XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU
vectorstock.com/15954469
Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection
DẠY KÈM QUY NHƠN MEDICINE PHÁT TRIỂN NỘI DUNG
XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ (Herba Centella asiatica) WORD VERSION | 2020 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y – DƯỢC ĐÀ NẴNG KHOA DƯỢC
XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ (Herba Centella asiatica)
GVHD : ThS.DS. Nguyễn Thị Thương Nhóm thực hiện: Tổ 1 - Lớp ĐH Dược 03B
Đà Nẵng, tháng 9 năm 2019.
1
Danh sách nhóm 1 – ĐH Dược 3B 1. Nguyễn Thị Phương Anh 2. Thái Thị Phương Ánh 3. Thái Thanh Bình 4. Trần Quốc Cường 5. Nguyễn Thị Diễm 6. Nguyễn Thị Thùy Dung 7. Đặng Hoàn Dũng 8. Nguyễn Ngọc Duy 9. Võ Thu Hà 10. Nguyễn Gia Hân 11. Nguyễn Thị Hằng 12. Phan Xuân Hiến 13. Lê Minh Hiền 14. Huỳnh Thị Ngọc Hoa 15. Lê Thị Hưng 16. Đặng Thị Hương 17. Đặng Thị Thùy Linh 18. Lê Anh Phương
2
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ .......................... 6 1.
Đặc điểm thực vật chi Centella .................................................................. 6
2.
Những nghiên cứu về cây Rau Má ............................................................ 7
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13 1.
Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 13
2.
Hóa chất - Thuốc thử - Dung môi - Phương tiện nghiên cứu................ 13
3.
Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 13 3.1.
Đặc điểm thực vật............................................................................... 13
3.2.
Thành phần hóa học .......................................................................... 15
3.3.
Định lượng .......................................................................................... 18
3.4.
Độ ẩm .................................................................................................. 19
3.5.
Độ tro ................................................................................................... 19
3.6.
Tạp chất .............................................................................................. 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 21 1.
Về mặt thực vật ......................................................................................... 21
2.
Về mặt vi phẫu .......................................................................................... 21
3.
Bột .............................................................................................................. 22
4.
Thành phần hóa học ................................................................................. 22 4.1.
Kết quả phân tích sơ bộ ..................................................................... 22
4.2.
Kết quả sắc ký lớp mỏng ................................................................... 22
5.
Định lượng ................................................................................................. 22
6.
Thử tinh khiết ............................................................................................ 23
CHƯƠNG 4: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU. ................................. 25 Tài liệu tham khảo: ................................................................................................ 27
3
ĐẶT VẤN ĐỀ Vai trò của cây thuốc đối với cuộc sống con người đã được chứng minh hàng ngàn năm qua. Từ xa xưa con người đã biết sử dụng các loài động thực vật làm các bài thuốc chữa bệnh. Ngày nay các bài thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng và chiếm được lòng tin người tiêu dùng. Nước ta có lợi thế về nguồn tài nguyên thiên nhiên, nguồn động thực vật làm thuốc vô cùng phong phú, đó là đề tài nghiên cứu luôn hấp dẫn các nhà khoa học trong và ngoài nước. Cây rau má là một trong những cây thuốc phổ biến, dễ trồng, rẻ tiền mà lại mang lại hiệu quả kinh tế cao. Rau má sinh trưởng tốt ở vùng khí hậu nhiệt đới. Người dân vẫn hay dùng rau má như một loại thực phẩm hằng ngày . Các hoạt chất sinh học trong rau má tập trung chủ yếu ở nhóm saponin triterpenoid, có tác dụng sát trùng, giải độc, thanh nhiệt, và tái tạo các mô liên kết giúp lên da non ở các vết thương nhanh chóng, tác dụng chống oxy hóa làm chậm quá trình lão hóa. Ngoài ra còn giúp tăng cường trí nhớ, cải thiện vi tuần hoàn và chữa một số bệnh ngoài da… Như vậy rau má có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm. Ngày nay khi ngành công nghiệp dược phẩm phát triển càng nhanh thì chất lượng của dược phẩm ngày càng được quan tâm hơn. Chất lượng dược liệu là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của các chế phẩm chiết xuất từ dược liệu. Chất lượng dược liệu có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: giống, điều kiện nuôi trồng, mùa thu hái, quy trình sơ chế và bảo quản….. Hiện nay các dược liệu kém chất lượng đang được mua bán tràn lan như: dược liệu giả, dược liệu bị chiết kiệt hoạt chất… các chế phẩm từ dược liệu chưa rõ nguồn gốc được người dân truyền tay nhau sử dụng. Điều này có thể gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người bệnh, đồng thời gây mất lòng tin của người dùng vào các chế phẩm từ dược liệu khi không nhận thấy
4
hiệu quả điều trị. Vì vậy xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho dược liệu là điều rất quan trọng để nâng cao hiệu quả điệu trị của các chế phẩm từ dược liệu. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng dược liệu cây rau má”. Đề tài được thực hiện với ba mục tiêu sau: - Quan sát vi học để đề xuất đặc điểm nhận diện dược liệu rau má. - Chiết xuất và phân tích sơ bộ thành phần hóa học, đối chiếu với kết quả đã công bố. - Tổng hợp tài liệu, đề xuất các chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu rau má.
5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CÂY RAU MÁ 1. Đặc điểm thực vật chi Centella 1.1.
Vị trí phân loại
Giới Thực vật (Plantae). Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta). Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida). Phân lớp Thù Du (Cornidae). Bộ Ngũ Gia Bì (Araliales). Họ Hoa Tán (Apiaceae). Chi Centella. Loài Centella asiatica Urb. [1]
1.2.
