Introdução à Pesquisa em CItogenética de Vertebrados by Editora Cubo

Sanae Kasahara

Introdução à Pesquisa em Citogenética de Vertebrados

Sociedade Brasileira de Genética

Capa: metáfase do anuro Hypsiboas crepitans com bandas RBA (foto da autora).

Kasahara, Sanae. Introdução à Pesquisa em Citogenética de Vertebrados. / Sanae Kassahara. 1ª ed. - Ribeirão Preto, S. P. : Sociedade Brasileira de Genética, 2009. 160 páginas. 1. Citogenética. 2. Vertebrados. 3. Genética. I Autor. II título

Diagramação e capa: cubo multimidia Revisão: Maria Izabel Boschi

Editora SBG Sociedade Brasileira de Genética Ribeirão Preto, SP Gestão 2006-2008

Prefácio

Desde que os cromossomos foram observados pela primeira vez ao microscópio, houve um grande desenvolvimento dos métodos e técnicas que se destinam à sua obtenção e análise. Isso possibilitou, sem dúvida, um avanço significativo no conhecimento do número, tamanho e morfologia dos cromossomos das espécies de animais e vegetais, como também da sua estrutura, organização molecular, comportamento durante a divisão celular e evolução, entre outros aspectos. Em 10 tópicos, o livro tem o objetivo de introduzir o estudante no campo da pesquisa em Citogenética de Vertebrados, grupo no qual a maioria das espécies, principalmente aquelas da região Neotropical, têm sequer o número de cromossomos conhecido. Assim, são apresentados os métodos usuais de como preparações citológicas podem ser obtidas diretamente do animal vivo, empregando-se procedimentos relativamente simples, ou com a utilização de uma infraestrutura laboratorial que possibilita o cultivo de células. São descritas diferentes maneiras de como os cromossomos mitóticos e meióticos podem ser analisados, incluindo os métodos que promovem a identificação de estruturas ou regiões particulares e aqueles mais refinados que fornecem informações sobre a composição molecular e mesmo sobre o funcionamento de sítios cromossômicos específicos. Tais procedimentos são especialmente relevantes para se compreender os mecanismos que levam à diferenciação dos cariótipos de espécies de vertebrados, sendo, assim, indispensáveis na citogenética comparativa. Alguns tópicos importantes na citogenética de vertebrados, isto é, os cromossomos sexuais e os cromossomos B, são tratados no livro, assim como os principais mecanismos que promovem alterações no número e na estrutura dos cromossomos, sendo, portanto, responsáveis pela variação dos cariótipos, e até pela origem de novas espécies, como é o caso da poliploidia. O livro finaliza com a apresentação de algumas aplicações que podem ter as análises dos cariótipos de espécies de vertebrados e, com isso, espera-se que os estudantes, que já tenham adquirido um conhecimento básico de genética, sejam motivados a realizar pesquisas na área de citogenética. Há, também, uma expectativa de que o livro seja útil para os

pesquisadores que, embora não pretendam analisar cariótipo, desejam se inteirar dos procedimentos básicos empregados no estudo dos cromossomos com vistas à filogenia e evolução de certos grupos. Na medida do possível, os diferentes tópicos foram ilustrados com dados obtidos por citogeneticistas brasileiros, cujo número muito tem aumentado nos últimos anos. No final do livro, são listados artigos mencionados ao longo dos diferentes tópicos e uma relação de trabalhos de referência, os quais fornecerão os subsídios teóricos para os temas aqui desenvolvidos. Rio Claro, agosto de 2008

