XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HOÀI ÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HOÀI ÂN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2019

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh là người trực tiếp hướng dẫn tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành Luận văn.

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trường và Trung tâm giám định ma túy của Viện khoa học hình sự - Bộ Công An đã giúp đỡ và tạo điều kiện về trang thiết bị cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và anh chị cán bộ Viện Công nghệ Dược Phẩm Quốc Gia- Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện về thiết bị và hỗ trợ cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp tại Trung tâm KN Dược phẩm, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Dù có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện đề tài, song có thể còn nhiều mặt thiếu sót và hạn chế. Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và sự chỉ dẫn của thầy cô giáo và các anh chị đồng nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2019

Trần Thị Hoài Ân

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ...................................................... 3 1.1.1. Tăng huyết áp .................................................................................................... 3 1.1.2. Amlodipin ........................................................................................................... 4 1.1.3. Nifedipin ............................................................................................................. 5 1.1.4. Varsatan .............................................................................................................. 6 1.1.5. Atenolol ............................................................................................................... 7 1.1.6. Hydroclorothiazid ............................................................................................. 8 1.1.7. Furosemid ........................................................................................................... 9 1.2. Một số các dược liệu và chế phẩm đông dược dùng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu. ........................................................... 10 1.3. Tình hình nghiên cứu xác định thuốc dược dược hạ huyết áp, lợi tiểu trộn lẫn trong chế phẩm đông dược ....................................................................... 13 1.4. Tổng quan về phương pháp LC-MS/MS ...................................................... 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 21 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu............................... 21 2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 21 2.1.2. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu ................................................................. 21 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 23 2.2.1: Xử lý mẫu ........................................................................................................ 23 2.2.2: Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS: ....................... 23 2.2.3: Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng: .................................. 23

2.2.4: Ứng dụng phân tích các mẫu chế phẩm đông dược đã thu thập được trên thị trường .............................................................................................................. 24 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................ 24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 25 3.1. Xây dựng phương pháp phân tích ........................................................ 25 3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch ................................................................................. 25 3.1.2. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ .......................................... 25 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................... 37 3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống .............................................................................. 37 3.2.2. Độ đặc hiệu của phương pháp ..................................................................... 39 3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng............................................... 43 3.2.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định .............................................................. 45 3.2.5. Độ đúng và độ chính xác .............................................................................. 48 3.3. Ứng dụng phân tích trên mẫu thực....................................................... 51 Chương IV: BÀN LUẬN .............................................................................. 57 4.1. Về nền mẫu .......................................................................................... 57 4.2. Về phương pháp phân tích ................................................................... 57 4.3. Về phương pháp xử lý mẫu .................................................................. 58 4.4. Về thẩm định phương pháp phân tích .................................................. 59 4.5. Về ứng dụng phương pháp ................................................................... 60 KẾT LUẬN .................................................................................................... 61 KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt ACN AOAC

HPLC

LC-MS/MS

Tiếng anh hoặc tên khoa học

Tiếng việt

Acetonitril Association of Official

Hiệp hội các nhà hóa

Analytical Chemists

phân tích chính thống

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography

cao

Liquid chromatography – Mass Sắc ký lỏng hai lần Spectrometry/Mass

khối phổ

Spectrometry LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiên

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng Khối lượng/điện tích

m/z MeOH

Methanol

MRM

Multiple Reaction Monitoring

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

NSAID

Non steroidal anti-

Thuốc chống viêm

inflammatory drug

không steroid

WHO

Word health organization

Tổ chức y tế thế giới

HCT

Hydroclorothiazid

AML

Amlodipin

NIF

Nifedipin

ATE

Atenolol

VAL

Valsartan

FUR

Furosemid

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.

Một số sản phẩm nguồn gốc đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết áp trên thị trường .....................................................................................................11

Bảng 2.1.

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu ....................................................21

Bảng 3.1.

Tối ưu điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu................................26

Bảng 3.2.

Điều kiện khối phổ của các chất phân tích ..............................................27

Bảng 3.3.

Khảo sát điều kiện pha động theo chế độ gradient .................................30

Bảng 3.4.

Kết quả đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc vào dung môi.....................33

Bảng 3.5.

Kết quả đánh giá hiệu suất chiết theo vào thời gian siêu âm .................35

Bảng 3.6.

Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS .......................38

Bảng 3.7.

LOD của các chất phân tích trên nền mẫu ...............................................43

Bảng 3.8.

Cách pha dãy các dung dịch chuẩn...........................................................45

Bảng 3.9.

Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu ...................................................................................................46

Bảng 3.10.

Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại trong ngày của phương pháp ....49

Bảng 3.11.

Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại khác ngày của phương pháp .....50

Bảng 3.12.

Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực .....................................................52

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1.a.

Hệ thống LC-MS/MS Bruker ...................................................................18

Hình 1.1. b. Tứ cực chập ba gấp cong trong hệ thống máy LC-MS/MS Brucker. .........18 Hình 3.1.

Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký ....................................................................29

Hình 3.2.

Sắc ký đồ khảo sát chế độ gradient thành phần pha động ......................30

Hình 3.3a.

Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của amlodipin trên nền viên nang .......40

Hình 3.3b.

Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của furosemid trên nền viên nang .......40

Hình 3.4a.

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nang ......41

Hình 3.4b.

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nén ........41

Hình 3.4c.

Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên hoàn..42

Hình 3.5.

Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD, LOQ trên nền viên hoàn ..44

Hình 3.6.

Phổ đồ định tính amlodipin trong mẫu NHA01 ......................................54

Hình 3.7.

