a 35oC e coliformes a 45oC, como indicado na Tabela 4.1.

MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS Os protocolos padrão para detecção da maioria dos microrganismos alimentares têm sido definidos por vários órgãos reguladores e organizações, como a Food and Drug Administration (FDA) e a International Organization for Standardization (ISO). No entanto, não há qualquer método ideal para cada microrganismo e, além disso, os países podem diferir quanto à técnica recomendada para determinada análise.11 A seguir serão descritas as principais metodologias de análise para detecção e quantificação de coliformes a 35°C e 45°C, bem como da família Enterobacteriaceae. As técnicas descritas abrangerão, primariamente, as recomendações da APHA e da Bacteriological Analytical Manual (BAM)/FDA. No entanto, antes de se utilizar qualquer metodologia de análise, deve ser realizada uma pesquisa em literatura especializada para maior aprofundamento sobre as técnicas atualmente disponíveis e/ou recomendadas para o estudo pretendido.

Determinação de Coliformes a 35°C e 45°C Técnica do número mais provável | Teste presuntivo para coliformes a 35°C A determinação do número mais provável (NMP) de coliformes a 35°C em alimentos é realizada por meio de uma série de três tubos

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Capítulo 4  Microrganismos Indicadores 55

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56 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática Tabela 4.1 Características da família Enterobacteriaceae e dos coliformes Família Enterobacteriaceae Bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, oxidase negativos e, usualmente, catalase positivos e redutoras de nitrato. Fermentam glicose e, usualmente, lactose. Flagelos ausentes ou peritríquios, quando presentes Representantes lactose-positivos Gênero

Coliforme a 35°C*

Coliforme a 45°C

Origem primariamente Enteropatogênico fecal

Citrobacter

Sim

Não

Não

Não

Enterobacter

Sim

Não

Não

Não

Erwinia

Não

Não

Não

Não

Escherichia

Sim

Sim

Sim

Alguns sorotipos

Klebsiella

Sim

Sim

Não

Alguns sorotipos

Proteus

Não

Não

Não

Alguns sorotipos

Salmonella

Não

Não

Sim

Sim

Serratia

Não

Não

Não

Não

Shigella

Não

Não

Sim

Sim

Yersinia

Não

Não

Sim

Não

*Característica apresentada pela maioria das espécies do gênero, mas algumas exceções podem ser encontradas.

Fonte: adaptada de Blood e Curtis, 1995;18 Manafi, 2003.19

contendo sucessivas diluições da amostra, preparados em replicata de três tubos por diluição.

No entanto, para mariscos e derivados, é adotado o procedimento com uma série de três tubos com diluições sucessivas, em replicata de cinco tubos por diluição.16 Para a realização do procedimento com replicata de três tubos por diluição, prepare uma série de nove tubos contendo caldo lauril sulfato triptose (LST) e tubos de Durham invertidos, previamente esterilizados, conforme pode ser observado na Figura 4.1. Transfira uma alíquota de 1mL de cada diluição (10–1, 10–2 e 10–3), previamente preparada de cada amostra, para três tubos contendo o caldo LST. Incube os tubos a 35°C ± 0,5°C e, após 24h ± 2h, verifique a ocorrência de produção de gás nos mesmos, que serão, então, considerados tubos positivos. A produção do gás pode ser constatada pela presença de bolhas dentro dos tubos de Durham ou pela efervescência decorrente da agitação suave dos tubos. Incube os tubos negativos (ausência de gás) por mais 24h e verifique novamente a ocorrência de produção de gás.

De acordo com a proporção de tubos positivos para as três diluições sucessivas, determine

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o NMP de coliformes a 35°C com base na Tabela 4.2.20 Os resultados devem ser expressos em NMP presuntivo de coliformes a 35°C por g ou mL da amostra. Em seguida, deve-se realizar, para os tubos positivos, o teste confirmativo de coliformes a 35°C, utilizando o caldo lactosado bile verde brilhante (CLBVB).

Teste confirmativo para coliformes a 35°C Agite suavemente os tubos positivos do teste presuntivo de coliformes a 35°C e, com auxílio de uma alça de repicagem ou outro instrumento de transferência adequado, transfira uma alçada ou pequena alíquota do conteúdo de cada tubo positivo para tubos contendo caldo CLBVB e tubos de Durham invertidos (Figura 4.2). Incube os tubos a 35°C ± 0,5°C por 48h ± 2h e avalie-os quanto à produção de gás, cuja presença deverá ser considerada a confirmação de coliformes a 35°C. Com base na proporção de tubos positivos para as três diluições sucessivas, determine o NMP de coliformes a 35°C por g ou mL, de acordo com a Tabela 4.2.

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AMOSTRA SÓLIDA

Pesar em condições assépticas, 50g da amostra*

Homogeneizar em 450mL de solução diluente esterilizada** (1a diluição decimal - 10-1)

Transferir 1mL da 1a diluição Transferir 1mL da 2a diluição para um tubo contendo 9mL para um tubo contendo 9mL de solução diluente esterilizada de solução diluente esterilizada a -2 (2 diluição decimal - 10 ) (3a diluição decimal - 10-3)

50,0g

AMOSTRA LÍQUIDA Transferir 1mL da 1a diluição para um tubo contendo 9mL de solução diluente esterilizada (2a diluição decimal - 10-2)

Transferir 10mL da amostra, em condições assépticas, para um frasco contendo 90mL de solução diluente esterilizada e homogeineizar (1a diluição decimal - 10-1)

Transferir 1mL da 2a diluição para um tubo contendo 9mL de solução diluente esterilizada (3a diluição decimal - 10-3)

Transferir 1mL de cada diluição decimal para tubos contendo caldo lauril sulfato triptose (LST) e tubos de Durhan invertidos. Realizar esse processo em triplicata

Incubar a 35°C ± 0,5°C por 24 e 48h ±2h

*A massa ou volume da amostra, bem como o volume do diluente podem variar de acordo com a legislação vigente. Amostras congeladas devem ser mantidas à temperatura de 2°C a 5°C durante o máximo de 18h, até o início das análises **Solução diluente: NaCl 0,85% (m/v), peptona 0,1% (m/v) ou tampão fosfato de Butterfield, de acordo com a legislação vigente Resultado: Avaliar a formação de gás no interior dos tubos de Durhan invertidos, como no exemplo a seguir, e calcular o NMP/g ou mL utilizando a tabela

+++

+–+

–––

Figura 4.1  Teste presuntivo para análise de coliformes a 35°C pela técnica do número mais provável Fonte: adaptada de APHA, 2001.16

Teste confirmativo para coliformes a 45°C Previamente à realização do teste confirmativo para coliformes a 45°C, devem ser realizados os testes presuntivos para coliformes a 35°C. Para a realização do teste confirmativo, agite lentamente todos os tubos positivos do teste

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presuntivo para coliformes a 35°C e, com auxílio de uma alça de platina ou outro instrumento de transferência adequado, transfira uma alçada ou pequena alíquota do conteúdo de cada tubo positivo para tubos contendo caldo Escherichia coli (EC) e tubos de Durham invertidos, previamente esterilizados (Figura 4.3). Para análise de

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Capítulo 4  Microrganismos Indicadores 57

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Métodos de Detecção de Microrganismos em Alimentos Convencionais e Rápidos Natan de Jesus Pimentel Filho  Gardênia Márcia Silva Campos Mata  Milene Therezinha das Dores

INTRODUÇÃO Os métodos de detecção ou análise são usados para avaliar quais e quantos microrganismos estão presentes em um alimento. Esses métodos podem ser qualitativos, ou seja, indicam o gênero ou até mesmo a espécie do microrganismo existente no alimento; ou podem ser quantitativos, isto é, indicam a quantidade aproximada ou estimada de microrganismos presentes, como é o caso dos métodos de enumeração baseados na técnica do número mais provável (NMP). Os métodos de detecção também podem ser qualitativos e quantitativos concomitantemente.1,2 Um dos objetivos dos métodos de pesquisa de microrganismos é detectar os microrganismos que promovem alterações benéficas nos alimentos, ou seja, modificando suas características originais e transformando-os em novos alimentos com características sensoriais agradáveis e que agregam valor ao produto, como no caso de alimentos fermentados.1,2 Outro objetivo é o de prospectar novas espécies microbianas para aplicação na indústria por meio de estudos que envolvem metagenômica3,4 e citometria de fluxo.5 Nesses estudos, pretendese caracterizar a comunidade microbiana de um alimento, já que muitos são viáveis; porém, não são cultiváveis pelas técnicas tradicionais de cultivo. Além disso, os métodos de detecção de microrganismos são amplamente aplicados para avaliar a qualidade higiênica com