Agradecimentos

Agradeço à Sociedade Brasileira de Genética, em nome de seu Editor de Livros, Dr. Pedro Manoel Galetti Junior, pela possibilidade de publicar o presente livro. Agradeço, também, às instituições de fomento, FAPESP, CNPq, CAPES e FUNDUNESP, que ao longo de mais de três décadas deram valioso apoio financeiro a mim e aos meus alunos para realizar pesquisas na área de citogenética. Sou igualmente grata ao Instituto de Biociências do Campus da UNESP em Rio Claro, SP, onde tenho podido até hoje dar continuidade às minhas atividades de docência e orientação, não só na pós-graduação, como também na graduação, e às pessoas que de diferentes formas contribuíram o desenvolvimento de minha formação como citogeneticista de vertebrados, pela possibilidade de participar de dezenas de bancas de trabalhos acadêmicos, pelos convites para ministrar palestras, seminários e mini-cursos. Um agradecimento especial é devido aos colegas Guaracy Tadeu Rocha, Luiz Antonio Carlos Bertollo, Orlando Moreira Filho, Cleusa Yoshiko Nagamachi, Júlio Cesar Pieczarka, José Fernando de Sousa Lima, Valéria Fagundes, Maria José de Jesus Silva, Yatiyo Yonenaga-Yassuda, Maria José de Souza Lopes, André Luís Bombeiro, Fernando Ananias, Ana Paula Zampieri Silva, Rita Maria Ladeira Pires, Patrícia Pasquale Parise-Maltempi, Lurdes Foresti de Almeida-Toledo e Shirlei Maria Recco-Pimentel, que prontamente cederam material de seus trabalhos, e à Cristiane Mileo e à Simone Lilian Gruber pela valiosa ajuda na preparação das ilustrações; finalmente, agradeço aos meus atuais e antigos orientados e estagiários, que, como alvo preferencial das informações aqui apresentadas, contribuíram para que essas pudessem ser organizadas de forma mais didática possível.

Conteúdo

Capítulo 1 Métodos de Obtenção de Cromossomos para Estudo de Cariótipo . . . . . . 9 Como obter preparações cromossômicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Os métodos diretos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 O cultivo de células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Capítulo 2 Análise dos Cromossomos com Coloração Convencional . . . . . . . . . . . . . . Os cromossomos mitóticos: número modal; morfologia e nomenclatura; estruturas particulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Representação do cariótipo: cariograma e ideograma; número fundamental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A análise dos cromossomos meióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21 21 28 32

Capítulo 3 Análise dos Cromossomos com Coloração Diferencial . . . . . . . . . . . . . . . . Bandas Q, G e R: diferenciação de bandas eucromáticas. . . . . . . . . . . . . . . . . Bandas C: regiões repetitivas nos cromossomos; aplicação das análises de bandas C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ag-RON: nucléolo e formação de ribossomos; aplicação das análises de Ag-RON. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

39 40 45 52

Capítulo 4 Análise dos Cromossomos com Técnicas Especiais de Marcação Cromossômica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Incorporação de análogos de base no DNA: tratamento pelo BrdU; aplicação das análises de bandas de replicação e de alta resolução. . . . . . . Coloração com fluorocromos base-específicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Técnicas de imunocitogenética. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

63 63 72 76

Bandas com enzimas de restrição. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Hibridação in situ: princípios, tipos e aplicações dos diferentes métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Capítulo 5 Variação Cariotípica: Alterações Cromossômicas Numéricas. . . . . . . . . . . 91 Origem das aneuploidias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 Poliploidia: autopoliploidia e alopoliploidia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Capítulo 6 Variação Cariotípica: Alterações Cromossômicas Estruturais. . . . . . . . . . 101 Origem dos diferentes tipos de rearranjos; emparelhamento e segregação meiótica dos cromossomos em portadores heteromórficos. . . 101

Capítulo 7 Cromossomos Sexuais e Sistemas Cromossômicos de Determinação do Sexo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Origem dos cromossomos sexuais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 Sistemas simples e múltiplos de determinação do sexo . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Capítulo 8 Cromossomos Supernumerários. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Características, ocorrência e origem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Capítulo 9 Polimorfismos Cromossômicos, Heteromorfismos Cromossômicos e Variações Cromossômicas Geográficas Intraespecíficas. . . . . . . . . . . . . . . 139

