KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM

vectorstock.com/20938731

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 

NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 

NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất Mã số

: 60 72 04 10

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. PHAN THANH DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Kết quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn là trung thực và không trùng với bất kì công trình khác.

Tác giả

Nguyễn Thị Như Ngọc

Luận văn Thạc sỹ dược học – Khóa 2015-2017 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất - Mã số: 60 72 04 10 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ ĐỂ KIỂM NGHIỆM PARACETAMOL, LORATADIN, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT Học viên: Nguyễn Thị Như Ngọc Giáo viên hướng dẫn: TS. Phan Thanh Dũng Mở đầu Công ty TNHH Hasan – Dermapharm đang nghiên cứu bào chế viên sủi bọt Parahasan Multi Symptoms gồm phenylephrin bitartrat (PHE), paracetamol (PAR), dextromethorphan hydrobromid (DEX), loratadin (LOR) nhưng chưa xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thành phẩm. Do đó, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng các chỉ tiêu để góp phần xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho thành phẩm này. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu Đối tượng Viên sủi bọt Parahasan Multi Symptoms của công ty TNHH Hasan – Dermapharm chứa PHE 11,7 mg, PAR 500 mg, DEX 15 mg, LOR 5 mg.

Phương pháp nghiên cứu Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời PHE, PAR, DEX, LOR trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Áp dụng quy trình này để xây dựng phương pháp thử cho chỉ tiêu độ đồng đều hàm lượng đối với PHE, DEX, LOR; áp dụng để định tính các hoạt chất dựa vào thời gian lưu và phổ UV-Vis tại thời gian lưu. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt. Các chỉ tiêu: hình thức, độ đồng đều khối lượng, độ rã thử theo quy định chung của DĐVN IV. Kết quả Đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời PHE, PAR, DEX, LOR trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Đã xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt.

Kết luận Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt Parahasan Multi Symptoms gồm các chỉ tiêu: hình thức, độ đồng đều khối lượng; độ rã; định tính; giới hạn tạp 4aminophenol; định lượng; độ đồng đều hàm lượng của PHE, DEX, LOR.

Master’s thesis – Academic course: 2015 – 2017 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 60 72 04 10 ESTABLISHING IN-HOUSE SPECIFICATIONS FOR TESTING PARACETAMOL, LORATADINE, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMIDE, PHENYLEPHRINE BITARTRATE IN EFFERVESCENT TABLET Nguyen Thi Nhu Ngoc Supervisor: Ph.D Phan Thanh Dung Introduction Hasan - Dermapharm Co., Ltd. is researching Parahasan Multi Symptoms effervescent tablet, including phenylephrine bitartrate (PHE), paracetamol (PAR), dextromethorphan hydrobromide (DEX), loratadine (LOR) but has not established in-house specifications for this finished product. Therefore, this study was conducted to establish in-house specifications for it.

Materials and methods Materials Parahasan Multi Symptoms effervescent tablet of Hasan - Dermapharm Co., Ltd. contains PHE 11.7 mg, PAR 500 mg, DEX 15 mg, LOR 5 mg.

Methods Simultaneous determination of PHE, PAR, DEX, LOR in effervescent tablet by a validated RP-HPLC method with PDA detector. Then this process will be applied for uniformity dosage units of PHE, DEX, LOR and for identification of active ingredients based on their retention time and the UV-Vis spectra at their retention time. Determination of impurity 4-aminophenol of paracetamol in effervescent tablets by a validated RP-HPLC method with PDA detector. Form, test for uniformity of weight and test for disintergration will be conducted by test methods in general regulations of the Vietnamese Pharmacopeia (4th Edition).

Result The process was built and validated for simultaneous determination of PHE, PAR, DEX, LOR in effervescent tablet by RP-HPLC method with PDA detector. The process for determination of 4-aminophenol in effervescent tablet was developed and validated.

Conclusion The in-house specifications for Parahasan Multi Symptoms effervescent tablet have been established, including: form, uniformity of weight, test for disintergration, identification, limit of impurity 4-aminophenol, assay, uniformity dosage units of PHE, DEX, LOR.

i

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1. Paracetamol ................................................................................................ 3 1.2. Dextromethorphan hydrobromid ................................................................ 7 1.3. Loratadin ................................................................................................... 10 1.4. Phenylephrin bitartrat ............................................................................... 12 1.5. Tạp 4-aminophenol ................................................................................... 14 1.6. Một số quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan HBr, loratadin, phenylephrin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao . 18 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu – hóa chất – trang thiết bị ..................................... 21 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ..................................................... 22 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 38 3.1. Định tính paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat ...................................................................................... 38 3.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA ............................................ 40 3.3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt ........................................................................ 67 3.4. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt chứa paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat ................. 74 CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN ................................................................................... 84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt

Chữ nguyên

Nghĩa tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

ASEAN

Association of Southeast Asian Nations

Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á

BP

The British Pharmacopoeia

DĐVN DEX

Dược điển Anh Dược điển Việt Nam

Dextromethorphan hydrobromide

Dextromethorphan hydrobromid

EP

The European Pharmacopoeia

Dược điển châu Âu

HPLC

High-performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LD50

Lethal Dose 50%

Liều gây chết 50% vật thí nghiệm

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

LOR

Loratadine

Loratadin

MeOH

Methanol

Methanol

PAR

Paracetamol

Paracetamol

PDA

Photodiode Array Detector

Đầu dò dãy diod quang

PHE

Phenylephrine bitartrate

Phenylephrin bitartrat

RP

Reversed-phase

Pha đảo

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối Diện tích pic

S SD

Standard Deviation

TCNSX

Độ lệch chuẩn Tiêu chuẩn nhà sản xuất

TEA

Triethylamine

Triethylamin

TFA

Trifloroacetic acid

Acid trifloroacetic

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

USP

United States Pharmacopeia

Dược điển Mỹ

UV-Vis

Ultra Violet - Visible

Tử ngoại – khả kiến

iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo paracetamol ................................................................. 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo dextromethorphan hydrobromid .................................. 7 Hình 1.3. Công thức cấu tạo loratadin ..................................................................... 10 Hình 1.4. Công thức cấu tạo phenylephrin bitartrat ................................................ 12 Hình 1.5. Công thức cấu tạo 4-aminophenol ........................................................... 14 Hình 1.6. Cơ chế paracetamol tạo ra tạp 4-aminophenol trong HCl 0,1 N/24 giờ . 14 Hình 1.7. Cơ chế paracetamol tạo ra 4-aminophenol trong NaOH 0,1 N/24 giờ…. 15 Hình 1.8. Ký hiệu GHS 07 và GSH 08 theo hệ thống GHS .................................... 15 Hình 3.1. Tính đặc hiệu quy trình định tính Br- ...................................................... 39 Hình 3.2. Tính đặc hiệu quy trình định tính bitartrat .............................................. 39 Hình 3.3. Biểu đồ hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu … .......... 41 Hình 3.4. Lựa chọn bước sóng phát hiện ................................................................. 42 Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát ............... 43 Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát (tiếp) ...... 44 Hình 3.7. Sắc ký đồ với pha động ACN - TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0/pH 2,/ pH 2,1 bằng TFA ........................................................................................................... 45 Hình 3.8. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch TFA pH 2,1 ......................... 46 Hình 3.9. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch acid phosphoric pH 2,1 ....... 46 Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký ................................................. 48 Hình 3.11. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu ........................................................ 50 Hình 3.12. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu (tiếp) ............................................... 51 Hình 3.13. Phổ UV-Vis các pic tại thời gian lưu trong mẫu chuẩn và mẫu thử. ..... 52 Hình 3.14. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt .................................... 52 Hình 3.15. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp)............................ 53 Hình 3.16. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp)............................ 54 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ........... 58 Hình 3.18. Sắc ký đồ các chương trình gradient khảo sát ....................................... 67 Hình 3.19. Sắc ký đồ tính đặc hiệu tạp 4-aminophenol .......................................... 69 Hình 3.20. Đồ thị tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic 4-aminophenol ........... 72

iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ Trang Bảng 1.1. Chương trình gradient định lượng paracetamol bằng HPLC của USP38...5 Bảng 1.2. Chương trình gradient định lượng phenylephrin bitartrat của USP 38 ... .13 Bảng 1.3. Chương trình gradient định lượng 4-aminophenol theo USP 38 ............ 16 Bảng 1.4. Giới hạn tạp 4-aminophenol cho phép ở các dược điển .......................... 17 Bảng 1.5. Các công trình nghiên cứu trong nước ..................................................... 18 Bảng 1.6. Các công trình nghiên cứu ngoài nước .................................................... 19 Bảng 2.1. Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu ........................... 21 Bảng 2.2. Thông tin các chất chuẩn ......................................................................... 22 Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị sử dụng ....................................................... 22 Bảng 2.4. Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất .................... 26 Bảng 2.5. Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng ........ 31 Bảng 2.6. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất ................. 32 Bảng 2.7. Chương trình gradient (-1%) của độ thô ................................................. 33 Bảng 2.8. Chương trình gradient (+1%) của độ thô ................................................ 33 Bảng 2.9. Chương trình gradient khảo sát định lượng tạp 4-aminophenol ............. 34 Bảng 2.10. Cách pha chuẩn khảo sát tính tuyến tính định lượng 4-aminophenol ... 36 Bảng 2.11. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4-aminophenol ....... 37 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu ........................................ 40 Bảng 3.2. Hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu ............................ 40 Bảng 3.3. So sánh độ phân giải khi thay đổi pH dung dịch B ................................. 47 Bảng 3.4. So sánh hệ số bất đối As với dung dịch B là TFA pH 2,1 và TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA ............................................................................................ 47 Bảng 3.5. So sánh cột Inersustain C8 và Inersustain C18 ....................................... 49 Bảng 3.6. Chương trình gradient tối ưu được lựa chọn ............................................ 49 Bảng 3.7. Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng ............................ 55 Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ lặp lại ................................................................... 56 Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian ............................................ 56 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát diện tích pic các hoạt chất theo nồng độ ................... 57

v

Bảng 3.11. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất ............................... 57 Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ đúng paracetamol ............................................... 58 Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ đúng phenylephrin bitartrat ............................... 59 Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ đúng dextromethorphan HBr ............................. 59 Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ đúng loratadin .................................................... 60 Bảng 3.16. Khoảng xác định của các hoạt chất ....................................................... 60 Bảng 3.17. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 0,9 ml/phút ............................ 61 Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 1,1 ml/phút ............................ 61 Bảng 3.19. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 23 oC ...................................... 62 Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 27 oC ...................................... 62 Bảng 3.21. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,0 ........................................................ 63 Bảng 3.22. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,2 ........................................................ 63 Bảng 3.23. Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (-1%) ..................... 64 Bảng 3.24. Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (+1%) ..................... 64 Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ thô - cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) ... 65 Bảng 3.26. Kết quả thẩm định độ thô - vị trí đặt lọ chứa mẫu trong hệ thống tiêm mẫu tự động .............................................................................................................. 65 Bảng 3.27. Kết quả thẩm định độ thô - độ ổn định của dung dịch phân tích .......... 66 Bảng 3.28. Chương trình gradient định lượng tạp 4-aminophenol ......................... 68 Bảng 3.29. Kết quả tính thích hợp hệ thống 4-aminophenol ................................... 70 Bảng 3.30. Kết quả thẩm định độ lặp lại tạp 4-aminophenol .................................. 71 Bảng 3.31. Kết quả độ chính xác trung gian tạp 4-aminophenol ............................ 71 Bảng 3.32. Kết quả khảo sát diện tích pic theo nồng độ tạp 4-aminophenol .......... 72 Bảng 3.33. Kết quả tính chính xác tại nồng độ LOQ .............................................. 73 Bảng 3.34. Kết quả khảo sát hàm lượng tạp 4-aminophenol trong mẫu thử ............ 73 Bảng 3.35. Kết quả thẩm định độ đúng tạp 4-aminophenol .................................... 73 Bảng 3.36. Công thức cho một viên sủi bọt ............................................................. 75 Bảng 3.37. Tiêu chuẩn của nguyên phụ liệu............................................................. 76 Bảng 3.38. Chương trình gradient định lượng tạp 4-aminophenol ......................... 79 Bảng 3.39. Chương trình gradient định lượng 4 hoạt chất ...................................... 80

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Cảm lạnh và cảm cúm là bệnh thường hay gặp do nhiễm trùng đường hô hấp gây ra bởi một số loại virus khác nhau. Các triệu chứng của nó bao gồm sung huyết mũi (nghẹt mũi), viêm mũi dị ứng, mày đay, hắt hơi, sổ mũi, ngứa mũi/họng, ho, sốt, nhức đầu, đau nhức mình, nhức đầu kết hợp viêm xoang. Để điều trị các bệnh này thường kết hợp sử dụng các thuốc làm giảm nhẹ triệu chứng. Paracetamol có tác dụng làm giảm sốt và giảm đau từ nhẹ đến vừa. Dextromethorphan là thuốc giảm ho do tác dụng lên trung tâm ho ở hành não dùng để điều trị triệu chứng do do họng hoặc phế quản bị kích thích khi cảm lạnh thông thường hoặc hít phải chất kích thích. Phenylephrin làm giảm nghẹt mũi và chảy mũi do có tác dụng chống sung huyết mũi, giảm sưng của các mạch máu trong mũi. Loratadin làm giảm nhẹ triệu chứng của viêm mũi dị ứng và mày đay, chống ngứa, không có tác dụng an thần [2].

Sự kết hợp đồng thời paracetamol, dextromethorphan, loratadin, phenylephrin trong một chế phẩm không những làm nâng cao hiệu quả, giảm chi phí mà còn mang lại sự thuận tiện cho bệnh nhân trong quá trình điều trị và cho bác sỹ khi kê đơn.

Hiện nay, trên thị trường chưa có dạng viên sủi bọt chứa đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat. Công ty TNHH HASAN-DERMAPHARM hiện đang nghiên cứu bào chế viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS chứa đồng thời bốn dược chất này và chưa xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm. Vì vậy, đề tài “Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở để kiểm nghiệm paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Mục tiêu tổng quát Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở để kiểm nghiệm paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt.

2

2. Mục tiêu cụ thể - Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời các hoạt chất paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang.

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt.

- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt chứa paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat.

3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. PARACETAMOL 1.1.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [1], [10], [11], [18] 1.1.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.1. Công thức cấu tạo paracetamol Công thức phân tử: C8H9NO2 Phân tử lượng: 151,2 g/mol 1.1.1.2. Danh pháp N-(4-hydroxyphenyl) acetamid, 4’-Hydroxyacetanilid 1.1.2. Tính chất [1], [10], [11], [21] Bột kết tinh trắng, không mùi. Hơi tan trong nước, rất khó tan trong cloroform, ether, methylen clorid, dễ tan trong dung dịch kiềm, ethanol 96%, pKa = 9,5.

1.1.3. Định tính 1.1.3.1. Nguyên liệu a. Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau [1], [10]: Nhóm I: A, C. Nhóm II: B, C, D, E. A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của paracetamol chuẩn.

B. Hoà tan 0,1 g chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 100 ml với cùng dung môi. Lấy 1,0 ml dung dịch, thêm 0,5 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M, thêm methanol thành 100 ml. Bảo quản dung dịch này tránh ánh sáng và đem đo ngay độ hấp thụ ở bước sóng cực đại 249 nm. A (1%, 1 cm) phải trong khoảng 860 - 980.

C. Điểm chảy: 168-172 oC

4

D. Đun nóng 0,1 g chế phẩm trong 1 ml acid hydrocloric trong 3 phút, thêm 1 ml nước, làm lạnh trong đá, không có tủa tạo thành. Thêm 0,05 ml dung dịch kali dicromat 0,49%, xuất hiện màu tím và không chuyển sang màu đỏ.

E. Chế phẩm phải có phản ứng của nhóm acetyl. Thực hiện phản ứng bằng cách đun trực tiếp trên lửa. b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượng nguyên liệu (phần b mục 1.1.4.1) 1.1.3.2. Thành phẩm a. Lấy một lượng bột thuốc tương ứng với khoảng 0,5 g paracetamol, thêm 20 ml aceton, khuấy kỹ, lọc, làm bay hơi dịch lọc đến cắn, lấy cắn làm các thí nghiệm [1], [10]: A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của paracetamol chuẩn.

B. Sấy cắn ở 105 oC, độ chảy của cắn khoảng 168-172 oC. C. Đun sôi 0,1 g cắn với 1 ml acid hydrocloric 3 phút, thêm 10 ml nước cất, để nguội. Thêm 1 giọt dung dịch kali dicromat 5% sẽ xuất hiện màu tím, không chuyển sang màu đỏ. b. Sắc ký lớp mỏng [18] Bản mỏng: Silicagel GF254 đã hoạt hoá ở 105 oC trong 1 giờ.

Hệ dung môi: Methylen clorid - methanol (4:1) Dung dịch thử: Hoà tan một lượng bột chế phẩm tương ứng với 10 mg paracetamol trong 10 ml methanol. Lọc.

Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 10 mg paracetamol trong 10 ml methanol.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l các dung dịch trên. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 15 cm. Lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí.

Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

5

Vết chính thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng về vị trí và màu sắc với vết chính thu được trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. c. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượng thành phẩm (phần b mục 1.1.4.2) 1.1.4. Định lượng 1.1.4.1. Nguyên liệu a. Phương pháp chuẩn độ thể tích [1], [10], [11] Hoà tan 0,300 g chế phẩm trong hỗn hợp gồm 10 ml nước và 30 ml dung dịch acid sulfuric loãng. Đun sôi hồi lưu trong 1 giờ, làm lạnh và pha loãng thành 100,0 ml bằng nước. Lấy 20,0 ml dung dịch, thêm 40 ml nước, 40 g nước đá, 15 ml dung dịch acid hydrocloric loãng và 0,1 ml dung dịch feroin. Định lượng bằng dung dịch amoni ceri sulfat 0,1 M cho đến khi xuất hiện màu vàng xanh. Song song tiến hành mẫu trắng trong cùng điều kiện.