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que os alimentos foram produzidos em uma indústria ou preparados em um restaurante, por exemplo. Isso inclui os microrganismos deterioradores e patogênicos.1,2 Nesse contexto, existem especificações e padrões microbiológicos nacionais e internacionais aos quais o produto final deve atender para estar apto ao consumo humano e poder ser comercializado. A análise microbiológica de alimentos também é útil para determinar o agente etiológico de um possível episódio de toxinfecção alimentar (conforme discutido no Capítulo 5) e para estimar o prazo de validade de um produto alimentício.1 Considerando que, para alguns microrganismos, apenas poucas células presentes em um alimento podem causar doenças, seria desejável que os métodos de detecção fossem capazes de identificar apenas um agente patogênico ou concentrações muito baixas deste em uma amostra de alimento. Entretanto, nem sempre isso é possível, pois muitos métodos necessitam da utilização de etapas de enriquecimentos que, além de assegurarem que o microrganismo detectado esteja vivo, constituem um ambiente propício para que uma pequena quantidade de células-alvo se multiplique até alcançar níveis detectáveis.6 Os métodos convencionais ou tradicionais de detecção de microrganismos em alimentos são baseados em cultura, ou seja, utilizam etapas de enriquecimento. Estas são, geralmente,

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CAPÍTULO 9

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seguidas pelas etapas de seleção de colônias típicas em meios sólidos específicos. Finalmente, as colônias típicas são isoladas em meios não seletivos e submetidas a testes bioquímicos e sorológicos e avaliação morfológica.6-9 Embora as etapas de enriquecimento ampliem a sensibilidade dos métodos convencionais, tal procedimento, normalmente, aumenta em 1 a 2 dias ao tempo total de análise e, somando-se aos demais procedimentos, tem-se um tempo de análise que varia de 3 a 5 dias. Por outro lado, a necessidade de métodos de coleta e análise que sejam mais rápidos, de custo reduzido e de fácil aplicação na indústria é crescente, e o desenvolvimento desses métodos tem sido fortemente incentivado pelas organizações e instituições que se preocupam com a presença de patógenos nos alimentos.

Por esses motivos, a grande promessa dos métodos de detecção alternativos ou rápidos que surgiram na década de 1970 é diminuir o tempo despendido nas análises microbiológicas, sem, contudo, perder em sensibilidade, especificidade, acurácia e limite de detecção. Os métodos rápidos eliminam muitas das etapas observadas nos métodos convencionais, tais como seleção de colônias típicas, provas morfológicas, bioquímicas e testes sorológicos.10 Embora os métodos rápidos sejam efetivos e com muitos protocolos validados internacionalmente, eles ainda são utilizados como métodos de triagem. Se o patógeno estiver presente, o método convencional deve ser utilizado para confirmação. Outra vantagem importante dos métodos rápidos é a possiblidade de detecção de microrganismos em estágio viável não cultivável (VNC).

Neste capítulo, serão abordadas as principais características de um laboratório de análise microbiológica de alimentos, os atributos de desempenho e os passos para validação de novos métodos de detecção, bem como os fundamentos das metodologias empregadas na análise microbiológica de alimentos. Além disso, alguns métodos internacionalmente reconhecidos serão discutidos, e, finalmente, será proposta uma atividade prática com a finalidade

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de fornecer treinamento para detecção de um patógeno alimentar por meio das metodologias convencional e rápida.

LABORATÓRIO DE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS O laboratório de análise microbiológica de alimentos é a unidade destinada a recebimento, armazenamento, avaliação e emissão de resultados relacionados à análise dos alimentos, com o intuito de monitorar o controle de qualidade e, assim, detectar desvios das boas práticas de fabricação ou investigar as causas de surtos de toxinfecção alimentar e problemas de deterioração dos alimentos. Nesse local pode-se ainda desenvolver pesquisa básica, que envolve a avaliação dos fatores que afetam a sobrevivência e multiplicação de microrganismos de importância em alimentos; ou pesquisa aplicada, na qual se utilizam as informações da pesquisa básica para desenvolver e testar novos produtos alimentícios e novos métodos microbiológicos.11 As análises microbiológicas e as pesquisas podem ser realizadas em laboratórios governamentais, industriais, comerciais ou acadêmicos.11 Para o laboratório estar oficialmente apto para exercer suas atividades, deve adotar requisitos de boas práticas laboratoriais (BPL) e ter o sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) implantado. A acreditação, segundo a norma internacional ABNT NBR ISO/ IEC 17.025:2005,12 que trata sobre os requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração, também é recomendada, e quem emite a certificação para o laboratório é o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Inmetro).

As BPL são necessárias para prevenir a contaminação cruzada das amostras e proteger o laboratorista e o ambiente de trabalho contra problemas de contaminação pessoal e ambiental, respectivamente. Por isso, a seleção apropriada de pessoal para executar as atividades laboratoriais é imprescindível para manter níveis desejáveis de qualidade.

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Outro fator relevante é a seleção e padronização de métodos de análise reconhecidos internacionalmente, de procedimentos de manipulação das amostras e da utilização de reagentes de boa qualidade. É necessário ainda prover facilidades e equipamentos para o desempenho das funções dos laboratórios. Com a realização da manutenção preventiva e o monitoramento dos equipamentos, evita-se perda de amostras e de tempo. Por fim, há necessidade de registrar as informações para verificar a acurácia e consistência do trabalho no laboratório e as medidas corretivas, quando níveis inaceitáveis de qualidade forem observados.

PARÂMETROS DE AVALIAÇÃO DOS MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS O método analítico ou teste diagnóstico pode ser considerado um exame realizado em laboratório, sendo necessário o entendimento de alguns princípios básicos para a sua interpretação, que serão discutidos a seguir.13,14 O teste diagnóstico é considerado positivo ou negativo, e o microrganismo, presente ou ausente. Há quatro interpretações possíveis para o resultado do teste: duas em que está correto e duas em que está incorreto. Quando o patógeno está presente e o resultado do teste é positivo ou quando o patógeno está ausente e o resultado teste é negativo, o teste está correto. Contudo, quanto há ausência do patógeno e o teste é positivo (falso-positivo) ou quando há presença do patógeno e o teste é negativo (falso-negativo), o teste está incorreto (Tabela 9.1).15 Para avaliar um novo método analítico ou teste diagnóstico, deve-se saber se a relação entre ele e o padrão-ouro é satisfatória.

Tabela 9.1 Relação entre o resultado de um teste diagnóstico e a presença do patógeno Patógeno Teste

Presente

Ausente

Positivo

Verdadeiro positivo (a)

Falsopositivo (b)

Negativo

Falsonegativo (c)

Verdadeiro negativo (d)

Fonte: adaptada de Fletcher et al., 1996.13

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O padrão-ouro geralmente é um teste simples e barato, mas representa o indicador mais fidedigno da verdade, por ter maior uso ou por ser julgado superior por um consenso entre estudiosos, sendo um meio de saber se o patógeno está ou não realmente presente. Para isso, devese estabelecer a acurácia ou exatidão.13,14 Por exemplo, na Pesquisa de Salmonella sp., o método convencional é adotado como padrão-ouro ou método de referência, e os métodos rápidos são avaliados quando comparados ao método convencional.15 Acurácia, então, é a proximidade dos resultados obtidos por um novo método analítico comparados ao valor verdadeiro.13,16 De acordo com Auriant et al. (1998), apud Silva e Souza (2004),17 uma boa acurácia está próxima de 75%.