Đặc điểm thực vật họ hoa tán (Apiaceae) và chi Centella
Họ hoa tán là họ lớn trong hệ thực vật trái đất. Các cây trong họ hoa tán là cây thân thảo một hay nhiều năm. Thân thường có gióng và mấu. Lá mọc so le có bẹ lá, phiến lá chẻ thùy lông chim 1 hay nhiều lần, mọc cách, không có lá kèm, thường có mùi thơm. Hoa nhỏ, cụm hoa tán đơn hay tán kép. Hoa đều, lưỡng tính mẫu 5, đài 5, tràng 5, một số rụng sớm. Nhị 5 xếp xen kẽ với cánh hoa. Bộ nhụy 2 lá noãn dính ở mặt trong, 2 vòi tự do với đầu nhụy hơi phồng lên. Đỉnh bầu có đĩa mật loe. Quả bế thường có cánh dẹt do hai mảnh ghép lại, khi chín thì tách thành 2 quả bế dính nhau ở đỉnh. [1] Họ hoa tán với hơn 400 chi, 3800 loài. Việt Nam có khoảng 20 chi trên 30 loài, phần lớn được trồng để làm gia vị, hương liệu, lấy tinh dầu (Thìa là, Rau mùi, Cần Tây, Mùi tàu), làm thuốc. [1] Theo APG II, họ hoa tán chia làm bốn phân họ: phân họ Apioideae với khoảng 400 chi, 3200 loài; phân họ Azorelloideae với khoảng 21 chi, 155 loài; phân họ Mackinlayoideae với 10 chi, 98 loài; phân họ Saniculoideae với 10 chi, 355 loài. [6, 7] Chi Centella - Rau má thuộc phân họ Mackinlayoideae, gồm 20 loài. Đặc điểm thực vật: cây cỏ, mọc bò, lá mọc so le, phiến lá hình thận, gân chân vịt, cụm hoa tán đơn, gồm 1-5 hoa. Phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhất là ở Nam Phi và Ôxtrâylia. Ở nước ta có 1 loài là Centella asiatica. [1] 6
2. Những nghiên cứu về cây Rau Má 2.1.
Danh pháp
Tên khoa học: Centella asiatica Urb. Tên tiếng Việt: Rau má. Tên khác: Tinh tuyết thảo.
2.2.
Đặc điểm thực vật
Rau má là loại cỏ mọc bò, rễ mọc ở các mấu của thân. Lá hình mắt chim, rộng 2 cm đến 4 cm, khía tai bèo, gân lá hình chân vịt, gốc lá hình tim. Cuống lá dài 2 cm đến 4 cm ở những nhánh mang hoa và 8 cm đến 12 cm ở những nhánh thường. Cụm hoa tán đơn gồm các hoa rất nhỏ, mọc ở nách lá. Quả rủ mọc đôi, dẹt, tròn, rộng 3 mm đến 5 mm, có cạnh dọc nhô lên và vân lưới nhỏ rõ rệt, cuống quả rất ngắn. Dược liệu khô thường cuộn lại thành khối. Rễ dài 2 cm đến 4 cm, đường kính 1 mm đến 1,5 mm; mặt ngoài màu nâu vàng nhạt hoặc màu vàng xám. Thân dài nhỏ, cong queo, màu vàng nâu, có vân nhăn dọc, trên mấu thường thấy rễ. Phiến lá có nhiều vết nhăn rách, đường kính 1 cm đến 4 cm, màu lục xám, mép có răng thô. Cuống lá dài 3 cm đến 6 cm, cong queo. Mùi nhẹ, vị nhạt. [2, 3, 4].
Hình 1: Cây Rau má Centella asiatica Urb
7
2.3.
Phân bố và sinh thái
Cây mọc hoang ở ruộng vườn, bãi cỏ… ở các vùng nhiệt đới như: Việt Nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấn Độ, Pakistan… Ở nước ta, Rau má được trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt ở các tỉnh duyên hải miền Trung, nơi khí hậu có độ ẩm cao và có loại đất sét pha cát rất thích hợp cho loại cây này phát triển. [4]
2.4.
Bộ phận dùng
Phần trên mặt đất. [2,3,4]
2.5.
Thành phần hóa học
2.5.1. Nghiên cứu trong nước Phần trên mặt đất của Rau má có các saponin triterpen 5 vòng và các sapogenin của chúng, chủ yếu thuộc nhóm ursan. Một số ít thuộc nhóm olean và lupan. Ngoài ra, Rau má còn có các flavonoid, tinh dầu, và một số hợp chất khác với hàm lượng thấp. Saponin: Các hợp chất triterpenoid nhóm ursan được xem là hoạt chất chính trong Rau má. Cho đến nay, hơn 20 chất đã được phân lập với phân nửa trong số đó là các saponoid. Các saponin quan trọng trong Rau má là asiaticosid và madecassoid. Hàm lượng asiaticosid thay đổi nhiều phụ thuộc vào nơi mọc, có thể từ 1% đến 6,4%. Một số saponin có cấu trúc ursan khác với hàm lượng thấp như: methyl asiatat, methyl brahmat, brahmol, acid madasiatic, acid isothankunic, acid 2α-3β20,23-tetrahydroxy-urs
-28-oic,
acid
2α-3β-23-trihydroxy-urs-20-en-28-oic,
asiaticosid B-F, centellasaponin B và C, brahminosid, isothankunisid, arabinosid 3O-α-L. [ 3]
8
Các dẫn chất oleanan như acid terminolic, acid 2α-3β-23-trihydroxy-olean-12en-28-oic, acid 3β-6β-23-trihydroxyolean-12-en-28-oic, centellasapogenol A, asiaticosid B, centellasaponin A,D và dẫn chất lupan là acid betulinic acid cũng được phân lập từ Rau má. [3] Flavonoid: đã được xác định có trong cây Rau má ở cả dạng tự do hoặc gắn kết với các gốc đường qua nhóm chức hydroxyl như: quercetin-3-O-β-Dglucuronid, kaempferol, quercetin, kaempferol-3-O-β-D-glucoside, quercetin-3-O-βD-glucoside. [3] Tinh dầu: Một nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Rau má. Kết quả thành phần hóa học chính trong tinh dầu ra má được tìm thấy và so sánh với những nghiên cứu khác trên thế giới như sau: [5] STT
Hợp chất
Hàm lương % GC/MS Việt
Malaysia
Banglasesh
Nam
Sri
Himalaya
Lanka
1
Apiol
2
Biciclogermacren
3
Oxid cariphilen
3,64