1 ml dung dịch amoni ceri sulfat 0,1 M tương đương với 7,56 mg C8H9NO2. b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Pha động: Dung dịch A: 1,7 g kali dihydrophosphat và 1,8 g dinatri hydrophosphat trong 1 lít nước.

Dung dịch B: Methanol Bảng 1.1. Chương trình gradient định lượng paracetamol bằng HPLC của USP 38 Thời gian (phút) 0,0 3,0 7,0 7,1 10,0

Dung dịch A (%) 99 99 19 99 99

Dung dịch B (%) 1 1 81 1 1

Dung dịch chuẩn: 0,1 mg/ml paracetamol trong methanol Dung dịch thử: 0,1 mg/ml paracetamol trong methanol

6

Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 230 nm Cột: C8 (100 mm; 4,6 mm; 3,5 µm) Nhiệt độ cột: 35 oC Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 5 µl 1.1.4.2. Thành phẩm a. Phương pháp quang phổ UV-Vis [1], [10] Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,15 g paracetamol vào bình định mức 200 ml, thêm 50 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M và 100 ml nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 ml dịch lọc đầu.

Lấy chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 0,1 M, thêm nước đến định mức, lắc đều. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 257 nm, dùng cốc dày 1 cm.

Mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyd 0,01 M. Tính hàm lượng paracetamol, C8H9NO2 theo A (1%, 1 cm). Lấy 715 là giá trị A (1%, 1 cm) ở bước sóng 257 nm. b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Pha động: Methanol - nước (1:3) Dung dịch chuẩn: 0,01 mg/ml paracetamol trong pha động Dung dịch thử gốc: Hòa tan một lượng bột thuốc tương đương với 10 g paracetamol trong 200 ml nước trong bình định mức 1000 ml, sử dụng nhiệt nếu cần, chờ đến khi bột sủi hết, định mức bằng nước đến vạch.

Dung dịch thử: Pha loãng dung dịch thử gốc với pha động để được dung dịch thử có nồng độ 0,16 mg/ml paracetamol.

7

Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 243 nm Cột: C18 (300 mm; 3,9 mm; 0,5 μm) Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl 1.2. DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID 1.2.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [10], [11], [18] 1.2.1.1. Công thức cấu tạo

.HBr.H2O

Hình 1.2. Công thức cấu tạo dextromethorphan hydrobromid Công thức phân tử: C18H26BrNO.H2O Phân tử lượng: 370,3 g/mol 1.2.1.2. Danh pháp Ent-3-methoxy-17-methylmorphinan hydrobromid monohydrat (9S, 13S, 14S)-3-methoxy-17-methylmorphinan hydrobromid monohydrat 3-Methoxy-17-methyl-9α,13α,14α-morphinan hydrobromid monohydrat 1.2.2. Tính chất [10], [11], [22] Bột kết tinh màu trắng. Hơi tan trong nước (74,7 mg/l ở 25 oC), dễ tan trong ethanol, cloroform. Điểm chảy khoảng 125 °C kèm theo phân hủy, pKa = 9,85, λMAX = 280 nm (trong ethanol).

1.2.3. Định tính 1.2.3.1. Nguyên liệu [1] Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau: Nhóm I: A, B, D.

8

Nhóm II: A, C, D. A. Góc quay cực riêng B. Phổ hấp thu hồng ngoại So sánh với phổ dextromethorphan hydrobromid chuẩn.

C. Sắc ký lớp mỏng Bảng mỏng: silicagel G. Pha động: Amoniac - methylen clorid – methanol - ethyl acetat - toluen (2:10:13:20:55).

Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg chế phẩm trong methanol và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 25 mg dextromethorphan hydrobromid chuẩn trong methanol và pha loãng thành 10 ml với cùng dung môi.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, làm khô trong không khí. Phát hiện vết bằng cách phun thuốc thử kali iodobismuthat. Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương tự về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

D. Cho phản ứng của bromid.

1.2.3.2. Thành phẩm Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượng thành phẩm (mục 1.2.4.2).

1.2.4. Định lượng 1.2.4.1. Nguyên liệu a. Phương pháp chuẩn độ điện thế [10], [11] Hòa tan 0,300 g chế phẩm trong hỗn hợp 5,0 ml acid HCl 0,01 M và 20 ml ethanol (96%). Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 M. Xác định điểm tương đương bằng chuẩn độ điện thế. Điểm tương đương là điểm uốn của đường cong chuẩn độ điện thế.

1 ml dung dịch 0,1 M natri hydroxyd tương đương với 35,23 mg C18H26BrNO.

9

b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Pha động: Lọc và đuổi khí dung dịch có chứa 0,007 M natri docusat và 0,007 M amoni nitrat trong hỗn hợp acetonitril và nước (70:30) và chỉnh pH 3,4 bằng acid acetic băng.

Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng chính xác chuẩn dextromethorphan hydrobromid trong nước để có nồng độ khoảng 1 mg/ml. Hút chính xác 10,0 ml dung dịch này vào bình định mức 100 ml, định mức bằng pha động, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 100 mg dextromethorphan hydrobromid, vào bình định mức 100 ml, định mức bằng nước, lắc đều. Hút chính xác 10,0 ml dung dịch này vào bình định mức 100 ml, định mức bằng pha động, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí. Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 280 nm Cột C18 (250 mm; 4,6 mm; 5 μm) Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

Thể tích tiêm: 20 μl 1.2.4.2. Thành phẩm Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Pha động: 0,34 g kali dihydrophosphat, 0,3 g triethylamin hydrocloric, 0,15 g natri lauryl sunfat và 0,1 ml acid phosphoric trong 100 ml hỗn hợp methanol và nước (60:40).

Dung dịch chuẩn: Hoà tan một lượng chính xác chuẩn dextromethorphan hydrobromid trong nước để được dung dịch có nồng độ 0,6 mg/ml. Pha loãng dung dịch này với acid phosphoric 0,1% để được dung dịch có nồng độ 0,06 mg/ml.

Dung dịch thử: Cân một lượng bột thuốc tương đương với khoảng 6 mg dextromethorphan hydrobromid vào bình định mức 100 ml. Thêm 10 ml methanol, siêu âm để hòa tan. Thêm 0,4 ml acid phosphoric, định mức bằng nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

10

Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 214 nm Cột: L11 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút Thể tích tiêm: khoảng 10 μl 1.3. LORATADIN 1.3.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [10], [11], [18] 1.3.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.3. Công thức cấu tạo loratadin Công thức phân tử: C22H23ClN2O2 Phân tử lượng: 382,88 g/mol 1.3.1.2. Danh pháp Ethyl 4-(8-chloro-5,6-11H-dihydro-benzo [5,6] cyclohepta [1,2-b] pyridin-11 yliden) piperidin-1-carboxylat 1.3.2. Tính chất [10], [11], [21] Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methanol, có tính đa hình, pKa = 4,33.

1.3.3. Định tính 1.3.3.1. Nguyên liệu [10], [11], [18] a. Phổ hồng ngoại So sánh với phổ của loratadin chuẩn.

11

b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượng nguyên liệu (phần b mục 1.3.4.1) 1.3.3.2. Thành phẩm a. Phổ hồng ngoại [10] Chiết xuất một lượng bột viên có chứa 50 mg loratadin với 20 ml aceton, lọc và làm bay hơi dịch lọc đến cắn. Phổ hấp thụ hồng ngoại của cắn phù hợp với phổ chuẩn của loratadin. d. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượng thành phẩm (phần b mục 1.3.4.2) 1.3.4. Định lượng 1.3.4.1. Nguyên liệu a. Phương pháp chuẩn độ điện thế [10], [11] Hòa tan 0,300 g trong 50 ml acid acetic băng. Chuẩn độ với acid percloric 0,1 M. Xác định điểm tương đương bằng chuẩn độ điện thế.

1 ml dung dịch 0,1 M acid pecloric là tương đương với 38,29 mg C22H23ClN2O2 b. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Dung dịch đệm A: dikali hydrophosphat 0,01 M trong nước Dung dịch đệm B: dikali hydrophosphat 0,6 M trong nước Pha động: Acetonitril, methanol và dung dịch đệm A (60:60:70), chỉnh pH 7,2 với acid photphoric 10%.

Dung môi pha loãng: Cho 400 ml dung dịch acid hydrocloric 0,05 N và 80 ml dung dịch đệm B vào bình định mức 1 lít, định mức bằng hỗn hợp acetonitril và methanol (1: 1).

Dung dịch chuẩn: 0,4 mg/ml loratadin trong dung môi pha loãng.

Dung dịch thử: 0,4 mg/ml loratadin trong dung môi pha loãng.

12

Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 254 nm Cột: C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Nhiệt độ cột: 25-35 oC Tốc độ dòng: 1 ml/phút Thể tích tiêm: 15 μl 1.3.4.2. Thành phẩm Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Dung dịch thử: Cho 10 viên vào bình định mức 250 ml, thêm 100 ml dung dịch acid hydrocloric 0,05 N, và lắc trong 40 phút hoặc cho đến khi thuốc bị phân tán hoàn toàn. Thêm 75 ml hỗn hợp methanol và acetonitril (1:1), lắc đều. Thêm 20 ml dikali hydrophosphat 0,6 M, lắc trong 5 phút, định mức bằng hỗn hợp methanol và acetonitril (1:1), lắc đều.

Dung dịch chuẩn: 0,4 mg/ml loratadin trong dung môi pha loãng. Điều kiện sắc ký: tương tự phần b mục 1.3.4.1 1.4. PHENYLEPHRIN BITARTRAT 1.4.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [18] 1.4.1.1. Công thức cấu tạo

.

Hình 1.4. Công thức cấu tạo phenylephrin bitartrat Công thức phân tử: C9H13NO2.C4H6O6 Phân tử lượng: 317,3 g/mol 1.4.1.2. Danh pháp Benzenemethanol, (R)-(-)-m-Hydroxy-α-[(methylamino)methyl]benzyl alcohol hydrogen tartrat

13

1.4.2. Tính chất [20], [21] Bột màu trắng hoặc gần như trắng, tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 140-145 oC, pKa = 9,07.

1.4.3. Định tính Nguyên liệu [14] Dùng nhóm định tính sau A. Phổ hấp thu hồng ngoại So sánh với phổ của phenylephrin bitartrat chuẩn.

B. Cho phản ứng của gốc bitartrat C. Thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ của mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn thu được trong phép định lượng nguyên liệu (mục 1.4.4) 1.4.4. Định lượng Nguyên liệu Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [18] Dung dịch đệm: Hoà tan 3,25 g muối natri 1-octansulfonic trong 1 lít nước, điều chỉnh pH 2,8 bằng acid phosphoric 3 M. Dung dịch A: Acetonitril - dung dịch đệm (10:90) Dung dịch B: Acetonitril - dung dịch đệm (90:10) Bảng 1.2. Chương trình gradient định lượng phenylephrin bitartrat của USP 38 Thời gian (phút)

Dung dịch A (%)

Dung dịch B (%)

0

93

7

10

70

30

10,1

93

7

18

93

7

Dung môi pha loãng: dung dịch A - dung dịch B (80:20) Dung dịch chuẩn: 0,6 mg/ml phenylephrin hydrocloric trong dung môi pha loãng Dung dịch thử: 0,9 mg/ml phenylephrin bitartrat trong dung môi pha loãng.

14

Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 215 nm Cột: C18 (550 mm; 4,0 mm; 3 μm) Nhiệt độ cột: 45 oC Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 4 μl 1.5. TẠP 4-AMINOPHENOL 1.5.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [1], [10], [11], [18], [19] 1.5.1.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.5. Công thức cấu tạo 4-aminophenol Công thức phân tử: C6H7NO Phân tử lượng: 109,13 g/mol 1.5.1.2. Danh pháp 4-amino-1-hydroxybenzene, p-aminophenol 1.5.2. Tính chất [19] Bột màu màu trắng hoặc hồng, không mùi hoặc có mùi amin nhẹ, nhiệt độ nóng chảy 180-190 °C, hơi tan trong nước.

1.5.3. Nguồn gốc phát sinh tạp [16] Khi thực hiện phân hủy paracetamol trong môi trường HCl 0,1 N hoặc NaOH 0,1 N trong 24 giờ, tạp 4-aminophenol được hình thành theo cơ chế sau:

Natri acetat 4-aminophenol Hình 1.6. Cơ chế paracetamol tạo ra tạp 4-aminophenol trong HCl 0,1 N/24 giờ

15

Acid acetic

4-aminophenol

Hình 1.7. Cơ chế paracetamol tạo ra tạp 4-aminophenol trong NaOH 0,1 N/24 giờ 1.5.4. Độc tính [19] Theo hệ thống hòa hợp toàn cầu về phân loại và ghi nhãn hoá chất – GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals), 4-aminophenol thuộc nhóm GHS 07 và GSH 08.

Hình 1.8. Ký hiệu GHS 07 và GSH 08 theo hệ thống GHS Tạp 4-aminophenol có thể gây phản ứng dị ứng da, gây kích ứng mắt, có thể gây dị ứng hoặc tạo ta triệu chứng hen hoặc khó thở nếu hít phải. Đặc biệt, 4-aminophenol có thể gây ra các khiếm khuyết di truyền, có thể gây tổn hại cho thận nếu phơi nhiễm kéo dài hoặc lặp lại. LD50 đường uống đối với chuột là 420 mg/kg.

16

1.5.5. Phương pháp kiểm nghiệm tạp 4-aminophenol trong thành phẩm 1.5.5.1. Dược điển Mỹ (USP 38) [18] Dung dịch thử gốc: Pha dung dịch thử có nồng độ 10 mg/ml paracetamol từ một lượng chế phẩm trong dung môi pha loãng.

Dung dịch chuẩn gốc: 25 μg/ml 4-aminophenol trong dung môi pha loãng.

Dung dịch chuẩn: Cho 25,0 ml dung dịch thử gốc và 15,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 50 ml và pha loãng với dung môi pha loãng, lọc qua màng lọc 0,45 μm, loại bỏ 3 ml dịch lọc đầu.

Dung dịch thử: Cho 25,0 ml dung dịch thử gốc vào bình định mức 50 ml định mức bằng dung môi pha loãng, lọc qua màng lọc 0,45 μm, loại bỏ 3 ml dịch lọc đầu.

Dung dịch đệm: 4,0 g natri citrat dihydrat và 1,5 g acid citric khan trong 1 lít nước.

Dung môi pha loãng: Dung dịch đệm - acetonitril (9:1) Dung dịch A: Dung dịch đệm phosphat 10 mM pha bằng cách thêm 0,60 g kali dihydrophosphat và 0,82 g dinatri hydrophosphat vào bình định mức 1 lít, hòa tan và pha loãng với nước đến thể tích sẽ được dung dịch pH 7,0.

Dung dịch B: Nước Dung dịch C: Acetonitril Bảng 1.3. Chương trình gradient định lượng 4-aminophenol theo USP 38 Thời gian (phút) 0 5 7 7,1 10

Dung dịch A (%) 90 90 10 90 90

Điều kiện sắc ký: Bước sóng phát hiện: 300 nm Cột: L85 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Nhiệt độ cột: 30 oC Tốc độ dòng: 1 ml/phút Thể tích tiêm: 10 μl

Dung dịch B (%) 5 5 10 5 5

Dung dịch C (%) 5 5 80 5 5

17

1.5.5.2. Dược điển Anh (BP 2016) [10] Dung dịch thử: Phân tán một lượng chế phẩm chứa 0,2 g paracetamol trong 8 ml pha động, siêu âm, thêm pha động để được 10 ml, trộn đều và lọc. Pha loãng dung dịch này 20 lần với pha động.

Dung dịch chuẩn: 0,002% 4-aminophenol và paracetamol trong pha động. Điều kiện sắc ký: Cột: C8 (250 mm; 4,6 mm; 5 μm) Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.

Nhiệt độ cột: 35 °C Bước sóng phát hiện: 245 nm Thể tích tiêm: 20 μl Chương trình sắc ký: chế độ đẳng dòng với pha động như bên dưới.

Pha động: 250 thể tích methanol có chứa 1,15 g dung dịch tetrabutylammonium 40%, 375 thể tích dinatri hydrophosphat 0,05 M và 375 thể tích natri dihydrophosphat 0,05 M. 1.5.5.3. Dược điển Việt Nam IV [1] Pha động: Dung dịch natri butansulfonat 0,01 M trong hỗn hợp gồm 0,4 thể tích acid formic, 15 thể tích methanol và 85 thể tích nước.

Dung dịch chuẩn: Chứa 0,001% của 4-aminophenol trong methanol 15%.

Dung dịch thử: Lắc một lượng bột chế phẩm tương ứng 1,0 g paracetamol trong 15 ml methanol, thêm nước vừa đủ 100 ml và lọc. Điều kiện sắc ký: Cột thép không gỉ (250 mm; 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (10 m).

Tốc độ dòng: 2 ml/phút Bước sóng phát hiện: 272 nm Thể tích tiêm: 20 μl.