Silva e Sousa (2002), apud Silva e Souza (2004),17 consideraram que valores maiores que 90% representam uma acurácia elevada, e 70% a 89% representam acurácia moderada. Algumas relações entre o teste diagnóstico e a presença do patógeno podem ser visualizadas na Tabela 9.2.

A sensibilidade e a especificidade são propriedades de um teste diagnóstico. Elas são usadas para comparar um novo método ao método padrão-ouro. Sendo assim, a sensibilidade pode ser definida como a proporção de amostras contaminadas com o patógeno (verdadeiro positivo), que tem um resultado positivo para o patógeno. Já a especificidade é a proporção de amostras não contaminadas (verdadeiro negativo), que tem um resultado negativo para o patógeno (Tabela 9.2).15,18 A partir do resultado de um teste diagnóstico, os valores preditivos, duas outras propriedades do teste diagnóstico, passam a ter significados mais relevantes do que a sensibilidade e especificidade, pois eles determinarão se a amostra tem ou não o patógeno. O valor preditivo positivo (VPP) é a probabilidade das amostras positivas identificadas pelo teste e que realmente estão contaminadas com o patógeno. O valor preditivo negativo (VPN) é a probabilidade das amostras negativas identificadas pelo teste e que realmente não estão contaminadas com o patógeno (Tabela 9.2).15,19

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Capítulo 9  Métodos de Detecção de Microrganismos em Alimentos Convencionais e Rápidos 137

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138 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática Tabela 9.2 Características e definições do teste diagnóstico Patógeno Teste

Total

Presente

Ausente

Positivo

a

b

Negativo

c

d

c+d

a+c

b+d

a+b+c+d

Total Sensibilidade = a / a + c

Especificidade = d / b + d

VPP = a / a + b

VPN = d / c + d

Acurácia = a + d / a + b + c + d

Prevalência = a + c / a + b + c + d

a+b

VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo.

Fonte: adaptada de Fletcher et al., 1996.13

O valor preditivo é determinado pela sensibilidade e especificidade e também pela prevalência do patógeno nas amostras em estudo. A prevalência é a proporção de amostras contaminadas no total de uma amostra definida, em um determinado ponto no tempo. Quanto mais sensível for um teste, melhor será o seu VPN (assegura que as amostras com resultado negativo não apresentam o patógeno). Por outro lado, quanto mais específico for o teste, melhor será o seu VPP (assegura que as amostras com resultado positivo realmente apresentam o patógeno).13,15 Resultados positivos, mesmo de um teste muito específico, quando se referirem à baixa prevalência do patógeno, serão, em grande parte, falso-positivos. Do mesmo modo, resultados negativos, mesmo de um teste muito sensível, quando se referirem à elevada prevalência do patógeno, serão prováveis falso-negativos.13,15 Por essa razão, amostras verdadeiramente positivas ou negativas tornam-se difíceis de serem

detectadas com confiabilidade ao usar amostras naturalmente contaminadas, sendo frequentemente observados na literatura trabalhos de avaliação de métodos cuja matriz alimentar é contaminada artificialmente com o patógeno pesquisado, no intuito de ampliar a prevalência e melhorar o limite de detecção e o limite de determinação do método avaliado.15,18 Além dos limites de detecção e determinação, outros atributos do teste diagnóstico têm seus conceitos sumarizados na Tabela 9.3.14,16,18 O coeficiente Kappa é também uma ferramenta útil na comparação de testes diagnósticos, pois estabelece o grau de confiabilidade, comparando a concordância observada com a concordância que seria esperada por mero acaso.19 Os valores do coeficiente de concordância Kappa variam de +1 a -1. O cálculo pode ser realizado considerando informações presentes na Tabela 9.2, e a interpretação dos resultados pode ser visualizada na Tabela 9.4.

Tabela 9.3 Conceitos relevantes na avaliação de métodos analíticos Precisão

É o grau de correspondência dos resultados de um método quando aplicado repetidamente a várias amostragens de uma mesma amostra

Reprodutibilidade

Refere-se ao grau de correspondência dos resultados quando procedimentos analíticos são aplicados em uma mesma amostra em diferentes laboratórios, utilizando diferentes analistas e equipamentos

Repetibilidade

Refere-se ao grau de correspondência dos resultados quando procedimentos analíticos são aplicados repetidamente a múltiplas análises da mesma amostra homogênea em curto espaço de tempo, utilizando os mesmos analistas e os mesmos equipamentos

Limite de detecção

Representa o número mais baixo de microrganismos que pode ser detectado com certo limite de confiabilidade, utilizando um determinado procedimento experimental, porém sem ser quantificado

Limite de determinação

Representa o número mais baixo de microrganismos que pode ser quantificado sob condições experimentais pelo método analisado

Fonte: adaptada de Mata, 2009.15

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(365nm).29 Como a maioria dos microrganismos não coliformes não sintetizam essas enzimas, eles são incapazes de crescer no meio. Os poucos não coliformes que apresentam essas duas enzimas têm seu crescimento suprimido por agentes seletivos específicos do teste.

Impedância A microbiologia da impedância é um método rápido que promove o rastreamento qualitativo e quantitativo de microrganismos pela medição da alteração na condutividade elétrica.30 Esse método se baseia no princípio de que, durante a multiplicação microbiana, moléculas grandes (proteínas, lipídios, carboidratos) são transformadas em moléculas menores (aminoácidos, ácidos graxos, ácidos orgânicos), quimicamente mais ativas, e o acúmulo desses metabólitos resulta em alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio – determinação direta. Na impedância indireta, as mudanças de condutividade elétrica são medidas a partir de reações químicas resultantes do crescimento microbiano, como, por exemplo, a produção de dióxido de carbono. O momento em que o crescimento é detectado pela primeira vez, referido como tempo de detecção (TD), é inversamente proporcional ao log do número de bactérias na amostra, o que significa que as contagens bacterianas podem ser preditas a partir do TD. Um processo de calibração inicial é requerido para estabelecer a relação matemática entre TD e log do número do microrganismo-alvo. BacTrac 4300, produzido pela SY-LAB Geräte GmbH, é um exemplo de produto comercial com metodologia baseada na impedância. Essa técnica é muito utilizada para detecção e enumeração de Enterobacteriaceae, especialmente Salmonella.

Epifluorescência direta (DEFT) Este método consiste na contagem microscópica de células. A amostra é tratada com detergentes e enzimas proteolíticas e filtrada em membrana de policarbonato. Assim, as células microbianas são separadas e concentradas sobre a membrana, sendo posteriormente

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coradas por fluorescência. O corante alaranjado de acridina produz fluorescência vermelha, quando está intercalado com o RNA, e verde, quando interage com moléculas de DNA. Consequentemente, células viáveis apresentam fluorescência vermelho-alaranjada, e células mortas, coloração verde. A análise microscópica é realizada nesta superfície sob a incidência de luz fluorescente.31 Esta detecção pode ser automatizada, ligando-se o microscópio a um sistema analisador de imagens. A técnica tem sido descrita para a contagem total em leite cru e em produtos lácteos.

Citometria de fluxo A citometria de fluxo é uma técnica de quantificação celular baseada na detecção de substâncias fluorescentes (fluorocromos) acopladas a anticorpos capazes de se ligar a determinada molécula presente nas células. Estas células marcadas são transportadas e protegidas por um fluxo hidrodinâmico contínuo, que as acomoda, de modo que, individualmente, sejam interceptadas pelo laser. Os fluorocromos são excitados por radiação laser e emitem um comprimento de onda (cor) que é detectado por um sensor (denominado fotomultiplicador) capaz de converter a luz captada em sinais eletrônicos, que são enviados ao computador, possibilitando, por meio de um software específico, uma análise multiparamétrica para obtenção dos resultados. Esta análise é realizada por meio de representações gráficas da intensidade de fluorescência emitida pelo fluorocromo e pelas respectivas características morfológicas das células.

A citometria de fluxo também torna possível a separação rápida e purificada de uma suspensão heterogênea de células pelo processo denominado Sorting. Anticorpos marcados com fluorescência encontram-se disponíveis para a detecção de vários patógenos e são muitas vezes utilizados para estudar viabilidade celular quando combinados com métodos de coloração que distinguem células vivas de mortas, como o SYTO-9 e o iodeto de propídio32

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e a atividade metabólica.33 A técnica é aplicada em água, bebidas e produtos lácteos; porém, algumas partículas dos alimentos podem causar interferência no teste em função da autofluorescência.