1,9
2,51
4
β-cariophilen
4,56
26,8
20,3
5
α-Copaen
6
β-Elemen
7
Micren
8
β-Farnesen
Ấn
Nam
Độ
Phi
4,49 11,22
12
3,3
15,1
0,27
23,3
10,3
19,8
14 4,28
56,09
4,71
1,58
0,4
0,85
6,55
Vết
4,45
5
6,3
9
9
Germacren D
10
α-Humulen
10
6,02
33,7
23,9
9
5,4
4,6
6,29
23,1
11,3 21,06
Các nhóm hợp chất khác: Trong Rau má còn có các carbohydrat (như mesoinositol, một oligosaccharid là centellose và một pectin là S3A), một alcaloid chưa được xác định cấu trúc là hydrocotylin (C23H33O8N). Ngoài ra còn có các hợp chất polyacetylen (acetonxycentellymol), sterol, lipid, vitamin C, carotenoid. [3]
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nước Brinkhaus và cộng sự đã tóm tắt các công thức hóa học của cây rau má trước năm 2000 [8]. Shukla và cộng sự đã tách được triterpenoid khung ursane mới từ cây Rau má [9]. Sau đó, Matsuda và cộng sự đã phân lập được một olean-13-ene triterpenoid mới, centellasapogenol A, và oligoglycoside từ cây Rau má trồng ở Việt Nam. [10] Từ dịch chiết n-BuOH của cây Rau má, Jiang và cộng sự đã tách được 4 triterpenoid glycoside mới là asiaticoside C, D, E, F. [11] Từ cây rau má ở Sirilanka, nhóm tác giả người Nhật (Hisashi Matsuda Trường đại học Dược Kyoto-Nhật Bản) đã phân lập được 8 triterpene glycoside là: centellasaponin A, centellasaponin B, centellasaponin C, centellasaponin D, madecassoside, asiaticoside, asiaticoside B và sceffoleoside. [12] Wan-Joo-Kim và các cộng sự - Trường đại học Seoun, Hàn Quốc đã phân lập được 4 triterpenoid từ cây rau má của Indonesia là: madecassoside, asiaticoside, asiatic acid và madecassic acid, với hàm lượng khá cao. [13] Yu Q.L. và cộng sự đã phân lập được một hợp chất mới là acid 2α-3β20,23-tetrahydroxy-urs-28-oic.[14]. Năm 2007, nhóm này còn phân lập được docosyl
ferulat,
bayogenin, 3β,6β,23-trihydroxy-olean-12-en-28-oic acid ,
3β,6β,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid, D-gulonic acid. Đây là những chất lần đầu tiên được tìm thấy ở cây rau má. [15] Theo nghiên cứu của O. A. Oydefi và A. J. Afolayan năm 2005 thì hàm lượng tinh dầu trong rau má là xấp xỉ 0,1% tính theo khối lượng khô. Thành phần monoterpene chính gồm: α-pinene, β-pinene, micrene, γ- terpinene,
10
borneol, các sesquiterpene chính gồm: α-copaene, β- elemene, β-caryophyllene, trans-β-farnesene, germacrene và bicycloelemene. [16]
2.6.
Tác dụng dược lý
2.6.1. Hoạt tính kháng khuẩn Năm 2004, Mamtha và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn đường ruột của dịch chiết của Rau má với methanol ở nồng độ 100, 200, 300 và 400 mg/ml. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất của dịch chiết Rau má chống lại mầm mống của bệnh đường ruột ở nồng độ 400 mg/ml. Hoạt tính kháng khuẩn này được đánh giá tương tự như một loại thuốc điều trị bệnh tiêu chảy. [17] 2.6.2. Hoạt tính giảm đau và kháng viêm Nhóm nghiên cứu của Somchit đã nghiên cứu hoạt tính giảm đau của dịch chiết nước cây Rau má với chuột nhắt trắng (10, 30, 100 và 300 mg/kg trọng lượng trên hai mô hình gây đau với acetic acid và đĩa nóng. Đồng thời, hoạt tính kháng viêm được nghiên cứu trên chuột cống gây viêm bàn chân bằng prostaglandin E2. Kết quả cho thấy, hoạt tính giảm đau của dịch nước cây Rau má tương tự như aspirin, nhưng yếu hơn morphine. Đáng chú ý, hoạt tính kháng viêm của dịch nước tương tự như các thuốc kháng viêm không steroid và meferamic acid [18]. 2.6.3. Hoạt tính chống oxy hóa Năm 2000, Cheng và Koo đã nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Rau má trong việc phòng, chống tổn thương dạ dày ở chuột gây ra bởi tác nhân ethanol. Với liều dùng (0,05 g/kg, 0,25 g/kg và 0,50 g/kg) bằng cách cho uống, trước khi dùng ethanol. Kết quả cho thấy dịch chiết từ Rau má ngăn ethanol gây ra tổn thương niêm mạc dạ dày bằng cách tăng cường các hàng rào niêm mạc và giảm thiểu các tác hại của các gốc tự do.[19] 2.6.4. Tác dụng bảo vệ thần kinh Năm 2005, Subathra cùng với các cộng sự đã nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ Rau má đối với vùng não của những con chuột già, khi cho chúng uống với liều (300 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày) trong 60 ngày. Kết quả cho thấy dịch chiết Rau má đã làm giảm nồng độ chất per-oxy hóa lipid (LPO) và cacbonyl protein (PCO) trong vùng não của chuột. [20] 11
2.6.5. Hoạt tính chống xơ vữa động mạch Trong bằng độc quyền sáng chế đăng ký tại Hoa Kỳ US 2007/0010459A1, 11/01/2007, nhóm nghiên cứu đã sử dụng asiatic acid hoặc hỗn hợp asiatic acid /asiaticoside để điều trị bệnh xơ vữa động mạch và xơ vữa phổi trên động vật thực nghiệm là chó và chuột cống. Các kết quả là rất khả quan. [21]
2.7.