1.5.6. Giới hạn tạp 4-aminophenol cho phép ở các dược điển Bảng 1.4. Giới hạn tạp 4-aminophenol cho phép ở các dược điển Dược điển Nguyên liệu Thành phẩm

USP 38 [18] ≤ 0,005% ≤ 0,15%

BP 2016 [10] ≤ 50 ppm ≤ 0,1%

EP 8 [11] ≤ 50 ppm -

DĐVN IV [1] ≤ 50 ppm ≤ 0,1%

18

1.6. MỘT SỐ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PHENYLEPHRIN, PARACETAMOL,

DEXTROMETHORPHAN

HYDROBROMID,

LORATADIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Một số quy trình định lượng đồng thời hai hoặc ba trong số bốn hoạt chất phenylephrin, paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin bằng phương pháp HPLC: • Nghiên cứu trong nước Bảng 1.5. Các công trình nghiên cứu trong nước

Tài liệu

[6]

Hoạt chất

Pha động

-

Cột sắc ký

Paracetamol,

ACN

dung

Cột Ascentis

Dextromethorphan HBr

dịch TEA 1,5

C8 (250 mm;

Loratadin

mM (85:15, tt/tt)

4,6 mm; 5

Bước sóng phát hiện (nm)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích tiêm mẫu (μl)

214

0,8

10

214

1,0

20

1,4

20

μm); nhiệt độ phòng [5]

Paracetamol,

ACN

-

dung

Phenylephrin HCl,

dịch natri heptan

RP18

Cafein

sulfonat pH 3

(125 mm; 4,6

(10:90, tt/tt)

LiChroCart

mm; 5 μm); nhiệt độ phòng

[15] Paracetamol

Gradient: ACN

Eclipse XDB

Phenylephrin HCl

– Đệm kali

C18 (250 mm;

265

Clorpheniramin maleat

dihydrophosphat

4,6 mm; 5

278

4-aminophenol

pH 2,5

μm); nhiệt độ 35 oC

19

• Nghiên cứu ngoài nước Bảng 1.6. Các công trình nghiên cứu ngoài nước Tài liệu

Hoạt chất

[11] Paracetamol Dextromethorphan HBr Chlopheniramin maleat Phenylephrin HCl [12] Paracetamol Dextromethorphan HBr Phenylephrin HCl Cafein

Pha động

Gradient: ACN dung dịch natri perclorat 0,01 M pH 3

Gradient: ACN dung dịch natri heptan sulfonat

Cột sắc ký

(250 mm; 4,6 mm; 5 μm); nhiệt độ phòng

(150 mm; 4,6 mm; 5 μm); nhiệt độ phòng

Phenylephrin HCl

[13] Paracetamol Phenylephrin HCl Loratadin

Methanol : ACN : nước : THF (50:40:10:2,5)

Luna C8 (250 mm; 4,6 mm; 5 μm)

[7]

ACN – nước (60:40) (nước chứa natri dodecyl sulfat và TEA, chỉnh pH 2,5 bằng H3PO4 0,01M và kali dihydrophosphat 0,01 M)

Hypersil C18 (250 mm; 4,6 mm; 5 μm); nhiệt độ

Paracetamol Pseudoephedrin HCl Clorpheniramin maleat Dextromethorphan HBr Chuẩn nội: Clordiazepoxid

204

1,4

20

214

1,0

20

1,2

20

247 246

0,8

20

203

1,0

10

Inertsil C8

PerfectSil Target (150 mm; 4,6 mm; 5 μm); nhiệt độ 30 oC

Clopheniramin maleat

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích tiêm mẫu (μl)

Cột C18

Methanol - nước (95:5) (nước chứa 6,0 g ammonium acetat và 10 ml of TEA mỗi lít, chỉnh pH 5 với H3PO4)

[17] Paracetamol Dextromethorphan HBr

Bước sóng phát hiện (nm)

25 oC

254 220 227

273

20

Nhận xét Hiện nay, trong Dược điển USP 38, BP 2016, Dược điển Việt Nam IV,... và các tài liệu khác chưa đưa ra quy trình định lượng đồng thời bốn hoạt chất paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp HPLC mà chỉ có một số quy trình định lượng riêng lẽ hoặc đồng thời hai hoặc ba trong số bốn hoạt chất trên bằng phương pháp HPLC. Các công trình đã công bố này có một số đặc điểm sau: - Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với cột C8 hoặc C18 có cùng kích thước hạt pha tĩnh 5 μm và chiều dài cột khác nhau .

- Sử dụng hệ pha động phân cực gồm một dung môi hữu cơ (acetonitril hoặc methanol) kết hợp với nước có bổ sung thêm các chất làm cải thiện hình dạng pic, muối tạo cặp ion, chất điều chỉnh pH, …

- Lựa chọn bước sóng phát hiện trong vùng tử ngoại.

- pH của dung dịch đệm muối lựa chọn trong khoảng từ 3-5.

- Hầu hết các tài liệu tham khảo sử dụng pha động với hệ đệm chứa muối có thể gây ăn mòn hệ thống, khó rửa cột,… hoặc sử dụng sắc ký tạo cặp ion với pha động có độ nhớt cao gây ra những khó khăn như áp suất cột cao, thời gian cân bằng giữa pha động và pha tĩnh diễn ra chậm, khó triển khai chương trình gradient, khó rửa cột.

Vì vậy, đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp RP-HPLC với pha tĩnh kém phân cực và pha động phân cực, bước sóng phát hiện trong vùng tử ngoại. Đề tài hạn chế sử dụng các hệ đệm chứa muối và ưu tiên sử dụng pha động gồm dung môi hữu cơ kết hợp với dung dịch nước có chứa các acid, base hữu cơ vừa đóng vai trò tạo pH môi trường vừa là chất cải biến hình dạng pic.

21

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Sản phẩm nghiên cứu: Viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS Bảng 2.1. Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu Hàm lượng (mg/viên)

STT Tên nguyên phụ liệu

Tiêu chuẩn

Dược chất 1 2 3 4

Paracetamol Dextromethorphan hydrobromid Phenylephrin bitartrat Loratadin Tá dược 5 Manitol 6 Acid citric khan 7 Natri hydrocarbonat khan 8 Natri carbonat khan 9 Povidon K30 10 Betacyclodextrin 11 Sucralose 12 Natri benzoat 13 PEG 6000 14 Natri docusat 15 Simethicon 16 Bột hương chanh 17 Ethanol tuyệt đối (*) Tổng cộng (*) Mất đi trong quá trình pha chế

500,0 15,0 11,7 5,0

EP 8 USP 38 USP 38 EP 8

330,0 950,0 810,0 270,0 30,0 140,0 12,0 80,0 20,0 1,2 5,1 20,0 280,0 3200,0

DĐVN IV BP 2016 DĐVN IV BP 2016 BP 2016 USP 38 USP 38 DĐVN IV BP 2016 USP 38 USP 38 TCNSX BP 2016

2.1.2. Dung môi, hóa chất, chất chuẩn - ACN, MeOH loại dùng cho HPLC (Baker).

- TEA, TFA, acid formic, acid phosphoric, natri butansulfonat, acid nitric, amoniac, sắt (II) sulfat, hydrogen peroxyd, natri hydroxyd, acid hydrocloric, kali dihydrophosphat, dinatri hydrophosphat đạt tiêu chuẩn phân tích.

22

Bảng 2.2. Thông tin các chất chuẩn Chất chuẩn

Số kiểm soát

Hàm lượng (%)

Nguồn gốc

Phenylephrin bitartrat

F003M0

100,00

USP

Paracetamol

QT009 170916

99,68

Dextromethorphan HBr

QT015 090616

95,80

Loratadin

QT070 100916

99,90

Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh

4-aminophenol

QT216 040916

99,80

2.1.3. Trang thiết bị Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị sử dụng STT Tên thiết bị

Nguồn gốc

1

Máy HPLC Hitachi Chromaster PDA-5430 (Phần mềm xử lý số liệu EZChrom Elite)

Nhật

2

Cân phân tích Shimadzu AUW 120D (Max = 120 g; Min = 10 mg, e = 1 mg, d = 0,1 mg)

Nhật

3

Bể siêu âm Elmasonic S 180 H

Đức

4

Máy đo pH Eutech 510

5

Cân kỹ thuật Shimadzu BL 220

Nhật

6

Bếp cách thủy Memmert WNB14

Đức

7

Tủ sấy Memmert UNB400

Đức

8

Đèn tử ngoại Spectronics CM-10

USA

9

Bộ lọc hút chân không

10

Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích

Singapore

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Định tính paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat 2.2.1.1. Định tính paracetamol - Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của pic paracetamol trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic paracetamol trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

23

2.2.1.2. Định tính dextromethorphan hydrobromid - Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của pic dextromethorphan trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic dextromethorphan trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

- Cho phản ứng đặc trưng của Br- [1] Hoà tan một lượng chế phẩm có chứa khoảng 3 mg ion bromid trong 5 ml nước, siêu âm khoảng 15 phút, khuấy từ khoảng 15 phút. Lọc lấy dịch lọc, acid hoá bằng acid nitric loãng và thêm 0,4 ml dung dịch bạc nitrat 4%. Lắc và để yên sẽ tạo tủa lổn nhổn. Lọc lấy tủa, rửa tủa ba lần, mỗi lần với 1 ml nước. Phân tán tủa trong 2 ml nước, thêm 1,5 ml dung dịch amoniac 10 M thì tủa khó tan.

2.2.1.3. Định tính phenylephrin bitartrat - Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của pic phenylephrin trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic phenylephrin trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

- Cho phản ứng đặc trưng của bitartrat [1] Hoà tan một lượng chế phẩm có chứa khoảng 15 mg bitartrat trong 5 ml nước, siêu âm khoảng 15 phút, khuấy từ khoảng 15 phút. Lọc lấy dịch lọc, thêm 0,05 ml dung dịch sắt (II) sulfat 1% và 0,05 ml dung dịch hydrogen peroxyd 10 TT; màu vàng không bền vững được tạo thành, sau khi màu vàng biến mất, thêm từng giọt dung dịch natri hydroxyd 2 M, xuất hiện màu xanh tím đến đỏ tía.

2.2.1.4. Định tính loratadin - Trong phần định lượng đồng thời 4 hoạt chất bằng HPLC, thời gian lưu của pic loratadin trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic loratadin trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

2.2.1.5. Thẩm định quy trình định tính: Tính đặc hiệu theo ASEAN 2008 [3], [9] - Bằng HPLC: tương tự tính đặc hiệu phần định lượng bằng HPLC

24

- Định tính Br-: Chuẩn bị các mẫu sau: + Mẫu thử: Cân khoảng 2963,2 mg bột thuốc. + Mẫu chuẩn: Cân khoảng 13,2 mg chuẩn dextromethorphan hydrobromid (tương đương với 3 mg ion bromid). + Mẫu placebo: Cân khoảng 2470,9 mg placebo. + Mẫu thử giả lập không chứa dextromethorphan hydrobromid: Cân khoảng 2470,9 mg placebo; thêm các chuẩn paracetamol, phenylephrin bitartrat, loratadin.

Thực hiện thí nghiệm với các mẫu trên. Quy trình đạt tính đặc hiệu khi: + Mẫu placebo và mẫu thử giả lập không chứa dextromethorphan hydrobromid không xuất hiện tủa. + Mẫu thử và mẫu chuẩn chứa dextromethorphan hydrobromid có xuất hiện tủa, tủa khó tan trong dung dịch amoniac.

- Định tính bitartrat: Chuẩn bị các mẫu sau: + Mẫu chuẩn: Cân khoảng 31,7 mg chuẩn phenylephrin bitartrat (tương đương với 15 mg bitartrat). + Mẫu thử: Cân khoảng 8670 mg bột thuốc. + Mẫu placebo: Cân khoảng 3229,2 mg placebo. + Mẫu thử giả lập không chứa phenylephrin bitartrat: Cân khoảng 3229,2 mg placebo; thêm các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin.

Thực hiện thí nghiệm với các mẫu trên. Quy trình đạt tính đặc hiệu khi: + Mẫu placebo và mẫu thử giả lập không chứa phenylephrin bitartrat không xuất hiện màu đỏ tía. + Mẫu thử và mẫu chuẩn chứa phenylephrin bitartrat xuất hiện màu đỏ tía.

2.2.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA

25

2.2.2.1. Điều kiện phân tích ban đầu • Xử lý mẫu Dung môi pha mẫu: Nước - acetonitril (85:15) Mẫu chuẩn: Cân chính xác 12,5 mg loratadin; 29,3 mg phenylephrin bitartrat; 37,5 mg dextromethorphan hydrobromid các chất chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 1) và định mức cho tới vạch bằng dung môi pha mẫu. Cân chính xác 25 mg paracetamol chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 2). Hút chính xác 1 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình 2 và định mức bằng dung môi pha mẫu cho tới vạch để thu được nồng độ các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat về nồng độ tương ứng 0,5000 mg/ml; 0,0150 mg/ml; 0,0050 mg/ml; 0,0117 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn.

Cân một lượng bột viên tương ứng với khối lượng trung bình viên cho vào bình định mức 100 ml, thêm từ từ một lượng khoảng 60 ml dung môi pha mẫu (tránh mẫu sủi mạnh trào ra khỏi bình định mức), chờ cho đến khi mẫu sủi hết, siêu âm trong khoảng 15 phút, để nguội, định mức cho đến vạch bằng dung môi pha mẫu.

Lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu để có nồng độ paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat cuối cùng tương ứng khoảng 0,5000 mg/ml; 0,0150 mg/ml; 0,0050 mg/ml; 0,0117 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. Tiến hành sắc ký lần lượt mẫu thử và chuẩn theo điều kiện sắc ký khảo sát.

• Điều kiện sắc ký Dựa vào cấu trúc hóa học của paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat đều là những chất phân cực có nối đôi liên hợp và có các nhóm mang màu nên có thể sử dụng kỹ thuật RP-HPLC với pha tĩnh kém phân cực, pha động phân cực và sử dụng đầu dò PDA để định lượng các hoạt chất này với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: + Cột sắc ký: Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 20 μl

26

+ Nhiệt độ cột: 25 oC + Bước sóng phát hiện: lựa chọn bước sóng phát hiện được cả bốn chất và cho tín hiệu tốt nhất. + Pha động: o Dung môi A: Acetonitril o Dung dịch B: Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0 bằng TFA 2.2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký + Bước sóng phát hiện Lựa chọn bước sóng phát hiện đồng thời cả bốn chất và cho tín hiệu tốt nhất. + Chương trình gradient Bảng 2.4. Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất Chương trình gradient

1

2

3

4

Thời gian (phút) 0 2,0 6,0 6,1 11,0 11,1 13,0 13,1 15,0 0 7,0 7,1 12 12,1 20 0 3 7,0 7,1 13,0 13,1 15 0 12 15 20

Dung môi A (%) 15 70 55 60 60 0 0 15 15 5 55 40 40 5 5 10 10 55 60 60 10 10 5 55 5 5

Dung dịch B (%) 85 85 45 40 40 100 100 85 85 95 45 60 60 95 95 90 90 45 40 40 90 90 95 45 95 95

Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

27

+ Thay đổi pH và thành phần dung dịch B Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,5 bằng TFA Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,1 bằng TFA Dung dịch TFA pH 2,1 Dung dịch acid phosphoric pH 2,1 + Cột sắc ký Cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Cột Inertsustain C18 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Yêu cầu: Lựa chọn điều kiện sắc ký có các pic đạt các thông số sắc ký theo quy định. Đối với định lượng hỗn hợp đa thành phần, đặc biệt ưu tiên độ phân giải (RS ≥ 1,5), hệ số đối xứng (0,8 ≤ AS ≤ 1,5), độ tinh khiết pic.

2.2.2.3. Khảo sát quá trình xử lý mẫu Sử dụng điều kiện sắc ký xây dựng được để khảo sát quá trình xử lý mẫu: + Dung môi pha mẫu: khảo sát 4 dung môi pha mẫu sau: Nước Nước - ACN (90:10) Nước - ACN (85:15) Nước - ACN (80:20) Yêu cầu: Lựa chọn dung môi pha mẫu có thời gian siêu âm làm mẫu tan hết bằng cảm quan nhanh nhất. + Thời gian siêu âm mẫu: khảo sát các khoảng thời gian siêu âm mẫu sau: 10 phút, 15 phút, 20 phút Yêu cầu: Lựa chọn thời gian siêu âm mẫu có hàm lượng các hoạt chất khác nhau có ý nghĩa thống kê so với các khoảng thời gian khác.

2.2.2.4. Thẩm định quy trình định lượng Sau khi đã lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, tiến hành thẩm định quy trình đã xây dựng được theo hướng dẫn của ASEAN 2008 [4], [9]: a. Tính đặc hiệu Chuẩn bị dung môi pha mẫu, mẫu giả dược (placebo), mẫu chuẩn riêng lẽ, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt:

28

- Mẫu được oxy hoá bởi hydrogen peroxyd 3% trong 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch H2O2 3%, chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch H2O2 3%,, lắc đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

- Mẫu thủy phân trong natri hydroxyd 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch NaOH 0,5 N, chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch NaOH 0,5 N, lắc đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu.

Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

- Mẫu thủy phân trong acid hydrocloric 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch HCl 0,5 N, chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch HCl 0,5 N, lắc đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

- Mẫu chiếu ánh sáng trực tiếp trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới ánh sáng mặt trời trong 48 giờ. Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

- Mẫu chiếu tia UV trong vòng 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới đèn UV 254 nm trong 24 giờ. Sau đó cho

29

bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

- Mẫu đặt ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành một lớp mỏng trong đĩa petri và cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC ± 2 oC trong 48 giờ. Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

- Mẫu đun cách thủy 60 oC trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, chờ mẫu sủi bọt hết, siêu âm 25 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Dung dịch sau khi pha được đun cách thủy ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ. Để nguội, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

Tiến hành sắc ký các loại mẫu theo quy trình phân tích. Ghi lại các sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu, độ tinh khiết của pic, phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn.

Yêu cầu - Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo phải không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.

- Sắc ký đồ mẫu thử phải cho thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử các pic hoạt chất cần phân tích tách hoàn toàn khỏi các pic khác.

- Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic phải tăng lên so với trước khi thêm chuẩn.

30

- Trên sắc ký đồ mẫu thử ở các điều kiện khắc nghiệt, các pic tạp xuất hiện phải tách ra khỏi các pic hoạt chất cần phân tích (độ phân giải RS ≥ 1,5).

- Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ của các mẫu phải tinh khiết (độ tinh khiết pic xấp xỉ 100%). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn. b. Tính thích hợp hệ thống Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 100% so với nồng độ định lượng trong dãy mẫu chuẩn khảo sát tính tuyến tính tiến hành sắc ký 6 lần, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thông số khác của pic (độ phân giải RS, hệ số đối xứng AS, số đĩa lý thuyết N…) Yêu cầu: - Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%.

- Các pic phải đạt các thông số sắc ký khác (0,8 ≤ AS ≤ 1,5; RS ≥ 1,5) [4] c. Độ chính xác • Độ lặp lại Tiến hành chuẩn bị 6 mẫu thử ở nồng độ 100% so với nồng độ định lượng tương tự mục 2.2.2.1. Xác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu theo công thức: X (%/nhãn) =

St ×mc ×C%×Dt ×MW×100 Sc ×mt ×Dc ×T

Trong đó: Sc, St: Diện tích pic trong mẫu chuẩn, mẫu thử.