Capítulo 10 Aplicações dos Estudos do Cariótipo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

Bibliografia Literatura citada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Literatura complementar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

capítulo

Métodos de Obtenção de Cromossomos para Estudo de Cariótipo

Como obter preparações cromossômicas Os cromossomos de vertebrados têm sido desde longa data objeto de interesse de pesquisadores, os quais procuraram ao longo dos anos aperfeiçoar diferentes métodos e técnicas de obtenção e análise. Dependendo do grupo zoológico, das características do animal, principalmente no que se refere ao seu tamanho, da disponibilidade de órgãos e tecidos, os resultados ainda hoje nem sempre têm sido satisfatórios, quanto à quantidade e qualidade de células em fases adequadas para observação dos cromossomos. Contudo, houve, sem dúvida, um grande avanço na melhoria das preparações citológicas e quaisquer que sejam os métodos e técnicas adotados, existem algumas etapas que são obrigatoriamente seguidas para obtenção de cromossomos para análise do cariótipo. A observação de cromossomos requer células em divisão, pois é nessa fase do ciclo celular que tais estruturas se tornam mais ou menos individualizadas. Na interfase, os cromossomos se encontram muito distendidos de modo que, excetuando algumas regiões cromossômicas particulares representadas pela heterocromatina associada em cromocentros, não se pode identificá-los em meio à massa de cromatina mais ou menos homogeneamente corada. Não é, pois, surpreendente que as primeiras informações sobre número de cromossomos em espécies de vertebrados, que começaram a ser divulgadas no final do século XIX, tenham se baseado em preparações citológicas obtidas a partir de tecido gonadal. O testículo, mais do que o ovário, foi e tem sido, mesmo nos dias de hoje, preferencialmente empregado nas pesquisas em citogenética, devido às peculiaridades da gametogênese feminina, o que implica em uma quantidade relativamente menor de células em divisão e, além disso, em períodos determinados na vida da fêmea. Já no testículo, uma alta taxa de divisão celular ocorre durante a espermatogênese, sejam as mitóticas na fase de multiplicação das espermatogônias, sejam as meióticas que ocorrem após o crescimento dos espermatócitos. De

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início, foram empregadas técnicas histológicas, em que fragmentos do testículo, devidamente fixados, eram incluídos em parafina, submetidos a cortes finos e, posteriormente, corados e analisados. Tal metodologia, não raramente, gerava dúvidas sobre a correta contagem do número de cromossomos, o que foi de certa forma minimizado, quando foi introduzido o procedimento de se esmagar literalmente o tecido entre lâmina e lamínula com o polegar. O esmagamento (squash) de pequenos fragmentos não só de testículos, como também de outros órgãos do animal, ainda é nos dias de hoje uma alternativa utilizada pelos citogeneticistas para obtenção de preparações citológicas de vertebrados para análise do cariótipo, com a vantagem de que a qualidade das mesmas foi bastante melhorada, principalmente com a introdução do uso da colchicina e do tratamento hipotônico. O ano de 1956 representa, sem dúvida, um marco para a citogenética pois foi a partir de trabalhos realizados por Tjio e Levan, Ford e Hamerton, que o tratamento pela colchicina e a solução hipotônica, antes da fixação do material, passaram a ser usados de modo rotineiro para obtenção de preparações citológicas para análise de cariótipo. Ainda que o tratamento hipotônico já fosse anteriormente empregado por citogeneticistas humanos e de animais, a melhoria na qualidade das preparações foi particularmente notável em relação aos cromossomos mitóticos, os quais puderam ser melhor individualizados com o uso da colchicina. A colchicina é um alcaloide extraído do Colchicum autumnale e de outras plantas da família das liliáceas. Trata-se de uma substância altamente tóxica, mas tem sido utilizada, desde há muito tempo, como medicamento para várias finalidades. A mais conhecida delas é para amenizar as dores nas articulações em pessoas afetadas por uma doença conhecida como gota. A colchicina passou a ser utilizada nas pesquisas em citogenética em decorrência de sua propriedade de se ligar aos dímeros de tubulinas, cuja polimerização fica impedida para formar os microtúbulos, componentes do fuso de divisão. Por outro lado, sendo os microtúbulos uma estrutura dinâmica que é capaz não só de ganhar como perder as subunidades protéicas, os dímeros que estavam anteriormente associados se desorganizam e o resultado do tratamento pela colchicina é, então, a não-formação do fuso e, como consequência, o impedimento da segregação anafásica. A colchicina promove, portanto, uma sincronização da divisão na metáfase, acumulando células nessa fase, que corresponde àquela em que os cromossomos atingem o máximo da condensação, facilitando a sua visualização. A droga tem também o efeito de promover uma condensação adicional dos cromossomos e desse