Công dụng
Y học hiện đại sử dụng Rau má và saponin toàn phần trong Rau má trong điều trị bỏng độ II và III, vết thương và các tổn thương ngoài da. Nó cũng được dùng đẻ ngăn ngừa sự sừng hóa tạo sự lồi. Dịch chiết được dùng ngoài để tăng cường sự lành vết thương hay hậu phẫu mãn. Sử dụng đường uống Rau má có tác dụng điều trị loét dạ dày tá tràng do stress. Các sản phẩm của Rau má còn được dùng trong bệnh tĩnh mạch mãn. Ngoài ra, Rau má được sử dụng trong điều trị các vết loét trong bệnh phong, eczema, các rối loạn tĩnh mạch. Rau má có tác dụng giảm viêm ứ ở bệnh nhân xơ gan. Trong y học cổ truyền, Rau má được sử dụng trong nhiều loại bệnh khác nhau. Nhân dân ta dùng Rau má để làm rau sống để ăn. Nước Rau má là loại nước giải khát phổ biến ở các tỉnh phía Nam. Kinh nghiệm nhân dân cho rằng Rau má có tác dụng giải nhiệt, giải độc, thông tiểu, dùng để chữa sốt, rôm sẩy, mẫn ngứa, các bệnh về gan, thổ huyết, đi lỏng, lỵ, viêm họng, viêm phế quản, viêm đường tiểu tiện. Trong đời sống, Rau má thường được dùng làm nước giải khát, chế biến các nước sâm mát cùng với các dược liệu khác nhau hay dùng làm rau xanh. Dược liệu được dùng tươi bằng cách xay với nước sôi để nguội, lọc lấy dịch, thêm đường để uống, ngày dùng 30-40g. [2]
12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu Dùng phần trên mặt đất của cây Rau má thu hái tại phường Điện Nam Trung, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam. Cây Rau má được cắt nhỏ phơi hoặc sấy khô, đóng gói và bảo quản để tiến hành thí nghiệm. 2. Hóa chất - Thuốc thử - Dung môi - Phương tiện nghiên cứu Thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt theo tiêu chuẩn DĐVN V. Phương tiện nghiên cứu: Kính hiển vi Leica, cân phân tích Ohaus PA213, tủ sấy, máy xay dược liệu, tủ hút, bếp cách thủy, đèn soi UV 2 bước sóng, lò nung. 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1.
Đặc điểm thực vật
Phân tích hình thái thực vật, vi phẫu. Nghiên cứu đặc điểm vi học dựa theo dược liệu. 3.1.1. Vi phẫu a. Chọn mẫu: Thường là mẫu tươi hoặc mẫu ngâm trong cồn 70 độ. Đối với mẫu vật là lá thì hình dạng lá phải còn nguyên vẹn, chọn những lá không già quá nhưng cũng không non quá (lá bánh tẻ). Đối với mẫu vật là cành, thân hoặc rễ cây thì nên chọn những đoạn tương đối thẳng, có đường kính từ 0,1 – 0,5cm. Các mẫu khô nên được luộc hay ngâm nước sôi trước khi cắt, thời gian ngâm hay luộc tùy thuộc vào mức độ rắn chắc của mẫu vật. b. Phương pháp cắt mẫu: Cắt trực tiếp. Mẫu được đặt lên một “thớt” (làm bằng vật liệu có độ cứng nhỏ hơn lưỡi dao cạo như gỗ hoặc khoai lang, v.v.), dùng lưỡi dao cạo cắt thành những lát mỏng. 13
Các lát cắt sau đó được ngâm ngay vào đĩa petri đã có sẵn nước cất. c. Tẩy và nhuộm mẫu: Tẩy:
Tẩy mẫu bằng dung dịch Cloramin B trong thời gian ít nhất là 30 phút. Rửa sạch Cloramin 3 lần bằng nước cất. Nếu mẫu chứa nhiều tinh bột có thể ngâm trong dung dịch cloran hydrat trong 30 phút, sau đó rửa sạch. Ngâm mẫu trong acid acetic trong 15 phút. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất. Nhuộm:
Nhuộm màu xanh bằng dung dịch xanh Methylen. Thời gian từ 5-30 giây. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất. Nhuộm màu đỏ bằng cách ngâm mẫu vào dung dịch đỏ Carmin khoảng 30 phút. Rửa sạch mẫu 3 lần bằng nước cất. Lên tiêu bản: Vi phẫu sau khi được nhuộm, được lên kính theo phương pháp giọt ép. Cách thực hiện như sau:
Nhỏ vào giữa phiến kính 1 giọt chất lỏng được dùng làm môi trường quan sát (nước, glycerin, vv.), dùng kim mũi mác hoặc bút lông đặt vi phẫu cần quan sát vào giọt chất lỏng. Đậy lá kính lại (chú ý không để lẫn bọt khí dưới lá kính). Có 2 cách đặt lá kính:
Cách 1: Đặt một cạnh lá kính tỳ vào bề mặt của phiến kính, bên cạnh giọt chất lỏng. Dùng kim mũi mác đỡ lấy cạnh đối diện rồi hạ từ từ xuống. Cách 2: Nhỏ 1 giọt chất lỏng (cùng loại với chất lỏng trên phiến kính) vào giữa lá kính. Lật ngược lá kính lại rồi hạ từ từ đây lên giọt chất lỏng trên phiến kính. Khi 2 giọt chất lỏng chạm nhau thì bỏ tay ra. Sau khi đậy lá kính, chất lỏng dưới lá kính phải vừa đủ để chiếm toàn bộ diện tích của lá kính, không thừa chảy ra ngoài và cũng không thiếu. Nếu thiếu, dùng một ống hút nhỏ thêm chất lỏng đã dùng để lên kính vào. Nếu thừa, dùng một mảnh giấy lọc để hút đi. Trong một số trường hợp cần phải thay đổi chất lỏng mà không 14
muốn bỏ lá kính ra thì làm như sau: ở một cạnh của lá kính, đặt một miếng giấy lọc để hút chất lỏng đang ở dưới lá kính. ở cạnh đối diện, dùng ống hút cho giọt chất lỏng mới vào thay thế . Khi cho chất lỏng mới vào thì đồng thời hút chất lỏng cũ ra. Chất lỏng mới sẽ thay thế cho chất lỏng cũ dưới lá kính. 3.1.2. Bột Sấy khô thân, lá cây rau má trong tủ sấy ở nhiệt độ 55-60oC. Sau đó dùng thuyền tán và cối chày sứ nghiền nhỏ. Ray lấy bột mịn, bột dược liệu được quan sát dưới kính hiển vi và được chụp ảnh các đặc điểm bột bằng máy ảnh chuyên dụng. 3.2.