Dc, Dt: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử. mc, mt: lượng cân của mẫu chuẩn, mẫu thử (mg) C%: hàm lượng % của chất chuẩn MW: khối lượng trung bình viên (mg) T: hàm lượng trên nhãn của hoạt chất trong một viên Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

31

Yêu cầu: - Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong 6 mẫu ≤ 2,0%, nếu lơn hơn 2% cần phải có sự giải thích phù hợp.

• Độ chính xác trung gian - Tiến hành tương tự như độ lặp lại nhưng do 02 kiểm nghiệm viên khác nhau thực hiện trên các ngày khác nhau.

- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích và giữa hai kiểm nghiệm viên.

- Xác định mức độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên.

Yêu cầu: - Các kết quả thu được phải khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (sử dụng F – test để đánh giá). RSD ≤ 2% và Ftn ≤ F0,05. d. Tính tuyến tính Dung dịch chuẩn gốc A: paracetamol 10 mg/ml Dung dịch chuẩn gốc B: hỗn hợp gồm dextromethorphan hydrobromid 1,5 mg/ml, phenylephrin bitartrat 1,17 mg/ml, loratadin 0,5 mg/ml.

Từ các dung dịch gốc này pha loãng thành các dung dịch từ 40% đến 140% so với nồng độ định lượng theo bảng để thu được dãy giai mẫu chuẩn.

Bảng 2.5. Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng Dung dịch

40%

60%

80%

100%

120%

140%

Dung dịch chuẩn gốc A (ml)

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Dung dịch chuẩn gốc B (ml)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Thêm dung môi pha mẫu (ml)

Vừa đủ 50 ml

Tiến hành sắc ký các mẫu, ghi lại các sắc ký đồ và xác định diện tích pic của các mẫu. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy.

Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,999

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

32

e. Độ đúng Bảng 2.6. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất

Mẫu tự tạo

70%

100%

130%

Khối lượng placebo (mg) 2668,5 2668,9 2668,3 2668,8 2668,5 2668,6 2668,1 2668,5 2668,5

Lượng cân chuẩn paracetamol (99,68%) (mg) 351,0 351,0 351,0 501,4 501,4 501,4 651,6 650,6 651,6

Thể tích dung dịch chuẩn gốc B thêm vào (ml) 7,0 7,0 7,0 10,0 10,0 10,0 13,0 13,0 13,0

Khối lượng chuẩn thêm vào (mg) PAR

PHE

DEX

LOR

349,9 349,9 349,9 499,7 499,7 499,7 649,5 648,5 649,5

8,1 8,1 8,1 11,6 11,6 11,6 15,1 15,1 15,1

10,5 10,5 10,5 15,0 15,0 15,0 19,5 19,5 19,5

3,5 3,5 3,5 5,0 5,0 5,0 6,5 6,5 6,5

Chuẩn bị 3 loại mẫu tự tạo trên trong bình định mức 100 ml, thêm chính xác một lượng chất chuẩn thích hợp vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 70%, 100% và 130% so với mức nồng độ định lượng trong quy trình và nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 3 mẫu độc lập phân tích theo quy trình đã xây dựng.

Mẫu chuẩn: sử dụng kết quả mẫu chuẩn của tính thích hợp hệ thống.

Phân tích mẫu theo quy trình phân tích. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức: Tỷ lệ thu hồi (%)=

Lượng hoạt chất thu hồi Lượng hoạt chất thêm vào

× 100

Yêu cầu: - Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0%. f. Khoảng xác định Được đánh giá dựa trên sự tương quan của tính tuyến tính, giá trị độ chính xác và độ đúng của phương pháp.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

33

g. Độ thô - Độ ổn định của phương pháp phân tích Khi thay đổi các thông số liệt kê ở phần này, yêu cầu RSD của diện tích pic  2%. + Thay đổi tốc độ dòng: ± 0,1 ml/phút + Thay đổi nhiệt độ cột: ± 2 oC + Thay đổi pH dung dịch B: ± 0,1 độ pH + Thay đổi vị trí đặt mẫu trong hệ thống HPLC: 9 vị trí khác nhau trong khay chứa mẫu + Thay đổi cột sắc ký: Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) + Thay đổi tỷ lệ pha động trong chương trình gradient: Bảng 2.7. Chương trình gradient (-1%) của độ thô Thời gian (phút) 0 12 15 20

Dung môi A (%) 4 54 4 4

Dung dịch B (%) 96 46 96 96

Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 1

Bảng 2.8. Chương trình gradient (+1%) của độ thô Thời gian (phút) 0 12 15 20

Dung môi A (%) 6 56 6 6

Dung dịch B (%) 94 44 94 94

Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 1

- Độ ổn định của dung dịch phân tích Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo điều kiện sắc ký đã xây dựng ở các thời điểm sau khi pha mẫu 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 giờ. Kiểm tra độ ổn định.

Tính RSD =

(St − S0) ×100 S0

Với S0 là diện tích pic lúc mới pha mẫu St là diện tích pic ở thời điểm t Yêu cầu: RSD ≤ 2,0%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

34

2.2.3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt 2.2.3.1. Xây dựng quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn.

Cân một lượng bột chế phẩm tương ứng 1,0 g paracetamol cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

Dung dịch chuẩn tạp gốc: Cân chính xác 10 mg chuẩn 4-aminophenol cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều để được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml 4aminophenol.

Dung dịch đối chiếu: Hút chính xác 10 ml dung dịnh chuẩn tạp gốc vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng methanol 15%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn chứa 0,01 mg/ml 4-aminophenol trong methanol 15%.

Chú ý: Tránh ánh sáng trong quá trình phân tích Điều kiện sắc ký ban đầu:  Cột: Ultra Restek C18 (25 cm × 4,6 mm, 5 µm)  Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng  Bước sóng phát hiện: 272 nm  Thể tích tiêm: 20 µl  Pha động: Chương trình (1) đẳng dòng với dung dịch D (Dung dịch natri butansulfonat 0,01 M trong hỗn hợp gồm 0,4 thể tích acid formic, 15 thể tích methanol và 85 thể tích nước) Khảo sát chương trình gradient: chương trình (2) Bảng 2.9. Chương trình gradient khảo sát định lượng tạp 4-aminophenol Thời gian (phút) 0 10 10,1 30

Dung môi C (%) 0 0 100 100

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Dung dịch D (%) 80 80 0 0

Nước (%) 20 20 0 0

Tốc độ dòng (ml/phút) 0,8 0,8 0,6 0,6

35

Trong đó: - Dung môi C: Methanol - Dung dịch D: Dung dịch natri butansulfonat 0,01 M trong hỗn hợp gồm 0,4 thể tích acid formic, 15 thể tích methanol và 85 thể tích nước.

2.2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt Sau khi đã lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, tiến hành thẩm định quy trình đã xây dựng được theo hướng dẫn của ASEAN 2008 [4], [9]. a. Tính đặc hiệu Chuẩn bị các mẫu sau: Mẫu trắng: methanol 15%.

Mẫu placebo: Cân khoảng 5337,6 mg placebo cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

Mẫu thử: Cân một lượng bột chế phẩm tương ứng 1,0 g paracetamol cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

Mẫu thử thêm chuẩn tạp: Cân một lượng bột chế phẩm tương ứng 1,0 g paracetamol cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

Tiến hành sắc ký các dung dịch mẫu trên, ghi lại các sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu, độ tinh khiết pic, phổ UV tại thời gian lưu của pic 4-aminophenol trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn. b. Tính thích hợp hệ thống Tiến hành sắc ký 6 lần mẫu chuẩn tạp 4-aminophenol có nồng độ 0,01 mg/ml. Ghi lại các sắc ký đồ, xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thông số khác (độ phân giải RS, hệ số đối xứng AS , số đĩa lý thuyết N…) Yêu cầu: - Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

36

- Các pic phải đạt các thông số sắc ký khác (0,8 ≤ AS ≤ 1,5; RS ≥ 1,5) [4] c. Độ chính xác • Độ lặp lại Tiến hành sắc ký 6 mẫu thử giả lập có chứa tạp 4-aminophenol nồng độ 0,01 mg/ml, ghi nhận giá trị diện tích pic, từ đó suy ra hàm lượng tạp chất có trong mỗi mẫu.

• Độ chính xác trung gian Tiến hành tương tự như độ lặp lại nhưng do 02 kiểm nghiệm viên khác nhau thực hiện trên các ngày khác nhau.

Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng tạp trong các mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích và giữa hai kiểm nghiệm viên.

Xác định mức độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên.

Yêu cầu: Các kết quả thu được phải khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (sử dụng F – test để đánh giá). RSD ≤ 2% và Ftn ≤ F0,05. d. Tính tuyến tính Dung dịch chuẩn tạp gốc: 4-aminophenol 0,1 mg/ml trong methanol 15%.

Từ dung dịch chuẩn tạp gốc, tiến hành pha loãng thành các dung dịch chuẩn tạp có nồng độ từ 20% đến 140% so với giới hạn tạp cho phép (0,1%).

Bảng 2.10. Cách pha chuẩn khảo sát tính tuyến tính định lượng 4-aminophenol Dung dịch

20%

40%

60%

80%

Chuẩn tạp gốc (ml)

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0,01

0,012

0,014

Vừa đủ 10 ml

Methanol 15% (ml) Nồng độ chuẩn tạp (mg/ml)

100% 120% 140%

0,002

0,004

0,006

0,008

Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và giá trị diện tích pic.

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

37

e. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Phương pháp tiến hành: Suy ra từ phương trình hồi quy tuyến tính Giá trị LOD và LOQ của phương pháp được xác định theo công thức sau: LOD =

3,3 ×  a

LOQ =

10 ×  a

: Độ lệch chuẩn của đáp ứng.

Trong đó:

a: Độ dốc của đường chuẩn.

Tiêm lặp lại tại nồng độ LOQ 6 lần để kiểm tra độ chính xác, giá trị RSD của diện tích pic < 2,0%. f. Độ đúng Được thực hiện bằng cách thêm chuẩn tạp vào mẫu thử ở ba mức nồng độ 80%, 100%, 120% so với giới hạn quy định của tạp chất (0,1%). Ở mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 mẫu. Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo quy trình đã xây dựng.

Bảng 2.11. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4-aminophenol Mẫu tự tạo

Khối lượng mẫu thử (mg)

80%

100%

120%

6415,6 6415,1 6416,0 6415,7 6415,5 6415,2 6415,2 6415,5 6415,4

Thể tích dung dịch chuẩn tạp gốc 4-aminophenol thêm vào (ml) 8,0 8,0 8,0 10,0 10,0 10,0 12,0 12,0 12,0

Khối lượng tạp 4-aminophenol thêm vào (mg) 0,8 0,8 0,8 1,0 1,0 1,0 1,2 1,2 1,2

Tính tỷ lệ thu hồi dựa trên lượng chuẩn tạp thêm vào và lượng tìm lại được: Tỷ lệ thu hồi (%)=

Lượng tạp chuẩn thu hồi Lượng tạp chuẩn thêm vào

× 100

Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0% g. Khoảng xác định Được đánh giá dựa trên sự tương quan của tính tuyến tính, giá trị độ chính xác và độ đúng của phương pháp.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

38

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.

ĐỊNH

TÍNH

PARACETAMOL,

DEXTROMETHORPHAN

HYDROBROMID, LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT 3.1.1. Định tính paracetamol - Thời gian lưu của pic paracetamol trong sắc ký đồ mẫu thử (tR = 6,247) tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (tR = 6,247). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic paracetamol trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn (Hình 3.13).

3.1.2. Định tính dextromethorphan hydrobromid - Thời gian lưu của pic dextromethorphan trong sắc ký đồ mẫu thử (tR = 11,840) tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (tR = 11,847). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic dextromethorphan trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn (Hình 3.13).

- Cho phản ứng đặc trưng của Br-: xuất hiện tủa (Hình 3.1).

3.1.3. Định tính phenylephrin bitartrat - Thời gian lưu của pic phenylephrin trong sắc ký đồ mẫu thử (tR = 4,520) tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (tR = 4,513). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic phenylephrin trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn (Hình 3.13).

- Cho phản ứng đặc trưng của bitartrat: có màu đỏ tía (Hình 3.2) 3.1.4. Định tính loratadin - Thời gian lưu của pic loratadin trong sắc ký đồ mẫu thử (tR = 13,513) tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (tR = 13,520). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic loratadin trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn (Hình 3.13).

3.1.5. Thẩm định quy trình định tính Thẩm định tính đặc hiệu theo hướng dẫn ASEAN 2008 - Bằng HPLC: tương tự tính đặc hiệu phần định lượng bằng HPLC

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

39

- Định tính Br-: (1) Mẫu placebo (2)

Mẫu

thử

giả

lập

không

chứa

dextromethorphan hydrobromid (3) Mẫu thử (4) (1)

(2)

(3)

(4)

Mẫu

chuẩn

dextromethorphan

hydrobromid

Hình 3.1. Tính đặc hiệu quy trình định tính BrNhận xét - Mẫu placebo và mẫu thử giả lập không chứa dextromethorphan hydrobromid không xuất hiện tủa.

- Mẫu thử và mẫu chuẩn dextromethorphan hydrobromid có xuất hiện tủa, tủa khó tan trong dung dịch amoniac.  Quy trình định tính Br- đạt tính đặc hiệu - Định tính bitartrat: (1’) Mẫu placebo (2’)

Mẫu

thử

giả

lập

không

chứa

phenylephrin bitartrat (3’) Mẫu chuẩn phenylephrin bitartrat (4’) Mẫu thử (1’)

(2’)

(3’)

(4’)

Hình 3.2. Tính đặc hiệu quy trình định tính bitartrat Nhận xét - Mẫu placebo và mẫu thử giả lập không chứa phenylephrin bitartrat không xuất hiện màu đỏ tía - Mẫu thử và mẫu chuẩn chứa phenylephrin bitartrat xuất hiện màu đỏ tía.  Quy trình định tính bitartrat đạt tính đặc hiệu

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

40

3.2. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI

PARACETAMOL,

DEXTROMETHORPHAN

HYDROBROMID,

LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ PDA 3.2.1. Xử lý mẫu 3.2.1.1. Dung môi pha mẫu Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu Thời gian siêu âm đến khi mẫu tan hết bằng cảm quan (phút) Mẫu 1 2 3 Trung bình

Nước – ACN (90:10) 20 21 21 20,67

Nước 25 24 26 25,00

Nước – ACN (85:15) 18 18 17 17,67

Nước – ACN (80:20) 12 11 11 11,33

Nhận xét Với dung môi pha mẫu là nước – ACN (80:20) mẫu tan hết bằng cảm quan trong thời gian siêu âm nhỏ nhất → Chọn dung môi hòa tan mẫu là nước – ACN (80:20) để khảo sát tiếp.

3.2.1.2. Thời gian siêu âm mẫu Tiến hành định lượng các mẫu thử được pha trong dung môi pha mẫu là nước – ACN (80:20) ở các khoảng thời gian siêu âm mẫu 10 phút, 15 phút, 20 phút. Mỗi khoảng thời gian chuẩn bị 03 mẫu. Tính giá trị trung bình hàm lượng các hoạt chất (Phụ lục 1).

Bảng 3.2. Hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu Hàm lượng trung bình (%) 10 phút

15 phút

20 phút

Phenylephrin bitartrat

104,88

105,34

105,82

Paracetamol

104,51

105,19

105,54

Dextromethorphan HBr

108,02

109,53

109,42

Loratadin

107,60

108,23

108,64

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

41

120

Hàm lượng trung bình (%)

110 100 90

10 phút 15 phút

80

20 phút 70 60 50 Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

Hình 3.3. Biểu đồ hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu Nhận xét Sử dụng trắc nghiệm thống kê so sánh phương sai và so sánh các trung bình (Phụ lục 2) cho thấy: - Phenylephrin bitartrat, dextromethorphan hydrobromid: trung bình hàm lượng ở các thời gian siêu âm mẫu không khác nhau có ý nghĩa thống kê.

- Paracetamol: trung bình hàm lượng ở các thời gian siêu mẫu ở 15 phút và 20 phút không khác nhau có ý nghĩa thống kê; trung bình hàm lượng ở 20 phút khác nhau có ý nghĩa so với 10 phút.

- Loratadin: trung bình hàm lượng ở thời gian siêu mẫu ở 15 phút và 20 phút không khác nhau có ý nghĩa thống kê và khác nhau có ý nghĩa so với thời gian siêu âm mẫu 10 phút.

Nhìn chung, hàm lượng 4 hoạt chất định lượng được ở 15 và 20 phút không khác nhau và lớn hơn ở 10 phút. Tuy nhiên, để ổn định quá trình hòa tan mẫu, chọn thời gian siêu âm mẫu là 20 phút.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

42

3.2.2. Điều kiện sắc ký 3.2.2.1. Bước sóng phát hiện Phổ UV của dung dịch chuẩn và thử trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm cho đỉnh hấp thu cực đại của phenylephrin bitartrat là 273 nm; của paracetamol 206 nm và 243 nm; của dextromethorphan HBr là 226 nm và 279 nm; của loratadin là 240 nm và 273 nm. Do paracetamol có nồng độ lớn nên ưu tiên chọn bước sóng phát hiện cho các chất còn lại. Ở bước sóng 273 nm, các chất có nồng độ nhỏ đều có độ hấp thu tốt. Do đó, chọn 273 nm làm bước sóng phát hiện.

226

240

273 Phenylephrin bitartrat

Dextromethorphan HBr

279

Loratadin

Hình 3.4. Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

43

3.2.2.2. Chương trình gradient

Chương trình gradient 1 (Xem bảng 2.4)

Chương trình gradient 2 (Xem bảng 2.4) Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

44

Chương trình gradient 3 (Xem bảng 2.4)

Chương trình gradient 4 (Xem bảng 2.4) Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient (tiếp)

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

45

Nhận xét - Chương trình gradient 1: chỉ tách được pic phenylephrin bitartrat.

- Chương trình gradient 2: chỉ tách được 3 pic phenylephrin bitartrat, paracetamol, loratadin; pic dextromethorphan HBr chưa tách được do trùng với thời gian rửa giải với pic tá dược.