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modo a sua individualização é grandemente facilitada, ainda mais pelo fato de não se encontrarem presos aos microtúbulos do fuso. Existem outras substâncias que impedem a formação do fuso de divisão, podendo por tal razão ser também empregados nas pesquisas em citogenética. Em vertebrados, porém, o uso da colchicina é praticamente universal, ainda que sua substituição pela Colcemid, um derivado da colchicina, tenha ocorrido eventualmente por ser menos tóxico. A metáfase mitótica obtida pela não-formação do fuso de divisão, sob ação de qualquer agente, é referida como metáfase-C e seu aspecto é muito diferente da célula nessa mesma fase, durante o processo normal de divisão celular (Fig. 1.1). É importante enfatizar que a colchicina bloqueia temporariamente a divisão celular na metáfase, não impedindo que o ciclo celular tenha prosseguimento, com separação das cromátides-irmãs de cada cromossomo, ainda que não ocorra segregação anafásica, nem citocinese. Como consequência, todo material genético da célula original permanece em um único núcleo, não se dividindo de modo equitativo e a célula se torna poliploide, isto é, com o dobro do número de cromossomos. Eventualmente, as cromátides-irmãs podem não se separar e o resultado é

Figura 1.1 Metáfases mitóticas do camundongo Mus musculus observadas durante a divisão celular sem tratamento (a) e com tratamento (b) pela colchicina (metáfase-C). (a) Figura de André Luís Bombeiro.

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o aparecimento de células endorreduplicadas, com o mesmo número de cromossomos da célula original, nas quais cada cromossomo metafásico apresenta um aspecto peculiar com quatro cromátides presas na altura do centrômero, sendo denominado de diplocromossomo. Tratamentos muito longos pela colchicina podem, pois, ter como consequência o aparecimento de poliploidia que no caso de análise de cariótipo recomenda-se evitar. A individualização dos cromossomos metafásicos é grandemente melhorada quando, além do uso da colchicina, as células são submetidas a tratamento hipotônico. Para tal, é empregada uma solução, cuja concentração é menor do que a do conteúdo citoplasmático, de modo a permitir a entrada de água na célula sem, no entanto, promover o seu rompimento. Caso isso ocorra, existe a possibilidade de perda de um ou vários cromossomos e não apenas o seu desejável espalhamento e individualização. Em citogenética de vertebrados, pode-se empregar para tratamento hipotônico, soluções salinas diversas em que diferentes sais, como citrato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, são dissolvidos em água; menos frequentemente, tem-se utilizado soro bovino ou meio de cultura diluídos em concentrações adequadas. A solução hipotônica que tem uso quase universal na obtenção de preparações citológicas de vertebrados é, sem dúvida, a de cloreto de potássio que, na concentração de 0,075M, cumpre o seu papel de promover a dispersão dos cromossomos. A fixação adequada das células constitui um procedimento tão importante quanto o tratamento pela colchicina e a hipotonização, para assegurar a qualidade do material a ser analisado. Um bom fixador deve provocar a morte rápida das células, preservando ao máximo a estrutura dos cromossomos. O fixador empregado pelos citogeneticistas em quase todas as preparações tem sido o Carnoy I, obtido pela mistura de três partes de álcool metílico ou etílico e uma parte de ácido acético glacial, sempre no momento do uso. Em alguns casos, principalmente quando se tem muitas hemácias anucleadas nas suspensões celulares, caso das espécies de mamíferos, aconselha-se intercalar o uso de uma outra mistura fixadora, conhecida como Carnoy II, cujos componentes são seis partes de álcool metílico, uma parte de ácido acético glacial e três partes de clorofórmio. Esse último componente auxilia na lise das hemácias e na remoção de seus resíduos durante a fixação. Quaisquer que sejam as preparações cromossômicas a serem obtidas, o tratamento pela colchicina, a hipotonização e a fixação constituem procedimentos fundamentais, para se ter cromossomos mitóticos de boa qualidade para análise de cariótipo, mas a maneira como têm sido empregados são muito variáveis, dependendo dos tipos celulares e da espécie de vertebrados com que se está trabalhando,