Thành phần hóa học
3.2.1. Định tính các nhóm hoạt chất chính bằng phản ứng hóa học Đối với toàn cây, saponin là hoạt chất chính có trong rau má. Bên cạnh việc định tính saponin, ta cần định tính thêm một số thành phần khác có ảnh hưởng đến tác dụng điều trị như flavonoid, tanin trong dược liệu Rau má. Định tính Saponin Phản ứng tạo bọt Cho 0,5g dược liệu vào ống nghiệm, thêm vào 10ml cồn 70%, đun nhẹ trên bếp cách thủy trong 5 phút rồi lọc nóng qua bông. Lấy dung dịch này cho vào ống nghiệm 1,6 x 16 cm. Thêm nước cất và dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống nghiệm trong 1 phút, nếu ống nghiệm còn bọt trên bề mặt dung dịch chứng tỏ có saponin. Cách tiến hành: lấy 1g bột nguyên liệu thực vật, thêm 5ml cồn, đun sôi cách thủy 15 phút. Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N (pH=1) vào ống thứ hai 5ml NaOH 0,1N (pH=13). Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dung dịch cồn chiết rồi bịt ống nghiệm, lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây. Ðể yên, nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau thì sơ bộ xác định trong dược liệu có saponin triterpenoid. Nếu ống kiềm có cột bọt cao hơn ống kia thì sơ bộ xác định là saponin steroid. 15
Phản ứng Liebermann-Burchardt Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 70% và đun cách thủy trong 5 phút. Lọc qua bông vào một chén sứ, cô trên bếp cách thủy đến cắn thật khô. Để nguội. Cho vào cắn 1ml anhydrid acetic, và 1ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan. Lọc bằng pipet Pasteur bịt bông, cho dịch lọc vào một ống nghiệm khô. Để ống nghiệm nguyên trên giá, dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 1ml H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi mặt ngăn cách giữa 2 lớp có màu từ nâu đỏ tới đỏ tím hay tím; lớp dung dịch phía trên có thể có màu xanh lá, xanh rêu hay nâu đỏ,… Định tính Flavonoid Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 10% (TT): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết + 2-3 giọt thuốc thử (TT), lắc đều. Quan sát màu, tủa và so sánh 2 ống. Phản ứng dương tính nếu ống thử đậm màu hơn. Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 (TT): Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết + 2-3 giọt thuốc thử (TT), lắc đều. Quan sát màu, tủa và so sánh 2 ống. Phản ứng dương tính nếu ống thử tạo phức màu. Phản ứng cyanidin: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết + một ít bột Mg + 2-3 giọt HCl đậm đặc. Quan sát màu, tủa. Ống có dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi. Để phân biệt glycoside với aglycon thì lắc với octanol, nếu lớp octanol lên màu thì là aglycon, không màu là glycoside. Định tính tanin Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón 50ml, thêm 30ml nước sôi, đun trên bế cách thủy sôi 10 phút, lắc đều khi đun. Lọc nóng lấy dịch lọc trong. Chiết tiếp bã dược liệu lần 2 với 10ml nước, nếu cần. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng định tính tannin.
16
Kết tủa với gelatin. Dung dịch tanin (0,5-1%) khi thêm vào dung dịch gelatin 1% có chứa 10% natrichlorid. Phản ứng dương tính nếu có xuất hiện tủa. Phản ứng Stiasny. Để phân biệt 2 loại tanin người ta dựa vào phản ứng Stiasny: Lấy 50ml dung dịch tanin, thêm 10ml formol và 5ml HCl, đun nóng. Tanin pyrogallic không tủa còn tanin pyrocatechic thì cho tủa. Nếu trong dung dịch có cả 2 loại tanin thì cho dư thuốc thử (formol + HCl), đun nóng rồi đem lọc để loại tủa tanin pyrocatechic, sau đó thêm vào dịch lọc natri acetat dư rồi thêm muối sắt, nếu có mặt tanin pyrogallic sẽ có tủa màu xanh đen. 3.2.2. Định tính các nhóm hoạt chất chính bằng SKLM Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Saponin Bản mỏng: Silica gel GF254. Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau: Hệ 1: Cloroform – methanol – nước (7 : 3 : 0,5) Hệ 2: Cloroform-metanol (8: 2) Hệ 3: Chloroform – acetic acid băng – methanol – nước (6:2:1:1) Hệ 4: Chloroform – acetic acid băng – methanol – nước (60:32:12:8) Hệ 5: Ethyl acetat – acid acetic – nước (8 : 2 : 1) Dung dịch thử: Lấy 1,0 g bột dược liệu qua cỡ rây số 250, thêm 25 ml ethanol 96% (TT), đun hồi lưu 30 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc đến khô. Hoà tan cắn trong 20 ml nước, chiết hai lần với n-butanol bão hoà nước (TT), mỗi lần 15 ml. Gộp các dịch chiết n-butanol, rửa bằng 15 ml nước bão hoà nbutanol (TT), bỏ lớp nước lấy lớp n-butanol bốc hơi đến khô. Hoà tan cắn trong 1 ml methanol (TT) dùng làm dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 10 μl dung dịch thử. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng, phun 17
lên bản mỏng dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT). Sấy bản mỏng ở 105oC đến khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường, soi UV ở bước sóng 254nm và 366nm. Ghi nhận lại sắc ký đồ. Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Flavonoid Bản mỏng: Silica gel GF254. Hệ dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau: Hệ 1: Chloroform: ethanol (9:1) Hệ 2: Chloroform: Methanol (18:2) Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón nút mài, thêm 5 ml methanol 80 % (TT), đậy kín, lắc đều trong 15 min, lọc. Dịch lọc được dùng làm dung dịch thử. Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 μl dung dịch thử. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng thường, soi UV ở bước sóng 254nm và 366nm. Ghi nhận lại sắc ký đồ. 3.3.