- Chương trình gradient 3: chỉ tách được pic phenylephrin bitartrat, paracemol; pic dextromethorphan HBr vẫn chưa tách hẳn với pic tá dược; pic loratadin bị dính chân với pic khác.

- Chương trình gradient 4: các pic tách nhau hoàn toàn, độ phân giải của pic dextromethorphan HBr với pic tá dược là 2,058 > 1,5  chọn chương trình gradient 4 làm chương trình để khảo sát tiếp.

Loratadin

Dextromethorphan HBr

Tá dược

Paracetamol

Phenylephrin bitartrat

3.2.2.3. Thay đổi pH và thành phần dung dịch B

pH 2,1 pH 2,5 pH 3,0

Hình 3.7. Sắc ký đồ với pha động ACN - TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0/pH 2,/ pH 2,1 bằng TFA

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

46

Hình 3.8. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch TFA pH 2,1

Hình 3.9. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch acid phosphoric pH 2,1

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

47

Nhận xét Trên chương trình gradient 4, tiến hành thay đổi pH và thành phần dung dịch B: - Khi thay đổi pH dung dịch B từ 3,0 đến 2,1: thời gian lưu của pic paracetamol và pic tá dược hầu như không thay đổi, thời gian lưu của các pic còn lại đều có sự thay đổi (Hình 3.7). Đặc biệt, khi pH dung dịch B là 2,1 thì pic dextromethorphan HBr tách hẳn với pic tá dược với độ phân giải càng lớn, các thông số sắc ký khác đều đạt và không tiếp tục giảm pH nữa vì sẽ ảnh hưởng tuổi thọ của cột.

Bảng 3.3. So sánh độ phân giải khi thay đổi pH dung dịch B Độ phân giải PHE PAR pH 3,0 12,463 pH 2,5 10,722 pH 2,1 9,331 - Với dung dịch B là nước chỉ chứa TFA pH 2,1:

DEX 2,058 3,655 4,882 hệ số đối xứng

LOR 14,630 10,993 9,820 của pic

dextromethorphan HBr và loratadin kém hơn so với khi dung dịch B là dung dịch TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA (Hình 3.8).

Bảng 3.4. So sánh hệ số bất đối (As) với dung dịch B là TFA pH 2,1 và TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA Hệ số bất đối TFA pH 2,1 TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA Phenylephrin bitartrat 0,985 1,109 Paracetamol 1,164 1,127 Dextromethorphan HBr 1,371 1,127 Loratadin 1,315 1,149 - Với dung dịch B là dung dịch acid phosphoric pH 2,1: pic dextromethorphan HBr chưa tách khỏi pic tá dược, pic phenylephrin bitartrat không xác định được trên sắc ký đồ (Hình 3.9).  Chọn dung dịch B là nước có chứa TEA 0,01% và chỉnh pH 2,1 bằng TFA. 3.2.2.4. Cột sắc ký Trên chương trình gradient 4 và dung dịch B là nước có chứa TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA, tiến hành thay cột C8 thành cột C18: Cột Inertsustain C18 (4,6 mm; 150 mm, 5 μm): các pic tách tốt, thời gian rửa giải không thay đổi nhiều so với cột Inertsustain C8 (4,6 mm; 150 mm, 5 μm), tuy nhiên pic paracetamol bị kéo đuôi (tailing) (Hình 3.10).  Chọn cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

48

Cột Inertsustain C18 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)

Cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

49

Bảng 3.5. So sánh cột Inertsustain C8 và Inertsustain C18 Cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) tR (phút) AS 1,109 4,680 1,127 6,407

Cột Phenylephrin bitartrat Paracetamol Dextromethorphan HBr

11,980

Loratadin

13,640

Inertsustain C18 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) tR (phút) AS

1,127 1,149

4,400 5,953

1,046 1,331

11,787

1,326

13,473

1,242

Kết luận Qua qua trình khảo sát, điều kiện sắc ký thích hợp như sau: + Cột sắc ký: Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 20 μl + Nhiệt độ cột: 25 oC + Bước sóng phát hiện: PDA 273 nm + Pha động: Dung môi A: Acetonitril Dung dịch B: Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,1 bằng TFA + Chương trình gradient: Bảng 3.6. Chương trình gradient tối ưu được lựa chọn Thời gian (phút) 0 12 15 20

Dung môi A (%)

Dung dịch B (%)

5 55 5 5

95 45 95 95

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 1

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

50

3.2.3.

Thẩm

định

quy

trình

định

lượng

đồng

thời

paracetamol,

dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang 3.2.3.1. Đề cương thẩm định Tương tự mục 2.2.2.4 3.2.3.2. Báo cáo kết quả thẩm định a. Tính đặc hiệu Dung môi pha mẫu

Placebo

Chuẩn phenylephrin bitartrat

Chuẩn paracetamol

Chuẩn dextromethorphan HBr

Hình 3.11. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Chuẩn loratadin

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

51

Hỗn hợp 4 chuẩn

Mẫu thử

Mẫu thử thêm chuẩn

Hình 3.12. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu (tiếp) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

52

243 206

273

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

240

226

273

279

Dextromethorphan HBr

Loratadin

Thử Chuẩn

Hình 3.13. Phổ UV-Vis của các pic tại thời gian lưu trong mẫu chuẩn và mẫu thử UV/24 giờ

Hình 3.14. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

53

H2O2 3%/48 giờ

1

Pic tạp 1 2

tR (phút) 1,827 12,467

RS 3,067

2

HCl 0,5 N/48 giờ Pic tạp 1 2

tR (phút) 2,613 5,373

RS 3,548

1

2

NaOH 0,5 N/48 giờ Pic tạp 3 4 6 7 19

tR (phút) 4,260 4,960 6,040 6,880 12,187

RS 3,678 1,563 1,501 2,476 1,571

6 1 2 3

4 5

7 …………..……17

18

19

Hình 3.15. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

54

Cách thủy 60 oC/48 giờ Pic tạp 1 2

tR (phút) 7,807 8,127

RS 8,711 2,017

1 2

Sấy 60 oC/48 giờ Pic tạp 1

tR (phút) 6,067

RS 1,921

1

Ánh sáng trực tiếp/48 giờ Pic tạp 1 2

1

tR (phút) 6,060 7,800

RS 1,810 8,448

2

Hình 3.16. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

55

Nhận xét: - Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các pic trong dung dịch chuẩn (Hình 3.11).

- Sắc ký đồ mẫu thử có pic có thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn (Hình 3.12). Trên sắc ký đồ mẫu thử các pic hoạt chất cần phân tích tách hoàn toàn khỏi các pic khác.

- Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích pic tăng lên so với trước khi thêm chuẩn (Hình 3.12).

- Trên sắc ký đồ mẫu thử ở các điều kiện khắc nghiệt, các pic tạp xuất hiện tách ra khỏi các pic của hoạt chất cần phân tích (Hình 3.14, 3.15, 3.16).

- Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ các mẫu phải tinh khiết (purity level xấp xỉ 100%). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn (Hình 3.13). b. Tính thích hợp hệ thống (Phụ lục 3) Bảng 3.7. Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng

Phenylephrin bitartrat Paracetamol Dextromethorphan hydrobromid Loratadin

TB SD RSD TB SD RSD TB SD RSD TB SD RSD

tR (phút) 4,52 0,01 0,18% 6,252 0,005 0,08% 11,85 0,005 0,04% 13,52 0,00 0,03%

S (mAU*s)

AS

RS

N

295742,67 1771,13 0,60% 39822958,33 130838,91 0,33% 300043,33 944,98 0,31% 612005,00 3064,33 0,50%

1,02 0,02 1,79% 1,11 0,02 1,90% 1,13 0,01 1,19% 1,19 0,02 1,66%

7,96 0,05 0,62% 32,86 0,13 0,39% 9,86 0,05 0,46%

4877,33 80,20 1,64% 20812,67 131,03 0,63% 80223,83 698,25 0,87% 99962,67 330,95 0,33%

Nhận xét: RSD của thời gian lưu và diện tích pic đều ≤ 2%; độ phân giải RS ≥ 1,5; hệ số đối xứng 0,8 ≤ AS ≤ 1,5  Quy trình đạt tính phù hợp hệ thống.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

56

c. Độ chính xác • Độ lặp lại Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ lặp lại Lượng mẫu thử

Phenylephrin

(mg)

S (mAU*s)

Chuẩn

295742,7

3207,8 3208,7 3208,3 3207,6 3208,1 3207,5 TB (n=6) RSD (n=6)

312477 317246 308818 318266 312933 308970

Hàm lượng (%)

105,32 106,64 103,82 107,02 105,21 103,89 105,32 1,27

Paracetamol

Dextromethorphan

Loratadin

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

39822958,3

-

300043,3

-

612005,0

-

41047925 41215980 42148827 41829713 41952974 42083567

103,24 103,38 105,74 104,96 105,25 105,60 104,70 1,06

306333 313118 313311 311355 311590 302249

107,57 109,66 109,74 109,08 109,14 105,89 108,51 1,38

662188 655256 660731 668165 665735 657616

108,07 106,65 107,55 108,78 108,37 107,07 107,75 0,75

Nhận xét: %RSD của % hàm lượng so với nhãn của các hoạt chất đều ≤ 2%  qui trình đạt độ lặp lại • Độ chính xác trung gian Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian Lượng

Phenylephrin

mẫu thử (mg)

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

Chuẩn

296968,0

3208,3 3208,9 3208,5 3207,9 3208,7 3207,8 TB (n=6) RSD (n=6) Ftn TB (n=12) RSD (n=12)

312459 317250 312824 314274 312916 309983

Paracetamol

Dextromethorphan

Loratadin

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

S (mAU*s)

Hàm lượng (%)

-

39917608,3

-

301167,7

-

611054,3

-

104,84 106,42 104,95 105,46 104,98 104,02 105,11 0,16 2,83 105,21

41838018 41488731 41910960 41225766 42168719 41506887

104,97 104,07 105,14 103,44 105,78 104,15 104,59 0,82 1,68 104,64

306349 313102 313300 309376 313574 309255

106,74 109,08 109,16 107,81 109,25 107,77 108,30 0,94 2,16 108,41

659190 655270 659719 658192 665758 660633

107,09 106,43 107,17 106,94 108,14 107,34 107,18 0,52 2,08 107,47

1,00

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

0,90

1,13

0,68

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

57

Nhận xét %RSD của % hàm lượng so với nhãn của các hoạt chất đều ≤ 2% Kiểm tra bằng F-test cho thấy Ftn < F0,05 = 5,05  Hai kiểm nghiệm viên đồng nhất về thống kê  Qui trình đạt độ chính xác trung gian d. Tính tuyến tính Bảng 3.10. Kết quả khảo sát diện tích pic các hoạt chất theo nồng độ Mức nồng độ 40% 60% 80% 100% 120% 140% Mức nồng độ 40% 60% 80% 100% 120% 140%

Phenylephrin bitartrat C (mg/ml) S (mAU*s) 0,0047 122510 0,0070 181400 0,0093 240453 0,0116 296978 0,0140 355196 0,0163 418846

Paracetamol C (mg/ml) S (mAU*s) 0,1999 16081022 0,2998 25004706 0,3997 32410968 0,4997 39653884 0,5996 46536178 0,6995 55501801

Dextromethorphan HBr C (mg/ml) S (mAU*s) 0,0060 126045 0,0090 185271 0,0120 244576 0,0150 300133 0,0180 360566 0,0210 432604

Loratadin C (mg/ml) S (mAU*s) 0,0020 249070 0,0030 379719 0,0040 498289 0,0050 617617 0,0060 726816 0,0070 856982

Tiến hành phân tích hồi quy (Phụ lục 4) thu được kết quả sau: Bảng 3.11. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất Hoạt chất

Phương trình hồi quy

Phenylephrin bitartrat

ŷ = 25286732,71x

Hệ số tương quan (r) 0,9999

Paracetamol

ŷ = 76894176,49x

0,9991

0,1999 – 0,6995

Dextromethorphan HBr

ŷ =20133653,62x

0,9992

0,0060 – 0,0210

Loratadin

ŷ =120188040,48x

0,9997

0,0020 – 0,0070

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Khoảng tuyến tính (mg/ml) 0,0047 – 0,0163

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

58

Phenylephrin bitartrat

400000

ŷ = 25286732,71x R = 0,9999

300000 200000 100000 0 0.0000

0.0050

0.0100

0.0150

Paracetamol

60000000

Diện tích pic (mAU*s)

Diện tích pic (mAU*s)

500000

ŷ = 76894176,49x R = 0,9991

50000000 40000000 30000000

20000000 10000000 0 0.0000

0.0200

0.2000

Nồng độ (mg/ml)

ŷ =20133653,62x R = 0,9992

300000 200000 100000 0 0.0000 0.0050 0.0100 0.0150 0.0200 0.0250

Diện tích pic (mAU*s)

Diện tích pic (mAU*s)

400000

0.6000

0.8000

Nồng độ (mg/ml)

Dextromethorphan HBr 500000

0.4000

Loratadin

1000000 800000

ŷ =120188040,48x R = 0,9997

600000 400000 200000 0 0.0000

0.0020

0.0040

0.0060

0.0080

Nồng độ (mg/ml)

Nồng độ (mg/ml)

Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích và nồng độ e. Độ đúng Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ đúng paracetamol Lượng

Chuẩn

Mẫu tự tạo

placebo

thêm vào

(mg)

(mg)

Chuẩn

-

-

2668,5 2668,9 2668,3 2668,8 2668,5 2668,6 2668,1 2668,5 2668,5

349,9 349,9 349,9 499,7 499,7 499,7 649,5 648,5 649,5

70%

100%

130%

Diện tích pic (mAU*s)

39822958,33 28285412 28208836 28302136 40261523 40157461 40358535 51723423 51728834 51021226

Lượng tìm lại (mg)

% phục hồi

354,9 353,9 355,1 505,2 503,8 506,4 649,0 649,0 640,2

101,44 101,16 101,50 101,08 100,82 101,32 99,91 100,07 98,55

Trung bình và RSD

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Trung bình và RSD (%) 101,37 0,18 101,08 0,25 99,51 0,84 100,65 0,97

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

59

Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ đúng phenylephrin bitartrat Diện tích pic (mAU*s)

Lượng tìm lại (mg)

% phục hồi

Trung bình và RSD (%)

-

295742,67

-

-

-

8,1 8,1 8,1 11,6 11,6 11,6 15,1 15,1 15,1

210959 209545 208345 299587 299857 301259 383394 391956 390971

8,3 8,2 8,2 11,8 11,8 11,9 15,1 15,4 15,4

101,90 101,22 100,64 101,30 101,39 101,87 99,72 101,95 101,69

Mẫu tự tạo

Lượng placebo (mg)

Chuẩn thêm vào (mg)

Chuẩn

2668,5 2668,9 2668,3 2668,8 2668,5 2668,6 2668,1 2668,5 2668,5

70%

100%

130%

Trung bình và RSD

101,25 0,62 101,52 0,30 101,12 1,21 101,30 0,72

Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ đúng dextromethorphan HBr Diện tích pic (mAU*s)

Lượng tìm lại (mg)

% phục hồi

Trung bình và RSD (%)

-

300043,33

-

-

-

10,5 10,5 10,5 15,0 15,0 15,0 19,5 19,5 19,5

208169 213708 207008 300576 295074 299126 394985 389384 388071

10,4 10,7 10,3 15,0 14,8 15,0 19,7 19,5 19,4

99,11 101,75 98,56 100,18 98,34 99,69 101,26 99,83 99,49

Mẫu tự tạo

Lượng placebo (mg)

Chuẩn thêm vào (mg)

Chuẩn

2668,5 2668,9 2668,3 2668,8 2668,5 2668,6 2668,1 2668,5 2668,5

70%

100%

130%

Trung bình và RSD

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

99,81 1,71 99,41 0,96 100,82 1,18 100,19 0,94

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

60

Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ đúng loratadin Diện tích pic (mAU*s)

Lượng tìm lại (mg)

% phục hồi

Trung bình và RSD (%)

-

612005,00

-

-

-

3,5 3,5 3,5 5,0 5,0 5,0 6,5 6,5 6,5

423784 437399 437399 606294 603624 603728 783968 782506 788964

3,5 3,6 3,6 4,9 4,9 4,9 6,4 6,4 6,4

98,72 101,89 101,89 98,87 98,43 98,45 98,34 98,16 98,97

Mẫu tự tạo

Lượng placebo (mg)

Chuẩn thêm vào (mg)

Chuẩn

2668,5 2668,9 2668,3 2668,8 2668,5 2668,6 2668,1 2668,5 2668,5

70%

100%

130%

Trung bình và RSD

100,84 1,82 98,58 0,25 98,49 0,43 99,30 1,50

Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi của paracetamol, phenylephrin bitartrat, dextromethorphan hydrobromid, loratadin nằm trong khoảng cho phép 98,0-102,0%; giá trị RSD của 3 mẫu cùng nồng độ và của 9 mẫu đều ≤ 2%. Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng. f. Khoảng xác định Các hoạt chất có khoảng tuyến tính từ 40% đến 140% so với nồng độ định lượng, đạt độ thu hồi tốt ở các mức nồng độ 70%, 100%, 130% và độ lặp lại của các mẫu tại mỗi nồng độ %RSD ≤ 2%. Vậy, chọn khoảng xác định của các hoạt chất từ 70% đến 130% so với nồng độ định lượng.