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da metodologia adotada e, muitas vezes, até dos protocolos técnicos padronizados em cada laboratório.

Os métodos diretos Uma das maneiras mais simples de se obter preparações de cromossomos mitóticos é pelo método direto, em oposição aos procedimentos de cultivo de células. No primeiro caso, a solução de colchicina é injetada em quantidade proporcional ao peso do animal (tratamento in vivo) e esse é sacrificado após algum tempo, para a retirada dos órgãos e tecidos de interesse. A concentração da solução de colchicina, assim como o tempo de tratamento, é bastante variável dependendo do organismo. De um modo geral, tem-se empregado soluções entre 0,01% a, no máximo, 2%, durante alguns minutos a várias horas. Roedores de pequeno porte, por exemplo, fornecem boas preparações com tratamentos de cerca de 15 minutos, mesmo com colchicina relativamente diluída a 0,1%, sob o risco de se obter metáfases com cromossomos excessivamente condensados ou mesmo poliploides. Outros animais, como os anfíbios, requerem muitas vezes tratamentos mais longos que podem durar a noite toda (tratamento dito overnight, de mais de 12 horas). Recomenda-se, portanto, consultar a literatura para se determinar a concentração mais adequada da colchicina, bem como a duração do tratamento em cada caso, além do que testes preliminares são sempre bastante úteis. Para sacrifício dos animais, emprega-se em geral éter ou clorofórmio, não se descartando o uso de outros anestésicos, como a benzocaína, entre outros. Por fornecer, em geral, uma quantidade relativamente boa de células em divisão, a obtenção da medula óssea tem sido uma prática muito comum para muitos vertebrados. Nesse caso, o fêmur é dissecado e o canal ósseo é submetido a lavagens, com injeções sucessivas de solução hipotônica com auxílio de uma seringa, até a retirada completa da medula. É também usual obter preparações citológicas do fígado, rim, baço e epitélio intestinal e, no caso específico de alguns grupos, a partir das brânquias como em peixes e a partir da polpa de penas em aves. Como procedimento rotineiro, é sempre indicada a retirada das gônadas dos machos, pois as preparações de testículos podem fornecer informações que complementam as análises baseadas em células somáticas, além do que podem apresentar um certo número de metáfases espermatogoniais, bastante úteis quando não se tem quantidade suficiente de metáfases mitóticas fornecidas por outras fontes. Qualquer que seja o tecido ou órgão, faz-se a dissociação das células com o uso de seringa, pinça, ou espátula, como no caso do epitélio intestinal, e as mesmas podem ser recolhidas diretamente em uma placa de Petri contendo