Định lượng
Định lượng chất chiết được trong rau má bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 12.10 – DĐVN V) Cân chính xác khoảng 2,000g đến 4,000g bột dược liệu (mbột)có cỡ bột nửa thô cho vào bình nón 100 ml hoặc 250 ml. Thêm chính xác 50,0 ml hoặc 100,0 ml ethanol 50%, đậy kín, cân xác định khối lượng, để yên 1h, sau đó đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1h, đề nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, dùng ethanol 50% để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước (mbì) cô trong cách thủy đến cắn khô, cắn thu được sấy ở 105°c trong 3h, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cân (mbì+cắn). Tính phần trăm lượng
18
chẼt chiáşżt đưᝣc báşąng ethanol 50% theo dưᝣc liᝇu khĂ´ (tháťąc hiᝇn 3 mẍu Ä‘áťƒ lẼy giĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh). CĂ´ng thᝊc tĂnh hĂ m lưᝣng chẼt chiáşżt đưᝣc: đ?‘Ž
M% =đ?‘?−đ?‘?∗đ??´ đ?‘‹ 100 Trong Ä‘Ăł: M%: HĂ m lưᝣng chẼt chiáşżt đưᝣc A: Ä?áť™ Ẋm nguyĂŞn liᝇu a: Kháť‘i lưᝣng chẼt chiáşżt đưᝣc (g) b: Kháť‘i lưᝣng nguyĂŞn liᝇu ban đầu (g) Ä?ĂĄnh giĂĄ: KhĂ´ng Ăt hĆĄn 25,0 % tĂnh theo dưᝣc liᝇu khĂ´ kiᝇt. 3.4.
Ä?áť™ Ẋm (Ph᝼ l᝼c 9.6 – DDVN V).
Dưᝣc liᝇu lĂ rau mĂĄ đưᝣc lĂ m thĂ nh mảnh nháť? Ä‘Ć°áť?ng kĂnh khĂ´ng quĂĄ 3 mm; lưᝣng Ä‘em tháť 1g; chiáť u dĂ y láť›p mẍu tháť Ä‘em sẼy lĂ 5 mm vĂ khĂ´ng quĂĄ 10 mm Ä‘áť‘i váť›i dưᝣc liᝇu cĂł cẼu tấo xáť‘p. Nhiᝇt Ä‘áť™ lĂ 85 oC vĂ tháť?i gian sẼy lĂ 4h. Ä?ưᝣc tĂnh theo cĂ´ng thᝊc:
Trong đó: p: Sᝑ gam cᝧa mẍu thᝠtrư᝛c khi sẼy a: Sᝑ gam cᝧa mẍu thᝠsau khi sẼy 3.5.
Ä?áť™ tro
3.5.1. Tro khĂ´ng tan trong acid (Ph᝼ l᝼c 9.7 – DDVN V) Náşżu khĂ´ng cĂł hĆ°áť›ng dẍn khĂĄc trong chuyĂŞn luáşn thĂŹ dĂšng phĆ°ĆĄng phĂĄp1. PhĆ°ĆĄng phĂĄp 1: Cho 25 ml dung dáť‹ch acid hydrocloric 2M (TT) vĂ o tro toĂ n phần, Ä‘un sĂ´i 5 min, láť?c Ä‘áťƒ táşp trung nhᝯng chẼt khĂ´ng tan vĂ o máť™t pháť…u thᝧy tinh xáť‘p Ä‘ĂŁ cân bĂŹ, hoạc vĂ o máť™t giẼy láť?c khĂ´ng tro, ráťa báşąng nĆ°áť›c nĂłng
19
ráť“i Ä‘em nung áť&#x; 500°C Ä‘áşżn kháť‘i lưᝣng khĂ´ng Ä‘áť•i. TĂnh tᝡ lᝇ phần trăm cᝧa tro khĂ´ng tan trong acid so váť›i dưᝣc liᝇu Ä‘ĂŁ lĂ m khĂ´ trong khĂ´ng khĂ. 3.5.2. Tro toĂ n phần (Ph᝼ l᝼c 9.8 – DDVN V) Náşżu khĂ´ng cĂł hĆ°áť›ng dẍn khĂĄc trong chuyĂŞn luáşn thĂŹ ĂĄp d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp 1. PhĆ°ĆĄng phĂĄp 1: Cho 2g Ä‘áşżn 3g báť™t mẍu tháť vĂ o máť™t chĂŠn sᝊ hoạc chĂŠn platin Ä‘ĂŁ nung vĂ cân bĂŹ. Nung áť&#x; nhiᝇt Ä‘áť™ khĂ´ng quĂĄ 4500C Ä‘áşżn khi khĂ´ng còn carbon, lĂ m nguáť™i ráť“i cân. Báşąng cĂĄch nĂ y mĂ tro chĆ°a loấi đưᝣc háşżt carbon thĂŹ dĂšng máť™t Ăt nĆ°áť›c Ẽm cho vĂ o kháť‘i chẼt Ä‘ĂŁ than hĂła, dĂšng Ä‘ĹŠa thᝧy tinh khuẼy Ä‘áť u, láť?c qua giẼy láť?c khĂ´ng tro. Ráťa Ä‘ĹŠa thᝧy tinh vĂ giẼy láť?c, táşp trung nĆ°áť›c ráťa vĂ o dáť‹ch láť?c. Cho giẼy láť?c vĂ cắn vĂ o chĂŠn nung ráť“i nung Ä‘áşżn khi thu đưᝣc tro mĂ u trắng hoạc gần nhĆ° trắng. Táşp trung dáť‹ch láť?c vĂ o cắn trong chĂŠn nung, Ä‘em báť‘c hĆĄi Ä‘áşżn khĂ´ ráť“i nung áť&#x; nhiᝇt Ä‘áť™ khĂ´ng quĂĄ 4500C Ä‘áşżn khi kháť‘i lưᝣng khĂ´ng Ä‘áť•i. TĂnh tᝡ lᝇ phần trăm cᝧa tro toĂ n phần theo dưᝣc liᝇu Ä‘ĂŁ lĂ m khĂ´ trong khĂ´ng khĂ. 3.6.