Bảng 3.16. Khoảng xác định của các hoạt chất Hoạt chất Phenylephrin bitartrat Paracetamol Dextromethorphan hydrobromid Loratadin

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Khoảng xác định (mg/ml) 0,0081-0,0151 0,3500-0,6500 0,0105-0,0195 0,0035-0,0065

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

61

g. Độ thô + Thay đổi tốc độ dòng: Tăng/giảm 0,1 ml/phút so với tốc độ dòng 1,0 ml/phút Bảng 3.17. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 0,9 ml/phút Diện tích pic (mAU*s) tại tốc độ dòng 0,9 ml/phút STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

325776

42957675

325876

630768

2

325785

42976796

327574

630857

3

325759

42965468

325767

631647

4

327459

42958794

324435

630479

5

326561

42965774

324647

631764

6

325796

42945678

325565

632647

TB

326189,33

42961697,50

325644,000

631360,333

RSD (%)

0,21%

0,02%

0,34%

0,13%

Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 1,1 ml/phút Diện tích pic (mAU*s) tại tốc độ dòng 1,1 ml/phút STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

274563

37878907

274756

565654

2

275668

37563479

274569

565676

3

274566

37497578

274564

562344

4

277575

37874598

274566

563412

5

275678

37874475

273434

568292

6

274575

37456758

278879

562343

TB

275437,50

37690965,83

275128,00

564620,17

RSD (%)

0,43%

0,55%

0,69%

0,42%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

62

+ Thay đổi nhiệt độ cột: Tăng/giảm 2 oC so với nhiệt độ cột 25 oC Bảng 3.19. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 23 oC Diện tích pic (mAU*s) tại nhiệt độ cột 23 oC STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

294563

39677856

294564

606456

2

294566

39656675

295645

603245

3

294565

39121039

296751

601234

4

293656

39345356

291344

603245

5

291323

39143147

292342

602334

6

292991

39456568

293454

602646

TB

293610,67

39400106,83

294016,67

603193,33

RSD (%)

0,44%

0,61%

0,69%

0,29%

Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 27 oC Diện tích pic (mAU*s) tại nhiệt độ cột 27 oC STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

295477

3967670

294576

603848

2

294757

3956690

298575

602342

3

294575

3912307

294553

603427

4

293464

3923728

295759

603474

5

292354

3923554

294755

604357

6

294575

3946462

295757

603755

TB

294200,33

3938401,83

295662,50

603533,83

RSD (%)

0,38%

0,55%

0,52%

0,11%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

63

+ Thay đổi pH dung dịch B: Tăng/giảm 0,1 độ pH so với pH 2,1 Bảng 3.21. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,0 Diện tích pic (mAU*s) với pH 2,0 STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

296768

39567673

294536

603246

2

296767

39563651

292354

603757

3

294434

39567789

293443

602644

4

294454

39979007

296775

602314

5

296788

39577668

297878

602313

6

296674

39567667

295767

602490

TB

295980,83

39637242,50

295125,50

602794,00

RSD (%)

0,40%

0,42%

0,70%

0,10%

Bảng 3.22. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,2 Diện tích pic (mAU*s) với pH 2,2 STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

295767

39765863

294585

603575

2

294585

39959560

299803

603485

3

294455

39958696

291239

604775

4

290980

39558868

296560

603457

5

291263

39984570

295563

602344

6

291636

39233588

295666

603489

TB

293114,33

39743524,16

295569,33

603520,83

RSD (%)

0,70%

0,75%

0,94%

0,13%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

64

+ Thay đổi tỷ lệ pha động trong chương trình gradient: Tăng/giảm 1% thành phần dung môi ACN trong chương trình gradient Bảng 3.23. Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (-1%) Diện tích pic (mAU*s) với chương trình gradient (-1%) STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

294765

40885973

295767

606864

2

292494

40723444

291244

602567

3

295757

40645466

293444

604657

4

293575

40667766

296766

604656

5

299331

40576767

296712

605223

6

293455

40572322

295656

603467

TB

294896,167

40678623,000

294931,500

604572,333

RSD (%)

0,83%

0,29%

0,74%

0,24%

Bảng 3.24. Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (+1%) Diện tích pic (mAU*s) với chương trình gradient (+1%) STT

Phenylephrin bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

1

294565

39568754

294570

604452

2

294533

39676763

299345

606842

3

292454

39467677

293230

603511

4

294578

39576776

294545

607996

5

294565

39568683

295651

602489

6

294042

39577547

291131

603356

TB

294122,833

39572700,000

294745,333

604774,333

RSD (%)

0,29%

0,17%

0,93%

0,36%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

65

+ Thay đổi cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ thô - cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)

STT 1 2 3 4 5 6 TB RSD (%)

Diện tích pic (mAU*s) với cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Phenylephrin Dextromethorphan Paracetamol Loratadin bitartrat hydrobromid 283850 38475095 298496 612988 283926 38463677 297533 611965 283538 38573319 294554 612279 285818 38549491 295436 613111 287361 38680766 298294 611270 285592 38872748 294260 613697 285014,17 38602516,00 296428,83 612551,67 0,53% 0,40% 0,64% 0,14%

+ Thay đổi vị trí đặt lọ chứa mẫu trong hệ thống tiêm mẫu tự động Bảng 3.26. Kết quả thẩm định độ thô - vị trí đặt lọ chứa mẫu trong hệ thống tiêm mẫu tự động Diện tích pic (mAU*s)

Vị trí đặt lọ chứa mẫu

Phenylephrin

1

341514

44052690

360433

694322

5

341526

44107205

359921

695059

10

343074

44104538

359455

696346

51

342466

44079356

358840

695624

55

342245

44049186

359227

695454

60

341838

43886208

357640

692472

101

343454

44174848

360625

696917

105

340187

43784991

356946

689978

110

341699

43783093

356829

690363

TB

342000,33

44002457,22

358879,56

694059,44

RSD (%)

0,28%

0,33%

0,40%

0,37%

bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan hydrobromid

Loratadin

Nhận xét: Khi thay đổi các yếu tố trên, %RSD của diện tích pic đều ≤ 2%. Phương pháp đạt yêu cầu về độ thô.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

66

+ Độ ổn định của dung dịch phân tích Bảng 3.27. Kết quả thẩm định độ ổn định của dung dịch phân tích Phenylephrin bitartrat Thời

Dung dịch chuẩn

điểm (giờ)

Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

Paracetamol

Dung dịch thử Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

Dung dịch chuẩn Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

Dung dịch thử Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

0

296978

-

340244

-

39653884

-

44498406

-

3

296054

0,31

345706

1,61

39945007

0,73

44406888

0,21

6

297256

0,09

341319

0,32

39916106

0,66

43864709

1,42

9

299754

0,93

339223

0,30

40072135

1,05

44637208

0,31

12

301227

1,43

338791

0,43

39996199

0,86

43953864

1,22

15

293386

1,21

338795

0,43

40023746

0,93

43874878

1,40

18

300754

1,27

342619

0,70

40210059

1,40

44069655

0,96

21

302643

1,91

342014

0,52

40266055

1,54

44060304

0,98

24

301701

1,59

339202

0,31

40353197

1,76

44016191

1,08

Dextromethorphan hydrobromid Thời điểm (giờ)

Dung dịch chuẩn

Dung dịch thử

Loratadin Dung dịch chuẩn

Dung dịch thử

Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

Diện tích pic (mAU*s)

RSD (%)

0

300133

-

363662

-

617617

-

694509

-

3

302352

0,74

362736

0,25

611485

0,99

698548

0,58

6

300767

0,21

359643

1,11

610977

1,08

687830

0,96

9

301769

0,55

360768

0,80

613276

0,70

690206

0,62

12

302194

0,69

359133

1,25

610942

1,08

692118

0,34

15

304461

1,44

359541

1,13

613886

0,60

693170

0,19

18

303439

1,10

360495

0,87

612254

0,87

694753

0,04

21

305075

1,65

360173

0,96

612272

0,87

695263

0,11

24

303972

1,28

359417

1,17

607122

1,70

692626

0,27

Nhận xét: Dung dịch chuẩn hỗn hợp vẫn ổn định trong 24 giờ, dung dịch thử ổn định trong 24 giờ (RSD ≤ 2%)

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

67

3.4. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP 4AMINOPHENOL CỦA PARACETAMOL TRONG VIÊN SỦI BỌT 3.4.1. Xây dựng quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt

4-aminophenol

4-aminophenol

Kết quả khảo sát chương trình sắc ký:

Chương trình 1

Chương trình 2 Hình 3.18. Sắc ký đồ các chương trình gradient khảo sát

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

68

Nhận xét Cả hai chương trình có pic tạp đều tách tốt. Tuy nhiên ở chương trình 1 có áp suất cột rất cao (khoảng 213 bar) và có một pic ra sau rất trễ làm kéo dài thời gian sắc ký. Chương trình 2 có áp suất cột thấp hơn (khoảng 148 bar) và thời gian ngắn hơn  chọn chương trình 2 Kết luận Điều kiện sắc ký •

Cột: Ultra Restek C18 (25 cm × 4,6 mm, 5 µm)

•

Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng

•

Bước sóng phát hiện: 272 nm

•

Thể tích tiêm: 20 µL

•

Pha động:

- Nước - Dung môi C: Methanol - Dung dịch D: Dung dịch natri butansulfonat 0,01 M trong hỗn hợp gồm 0,4 thể tích acid formic, 15 thể tích methanol và 85 thể tích nước Bảng 3.28. Chương trình gradient định lượng tạp 4-aminophenol Thời gian (phút) 0 10 10,1 30

Dung môi C (%) 0 0 100 100

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Dung dịch D (%) 80 80 0 0

Nước (%) 20 20 0 0

Tốc độ dòng (ml/phút) 0,8 0,8 0,6 0,6

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

69

3.4.2. Thẩm định quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt 3.4.2.1. Đề cương thẩm định: Tương tự mục 2.2.4.2 3.4.2.2. Báo cáo kết quả thẩm định a. Tính đặc hiệu

Dung môi pha mẫu

Mẫu thử

Placebo

Thử thêm chuẩn tạp Mẫu thử

Mẫu chuẩn

Mẫu chuẩn tạp

Phổ UV-Vis tại thời gian lưu

Hình 3.19. Tính đặc hiệu tạp 4-aminophenol Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

70

Nhận xét - Sắc ký đồ dung môi pha mẫu, mẫu placebo không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chuẩn tạp 4-aminophenol.

- Sắc ký đồ mẫu thử cho thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Pic tạp 4-aminophenol tách hoàn toàn khỏi các pic khác.

- Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, diện tích pic tạp 4-aminophenol tăng lên so với trước khi thêm chuẩn.

- Pic của tạp 4-aminophenol trong các sắc ký đồ tinh khiết (độ tinh khiết pic xấp xỉ 100%). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic tạp 4-aminophenol trong mẫu thử thêm chuẩn tạp giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic tạp 4-aminophenol trong mẫu chuẩn. b. Tính thích hợp hệ thống Bảng 3.29. Kết quả tính thích hợp hệ thống 4-aminophenol STT

tR (phút)

S (mAU*s)

AS

N

1

8,027

563671

1,3

11302

2

8,026

564128

1,3

10912

3

8,027

560612

1,3

11421

4

8,027

563525

1,3

11136

5

8,028

565317

1,3

11294

6

8,027

566892

1,3

11025

TB

8,027

564024,2

1,3

11181,67

SD

0,00

2093,96

0,02

191,69

RSD

0,01%

0,37%

1,38%

1,71%

Nhận xét: Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic đều ≤ 2%; độ phân giải RS ≥ 1,5; hệ số đối xứng 0,8 ≤ AS ≤ 1,5 → Quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. c. Độ chính xác

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

71

• Độ lặp lại Tiến hành sắc ký 6 mẫu thử giả lập, ghi nhận giá trị diện tích pic, từ đó suy ra hàm lượng tạp chất có trong mỗi mẫu.

Bảng 3.30. Kết quả thẩm định độ lặp lại tạp 4-aminophenol Khối lượng mẫu thử (mg) 6415,6 6417,4 6416,6 6415,2 6416,2 6415,0

STT Chuẩn 1 2 3 4 5 6 TB RSD

Diện tích pic (mAU*s) 564024,2 557098 562368 556758 564833 554746 559681

Hàm lượng tạp (mg/viên) 0,49 0,50 0,49 0,50 0,49 0,50 0,49 0,68%

Nhận xét: %RSD của hàm lượng tạp ≤ 2% → Quy trình đạt độ lặp lại • Độ chính xác trung gian Bảng 3.31. Kết quả độ chính xác trung gian tạp 4-aminophenol - Kiểm nghiệm viên: Nguyễn Thị Như Ngọc

- Kiểm nghiệm viên: Đỗ Thị Bích Liên

- Hệ thống HPLC: Hitachi Chromaster PDA

- Hệ thống HPLC: Hitachi Chromaster

-5430 (Nhật)

PDA -5430 (Nhật)

- Ngày tiến hành: 08/06/2017

- Ngày tiến hành: 09/06/2017

Khối lượng Diện tích pic Hàm lượng Khối lượng Diện tích Hàm lượng mẫu thử (mg) (mg/viên) mẫu thử (mg) pic (mg/viên) Chuẩn 564024,2 Chuẩn 557233,7 6415,6 550597 0,49 6416,6 562502 0,50 6417,4 562960 0,50 6417,8 561259 0,50 6416,6 561158 0,50 6417,0 550801 0,49 6415,2 563833 0,50 6415,8 560245 0,50 6416,2 564706 0,50 6417,4 561533 0,50 6415,0 559681 0,50 6415,6 554263 0,50 Trung bình: 0,50 mg/viên (n = 6) Trung bình: 0,50 mg/viên (n = 6) RSD (%) = 0,92% RSD (%) = 0,85% Trung bình: 0,50 mg/viên (n = 12) RSD (%) = 0,95%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

72

Ftn = 1,16 < F0,05 = 5,05 → Kết quả định lượng của 02 kiểm nghiệm không khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê → Quy trình đạt độ chính xác trung gian d. Tính tuyến tính Bảng 3.32. Kết quả khảo sát diện tích pic theo nồng độ tạp 4-aminophenol Nồng độ (mg/ml) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014

Diện tích pic (mAU*s) 156742 269608 368825 457548 563671 676264 769240

Kết quả thống kê R= 0,9996 F = 6427,26 F0,05 = FINV(0,05;1;5 ) = 6,61 ta = 80,17 tb = 10,49 t0,05 = TINV(0,05;5) = 2,57

4-aminophenol Diện tích pic (mAU*s)

1000000 ŷ = 50917048,38x + 59463,71 R = 0,9996

800000 600000

400000 200000 0 0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

Nồng độ (mg/ml)

Hình 3.20. Đồ thị tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic 4-aminophenol Nhận xét Nồng độ và diện tích có sự tương quan tuyến tính theo ŷ = 50917048,38x + 59463,71 với hệ số tương quan R = 0,9996 (phụ lục 5) e. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Suy ra từ phương trình hồi quy tuyến tính:

LOD =

3,3 ×  a

= 0,0004 (mg/ml) LOQ =

10 ×  a

= 0,001 (mg/ml)

Trong đó: : Độ lệch chuẩn của đáp ứng = Standard Error = 6707,95 (phụ lục 5) a: Độ dốc của đường chuẩn = 50917048,38

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

73

Tiêm lặp lại tại nồng độ LOQ 6 lần để kiểm tra độ chính xác, giá trị RSD của diện tích pic < 2,0% Bảng 3.33. Kết quả tính chính xác tại nồng độ LOQ STT 1 2 3 4 5 6 TB RSD

Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (mAU*s) 0,001 37769 0,001 37750 0,001 37801 0,001 37690 0,001 38002 0,001 37810 37803,67 0,28%

f. Độ đúng Bảng 3.34. Kết quả khảo sát hàm lượng tạp 4-aminophenol trong mẫu thử STT 1 2 3

Khối lượng mẫu thử (mg) 6415,3 6415,2 6415,2

Diện tích pic (mAU*s) Không phát hiện Không phát hiện Không phát hiện

Hàm lượng tạp (mg/viên) 0 0 0

Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm chuẩn tạp vào mẫu thử ở ba mức nồng độ 80%, 100%, 120% so với giới hạn quy định của tạp chất (0,1%). Ở mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 mẫu.

Bảng 3.35. Kết quả thẩm định độ đúng tạp 4-aminophenol Mẫu tự tạo Chuẩn 80%

100%

120%

Khối lượng mẫu thử (mg)

Chuẩn tạp thêm vào (mg)

Diện tích pic (mAU*s)

Lượng tìm lại (mg)

% phục hồi

Trung bình và RSD (%)

6415,6 6415,1 6416,0 6415,7 6415,5 6415,2 6415,2 6415,5 6415,4

0,80 0,80 0,80 1,00 1,00 1,00 1,20 1,20 1,20

557233,7 443018 445740 440739 559771 552865 558188 677013 678839 675217

0,78 0,79 0,78 0,99 0,98 0,99 1,20 1,20 1,19

98,38 98,98 98,54 99,44 98,22 99,16 100,23 100,50 99,96

-

Trung bình và RSD

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

98,63 0,32 98,94 0,65 100,23 0,27 99,27 0,83

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

74

Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi của 4-aminophenol nằm trong khoảng cho phép 98,0102,0%; giá trị RSD ≤ 2% → Quy trình đạt độ đúng g. Khoảng xác định Được đánh giá dựa trên sự tương quan của tính tuyến tính, giá trị độ chính xác và độ đúng của phương pháp → Khoảng xác định từ 80% đến 120% so với nồng độ tương ứng với giới hạn quy định của tạp chất (0,1%): 0,008-0,012 mg/ml 3.4. DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO VIÊN SỦI BỌT CHỨA PARACETAMOL,

DEXTROMETHORPHAN

LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT 3.4.1. Bìa SỞ Y TẾ BÌNH DƯƠNG CÔNG TY TNHH HASAN-DERMAPHARM

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

Viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS Số tiêu chuẩn: …

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

HYDROBROMID,

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

75

3.4.2. Tiêu đề Sở Y tế Bình Dương Công ty TNHH

Số tiêu chuẩn: ...

Viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS

Hasan-Dermapharm

Có hiệu lực từ: ...

Ban hành theo quyết định số .... ngày .... tháng .... năm ......