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solução hipotônica, cujo volume varia por sua vez com a quantidade de células em suspensão. A duração e a temperatura do tratamento dependem não só dos tipos celulares, como também da própria substância empregada no preparo da solução hipotônica. O passo subsequente, o da fixação, requer cuidados, como várias lavagens para se assegurar a obtenção de preparações citológicas de boa qualidade, com eliminação de restos de citoplasma que, no caso das células em divisão, podem dificultar o espalhamento dos cromossomos. Existem várias circunstâncias em que a injeção da colchicina no animal vivo nem sempre é praticável, por se tratar, por exemplo, de um exemplar que requer uma quantidade relativamente grande do reagente, de embriões em desenvolvimento obtidos a partir de desovas conseguidas na natureza ou em laboratório, de formas jovens como é o caso dos girinos, e de aves, cujo sexo se quer determinar pela análise citogenética, com vistas à sua reprodução em cativeiro. Nesses casos, pode-se fazer o tratamento de colchicina in vitro, em que fragmentos de tecidos, órgãos e mesmo o organismo inteiro (caso dos embriões e girinos) são dissociados e incubados em solução salina ou em meio de cultura. As suspensões celulares são mantidas na estufa por tempos variáveis, antes da adição de colchicina, como se tratasse de uma cultura temporária de células. Os métodos e técnicas de obtenção de preparações cromossômicas diretas foram se aperfeiçoando ao longo do tempo com a finalidade de se obter um aumento do índice mitótico. Têm sido descritos na literatura e adotados por muito citogeneticistas alguns procedimentos que, de alguma forma, induzem divisões celulares, principalmente em tecidos e órgãos hematopoiéticos, como a medula óssea e o baço. Desse modo, é frequente nos protocolos técnicos uma etapa que consiste na injeção de solução de fermento biológico ou de fitohemaglutinina no animal vivo, antes do tratamento pela colchicina. Manter o animal em ambiente aquecido, principalmente em dias muito frios, tem sido também uma prática comum, além de outras menos usuais. Como se pode constatar, os chamados procedimentos diretos de obtenção de preparações cromossômicas são relativamente simples e demandam um período de tempo relativamente curto. Por isso, são muitas vezes realizados em laboratórios improvisados no campo, quando os citogeneticistas saem para coleta de seu material de estudo, sem possibilidade de retorno a curto prazo ao seu local de trabalho. Certos equipamentos, como a estufa, por exemplo, podem ser dispensados, pois a hipotonização pode ser realizada à temperatura ambiente, desde que se aumente o período de tratamento, e centrífugas manuais são boas substitutas para os trabalhos de campo.

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Algumas desvantagens ou limitações podem, no entanto, ser apontadas no emprego dos métodos diretos. Uma delas é o sacrifício do animal, o que é sempre desejável evitar. A repetição do procedimento em um exemplar em particular é inviabilizada, em caso de insucesso ou baixo índice mitótico, assim como existe uma dificuldade maior para aplicação dos chamados métodos dinâmicos de marcação cromossômica, que implicam em tratamentos no momento da duplicação do cromossomo, como é o caso da incorporação da 5-bromodeoxiuridina na molécula do DNA.