Separação imunomagnética A técnica utiliza partículas superparamagnéticas que contêm γ-Fe2O3 revestidas com anticorpos específicos contra o microrganismo-alvo. Dessa forma, mesmo em uma população mista, o microrganismo-alvo é capturado e isolado por essas partículas em função da especificidade do antígeno-anticorpo. Após estabelecida a ligação entre o antígeno bacteriano e as partículas cobertas de anticorpos, o sistema é colocado em um suporte que contém um imã que atrai as partículas metálicas. A separação imunomagnética reduz significativamente o tempo de detecção devido à eliminação da etapa de enriquecimento. Kits para detecção de importantes patógenos, como Salmonella sp., E. coli O157:H7, L. monocytogenes e Cryptosporidium, encontram-se disponíveis no mercado.34

Ensaios imunoenzimáticos Os ensaios imunoenzimáticos, também conhecidos como ELISA, do inglês EnzymeLinked Immunosorbent Assay, são amplamente utilizados na detecção de patógenos e toxinas microbianas em alimentos. O teste se baseia na interação específica de anticorpos mono e policlonais, fixados em uma superfície, e o antígeno-alvo (microrganismo-alvo).

O antígeno capturado pelo anticorpo é detectado pela introdução de um segundo anticorpo conjugado com uma enzima. Por fim, um substrato para a enzima é adicionado ao teste; então, o antígeno-alvo é evidenciado.35 Embora seja considerado um método de detecção rápida, etapas de enriquecimento seletivo podem ser necessárias. Um exemplo automatizado deste tipo de método é o sistema VIDAS®, produzido e comercializado pela BioMerieux.

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Reação em cadeia da polimerase A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica altamente sensível na qual em poucas horas são obtidas milhões de cópias de sequências de ácidos nucleicos a partir de baixas quantidades de DNA ou RNA. Desenvolvida primeiramente por Kary B. Mullis, em 1985, esta técnica propicia a multiplicação (amplificação) exponencial e direcionada de um fragmento específico de DNA por meio da ação da enzima Taq DNA polimerase e de oligonucleotídeos iniciadores (primers) em um DNA molde. É realizada em um equipamento automatizado, denominado termociclador, que promove a alternância de temperaturas por determinados períodos, possibilitando a ocorrência de ciclos repetitivos de desnaturação do DNA, separação em fitas simples, ligação dos oligonucleotídeos e síntese da fita complementar de DNA pela polimerização.

A introdução da PCR em diagnóstico microbiano estabeleceu uma alternativa viável aos métodos convencionais de cultivo. A amplificação do número de cópias de DNA de um microrganismo específico permite que testes de hibridização sejam feitos com elevada eficiência. Essa técnica apresenta diversas vantagens em relação aos métodos convencionais, como maior poder de tipificação e discriminação, maior rapidez, bom limite de detecção, maior seletividade, especificidade, potencial para automação e a possibilidade de trabalhar com bactérias no estágio VNC.36 Um exemplo de kit comercialmente disponível que utiliza a técnica de PCR para detecção de bactérias patogênicas e fungos é o Sistema Bax®, desenvolvido pela DuPont Qualicon.37

Hibridização direta Este método utiliza uma sonda que é um fragmento de DNA fita simples marcado com uma enzima ou uma molécula radioativa ou fluorescente. A sequência de nucleotídeos da sonda deve ser complementar ao DNA do microrganismo de interesse, chamado DNA-alvo. O DNA total dos microrganismos presentes no

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alimento é extraído e desnaturado por agente alcalino, sendo, posteriormente, imobilizado por meio da ligação em um suporte sólido, como uma membrana, de nitrocelulose. As fitas de DNA tornam-se disponíveis para hibridizar com a sonda marcada. A sonda não ligada é removida por lavagem da membrana, e a hibridização é medida pela retenção da sonda.38 É considerado um método rápido de detecção microbiana, mas requer uma quantidade substancial de DNA microbiano.

CONSIDERAÇÕES FINAIS Tendo em vista a grande variedade de métodos de detecção de patógenos em alimentos disponíveis, percebe-se que a escolha do método mais adequado dependerá dos objetivos da análise. Assim, se o objetivo da análise for verificar a qualidade de um alimento comparando os valores encontrados com a legislação vigente, métodos oficiais devem ser usados. Entretanto, se o produto for destinado para exportação,

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métodos internacionalmente aceitos devem ser escolhidos, mas se o objetivo da pesquisa for o acompanhamento da linha de produção, por exemplo, outras metodologias podem ser escolhidas, desde que sejam devidamente certificadas.

Nota-se, ainda, um conflito de escolha entre métodos convencionais e rápidos. Apesar do longo tempo para o diagnóstico final da análise apresentada pelos métodos convencionais, o que pode resultar em perdas econômicas, uma vez que a indústria de alimentos retém seus produtos até a obtenção dos resultados analíticos frente a um patógeno, eles são considerados de referência e oficialmente aceitos por órgãos nacionais e internacionais. Por outro lado, embora os métodos rápidos proporcionem praticidade, economia de espaço e materiais e agilidade nos resultados sem perder em sensibilidade e especificidade, ainda são usados como método de triagem, ou seja, os resultados positivos devem ser confirmados pelos métodos convencionais.

ATIVIDA DE PR ÁTICA Avaliação de Salmonella sp. em amostra de alimento por meio dos métodos convencional e rápido

Objetivo Detectar Salmonella sp. em amostra de alimento por métodos convencional e rápido.

Método convencional Materiais • Reagentes: solução salina peptonada a 1% tamponada (para 1L de solução, pesar: 10g de peptona de carne, 5g de NaCl, 3,5g de Na2HPO4 e 1,5g de KH2PO4, ajustar o pH para 7,0 ± 0,2 e autoclavar por 15min a 121ºC), álcool a 70%, meios de cultura (Rappaport Vasilliadis, Selenito Cistina, XLD, BPLS, PCA, SIM, TSI, LIA e caldo ureia, preparado de acordo com recomendações do fabricante), fitas para teste de oxidase, antissoro polivalente O.6,7 • Equipamentos e utensílios: balança, cabine de fluxo laminar ou bico de Bunsen, espátulas estéreis, sacos plásticos estéreis, homogeneizador de amostras (Stomacher), frascos Schott, tubos de ensaio com roscas estéreis, suporte para tubos, placas de Petri estéreis, alça de platina, palitos de madeira, pipeta Pasteur, lâminas de vidro, micropipetas e ponteiras (1.000µL e 100µL), tesoura, estufa microbiológica, agitador de tubos tipo Vortex, recipiente para descontaminação e descarte das ponteiras.

• Amostra de alimento: queijo Minas frescal ou outro alimento à escolha da turma.

Procedimento • Preparar a cabine de fluxo laminar procedendo à assepsia e esterilização do ambiente. Se for utilizar o bico de Bunsen, limpar a superfície com álcool a 70% antes de acender a chama.

• Pesar 25g de alimento em um saco plástico resistente estéril e, posteriormente, adicionar 225mL de salina peptonada a 1% tamponada. Homogeneizar em stomacher e incubar a 36 ± 1ºC por 16 a 20h.

• Transferir 0,1mL e 1,0mL para tubos contendo 10mL dos caldos Rappaport Vasilliadis e Selenito Cistina, respectivamente, e incubar a 41 ± 0,5ºC por 24 a 30h.

• Realizar o isolamento em placas de Petri contendo meio solidificado XLD e BPLS e incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24h.

• Selecionar de 3 a 10 colônias típicas, isolar em ágar PCA e incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24h.