3.4.3. Yêu cầu kỹ thuật 3.4.3.1. Công thức cho một đơn vị thành phẩm Bảng 3.36. Công thức cho một viên sủi bọt Hàm lượng (mg/viên)

STT Thành phần Hoạt chất 1 2 3

Paracetamol Dextromethorphan hydrobromid Phenylephrin bitartrat

4

Loratadin

500,0 15,0 11,7 5,0

Tá dược 5 6 7

Manitol Acid citric khan Natri hydrocarbonat khan

330,0 950,0 810,0

8 9 10 11

Natri carbonat khan Povidon K30 Betacyclodextrin Sucralose

270,0 30,0 140,0 12,0

12 13 14 15 16 17

Natri benzoat PEG 6000 Natri docusat Simethicon Bột hương chanh Ethanol tuyệt đối (*)

80,0 20,0 1,2 5,1 20,0 280,0

Tổng cộng

3200,0

(*) Mất đi trong quá trình pha chế

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

76

3.4.3.2. Nguyên liệu, phụ liệu Bảng 3.37. Tiêu chuẩn của nguyên phụ liệu STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tên nguyên phụ liệu Paracetamol Dextromethorphan hydrobromid Phenylephrin bitartrat Loratadin Manitol Acid citric khan Natri hydrocarbonat khan Natri carbonat khan Povidon K30 Betacyclodextrin Sucralose Natri benzoat PEG 6000 Natri docusat Simethicon Bột hương chanh Ethanol tuyệt đối

Tiêu chuẩn EP 8 USP 38 USP 38 EP 8 DĐVN IV BP 2016 DĐVN IV BP 2016 BP 2016 USP 38 USP 38 DĐVN IV BP 2016 USP 38 USP 38 TCNSX BP 2016

3.4.3.3. Yêu cầu chất lượng - Hình thức Viên nén tròn, màu trắng, hai mặt phẳng, cạnh và thành viên lành lặn, có mùi và vị chanh.

- Độ đồng đều khối lượng Khối lượng trung bình viên ± 5% - Độ rã Không quá 5 phút - Định tính Chế phẩm phải cho phép thử định tính của paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat.

- Giới hạn tạp 4-aminophenol Không được quá 0,1%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

77

- Định lượng  Hàm lượng paracetamol (C8H9NO2) phải đạt từ 95,0 - 105,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình viên.  Hàm lượng phenylephrin bitartrat (C9H13NO2.C4H6O6) phải đạt từ 90,0 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình viên.  Hàm lượng loratadin (C22H23ClN2O2) phải đạt từ 90,0 - 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình viên.  Hàm lượng dextromethorphan hydrobromid (C18H25NO.HBr.H2O) phải đạt từ 90,0 - 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình viên.

- Độ đồng đều hàm lượng của dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat Đạt theo yêu cầu của DĐVN IV, phụ lục 11.2 3.4.4. Phương pháp thử 3.4.4.1. Hình thức Thử bằng cảm quan, viên phải đạt những yêu cầu đã nêu.

3.4.4.2. Độ đồng đều khối lượng Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 11.3 3.4.4.3. Độ rã Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 1.20 3.4.4.4. Định tính Định tính paracetamol Thời gian lưu của pic paracetamol trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn trong phần định lượng 4 hoạt chất bằng phương pháp HPLC. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic paracetamol trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn. Định tính dextromethorphan hydrobromid - Thời gian lưu của pic dextromethorphan trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn trong phần định lượng 4 hoạt chất bằng

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

78

phương pháp HPLC. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic dextromethorphan trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

- Cho phản ứng đặc trưng của BrHoà tan một lượng chế phẩm có chứa khoảng 3 mg ion bromid trong 5 ml nước, siêu âm khoảng 15 phút, khuấy từ khoảng 15 phút. Lọc lấy dịch lọc, acid hoá bằng acid nitric loãng và thêm 0,4 ml dung dịch bạc nitrat 4%. Lắc và để yên sẽ tạo tủa lổn nhổn. Lọc lấy tủa, rửa tủa ba lần, mỗi lần với 1 ml nước. Phân tán tủa trong 2 ml nước, thêm 1,5 ml dung dịch amoniac 10 M thì tủa khó tan. Định tính phenylephrin bitartrat - Thời gian lưu của pic phenylephrin trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn trong phần định lượng 4 hoạt chất bằng phương pháp HPLC. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic phenylephrin trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

- Cho phản ứng đặc trưng của bitartrat Hoà tan một lượng chế phẩm có chứa khoảng 15 mg bitartrat trong 5 ml nước, siêu âm khoảng 15 phút, khuấy từ khoảng 15 phút. Lọc lấy dịch lọc, thêm 0,05 ml dung dịch sắt (II) sulfat 1% và 0,05 ml dung dịch hydrogen peroxyd 10 TT; màu vàng không bền vững được tạo thành, sau khi màu vàng biến mất, thêm từng giọt dung dịch natri hydroxyd 2 M, xuất hiện màu xanh tím đến đỏ tía. Định tính loratadin Thời gian lưu của pic loratadin trong sắc ký đồ mẫu thử tương ứng với thời gian lưu trong sắc ký đồ mẫu chuẩn trong phần định lượng 4 hoạt chất bằng phương pháp HPLC. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic loratadin trong mẫu thử tương tự như mẫu chuẩn.

3.4.4.5. Giới hạn tạp chất 4-aminophenol a. Hóa chất, thuốc thử - Chất chuẩn: 4-aminophenol - Methanol loại dùng cho HPLC - Natri butansulfonat, acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

79

b. Thiết bị - Máy HPLC Hitachi Chromaster PDA-5430 (Phần mềm xử lý số liệu EZChrom Elite) – Nhật c. Cách thử Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn.

Cân một lượng bột chế phẩm tương ứng 1,0 g paracetamol cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, siêu âm đuổi khí.

Dung dịch chuẩn tạp gốc: Cân chính xác 10 mg chuẩn 4-aminophenol cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 10 phút, để nguội, định mức đến vạch bằng nước, lắc đều để được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml 4aminophenol .

Dung dịch đối chiếu: Hút chính xác 10 ml dung dịnh chuẩn tạp gốc vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch bằng methanol 15%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn chứa 0,01 mg/ml 4-aminophenol trong methanol 15%.

Chú ý: Tránh ánh sáng trong quá trình phân tích Điều kiện sắc ký: • Cột: Ultra Restek C18 (250 mm; 4,6 mm, 5 µm) • Nhiệt độ cột: Nhiệt độ phòng • Bước sóng phát hiện: PDA 272 nm • Thể tích tiêm: 20 µl • Pha động: - Nước - Dung môi C: Methanol - Dung dịch D: Dung dịch natri butansulfonat 0,01 M trong hỗn hợp gồm 0,4 thể tích acid formic, 15 thể tích methanol và 85 thể tích nước Bảng 3.38. Chương trình gradient định lượng tạp 4-aminophenol Thời gian (phút) 0 10 10,1 30

Dung môi C (%) 0 0 100 100

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Dung dịch D (%) 80 80 0 0

Nước (%) 20 20 0 0

Tốc độ dòng (ml/phút) 0,8 0,8 0,6 0,6

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

80

Yêu cầu: Trong sắc ký đồ thu được, diện tích pic tương ứng với 4-aminophenol trong dung dịch thử không được lớn hơn diện tích pic này trong dung dịch chuẩn (0,1%).

3.4.4.6. Định lượng a. Hóa chất, thuốc thử - Chất chuẩn: paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat - Acetonitril loại dùng cho HPLC, triethylamin, acid trifloroacetic đạt tiêu chuẩn phân tích b. Thiết bị Máy HPLC Hitachi Chromaster PDA-5430 (Phần mềm xử lý số liệu EZChrom Elite) – Nhật c. Cách thử Phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký: • Cột sắc ký: Inertsustain C8 (4,6 mm; 150 mm, 5 μm) • Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút • Thể tích tiêm: 20 μl • Nhiệt độ cột: 25 oC • Bước sóng phát hiện: PDA 273 nm • Pha động: Dung môi A: Acetonitril Dung dịch B: Cho 0,1 ml triethylamin vào 1 lít nước, chỉnh pH 2,1 bằng acid trifloroacetic.

Bảng 3.39. Chương trình gradient định lượng 4 hoạt chất Thời gian (phút)

Dung môi A (%)

Dung dịch B (%)

0 12 15 20

5 55 5 5

95 45 95 95

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 1

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

81

Dung môi pha mẫu: Acetonitril – nước (20:80) Mẫu chuẩn: Cân chính xác 12,5 mg loratadin; 29,3 mg phenylephrin bitartrat; 37,5 mg dextromethorphan hydrobromid các chất chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 1) và định mức cho tới vạch bằng dung môi pha mẫu. Cân 25 mg paracetamol chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 2). Hút chính xác 1 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình 2 và định mức bằng dung môi pha mẫu tới vạch để thu được nồng độ các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat về nồng độ tương ứng 0,5000 mg/ml; 0,0150 mg/ml; 0,0050 mg/ml; 0,0117 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứng với khối lượng trung bình viên cho vào bình định mức 100 ml, thêm từ từ một lượng khoảng 60 ml dung môi pha mẫu (tránh mẫu sủi mạnh trào ra khỏi bình định mức), chờ cho đến khi mẫu sủi hết, siêu âm trong khoảng 15 phút, để nguội, định mức cho đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu để có nồng độ paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat cuối cùng tương ứng khoảng 0,5000 mg/ml; 0,0150 mg/ml; 0,0050 mg/ml; 0,0117 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. Tiến hành sắc ký lần lượt mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ.

Dung dịch tương thích hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn, tính RSD của thời gian lưu và diện tích pic RSD ≤ 2%. Các pic phải đạt các thông số sắc ký khác (0,8 ≤ AS ≤ 1,5; RS ≥ 1,5, N ≥ 2000) Cách tính: Hàm lượng (%) hoạt chất trong một viên so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình viên được tính theo công thức sau:

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

82

X (%/nhãn) =

St ×mc ×C%×Dt ×MW×100 Sc ×mt ×Dc ×T

Trong đó: Sc, St: Diện tích pic trong mẫu chuẩn, mẫu thử.

Dc, Dt: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử. mc, mt: lượng cân của mẫu chuẩn, mẫu thử (mg) C%: hàm lượng % của chất chuẩn MW: khối lượng trung bình viên (mg) T: hàm lượng trên nhãn của hoạt chất trong một viên 3.4.4.7. Độ đồng đều hàm lượng của dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat Thử theo Dược điển Việt Nam IV, phụ lục 11.2, tiến hành trên 10 đơn vị riêng lẻ bất kỳ.

Mẫu chuẩn: Tương tự phần định lượng Mẫu thử: Tiến hành trên một viên với quy trình tương tự mẫu thử phần định lượng mục 3.5.4.7. Điều kiện sắc ký: Tương tự phần định lượng Cách tính: Hàm lượng (%) hoạt chất trong một viên so với hàm lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức sau: Y (%/nhãn) =

St ×mc ×C%×Dt ×100 Sc ×Dc ×T

Trong đó: Sc, St: Diện tích pic của pic của mẫu chuẩn, mẫu thử.

Dc, Dt: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử. mc: lượng cân của mẫu chuẩn (mg) C%: hàm lượng % của mẫu chuẩn tính trên nguyên trạng T: hàm lượng trên nhãn của hoạt chất trong một viên

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

83

3.4.5. Đóng gói – Ghi nhãn – Bảo quản Đóng gói: Hộp 03 vỉ x 04 viên sủi bọt. Vỉ xé nhôm – nhôm Ghi nhãn: Rõ ràng, đúng quy chế Bảo quản: Nơi khô thoáng, dưới 30 oC. Tránh ánh sáng. .... ngày .... tháng ... năm ....

Người đứng đầu đơn vị (ký tên, đóng dấu)

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

84

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN 4.1. Quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang 4.1.1. Quy trình xử lý mẫu Viên sủi bọt nghiên cứu có chứa phenylephrin bitartrat tan trong nước, loratadin thực tế không tan trong nước, paracetamol và dextromethorphan hydrobromid hơi tan trong nước. Mục đích bào chế đối với viên sủi bọt này là phối hợp với các tá dược thích hợp để khi cho vào nước thì viên phải sủi và các hoạt chất phải hòa tan hoàn toàn trong nước tạo thành dung dịch thuốc. Tuy nhiên, để đảm bảo định lượng đúng hàm lượng các dược chất, chúng tôi khảo sát dung môi pha mẫu là nước phối hợp với acetonitril ở các tỷ lệ khác nhau để hòa tan tối đa các dược chất. Với dung môi pha mẫu gồm nước – ACN (80:20) và thời gian siêu âm mẫu 20 phút cho thấy hàm lượng các dược chất định lượng được tối ưu nhất. Vì vậy, lựa chọn các điều kiện này để xử lý mẫu.

4.1.2. Điều kiện sắc ký Dựa vào cấu trúc hóa học của paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat đều là những chất phân cực có nối đôi liên hợp và có các nhóm mang màu nên có thể sử dụng kỹ thuật RP-HPLC với pha tĩnh kém phân cực, pha động phân cực và sử dụng đầu dò PDA để định lượng các hoạt chất này.

4.1.2.1. Pha động Khi chế tạo pha tĩnh pha liên kết, người ta thường cho các nhóm silanol trên bề mặt các hạt silica phản ứng với các hợp chất cơ clorosilan có chứa gốc alkyl (n-octyl, noctadecyl,…). Do cản trở không gian, chỉ có một số nhóm silanol bị silan hóa. Để khắc phục điều này, người ta cho phản ứng tiếp tục với clorotrimethylsilan do kích thước phân tử này nhỏ hơn có thể liên kết với các nhóm silanol tự do còn lại (kỹ

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

85

thuật end-capped silanol), nhưng thực tế hiệu suất end-capped thường không hoàn toàn do hiệu ứng không gian nên vẫn sẽ còn những nhóm silanol tự do trên bề mặt pha tĩnh. Khi phân tích các hợp chất có các nguyên tố có độ âm điện lớn và còn đôi điện tử chưa tham gia liên kết (O, N, …) sẽ tạo liên kết hydro với nhóm –OH của silanol tự do dẫn đến hiện tượng các phân tử của cùng một chất không được rửa giải cùng lúc nên pic thường bị kéo đuôi. Để khắc phục hiện tượng này, người ta thường thêm vào pha động các chất cải thiện hình dạng pic do có khả năng cạnh tranh tương tác với nhóm silanol tự do so với hoạt chất. Đối với các hợp chất có nhóm chức có tính acid, người ta thường thêm vào acid trifloroacetic. Đối với các hợp chất có nhóm chức có tính base, người ta thường thêm vào triethylamin. Trong nghiên cứu này, paracetamol và phenylephrin bitartart có nhóm –OH phenol có tính acid, dextromethorphan HBr và loratadin có nitơ còn đôi điện tử chưa liên kết nên có tính base theo thuyết acid-base của Lewis. Do đó, đề tài tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký ban đầu với pha động gồm dung môi hữu cơ kết hợp với dung dịch nước có chứa cả acid trifloroacetic và triethylamin cùng nồng độ 0,01% (tương ứng với pH 3,0) và sau đó khảo sát với sự thay đổi nồng độ acid trifloroacetic tương ứng với pH 3,0 đến 2,1. Ở pH 2,1 cho độ phân giải giữa pic tá dược và pic dextromethorphan HBr lớn hơn, do đó lựa chọn pH này.

Kết quả cho thấy khi sử dụng cả acid trifloroacetic và triethylamin thì hệ số bất đối (As) tốt hơn so với các trường hợp khác. Khi không sử dụng triethylamin, kết quả sắc ký đồ của hệ có dung dịch B chỉ chứa nước chỉnh pH 2,1 bằng acid trifloroacetic cho thấy hệ số bất đối của pic dextromethorphan HBr và loratadin kém hơn so với khi có sử dụng triethylamin. Khi không sử dụng cả acid trifloroacetic và triethylamin, chỉ sử dụng acid rẻ tiền hơn là acid phosphoric thì hiệu lực tách của cột trở nên kém ổn định do các chất phân tích vừa phải tương tác với pha tĩnh vừa tương tác với các nhóm silanol tự do trên pha tĩnh. Do đó, trên sắc ký đồ của hệ có dung dịch B chỉ chứa nước chỉnh pH 2,1 bằng acid phosphoric không xác định được pic phenylephrin bitartart và pic dextromethorphan chưa tách khỏi pic tá dược.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

86

4.2.1.2. Pha tĩnh Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với pha tĩnh kém phân cực, cột C8 hoặc C18 thường được sử dụng. Với cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) sẵn có, đề tài tiến hành khảo sát trên cột này. Pha tĩnh của cột C8 có nhóm alkyl 8 carbon sẽ phân cực hơn so với pha tĩnh cột C18 có nhóm alkyl 18 carbon nên khả năng tương tác với các chất phân tích sẽ khác nhau dẫn đến thời gian lưu sẽ khác nhau. Khi tiến hành khảo sát trên hai cột này với điều kiện sắc ký tương tự nhau thì thời gian lưu của các pic thay đổi rất ít, các thống số sắc ký khác đều đạt. Tuy nhiên, cột Inertsustain C18 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) có pic paracetamol bị kéo đuôi. Do đó lựa chọn cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm).

4.2. Quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt Tạp 4-aminophenol là một tạp phân hủy do paracetamol sinh ra trong quá trình bảo quản và sản xuất, đồng thời nó là một tạp có khả năng gây ra khiếm khuyết di truyền và gây độc trên thận nếu phơi nhiễm lâu dài hoặc lặp lại [19]. Do đó, tạp 4aminophenol bắt buột phải được kiểm soát trong cả nguyên liệu và thành phẩm đối với các sản phẩm có chứa paracetamol. Mức giới hạn tạp 4-aminophenol trong thành phẩm của các dược điển cho phép là 0,15% đối với USP 38, 0,1% đối với BP 2016 và dược điển Việt Nam IV [1], [19], [18]. Để kiểm soát chặt chẽ tạp này, chọn mức giới hạn tạp cho phép là 0,1%.

Quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt được khảo sát với điều kiện sắc ký ban đầu tương tự như dược điển Việt Nam IV với sắc ký tạo cặp ion. Vai trò của muối natri butansulfonat là muối tạo cặp ion. Tạp 4aminophenol ở dạng ion sẽ bị rửa giải quá nhanh trong pha động phân cực, quá trình cân bằng pha chưa kịp xảy ra nên pic thường bị kéo đuôi. Do đó thêm muối natri butansulfonat để tạo cặp ion với 4-aminophenol tạo thành cặp ion trung hòa không tích điện nên độ phân cưc giảm, sẽ tương tác tốt hơn với pha tĩnh kém phân cực dẫn đến cặp ion không bị rửa giải quá nhanh nên hệ số bất đối dễ đạt hơn.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

87

Khi triển khai với điều kiện này thấy áp suất cột rất cao (213 bar) do pha động có độ nhớt cao, vì vậy phải giảm tốc độ dòng và phối hợp pha động thêm với nước để giảm áp suất. Khi thành phần pha động thay đổi quá 5% sẽ phải thẩm định lại.