O cultivo de células O cultivo de células representa uma alternativa importante, muitas vezes obrigatória, para a obtenção de preparações cromossômicas. É o caso, por exemplo, quando o cariótipo precisa ser previamente determinado para fins de cruzamento em cativeiro ou para outras finalidades em que o animal não pode ser sacrificado. Embora a metodologia do cultivo de células represente a possibilidade de se manter vivo o animal, sendo ele de pequeno porte, o sacrifício não pode ser evitado na maioria das vezes, devido à dificuldade em se obter amostra de sangue para cultura de linfócitos ou biópsias de órgãos internos destinadas à cultura de fibroblastos. A cultura de linfócitos realizada a partir do sangue do animal vivo constitui uma metodologia relativamente simples e com grande possibilidade de sucesso, principalmente no grupo dos mamíferos e, em particular, para espécies de primatas. Os protocolos, mesmo aqueles destinados a outros vertebrados, seguem o procedimento que foi estabelecido para a espécie humana, com pequenas modificações. De modo sumarizado, o primeiro passo é a obtenção de uma amostra de sangue do animal, que pode ser colhido por punção venosa (Fig. 1.2) ou diretamente do coração, com auxílio de uma seringa contendo anticoagulante heparina, em condições de completa assepsia. O sangue assim obtido pode ser semeado imediatamente em meio de cultura ou se a quantidade for relativamente grande, isto é mais de 1mL, é deixado em repouso na própria seringa mantida em pé, com a agulha voltada para cima e coberta com o seu protetor plástico, até que ocorra a sedimentação das células sanguíneas por gravidade. Os eritrócitos se separam primeiro da parte líquida ou plasma, no qual os leucócitos ficam, de início, em suspensão. Após algum tempo, essas células tendem a se depositar sobre a camada de hemácias, formando o chamado anel leucocitário. A agulha é, então, curvada com auxílio de uma pinça e algumas gotas da mistura do plasma com leucócitos são inoculadas no frasco contendo meio de cultura.

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Figura 1.2 Obtenção de amostra de sangue de um animal híbrido de cateto e queixada por punção venosa. Figura de Guaracy Tadeu Rocha. (Rocha 1993).

O meio de cultura é uma mistura de vários componentes dissolvidos em meio aquoso, como aminoácidos, vitaminas e sais, e deve ser suplementada pela adição de soro bovino fetal, antibióticos para prevenir a contaminação bacteriana e, sobretudo, de um agente mitogênico, mais comumente representado pela fitohemaglutinina (PHA). Ainda que o meio de cultura possa ser preparado pelo pesquisador em seu laboratório, existem disponíveis comercialmente meios de cultura, prontos para serem usados após a devida suplementação. É importante enfatizar, porém, que a escolha do meio de cultura mais apropriado para o uso a que se destina, seja para cultivo de linfócitos, seja para cultivo de fibroblastos, nem sempre é uma tarefa simples, demandando a realização de testes experimentais. A fitohemaglutinina é obtida do feijão e seu uso ocorreu primariamente para promover a aglutinação das hemácias, separando-as dos leucócitos. Sua ação mitogênica foi descoberta por acaso, sendo obrigatória a sua presença no meio de cultura, pois promove a desdiferenciação dos linfócitos, que são as células da linhagem branca que se dividem in vitro. Os linfócitos, que se encontram normalmente diferenciados no sangue circulante, retornam à condição de linfoblastos e

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como tal são capazes de se multiplicar, uma a duas vezes, no período de 72 horas. Esse tem sido, então, o tempo médio indicado para a manutenção das culturas na estufa, quaisquer que sejam os vertebrados, embora períodos maiores possam ser eventualmente empregados. Temperaturas de incubação menores que 37oC, essa considerada ótima para os mamíferos, são indicadas para os vertebrados ectotérmicos. Na literatura, é possível encontrar informações bastante úteis sobre os meios de cultura, assim como os melhores tempos e temperaturas de incubação recomendados para cada grupo de vertebrados. Os passos seguintes para a obtenção das preparações cromossômicas consistem, como já enfatizado, no tratamento pela colchicina, cuja duração assim como a concentração da droga no meio de cultura podem ser variáveis, no tratamento hipotônico e na fixação das células. As culturas de linfócitos são chamadas também de culturas de curta duração, ao contrário daquelas que são obtidas a partir de biópsias de tecido sólido, que são consideradas de longa duração, pois o processo, desde o plantio dos explantes até o estabelecimento da chamada cultura primária e a disponibilidade de células para as primeiras preparações cromossômicas, leva um certo período de tempo, em geral, não menos de 10 dias. Em linhas gerais, a primeira etapa consiste na obtenção de uma amostra de tecido, que pode ser a partir de uma biópsia de pele, profunda o suficiente para abranger a região da derme. Para alguns vertebrados, pode-se fazer biópsias da orelha (roedores, por exemplo), asa (quirópteros, por exemplo) ou cauda (caso de alguns lagartos), mas não está descartada a obtenção de fragmentos de órgãos, como rim, fígado, baço e pulmão. A cultura de tecido sólido, também referida como cultura de fibroblastos, requer condições totais de assepsia, desde o momento da obtenção do material, que deve ser feita após a limpeza rigorosa da região do animal de onde será feita a biópsia. A amostra de tecido é colocada em frascos esterilizados, contendo solução salina de Hanks e antibiótico. Recomenda-se manter o material por cerca de 24 horas levemente resfriado na geladeira ou mesmo à temperatura ambiente para descartar uma possível contaminação antes da semeadura. Muitas vezes, as biópsias são realizadas no campo ou em locais muito distantes do laboratório do pesquisador, mas desde que adequadamente armazenadas e transportadas, podem ser destinadas sem problemas ao cultivo de células. Para iniciar a cultura, a amostra de tecido é desagregada por tratamento enzimático e a suspensão de células é colocada em um recipiente próprio para cultivo. Uma outra alternativa é cortar o tecido em pequenos fragmentos, distribui-los