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Capítulo 9  Métodos de Detecção de Microrganismos em Alimentos Convencionais e Rápidos

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Estratégias para Capacitação de Manipuladores de Alimentos Monise Viana Abranches  Regiane Lopes de Sales  Kenia Costa de Souza Moraes

INTRODUÇÃO Um dos principais objetivos das empresas do setor alimentício é assegurar que o alimento comercializado por elas chegue ao consumidor final em perfeito estado higiênico-sanitário.1 Isso se deve ao fato de muitas doenças e óbitos ocorrerem pela ingestão de alimentos e água contaminados.2 No Brasil, a Lei de Segurança Alimentar e Nutricional (Lei no 11.346, de 15 de setembro de 2006)3 preconiza em seu art. 4o que a segurança alimentar e nutricional contempla, entre outras questões: [...] IV – a garantia da qualidade biológica, sanitária, nutricional e tecnológica dos alimentos [...]

Considerando-se a segurança alimentar e nutricional, os manipuladores de alimentos exercem papel fundamental para a garantia das condições higiênico-sanitárias dos produtos disponibilizados ao consumidor. Devido às funções que desempenham, eles são potenciais veículos de contaminação em virtude de higiene pessoal deficiente e/ou por favorecerem a ocorrência da contaminação cruzada entre alimentos crus e cozidos.4 Outros fatores que favorecem a contaminação ou a multiplicação dos microrganismos nos alimentos incluem:2 • Armazenamento dos gêneros alimentícios em temperaturas inadequadas.

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• Cocção de carnes em temperatura baixa.

• Uso de matérias-primas provenientes de fornecedores não confiáveis (matérias-primas com elevada carga microbiana).

• Má higienização dos equipamentos.

• Preparo dos alimentos com grande antecedência.

Para garantir a inocuidade dos alimentos produzidos, é necessário promover a educação entre os manipuladores, capacitando-os para as funções que desempenham dentro da empresa.

CAPACITAÇÕES PARA MANIPULADORES DE ALIMENTOS A qualidade de um produto é o resultado da soma de todos os procedimentos, cumprimento de critérios e cuidados empregados ao longo da cadeia produtiva. No setor de produção de refeições para coletividades não é diferente, devendo o aumento da produtividade estar atrelado à garantia da qualidade dos alimentos produzidos, especialmente ao que se refere ao aspecto higiênico-sanitário. Então, como assegurar que o alimento disponibilizado ao consumidor não acarrete riscos de desenvolvimento de doenças quando ingerido?

A Confederation of Food and Drink Industries, da União Europeia, vê a qualificação e o treinamento dos profissionais como um componente essencial da competitividade.1 Esses componentes devem ser uma das formas de investimento

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CAPÍTULO 16

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de uma empresa. Neste sentido, as capacitações podem ser consideradas ferramentas eficazes, pois proporcionam aos manipuladores a aquisição de conhecimentos condizentes às funções que desempenham, a criação e o aprimoramento de suas habilidades.5 Embora a Resolução no 216, de 2004, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa),6 ressalte a necessidade de realização de treinamentos, por considerar que os manipuladores sejam potenciais fontes de contaminação dos alimentos, estudos7-9 revelaram que não é incomum a carência de conhecimentos sobre as boas práticas de produção de alimentos.

Etapas da Capacitação A capacitação possibilita ao participante aprender os assuntos abordados por meio da execução de atividades que os aproxima do contexto vivenciado na rotina de trabalho. Durante a sua realização é possível trabalhar aspectos que envolvam as relações entre as pessoas, o diálogo, a troca de saberes, o repasse de informações, o trabalho em equipe (parcerias), a motivação (valorização profissional) e a criatividade. Com isso, maneiras alternativas de resolução de problemas podem ser desenvolvidas, e os manipuladores tendem a adquirir novos conhecimentos e a desenvolver novas habilidades.10 Assim, a empresa ganha não apenas em qualidade, mas também em produtividade.

O simples repasse de informações realizado do decorrer do treinamento não significa que os novos conhecimentos serão transformados em práticas e atitudes implantadas na rotina diária de trabalho. Em seu estudo, Da Cunha et al. (2015)11 apontaram que isso ocorre porque muitas vezes os manipuladores de alimentos têm a percepção de que eventos negativos que podem causar doenças transmitidas por alimentos (DTA) são menos prováveis de acontecer com eles do que com seus colegas de profissão.

Todavia, segundo os autores, manipuladores que já haviam participado de treinamentos anteriores compreendiam que eles poderiam ser

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responsáveis pela ocorrência de uma DTA, além de apresentarem mais conhecimento do que os manipuladores não capacitados. Os pesquisadores concluíram que a percepção otimista pode levar os manipuladores a terem práticas inadequadas ou perigosas, sendo assim, estratégias para adequar a percepção deles devem ser adotadas.

Estabelecimentos que contam com supervisão técnica e infraestrutura adequada, como hospitais, escolas e restaurantes, podem ter a percepção otimista dos manipuladores mais agravada. Manipuladores vinculados a esses locais podem desconsiderar certos riscos por se sentirem “protegidos” em relação aos eventos negativos que podem vir a ocorrer por manipulação inapropriada dos alimentos. Essa percepção dificulta a adoção de medidas preventivas, o que torna necessária a discussão das percepções, condições e situações de risco com toda a equipe de trabalho que direta ou indiretamente está envolvida na produção das refeições.12 Assim, as capacitações devem ter por objetivo o esclarecimento das atividades a serem realizadas, como essas atividades devem ser realizadas e os cuidados a serem tomados, com o intuito de garantir a qualidade higiênico-sanitária dos alimentos produzidos. Então, o que constitui as capacitações para manipuladores de alimentos?

Ao elaborar um programa de capacitação, devem-se considerar a realidade de cada estabelecimento e as carências instrucionais dos manipuladores, com o objetivo de atender às metas da organização para a qual o programa se destina. As etapas de elaboração do programa são apresentadas na Figura 16.1.

De modo geral, os treinamentos podem ser realizados de diferentes maneiras (p. ex., exposição oral, atividade prática, leitura de textos), em diferentes locais (sala de reuniões, setor de produção, visita técnica) e com diferentes objetivos. Ele pode também ser realizado em grupos de pessoas ou individualmente, mas anterior ao seu desenvolvimento é importante conhecer o perfil do público ao qual se destina.

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Material • Uma folha de EVA para confeccionar uma mão grande (50cm).

• Desenhos de microrganismos para simbolizar as sujidades.

• Cola quente ou branca.

• Tesoura.

• Lápis.

• Lápis de cor.

• Pincel atômico preto.

• Fita adesiva.

Confecção do material Desenhar uma mão de aproximadamente 50cm de comprimento na folha de EVA. A mão deve ser recortada duas vezes, e suas laterais, coladas, deixando as bordas na parte inferior (do antebraço) abertas. Em uma das faces da mão devem ser colocados, com auxílio da fita adesiva, os microrganismos que normalmente ficam impregnados na mão quando as mesmas não são higienizadas adequadamente (Figura 16.3).

Desenvolvimento O instrutor deve distribuir os pedaços de papel (simbolizando as sujidades) no ambiente da capacitação (mesa, balcão, cadeiras) com uma pequena fita adesiva voltada para cima.

Em seguida, ele deve explicar os perigos à saúde acarretados pelas sujidades quando estão contidas no ambiente. Deve-se enfatizar que as mãos são potenciais fontes de contaminação dos alimentos, podendo carregar microrganismos, compostos químicos e perigos físicos para os alimentos. Enquanto explica, o moderador deve vestir a mão confeccionada e, então, aplicá-la sobre os lugares que apresentarem as sujidades representadas pelo papel (microrganismos), de modo que estes fiquem aderidos à superfície da mão. Ao final, o moderador deve mostrar a mão agora contaminada e explicar que a adesão das sujidades a ela é algo que comumente ocorre no ambiente de trabalho.

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Aplicação Informar sobre a necessidade da lavagem correta das mãos. O moderador deve retirar cada microrganismo lentamente, explicando que eles devem ser eliminados por essa técnica com a finalidade de evitar a possibilidade de chegarem até o alimento, causando diversos tipos de doenças.

Lavagem correta das mãos Objetivo Estimular a adequada higienização das mãos dos manipuladores de alimentos.

Material • Tinta lavável.

• Pincel.

• Venda para os olhos.