Ngoài ra, quy trình của DĐVN IV để xác định tạp này trong chế phẩm chỉ chứa paracetamol, trong khi đó mẫu thử trong đề tài này có chứa các dược chất và tá dược khác nữa. Nguyên tắc: khi thành phần mẫu phân tích thay đổi thì phải thẩm định lại do sự tương tác giữa các thành phần sẽ thay đổi khả năng tách. Quy trình được thẩm định theo hướng dẫn của ASEAN 2008 và đạt tất cả các chỉ tiêu cần thẩm định.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

88

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề tài đã hoàn thành mục tiêu đề ra của luận văn với các kết quả đạt được như sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các hoạt chất paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang với pha động không chứa dung dịch đệm. Quy trình đã được thẩm định theo hướng dẫn của ASEAN gồm tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, khoảng xác định, độ thô. Khoảng xác định của phenylephrin bitartrat 0,0081-0,0151 mg/ml, paracetamol 0,3500-0,6500 mg/ml, dextromethorphan hydrobromid 0,0105-0,0195 mg/ml, loratadin 0,0035-0,0065 mg/ml với hệ số tương quan từ 0,9991-0,9999. Độ thu hồi của các hoạt chất nằm trong khoảng 98-102% với RSD nhỏ hơn 2%.

- Xây dựng quy trình định lượng tạp 4-aminophenol của paracetamol trong viên sủi bọt. Quy trình đã được thẩm định theo hướng dẫn của ASEAN gồm tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, tính tuyến tính, khoảng xác định, giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện. Khoảng xác định của 4-aminophenol 0,008-0,012 mg/ml với hệ số tương quan 0,9996. Độ thu hồi của 4-aminophenol nằm trong khoảng 98-102% với RSD nhỏ hơn 2%, giới hạn phát hiện 0,0004 mg/ml, giới hạn định lượng 0,001 mg/ml. Do đó, quy trình đã xây dựng đủ tin cậy để kiểm soát tạp 4-aminophenol trong viên sủi bọt này.

- Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho viên sủi bọt chứa paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat gồm các chỉ tiêu: hình thức, độ đồng đều khối lượng, độ đồng đều hàm lượng, độ rã, giới hạn tạp 4aminophenol, định tính, định lượng.

KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu các tạp cần kiểm soát trong viên sủi bọt này để hoàn thiện tiêu chuẩn cho sản phẩm.

- Nghiên cứu khảo sát độ ổn định, xác định tuổi thọ của viên sủi bọt này.

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr.219-221, tr 462466.

2. Bộ Y tế (2012), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr.421-422, tr.748-750, tr.904-907 3. Bộ Y tế (2012), Kiểm nghiệm thuốc (Dành cho đài tạo dược sỹ đại học), NXB Giáo dục Việt Nam, Hà nội, tr. 177-201 4. Bộ Y tế (2013), Quyết định số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013 về việc ban hành Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8.

5. Nguyễn Thị Thu Nguyệt, Võ Thị Bạch Huệ (2014), Xây dựng quy trình định lượng và khảo sát độ hòa tan của paracetamol, cafein, phenylephrin hydroclorid trong viên nén bao phim Parin-An bằng phương pháp HPLC, Luận văn tốt nghiệp Dược sỹ chuyên khoa I, Trường ĐH Y Dược Hồ Chí Minh, tr.28 6. Đoàn Thị Ngọc Yến, Nguyễn Đức Tuấn (2012), Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan và loratadin trong một số dược phẩm đa thành phần bằng phương pháp HPLC với đầu dò dãy Diod quang, Khóa luận dược sỹ đại học, Trường ĐH Y Dược Hồ Chí Minh, tr.37 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 7. Akraa Hussen, Nazira Sarkis, Mohannad Alshehaby (2013), “New rapid RPHPLC method for simultaneous determination of some decongestants and cough-sedatives”, Int J Pharm Pharm Sci, Vol 5, Suppl 4, pp. 234-241 8. Anjana. M. N, Sreeja C Nair, Jipnomon Joseph (2013), “An updated review of cyclodextrins – an enabling technology for challenging pharmaceutical formulations”, Int J Pharm Pharm Sci, 5 (3), pp. 54 - 58 9. Asean (2008), Asean guideline for validation of analytical procedures, pp. 1-17 10. British Pharmacopoeia (2016), pp. 131-133 , pp. 502-503, pp. 785-786 11. European Pharmacopoeia – 8th Edition (2013), pp. 2963-2964, pp. 2015-2026, pp. 2638-2639

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

12. M. Palabıyık, F. Onur& (2007), “The Simultaneous Determination of Phenylephrine Hydrochloride, Paracetamol, Chlorpheniramine Maleate and Dextromethorphan

Hydrobromide

in

Pharmaceutical

Preparations”,

Chromatographia Supplement, Vol. 66, pp. 93- 96 13. Nitin Dubey, Rizwana Siddiqui And Dinesh K. Jain (2012), “Simultaneous Determination of Paracetamol, Phenylephrine Hydrochloride and Loratadine”, Asian Journal of Chemistry; Vol. 24, No. 11, pp. 5409-5410 14. Palled Mahesh, Karagane Swapnalee, Mane Aruna, Bhat Anilchandra, Shinde Prashanti (2013), “Analytical Method Development And Validation Of Acetaminophen,

Caffeine,

Phenylephrine

Hydrochloride

And

Dextromethorphan Hydrobromide In Tablet Dosage Form By Rp-Hplc”, International Journal of Pharmaceutical Science Invention, pp. 9-15 15. Phan Thanh Dung, Kieu Xuan Hai (2016), “Simultaneous determination of paracetamol, phenylephrine, clorpheniramine and related compound 4aminophenol in multi-components pharmaceuticals by high performance liquid chromatography”, Mahidol Univ J Pharm Sci; 43 (1), pp. 37-44 16. Ramadevi Bhimavarapu, Karuna Priya Chitra, Haritha Meda, Dhavani Kanikanti, Manasa Anne and N. Gowthami (2011), “Forced Degradation Study Of Paracetamol In Tablet Formulation Using RP-HPLC”, Bulletin of Pharmaceutical Research 2011, 1(3), pp. 15-16 17. Rouhollah Heydari (2008), “New HPLC Method for the Simultaneous Determination of Acetaminophen, Phenylephrine, Dextromethorphan and Chlorpheniramine in Pharmaceutical Formulations”, Analytical Letters, pp.965-976 18. United States Pharmacopeia, Second Supplement (USP 38-NF 33) (2015), CDROM 19. U.S Pharmacopeial Convention (2010), Safety Data Sheet, Material Name: 4Aminophenol, pp. 1-8 20. U.S Pharmacopeial Convention (2013), Safety Data Sheet, Material Name: Phenylephrine Bitartrate, pp. 1-6

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

TÀI LIỆU TRANG WEB 21. https://www.drugbank.ca/drugs/DB00316 (Truy cập ngày 03/08/2017) 22.https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/dextromethorphan#section=Decom position (Truy cập ngày 03/08/2017)

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PHỤ LỤC Trang Phụ lục 1. Kết quả định lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu .......... PL-1 Phụ lục 2. Kết quả xử lý thống kê khảo sát thời gian siêu âm mẫu .................... PL-2 Phụ lục 3. Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng ....................... PL-3 Phụ lục 4. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất ............................ PL-4 Phụ lục 5. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính 4-aminophenol .......................... PL-8 Phụ luc 6. Chứng nhận phân tích của các chất chuẩn .......................................... PL-9

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-1

Phụ lục 1. Kết quả định lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu Thời gian siêu âm mẫu

10 phút

15 phút

20 phút

10 phút

15 phút

20 phút

10 phút

15 phút

20 phút

10 phút

15 phút

20 phút

Khối lượng mẫu thử (mg) 3208,8 3208,6 3208,7 3208,7 3209,1 3208,9 3209,1 3208,9 3209,2 3208,8 3208,6 3208,7 3208,7 3209,1 3208,9 3209,1 3208,9 3209,2 3208,8 3208,6 3208,7 3208,7 3209,1 3208,9 3209,1 3208,9 3209,2 3208,8 3208,6 3208,7 3208,7 3209,1 3208,9 3209,1 3208,9 3209,2

S thử (mAU*s)

STB chuẩn (mAU*s)

Phenylephrin bitartrat 322184 325651 323795 326318 306971,33 324156 325428 326244 328504 325706 Paracetamol 42120480 42394520 42290529 42592486 40398261,33 42630538 42412868 42698406 42565170 42796888 Dextromethorphan HBr 309573 305559 302494 309292 297545,33 312646 308601 309662 308257 311736 Loratadin 639369 638302 638272 642245 591225,00 642474 642684 644509 646667 643548

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Hàm lượng (%) 104,33 105,46 104,86 105,67 104,96 105,38 105,64 106,38 105,46 104,14 104,83 104,57 105,31 105,40 104,86 105,56 105,24 105,80 109,32 107,91 106,83 109,23 110,40 108,98 109,34 108,86 110,07 107,71 107,54 107,53 108,20 108,23 108,27 108,57 108,94 108,40

Hàm lượng trung bình (%)

104,88

105,34

105,82

104,51

105,19

105,54

108,02

109,53

109,42

107,60

108,23

108,64

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-2

Phụ lục 2. Kết quả xử lý thống kê khảo sát thời gian siêu âm mẫu 10 phút và 15 phút F = 2,49 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau Phenylephrin |t Stat| = 1,18 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 1,45 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau Paracetamol |t Stat| = 2,62 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 2,72 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác Dextromethorphan nhau hydrobromid |t Stat| = 1,79 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 9,09 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau Loratadin |t Stat| = 10,22 > t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình khác nhau

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

15 phút và 20 phút F = 0,54 > F Critical one-tail = 0,05 → Hai phương sai khác nhau |t Stat| = 1,39 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 1,03 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau |t Stat| = 1,48 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 1,53 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau |t Stat| = 0,19 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 0,02 < F Critical one-tail = 0,05 → Hai phương sai không khác nhau |t Stat| = 2,54 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau

10 phút và 20 phút F = 1,35 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau |t Stat| = 2,19 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 1,49 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau |t Stat| = 3,97 > t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình khác nhau F = 4,17 < F Critical one-tail = 19 → Hai phương sai không khác nhau |t Stat| = 1,74 < t Critical two-tail = 2,78 → Hai trung bình không khác nhau F = 0,14 > F Critical one-tail = 0,05 → Hai phương sai khác nhau |t Stat| = 6,17 > t Critical two-tail = 3,18 → Hai trung bình khác nhau

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-3

Loratidin

Dextromethorphan hidrobromid

Paracetamol

Phenylephrin bitartrat

Phụ lục 3. Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng STT 1 2 3 4 5 6 TB SD RSD STT 1 2 3 4 5 6 TB SD RSD STT 1 2 3 4 5 6 TB SD RSD STT 1 2 3 4 5 6 TB SD RSD

tR (phút) 4,513 4,513 4,527 4,527 4,533 4,527 4,52 0,01 0,18% tR (phút) 6,247 6,247 6,253 6,253 6,260 6,253 6,252 0,005 0,08% tR (phút) 11,847 11,847 11,853 11,853 11,860 11,847 11,85 0,005 0,04% tR (phút) 13,520 13,520 13,520 13,520 13,527 13,513 13,52 0,00 0,03%

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

S (mAU*s) 296978 297385 294496 293865 294084 297648 295742,67 1771,13 0,60% S (mAU*s) 39653884 39701084 39850822 39847588 39863633 40020739 39822958,33 130838,91 0,33% S (mAU*s) 300133 299043 299991 299786 299504 301803 300043,33 944,98 0,31% S (mAU*s) 617617 610236 610419 610229 609956 613573 612005,00 3064,33 0,50%

AS 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,02 0,02 1,79% AS 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,11 0,02 1,90% AS 1,2 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,13 0,01 1,19% AS 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,19 0,02 1,66%

RS RS 7,9 7,9 8,0 8,0 8,0 8,0 7,96 0,05 0,62% RS 33,1 33,0 32,7 32,8 32,9 32,8 32,86 0,13 0,39% RS 9,9 9,9 9,8 9,8 9,9 9,8 9,86 0,05 0,46%

N 4893 4720 4934 4896 4937 4884 4877,33 80,20 1,64% N 20953 20983 20637 20767 20758 20778 20812,67 131,03 0,63% N 81388 80308 79555 79904 80590 79598 80223,83 698,25 0,87% N 100601 99834 99649 99884 99982 99826 99962,67 330,95 0,33%

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-4

Phụ lục 4. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất quy trình định lượng Phenylephrin bitartrat SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9999 R Square 0,9998 Adjusted R Square 0,9997 Standard Error 1944,90 Observations 6 ANOVA df Regression Residual Total

Intercept X Variable 1

1 4 5 Coefficients 4425,69 25286732,71

SS MS F 60598904652 60598904652 16020,34 15130491,37 3782622,84 60614035144 Standard Error 2237,74 199782,23

t Stat 1,98 126,57

P-value 0,12 0,00

Significance F 2,33683E-08

Lower 95% Upper 95% -1787,27 10638,64 24732048,32 25841417,10

Hệ số tương quan R = 0,9999 F = 16020,34 > F0,05 = FINV(0,05;1;4)=7,71→ Phương trình hồi quy tương thích ta = 126,57 > t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số a có ý nghĩa thống kê tb = 1,98 < t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số b không có ý nghĩa thống kê Vậy, phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ phenylephrin bitartrat là ŷ = 25286732,71x

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-5

Paracetamol SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9991 R Square 0,9982 Adjusted R Square 0,9978 Standard Error 678018,2665 Observations

6

ANOVA df

SS

Regression Residual

1 4

1E+15 2E+12

Total

5

1E+15

Coefficients 1286602,08 76894176,49

Standard Error 780106,95 1621909,00

Intercept X Variable 1

MS 1E+15 5E+11

F 2247,68

Significance F 0,00 7,708647422

t Stat 1,65 47,41

P-value 0,17 0,00

Lower 95% Upper 95% -879322,04 3452526,19 72391035,20 81397317,79

Hệ số tương quan R = 0,9991 F = 2247,68 > F0,05 = FINV(0,05;1;4)=7,71→ Phương trình hồi quy tương thích ta = 47,41 > t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số a có ý nghĩa thống kê tb = 1,65 < t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số b không có ý nghĩa thống kê Vậy, phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ paracetamol là ŷ = 76894176,49x

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-6

Dextromethorphan HBr SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9992 R Square 0,9984 Adjusted R Square 0,9981 Standard Error 4987,7474 Observations 6 ANOVA df Regression Residual

SS MS 1 63857115602 63857115602 4 99510496,42 24877624,1

Total

5 63956626099

Intercept X Variable 1

Coefficients 3035,36 20133653,62

Standard Error 5738,75 397395,00

t Stat 0,53 50,66

F 2566,85

P-value 0,62 0,00

Significance F 9,08288E-07

Lower 95% Upper 95% -12897,96 18968,68 19030308,23 21236999,01

Hệ số tương quan R = 0,9992 F = 2566,85 > F0,05 = FINV(0,05;1;4)=7,71→ Phương trình hồi quy tương thích ta = 50,66 > t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số a có ý nghĩa thống kê tb = 0,53 < t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số b không có ý nghĩa thống kê Vậy, phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dextromethorphan HBr là ŷ = 20133653,62x

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-7

Loratadin SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9997 R Square 0,9994 Adjusted R Square 0,9993 Standard Error 6033,8065 Observations 6 ANOVA df Regression Residual

1 4

SS MS 2,52021E+11 2,52021E+11 145627285,1 36406821,28

Total

5

2,52167E+11

Coefficients 14725,82 120188040,48

Standard Error 6942,31 1444554,25

Intercept X Variable 1

t Stat 2,12 83,20

F 6922,37

Significance F 1,2509E-07

P-value Lower 95% Upper 95% 0,10 -4549,13 34000,77 0,00 116177314,91 124198766,06

Hệ số tương quan R = 0,9997 F = 6922,37 > F0,05 = FINV(0,05;1;4)=7,71→ Phương trình hồi quy tương thích ta = 83,20 > t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số a có ý nghĩa thống kê tb = 2,12 < t0,05 = TINV(0,05;4) = 2,78 → Hệ số b không có ý nghĩa thống kê Vậy, phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ loratadin là ŷ = 120188040,48x

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-8

Phụ lục 5. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính tạp 4-aminophenol SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0,9996 R Square 0,9992 Adjusted R Square 0,9991 Standard Error 6707,95 Observations

7

ANOVA df Regression Residual Total

1 5 6 Coefficients

Intercept X Variable 1

SS MS F 2,89205E+11 2,89205E+11 6427,26 224982882,6 44996576,51 2,8943E+11 Standard Error

59463,71 50917048,38

5669,25 635111,80

t Stat 10,49 80,17

P-value

Significance F 5,72157E-09

Lower 95%

Upper 95%

0,00 44890,44 74036,99 0,00 49284441,52 52549655,25

Hệ số tương quan R = 0,9996 F = 6427,26 > F0,05 = FINV(0,05;1;5 ) = 6,61→ Phương trình hồi quy tương thích ta = 80,17 > t0,05 = TINV(0,05;5) = 2,57 → Hệ số a có ý nghĩa thống kê tb = 10,49 > t0,05 = TINV(0,05;5) = 2,57 → Hệ số b có ý nghĩa thống kê Vậy, phương trình biểu diễn tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ 4aminophenol là ŷ = 50917048,38x + 59463,71

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn

Bản quyền tài liệu này thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM

PL-9

Phụ luc 6. Chứng nhận phân tích của các chất chuẩn

Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử.

Ghi rõ nguồn tài liệu này khi trích dẫn