Métodos de Obtenção de Cromossomos para Estudo de Cariótipo

pela superfície do frasco e, nesse caso, os explantes só são removidos quando os fibroblastos deles emergirem. Após alguns dias na estufa e controle diário das condições do meio de cultivo, os fibroblastos se multiplicam de modo a cobrir toda a superfície livre dos recipientes de cultura. Assim que se formar uma monocamada de células, a cultura está pronta para sofrer a primeira tripsinização, isto é, descolamento das células e replantio em novos recipientes, para que o número de amostras seja suficientemente grande, não só para as futuras preparações cromossômicas, como também para que haja células para armazenagem em nitrogênio líquido, em um Banco de Células. Para se guardar as células, amostras da suspensão são colocadas em frascos criogênicos e, em caso de necessidade, o cultivo celular pode ser retomado, mesmo muito tempo depois. O momento indicado para se obter preparações cromossômicas é cerca de 24 horas após o estabelecimento de subculturas, pois corresponde à primeira onda de divisões celulares que ocorrem, independentemente de qualquer outro tipo de estímulo. A colchicina é, então, inoculada na cultura e, em seguida, se processam os demais passos, isto é, a hipotonização e a fixação, necessários para a obtenção de preparações cromossômicas. A cultura de fibroblastos é, sem dúvida, um procedimento muito vantajoso quando se trabalha com citogenética de vertebrados, principalmente quando o acesso ao animal vivo é de alguma forma dificultado. Caso exista a necessidade de se repetir ou aplicar técnicas citogenéticas novas, ou mesmo outras metodologias, como o sequenciamento de DNA, é muito prático recorrer ao Banco de Células. Além disso, a cultura de fibroblasto, assim como a de linfócitos, possibilita a aplicação de certos tipos de tratamento diretamente nas células vivas, em condições mais controladas do que in vivo. É importante lembrar que para a realização de cultura de fibroblastos são necessárias instalações físicas adequadas, fluxo laminar para se ter ambiente asséptico, equipamentos como, por exemplo, o microscópio invertido para monitorar a multiplicação das células na superfície do frasco de cultura, nem sempre disponíveis nos laboratórios de citogenética. Além disso, quando se trabalha com animais da natureza, a padronização das técnicas de cultivo para aquele grupo zoológico em particular nem sempre é conseguida com facilidade, exigindo um investimento grande em testes para se conseguir uma boa multiplicação das células in vitro. Um outro ponto a ser lembrado, é que a duração relativamente longa do cultivo dos fibroblastos propicia o aparecimento e a fixação de linhagens celulares portadoras de algum tipo de rearranjo cromossômico, que pode induzir o citogeneticista a

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