Tấp chẼt (Ph᝼ l᝼c 12.11 – DDVN V)
Cân máť™t lưᝣng mẍu vᝍa đᝧ (50g), dĂ n máť?ng trĂŞn táť? giẼy, quan sĂĄt báşąng mắt thĆ°áť?ng hoạc kĂnh lĂşp, khi cần cĂł tháťƒ dĂšng rây Ä‘áťƒ phân tĂĄch tấp chẼt vĂ dưᝣc liᝇu. Cân phần tấp chẼt vĂ tĂnh phần trăm nhĆ° sau: đ?‘Ž
X% = x100 đ?‘?
Trong Ä‘Ăł: a: lĂ kháť‘i lưᝣng tấp chẼt tĂnh báşłng gam. p: lĂ kháť‘i lưᝣng mẍu tháť tĂnh báşąng gam.
20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Về mặt thực vật 2. Về mặt vi phẫu Thân: Biểu bì gồm 2-3 hàng rào tế bào hình chữ nhật. Mô dày ở những chỗ lồi của thân. Ống tiết ở sát biểu bì, đường kính 23-24 um gồm có 5-7 tế bào tiết. Mô mềm ruột. Các bó libe gỗ chồng kép, xếp theo vòng tròn liên tục, mỗi bó gồm: 1 đám mô cứng, libe và gỗ. Tầng sinh libe gỗ gồm 1 lớp tế bào xếp đều đặn giữa libe và gỗ. Mô mềm ruột. Lá: • Gân giữa: biểu bì trên ngay gân giữa tế bào hình chữ nhật nhỏ, bên cạnh là những tế bào kích thước lớn hơn; biểu bì dưới tế bào hình chữ nhật, kích thước không đều. • Mô dày: gồm 3-4 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Mô mềm khuyết gồm 2-5 lớp tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn, kích thước không đều. Túi tiết ly bào trong mô mềm. Bó dẫn xếp thành hình cung, libe ở dưới gỗ ở trên. Mạch gỗ kích thước không đều, hình tròn hoặc gần tròn; mô mềm gỗ hình đa giác, vách cellulose. Libe gồm nhiều lớp tế bào kích thước nhỏ, sắp xếp lộn xộn. • Phiến lá: Biểu bì trên và dưới có hình chữ nhật, tế bào biểu bì trên lớn gấp đôi tế bào biểu bì dưới. Mô mềm giậu 2 lớp tế bào đi hơi sâu và phần gân giữa. Mô mềm khuyết gồm 5-6 lớp tế bào thuôn dài, vách uốn lượn. Lỗ khí ở 2 mặt biểu bì, nhiều ở biểu bì dưới. Tinh thể calci oxalate cầu gai kích thước lớn. • Cuốn lá: Tiết diện gần tròn hơi khuyết ở mặt trên. Biểu bì tế bào hình chữ nhật, rải rác có lỗ khí. Mô dày góc gồm 1-3 lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều. Mô mềm khuyết gồm 6-9 lớp tế bào hình tròn hoặc đa giác gần tròn, kích thước lớn, có nhiều túi tiết ly bào, hoặc lục lạp, tinh thể calci oxalate hình cầu gai, thỉnh thoảng có tinh thể hình khối. Trụ bì 2-3 lớp
21
tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô cứng thành cụm trên libe. Libe gỗ xếp thành 7 bó lớn và 2-3 bó nhỏ. Mô mềm tủy bị tiêu hủy còn 2-3 lớp. 3. Bột Bột màu xám. Mảnh mô mềm thân và là tế bào có hình đa giác gần tròn, vách mỏng. Mảnh biểu bì tế bào gần đa giác, lỗ khí kiểu dị bào. Sợi khoang rộng. Tế bào mô cứng hình đa giác thuôn dài hoặc 1 đầu nhọn. Tinh thể calci oxalate kích thước lớn. Mảnh mạch xoắn, mạch vạch. 4. Thành phần hóa học 4.1. Nhóm
Kết quả phân tích sơ bộ Phản ứng định tính
Kết quả sơ bộ
chất Saponin
Kết quả - Phản ứng tạo bọt
+/-
Kết luận Có/Không
- Phản ứng LierbermannBurchard Flavonoid - Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 10% - Phản ứng tạo phức với dung dịch FeCl3 - Phản ứng cyanidin - Kết tủa với gelatin.
Tanin
- Phản ứng Stiasny. Ghi chú: (-) Không có, (+) Rất ít, (++) Có, (+++) Rất nhiều. 4.2.
Kết quả sắc ký lớp mỏng
Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Saponin Hệ dung môi khai triển tốt nhất. Định tính SKLM hoạt chất thuộc nhóm Flavonoid Hệ dung môi khai triển tốt nhất. 5. Định lượng 22
Lần Lần
Lần Trung bình
1
3
2
mbì mbột mbì+cắn mchất chiết được = mbì+cắn – mbì M%= mchất chiết được *100%/(mbột-mbột*A)
6. Thử tinh khiết Lần 1
Lần 2
Lần 3
Trung bình
Độ
P trước khi
ẩm
sấy (g) a sau khi sấy (g) P (g) – a (g) Độ ẩm (%)
Tạp
a tạp chất (g)
chất
p mấu thử (g) Tạp chất ( %)
Xác
Tỉ
định
trăm của tro
tro
toàn
toàn
(%)
lệ
phần phần
phần 23
Tro
Tỉ
lệ
phần
không trăm của tro tan
không
trong trong acid
tan acid
(%)
24
CHƯƠNG 4: XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU. Từ kết quả nghiên cứu và tổng hợp tài liệu, chúng tôi đề xuất tiêu chuẩn dược liệu Rau má () như sau: RAU MÁ Bộ phận dùng Mô tả Vi phẫu Định tính A. Định tính bằng phản ứng hóa học B. Định tính bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng Định lượng Độ ẩm Tro không tan trong acid Tro toàn phần Tạp chất Chế biến, bảo quản Rau má mua về rửa sạch, loại bỏ các lá hư, tạp chất. Cắt thành từng đoạn nhỏ, để ráo nước. Để nơi khô ráo, thoáng mát, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp. Tính vị quy kinh Tính vị: Vị khổ,tân. Tính Hàn. Quy Kinh: Can, Tỳ, Thận. Công năng chủ trị Thanh nhiệt trừ thấp, giải độc, tiêu sưng. Chủ trị: Hoàng đản thấp nhiệt, tiêu chảy, thổ huyết, chảy máu cam. nhọt độc sưng. Tiểu tiện rắt buốt. Cách dùng, liều dùng Ngày dùng từ 30g đến 40g Rau má tươi, vò nát, lấy nước hoặc sắc uống. Đối với dược liệu khô, ngày dùng từ 15g đến 30g dưới dạng thuốc sắc. 25
Dùng ngoài: Dùng dược liệu tươi, giã nát, đắp chữa vết thương do ngã, gây xương, bong gân và làm tan ung nhọt, lượng thích hợp.