Desenvolvimento O moderador convida um manipulador de alimentos para participar da atividade. Em seguida, venda os olhos do mesmo. O participante é então convidado a se dirigir guiado até um ponto de água (pia). O instrutor pode fazer uma adaptação para a pia utilizando uma bacia (pia) e um regador com água (torneira). O participante deve ser orientado a seguir as instruções informadas, tais como: Você abriu a torneira e está molhando as suas mãos. Agora, elas irão receber o sabonete líquido (no lugar do sabonete, o instrutor deve aplicar a tinta). Lave as mãos com o sabonete (o instrutor deve aguardar aproximadamente 20s para que o participante esfregue as mãos). Ao final do processo, o instrutor deve retirar as vendas dos olhos do participante para que ele e os demais participantes analisem se as mãos foram cobertas pela tinta.20 Para lavar as mãos adequadamente é preciso seguir as seguintes orientações: • Umedecer as mãos com água e adicionar o sabão neutro líquido.

• Esfregar a palma das mãos, as superfícies entre os dedos e o dorso das mãos, não se esquecendo dos antebraços.

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C

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Figura 16.3  Etapas da confecção da mão em EVA. A. Materiais necessários. B. Ilustração dos microrganismos. C. Confecção da mão em EVA. D. Exemplo da utilização da mão de EVA durante a realização da atividade

• Enxaguar as mãos para a remoção dos resíduos e secá-las.

• Aplicar o antisséptico como, por exemplo, o álcool 70%. A técnica correta é apresentada na Figura 16.4.

Aplicação O instrutor deve enfatizar que os locais que não foram pintados são aqueles que precisam de uma atenção maior quando da higienização das mãos.20

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Contaminação cruzada: superfícies brilhantes Objetivo Demonstrar a importância da correta higienização de mãos, dos alimentos e utensílios.

Material • Um frasco de glitter da cor de sua preferência.

• Mesa/bancada.

• Suporte de altileno.

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Figura 16.4  Técnica correta de lavagem das mãos

• Faca.

• Alimentos (como pão, frutas, bolo, legumes, entre outros).

Desenvolvimento Primeira etapa. Colocar sobre a mesa o suporte de plástico, os alimentos e a faca. Distribuir o glitter sobre as palmas das mãos, que serão consideradas contaminadas (o glitter deve ter cor contrastante e representará os microrganismos). Em seguida, manipular um alimento e cortá-lo (p. ex., uma fruta a ser usada no preparo de um molho, suco ou como sobremesa). Mostrar como as mãos, o suporte, os alimentos e o seu interior ficaram, uma vez que as mãos não foram higienizadas e transferiram a contaminação. Reforçar que uma vez

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que os microrganismos não podem ser vistos, a higienização deve ser eficiente e garantir a segurança dos alimentos e que os microrganismos da casca (superfície) é transferido para a polpa (interior) do alimento. Mostrar aos manipuladores que, quando não higienizamos os utensílios e os utilizamos no preparo de outros alimentos (p. ex. porcionamento de lanches ou sobremesas), estes passam a ficar contaminados com os microrganismos presentes no alimento anterior. A Figura 16.5 ilustra as etapas da demonstração.

Segunda etapa. Explicar como deve ser a higienização correta, esclarecer que, durante o processo de higienização é importante seguir duas etapas: limpeza e sanitização/antissepsia. A limpeza consiste na remoção de resíduos

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236 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

Figura 16.5  Etapas da demonstração da contaminação cruzada. A. Materiais necessários. B a D. Impregnar a superfície das mãos com o glitter (representação dos microrganismos). Umedecer as mãos antes de iniciar a demonstração. E. Tocar no alimento a ser cortado (o glitter da mão será transferido para o alimento). F a I. Cortar o alimento e mostrar que a contaminação atinge o seu interior quando este entra em contato com a superfície da faca. J e K. Demonstrar que subsequentes contaminações de alimentos podem ocorrer se a faca não for higienizada.

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• Podemos reaproveitar as sobras dos alimentos? Quais cuidados devemos ter durante esse processo para evitarmos a contaminação das preparações e o surgimento doenças.

• Quais cuidados devemos ter com a nossa higiene pessoal para evitarmos a contaminação dos alimentos?

Aplicação Os resultados esperados com a realização da atividade são a reflexão dos manipuladores sobre os princípios da higiene pessoal e das boas práticas e suas aplicações na rotina de trabalho.

Além disso, os manipuladores serão estimulados a trabalhar em equipe para responder corretamente às questões.

Não somente as atividades podem ser elaboradas, mas também materiais para leitura podem ser confeccionados para os manipuladores de alimentos, em linguagem clara e objetiva.

Alguns exemplos de folders que podem ser distribuídos são apresentados na Figura 16.8.

Avaliação da Efetividade do Treinamento Não é incomum encontrarmos estabelecimentos que não proveem capacitação sobre higiene de alimentos para seus manipuladores.21 Estudo realizado por Seaman e Eves (2010)22 revelou que a maior parte dos manipuladores de alimentos não foram treinados (80%) no período inicial de admissão no trabalho.

Sabe-se que a carência de capacitações dificulta a garantia da realização das boas práticas pelos manipuladores. Todavia, quando aplicados, os treinamentos devem ser avaliados quanto à sua eficácia, caso contrário, não será possível saber se as metas foram alcançadas. Então, quais critérios devem ser considerados na avaliação? É importante avaliar as reações dos manipuladores ao treinamento, especialmente ao valor que atribuem às capacitações; à aquisição de conhecimento (antes e após os treinamentos);

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às mudanças de práticas e atitudes; às melhorias organizacionais, ressaltando a limpeza do ambiente e a satisfação do cliente (interno e externo) e a transferência de motivação (investimento em infraestrutura, equipamentos, crescimento profissional). Assim, o efeito do programa de capacitação pode ser avaliado com dois focos: no manipulador e na organização.14 Sabendo o que deve ser avaliado, surge outra questão: Como avaliar?

Seaman (2010)14 propôs que o desempenho individual pode ser avaliado por meio da observação in loco, por um profissional supervisor adequadamente treinado. Ainda, após um período transcorrido dos primeiros treinamentos (p. ex., 1 mês), questões sobre a manipulação adequada de alimentos podem ser feitas para os manipuladores, devendo os resultados ser analisados com o intuito de mostrar se os manipuladores apreenderam as informações e o que precisa ser reforçado.

Paralelamente, a verificação da atuação dos manipuladores também deve ser realizada, para que possa ser mensurado o desempenho prático. O impacto dos treinamentos para o estabelecimento pode ser mensurado por meio de: • Questionários de saúde dos manipuladores.

• Pesquisas de satisfação dos manipuladores e clientes externos.

• Avaliação da frequência e do tipo de reclamação dos clientes.

• Análises microbiológicas de equipamentos, superfícies e mãos dos manipuladores.

• Avaliação do desperdício por deterioração ou contaminação de alimentos.

• Avaliação do tipo e da frequência de infestações das instalações por pragas.

Assim, é necessário não somente capacitar, mas também avaliar os resultados alcançados, na tentativa de que possíveis dúvidas dos manipuladores possam ser sanadas em oficinas futuras.

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Capítulo 16  Estratégias para Capacitação de Manipuladores de Alimentos 241

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242 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

Como evitar as DTA? Cozinhar bem os alimentos, atingindo a temperatura de 74°C no seu interior Guardar os alimentos sempre com bastante cuidado, separando os alimentos crus dos cozidos Alimentos prontos que serão consumidos posteriormete devem ser mantidos sob refrigeração e aquecidos no momento do consumo Ler a seguir as instruções do Manual de Boas Práticas

Como evitar as DTA? (Doenças Transmitidas por Alimentos)

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O que é uma DTA? É uma doença infecciosa ou tóxica causada pelo consumo de alimentos ou água contaminada, causado por agentes que podem ser químicos, biológicos e físicos.

CRÉDITOS (Frente) A1

A contaminação pode começar desde o recebimento das matérias-pimas, estender-se no preparo das refeições e continuar nas etapas de transporte, recepção, armazenamento e distribuição.

Como surge a DTA? Armazenamento inadequado Cocção ou reaquecimento insuficiente

Azona de perigo que favorece o crecimento da maioria dos microrganismos varia de 5°C a 60°C. Sintomas reais comuns das DTAs: Diarreia Náusea Vômito Dor de cabeça Dor abdominal Febre Formação de gases

Higiene pessoal precária

Contaminação cruzada Descongelamento sem o controle da temperatura Reutilização de sobras sem aquecê-las adequadamente

(Verso) A2 B Figura 16.8  (continuação) (A a D) Exemplos de cartilhas sobre higiene pessoal e higiene de alimentos (continua)

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A Acidez dos alimentos, 34, 113 Ácido(s), 183 - acético, 213 - ascórbico, 213 - lático, 213 - peracético, 212 - orgânicos, 27 Acurácia, 137 Adesão bacteriana, 168, 169 - aspectos microbiológicos, 170 - controle, 170 Aditivos alimentares, 27 Aeróbios obrigatórios, 19 Aflatoxinas, 91, 95 Agentes de limpeza, 183 Água, 11 - engarrafada, 130 - quente, 184 Alcalinidade, 113 Alcalinos, 183 Alcaloides ergóticos, 93, 96 Álcool, 184 Alimento(s), 122 - ácidos, 48 - com maior probabilidade de veicular uma doença, 154 - de origem vegetal, deterioração, 44 - enlatados, deterioração, 46 Alterações - de coloração, 39 - químicas e sensoriais, 37 - relacionadas à multiplicação de bactérias, 37 - relacionadas ao crescimento de fungos filamentosos e leveduras, 40 Amilase, 19 Amostra de lote, 128 Anaeróbios - facultativos, 19

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- obrigatórios, 19 Análise de alimentos etapas da, 129 Antibióticos, 21 Ar, 177, 186 - quente, 184 Armazenamento, 129, 161 Artrite reativa, 6 Aspersão, 209 Aspiração, 182 Ativadores de alimentos, 188 Atividade de água, 11 Atmosfera gasosa, 26 Avaliação de superfícies de preparo dos alimentos, 218

B Bacillus cereus, 90 Bactérias termófilas - anaeróbias, 47 - do grupo flat sour, 47 Bacteriocinas, 21 Bacteriófagos, 21 Bancadas, 187 Batedeiras, 188 Biofilmes microbianos, 167 Boas práticas - de manipulação de alimentos, 158 - laboratoriais (BPL), 136 Bolores, 40 Branqueamento, 106, 107

C Campilobacteriose, 77 Campo elétrico pulsado, 116 Campylobacter spp., 70, 77 Câncer, 6, 7 Capacitação de manipuladores de alimentos, 229, 230 Capacitação profissional, 197

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Índice

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248 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

Carboidratos complexos, 18 Carga elétrica, 169 Carnes e derivados, deterioração, 41 Caso, 152 Cegueira, 6 Celulase, 19 Citometria de fluxo, 143 Citrinina, 93, 95 Clorado inorgânico, 184 Cloreto de sódio, 27 Clostridium botulinum, 87 Clostridium perfringens, 89 Cocção, 162 Coeficiente kappa, 138 Coleta, 129 Coliformes, 54 Colilert, 142 Compostos antimicrobianos, 20 Congelamento, 26, 108, 161 Conservação - dos alimentos, 105 - - tecnologias convencionais para, 106 - pela redução do pH, 113 - pelo calor, 106 - pelo frio, 107, 108 - pelo processo de congelamento, 108 Conservadores, 27 Conservantes, 28 - químicos, 112 Constante - de acidez (Ka ), 16 - de dissociação de um ácido (pKa), 17 Contagem em placas, 125, 126, 140 Contaminação - cruzada, 235 - de superfícies, 178 - dos alimentos tipos de, 150 - vias de, 65 Controle - de matérias-primas, 160 - de pragas, 163 Crescimento de fungos filamentosos e leveduras, 40 Critérios microbiológicos, 123, 124 Culturas microbianas - starter, 4 - utilizadas na indústria, 4

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D Desenvolvimento microbiano em alimentos - fatores extrínsecos, 22 - fatores implícitos, 29 - fatores intrínsecos, 11 Desidratação, 109 - osmótica, 110 Deterioração dos alimentos, 37 - carnes e derivados, 41 - de origem vegetal, 44 - enlatados, 46 - frutos do mar, 43 - leite e derivados, 41 - ovos, 43 - pescados, 43 Deterioração - microbiana, 7, 33, 105 - - fatores determinantes da, 33 - sulfídrica, 47 Determinação - de coliformes - - a 35°C e 45°C, 55 - - a 35°C em meio sólido, 59 - de enterobacteriaceae em meio sólido, 60 Dióxido - de cloro, 213 - de enxofre, 27 Distribuição, 162 Distúrbios no desenvolvimento neurológico, 7 Doença(s) - cardiovasculares, 6 - renal, 7 - transmitidas por alimentos (DTA) , 4, 63, 85 - - aspectos epidemiológicos, 152 - - fatores causadores de surtos, 158 - - mecanismos envolvidos na ocorrência, 150

E Eletroporação, 117 Embalagem(ns) - a vácuo, 112 - ativa, 26 - em atmosfera modificada (MAP), 27, 111, 112 - inteligentes, 26 - passivas, 26 Endotoxinas, 64, 65

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Ensaios imunoenzimáticos, 144 Enterocolite, 66 Enterotoxinas estafilocócicas, 87 Epifluorescência direta (DEFT), 143 Epilepsia, 6 Ergotismo, 2, 93 Escherichia coli, 73 - de adesão difusa, 75 - enteroagregativa, 74 - enteroinvasiva, 76 - enteropatogênica clássica, 73 - enterotoxigênica, 74 - produtora de toxina Shiga, 75 Especificidade, 137 Espectro de ação dos compostos antimicrobianos, 21 Espera pós-cocção, 162 Esporos bacterianos, 23 Esterilização, 107 Exotoxinas, 64, 65, 85, 86

F Fagos, 21 Falência - de múltiplos órgãos, 6 - renal, 6 - - aguda, 6 Febre, 87 - entérica, 66 Fogões, 187 Formação de biofilmes, 168 - controle, 170 Fornos, 187 Fosfatos, 183 Freezers, 187 Fricção, 182, 223 Frutos do mar, deterioração, 43 Fumonisinas, 91, 95 Fungos, 126 - filamentosos, 40

G Gastrenterite, 6, 7 - aguda de origem alimentar, 66 Geladeiras, 187

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H Hábitos comportamentais versus contaminação dos alimentos, 201 Hepatite - A, 70, 79 - aguda, 6 Hibridização direta, 144 Hidrofobicidade, 169 High temperature short time (HTST), 25 Higiene - de superfícies e do ambiente de manipulação de alimentos, 175 - dos alimentos, 149 - dos manipuladores de alimentos, 193 Higienização - de equipamentos, 187 - de frutas e hortaliças, 207 - de ovos, 210 - de utensílios, 188 - do ambiente frequência, 188 - dos alimentos, 207 - periodicidade de, 188 - procedimentos específicos de, 186

I Imersão, 182 Impedância, 143 Impressão - de microrganismos do ar em meio sólido, 225 - do ar, 226 Inativação microbiana proporcionada pelo ultrassom, 113 Indicadores de qualidade, 122 Infecção(ões), 151 - alimentares, 65 - - causadas por bactérias, 66 - - causadas por vírus, 78 - - controle das, 79 - por Salmonella spp., 66 Interpretação dos resultados e conclusão, 131 Interruptores, 186 Intoxicação(ões) alimentar(es), 85, 151 - bacteriana, 86 - controle das, 79, 94 - de origem alimentar, 86 - fúngica, 90

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- não bacteriana, 151 - por ingestão de exotoxinas microbianas, 85 Iodóforos, 184 Irradiação, 114