26
Tài liệu tham khảo: I. Tiếng việt 1. Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn, 2007, Giáo trình Thực vật học, NXB Y học, trang 293-296 2. Bộ Y tế, 2018, Dược Điển Việt Nam V, NXB Y học. 3. Nguyễn Vân Thu, Trần Hùng, 2011, Dược liệu học tập 1, NXB Y học, trang 237 – 240. 4. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2006, NXB Y học, trang 631 - 632. 5. Tạp chí Dược học số 428, 2011, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Rau má, trang 27 – 30. II. Tiếng anh 6. Nicolas A. N & Plunkett G. M, 2014, Diversification times and biogeographic patterns in Apiales, page 30-58. 7. Calvino C. I. Teruel F. E & Downie S. R, 2016, The role of the Southern Hemisphere in the evolutionary history of Apiaceae, a mostly north temperate plant family. J. Biogeog. page 398-409. 8. B. Brinkhaus, M. Lindner, D. Schuppan, 2000, Chemical pharmacological and clinical profile of the East Asian medical plant Centella asiatica, page 427-448. 9. Y. N. Shukla, R. Srivastava, A. K. Tripathi, et al, 2000, Characterization of an ursane triterpenoid from Centella asiatica with growth inhibitory activity against Spilarctia bliqua, page 262-267. 10. H. Matsuda, T. Morikawa, H. Ueda, et al, 2001, Saponin constituents of gotu kola(2): structures of new ursane and oleanane type triterpene oligoglycosides, centellasaponins B, C and D from Centella asiatica cultivated in Sri Lanka, Medicinal foodstuffs, XXVII, Chem. Pharm. Bull. ( Tokyo), page 1368-1371.
27
11. Z. Y. Jiang, X. M. Zhang, J. Zhou, 2005, New triterpenoid glycosides from Centella asiatica, Helv Chim Acta, page 297-303. 12. Y. N. Shukla, R. Srivastava, A. K. Tripathi, et al, 2000, Characterization of an ursane triterpenoid from Centella asiatica with growth inhibitory activity against Spilarctia bliqua, Pharm. Biol, page 262-267. 13. W. J. Kim, Jaehoonkim, B. Veriansyah, J. Kim, 2009, Extraction of bioactive components from Centella asiatica using subcritical water, J. of supercritical Fluids, page 211-216. 14. Q. L. Yu, H. Q. Duan, Y. Takaishi, W. Y Gao, 2006, A novel triterpene from Centella asiatica, Molecules. 15. Q. L. Yu, W. Y. Gao, Y. W. Zhang, J. Teng, H. Q. Duan, 2007, Studies on chemical constituents in herb of Centella asiatica, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 16. O. A. Oydefi, A. J. Afolayan, 2005, Chemical composition and Antibacterial activity of the Essential oil of Centella asiatica Growing in South Africa, Pharmaceutical Biology, Vol.43, page 249-252. 17. B. Mamtha, K. Kavitha, K. K. Srinivasan, P. G. Shivananda, 2004, An in vitro study of the effect of Centella asiatica [Indian pennywort] on enteric pathogens, Research Letter, Indian J Pharmacol , Vol 36, Issue 1, page 4144. 18. M. N. Somchit et al, 2004, Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Centella asiatica, Indian J. Pharmacology, page 377-380. 19. X. X. Weng, Y. Shao, Y. Y. Chen, W. Gao, L. Cheng, D. Y. Kong, 2011, Two new dammarane monodesmosides from Centella asiatica, J Asian Nat Prod Res. 20. M. Subathra, S. Shila, M. A. Devi, C. Panneerselvam, 2 0 0 5 , Emerging role of Centella asiatica in improving age-related neurological antioxidant status, Experimental Gerontology , page 707–715
28
21. Garo et al, 2007, Asiatic acid and Corosolic acid Enhance the Susceptibility of Pseudomonas aeruginosa Biofilm to Tobramycin, Antimicrobial Agents and chemotherapy, page 1813-1817. 22. Dewi Sondari, Sri Budi Harmami, M. Ghozali, Ahmad Randy, Athanasia Amanda S., Yan Irawan (2011), Determination of The Active Asiaticoside Content in Centella asiatica as Anti-Cellulite Agent, Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, ISSN: 2088–0197, 222 – 227. 23. Jacinda James, Ian Dubery (2011), Identification and Quantification of Triterpenoid Centelloids in Centella asiatica (L.) Urban by Densitometric TLC, Journal of Planar Chromatography - Modern TLC, 24(1), 82-87. 24. Mariappan Senthilkumar (2018), Preliminary phytochemical screening of bioactive compounds from leaves of Centella asiatica L. Urban, International Journal of Biology Research, ISSN: 2455-6548, 57-65. 25. N.A. Zainol, S.C. Voo, M.R. Sarmidi, R.A. Aziz (2008), Profiling of centella asiatica (l.) Urban extract, The Malaysian Journal of Analytical Sciences, Vol 12, No 2, 322 -327. 26. Sanjay R. Biradar, Bhagyashri D. Rachetti (2013), Extraction of Some Secondary Metabolites &Thin Layer Chromatography from Different Parts of Centella Asiatica L. (URB), American Journal of Life Sciences, Vol. 1, No. 6, 243-247.
29