J Janelas, 187

L Laboratório de análise microbiológica de alimentos, 136 Lactoferrina, 36 Lâmpadas, 186 Lavagem, 182, 223 Legislações relacionadas às boas práticas, 159 Leite - e derivados, deterioração, 41 - pasteurizado, 41 Leveduras, 40 Limite - de detecção, 138 - de determinação, 138 Liofilização, 110 Lipase, 19 Lipídios, 39 Liquidificadores, 188 Listeria monocytogenes, 68, 72 Lote, 128 Low temperature long time (LTLT), 25 Luminárias, 186 Luz ultravioleta, 184

M Maçanetas, 187 Maionese, 49 Manipuladores de alimentos, 231 - adequação da higiene, 198 - e higiene no processo produtivo, 195 Manual de boas práticas, 158 Máscaras, 200 Masseira, 188 Meningite, 6 Mesas de apoio, 187 Metais, 28 Metodologias para oficinas de capacitação, 231

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Métodos - analíticos, 125 - convencionais ou tradicionais, 135 - de detecção, 55, 135, 139 - de fricção de esponjas, 221 - de recuperação de microrganismos de superfícies, 223 - microbiológicos, parâmetros de avaliação dos, 137 - para avaliação da contaminação do ar, 224 Micélio, 40 Micotoxinas, 40 Microaerófilos, 19 Microbiologia, 1 - para a produção de alimentos, 2 Microrganismo patogênico, 64 Microrganismos - causadores de infecção alimentar, 65 - deterioradores, 7 - em alimentos, 4, 122 - fastidiosos, 18 - halodúricos, 13 - halofílicos, 13 - halotolerantes, 13 - indicadores, 53 - mesófilos, 23 - osmodúricos, 13 - osmofílicos, 13 - patogênicos causadores de - - infecções alimentares, 63 - - intoxicações alimentares, 85 - psicrófilos, 23 - termófilos, 23 - xerofílicos, 13 Minerais, 35 Moedores, 188 Móveis, 187 Multiplicação de bactérias, 37

N Nanopartículas de prata, 172 Natamicina, 28 Neurotoxina botulínica, 88 Nisina, 28 Nitratos, 27 Nitritos, 27

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Norovírus, 70, 78 Notificação, 154, 155 Nozes, 49 Número mais provável, 126 Nutrientes, 17

O Ocratoxina, 94, 96 Ondas ultrassônicas, 113 Ovos, deterioração, 43 Oxidação-redução, 19 Oxigênio, 26

P Padrão-ouro, 137 Padrões microbiológicos sanitários para alimentos destinados ao consumo humano, 131 Paralisia, 6 Parâmetros de avaliação dos métodos microbiológicos, 137 Paredes, 186 Pasteurização, 24, 107 - lenta, 25 - rápida, 25 Patulina, 93, 95 Pectinase, 19 Perda perinata, 6 Perigos - biológicos, 150 - físicos, 150 - químicos, 150 Peróxido de hidrogênio, 212 Pescados, deterioração, 43 Petrifilm™, 142 pH, 14, 34 Piso, 187 Placas de contato, 222, 223 Planos de amostragem, 128 - de duas classes, 129 - de três classes, 129 Plaqueamento em espiral, 141 Polissacarídeos, 18, 39 Portas, 187 Potencial - de oxirredução, 19

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- redox de um substrato, 19 Pré-lavagem, 182 Pré-preparo, 162 Precisão, 138 Preparo dos alimentos, 162 Probióticos, 4 Procedimento geral de higienização, 180 Processadores, 188 Produtos - em condições sanitárias - - insatisfatórias, 131 - - satisfatórias, 131 - metabólicos, 122 Protease, 19 Psicrotolerantes, 23 Psicrotrófico, 23

Q Qualidade, 121 Quaternário de amônio, 184

R Radapertização, 116 Ralos, 187 Raspagem/ moagem, 223 Reação - de Stickland, 39 - em cadeia da polimerase, 144 Reaquecimento, 163 Recebimento, 160 Redução da atividade de água, 109 Refrigeração, 25, 108 Repetibilidade, 138 Reprodutibilidade, 138 Retardo mental, 6 Retinopatia, 6 Risco - atribuível, 156 - relativo, 156 Rodapés, 187 Rotavírus, 70, 79 Rubratoxina, 94, 96 Rugosidade, 169

S Salmonella spp., 66, 68

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252 Microbiologia e Higiene de Alimentos – Teoria e Prática

Sanitização, 209 - por aspersão ou nebulização, 183 - por circulação, 183 - por contato, 183 - por imersão, 183 Sanitizante, 211 Saúde do manipulador, 160 Secagem, 109 Sedimentação simples, 224, 226 Segurança alimentar e nutricional, 229 Sensibilidade, 137 Separação imunomagnética, 144 Septicemia, 6 Sequestrantes, 183 Shigella spp., 67, 68 Simplate™, 142 Síndrome - do choque tóxico, 87 - do intestino irritável, 6 - emética, 90 - Guillain Barré, 6 - urêmica-hemolítica, 6 Staphylococcus aureus, 87 Substâncias com ação antimicrobiana, 20 Sulfitos, 27 Superfícies e contaminação dos alimentos, 175 Surdez, 6 Surto, 152 Swabs, 218, 223

T Taxa de ataque - entre os expostos, 155 - entre os não expostos, 156 Técnica do número mais provável, 55-57, 141 Tecnologia(s) - convencionais para conservação de alimentos, 106 - de barreiras, 28 - de obstáculos ou de barreiras, 28 Telas, 187 Temperatura, 22 Tensoativos, 183 Teste - confirmativo, 127 - - para coliformes a 35°C, 56

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- - para coliformes a 45°C, 57 - da ATP-bioluminescência, 219, 221 - de coliformes a 45°C, 127 - do swab, 218 - presuntivo, 127 - - para coliformes a 35°C, 55 Tetos, 186 Tomadas, 186 Toxina - botulínica, 87 - de Bacillus cereus, 90 - de Clostridium perfringens, 89 - Shiga, 71 Toxinfecção, 151 Transmissão de microrganismos patogênicos através do ar, 177 Transporte de amostras, 129, 130 Tratamento térmico, 106 Tricotecenos, 92, 95

U Ultra high temperature (UHT), 24 Ultrassom, 113 Umidade relativa, 22 Unidade amostral ou analítica, 128

V Validação de métodos rápidos de pesquisa microbiológica de alimentos, 139 Valor preditivo, 138 - negativo (VPN), 137 - positivo (VPP), 137 Vapor, 184 Varrição, 182 Vias de contaminação, 65 Vibrio cholerae, 69, 72 Vírus da hepatite A, 79 Vitaminas, 35

X Yersinia spp., 68, 71

Z Zearalenona, 92, 95

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SOBRE AS ORGANIZADORAS

Muito se avançou no controle das doenças transmitidas por alimentos

Jackline Freitas Brilhante de São José

(DTA), no entanto, dados do Ministério da Saúde ainda evidenciam a

Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

na articulação entre os atores implicados no processo. Se por um lado,

Mestre em Microbiologia Agrícola pela UFV. Graduada em Nutrição pela UFV.

necessidade do aperfeiçoamento nas ações intersetoriais, bem como

o Estado precisa aperfeiçoar as ações da vigilância sanitária, ambiental e agropecuária (entre outras), fomentando práticas inovadoras que contemplem planejamento, monitoramento e avaliação permanentes, bem

Monise Viana Abranches

como processos de educação em saúde; por outro lado, a sociedade

Doutora em Biologia Celular e Estrutural pela Universidade Federal de Viçosa (UFV).

civil, representada por empresários da área de alimentos e por cidadãos

Mestre em Ciência da Nutrição pela UFV.

comuns, precisa estar consciente do seu papel no exercício da Segu-

Graduada em Nutrição pela UFV.

rança Alimentar e Nutricional.

Microbiologia e Higiene de Alimentos: Teoria e Prática tem como objetivo levar ao público informações atualizadas sobre temas que perpassam a microbiologia e a higiene de alimentos no âmbito dos Serviços de Alimentação para Coletividades; e apresentar de maneira didática os conceitos ligados à microbiologia de alimentos, passando pelos princípios gerais de conservação; à higiene de alimentos e dos manipuladores e ao monitoramento das condições microbiológicas no ambiente de produção de refeições, demonstrando situações-problema que podem facilmente ser enfrentadas no dia a dia.

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