Phổ đồ định tính furosemid trong mẫu NHA01 ......................................55

Hình 3.8.

Sắc ký đồ phân tích mẫu NHA01 .............................................................56

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay xu thế sử dụng các thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng phổ biến. Với suy nghĩ thuốc ‘tây y’ là những hóa chất được tổng hợp hóa học tuy tác dụng chữa bệnh nhanh nhưng đem lại nhiều tác dụng phụ thì các chế phẩm đông dược với thành phần tự nhiên được đánh giá là an toàn ít độc hơn. Tuy nhiên, do các chế phẩm từ đông dược tác dụng xuất hiện từ từ đòi hỏi người dùng phải sử dụng liên tục trong một thời gian dài. Để thu hút người dùng sử dụng sản phẩm hay tăng hiệu quả kinh doanh hiện nay một số nhà sản xuất và cơ sở khám chữa bệnh tư nhân đã trộn trái phép vào các chế phẩm đông dược một số loại thuốc hóa dược để đẩy nhanh tác dụng của thuốc và tạo ra tác dụng điều trị. Trong khoảng thời gian gần đây, đã có nhiều trường hợp người dùng do sử dụng các chế phẩm đông dược trộn trái phép chất hóa dược mà chịu nhiều biến chứng nghiêm trọng: gây độc cho gan, thận, suy tuyến thượng thận, nhiễm toan máu ….[36].

Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới, tăng huyết áp là một trong những bệnh gây tử vong hàng đầu thế giới và ước tính đang gia tăng. Theo thống kê năm 2013, mỗi năm trên thế giới có gần 9 triệu người chết do tăng huyết áp hoặc các biến chứng của tăng huyết áp [31]. Các nhóm dược chất hóa dược được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp: nhóm chẹn kênh calci, nhóm tác dụng lên hệ renin-angiotensin, nhóm tác dụng trên hệ giao cảm và thường phối hợp với các thuốc nhóm lợi tiểu. Trong đó các dược chất như: amlodipine, nifedipine, atenolol, valsartan, hydroclorothiazid, furosemide…. thường hay được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp do có hiệu quả điều trị tốt và có giá thành rẻ.

Các dược chất này được sử dụng một mình trong điều trị hoặc ở dạng phối hợp 2 đến 3 thành phần. Ngoài ra do đặc điểm bệnh lý của tăng huyết áp khiến người bệnh phải sử dụng thuốc thường xuyên đi kèm là các tác dụng không mong muốn cũng xuất hiện nhiều hơn. Nắm bắt xu hướng đó trên thị trường có rất nhiều các chế phẩm đông dược với chỉ định hỗ trợ hoặc thay thế điều trị tăng huyết áp, phòng chống tai biến do tăng huyết áp. Nhưng trong những năm gần đây, trên thế giới đã ghi nhận nhiều báo cáo của các nhóm nghiên 1

cứu phát hiện các trường hợp các chế phẩm đông dược này bị trộn trái phép các dược chất hóa dược như : amlodipin, nifedipin, valsartan, atenolol, clonidin hydrochlorothiazid,…. [14],[15],[22],[27],[28]. Do vậy trong việc đảm bảo chất lượng thuốc đông dược, bên cạnh việc chuẩn hóa các thành phần hoạt chất trong dược liệu thì cần phải có các phương pháp phân tích xác định các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược.

Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khố phổ (LC-MS/MS) là một phương pháp phân tích hiện đại, đang được triển khai rộng rãi ở các cơ sở phân tích và kiểm nghiệm thuốc. Với ưu thế trong khả năng phân tích tách chất của sắc ký lỏng (LC) kết hợp với khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS), phương pháp này cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao phù hợp với các chế phẩm có nền mẫu phức tạp như các chế phẩm đông dược, sinh học…

Với mục đích phát triển một phương pháp phân tích có thể phát hiện đồng thời nhiều hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược ở nồng độ thấp và có độ tin cậy cao, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc huyết áp và lợi tiểu trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS”.

Với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời amlodipin, atenolol, nifedipin, valsartan, hydroclorothiazid và furosemid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng LC-MS/MS. 2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng được để phát hiện các dược chất trên trộn lẫn trong chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Tăng huyết áp Tăng huyết áp là một bệnh lý trong đó trị số huyết áp lúc nghỉ cao hơn mức bình thường: tăng huyết áp tâm thu đơn thuần khi ≥ 140 mmHg, tăng huyết áp tâm trương đơn thuần khi ≥ 90 mmHg, hoặc tăng cả hai. [2] Các nhóm chất hóa dược được sử dụng để điều trị tăng huyết áp hiện nay: - Nhóm thuốc tác dụng trên hệ giao cảm: atenolol, propanolol, …

- Nhóm thuốc chẹn kênh calci: nifedipin, amlodipin, ….

- Nhóm thuốc ức chế hệ RAAS: valsartan, lorsatan, captopril, ….

- Nhóm thuốc lợi tiểu: clorothiazid, hydroclorothiazid, furosemid, ….

Các thuốc lợi tiểu làm giảm thể tích huyết tương dẫn đến làm giảm cung lượng tim và giảm huyết áp nên thường phối hợp với thuốc hạ huyết áp, làm tăng tác dụng của thuốc hạ huyết áp. Thường phối hợp thuốc lợi tiểu với thuốc hủy giao cảm và thuốc giãn mạch, ít hiệu quả hơn khi phối hợp với thuốc chẹn calci. Trong tăng huyết áp, thuốc lợi tiểu được dùng phổ biến do hiệu quả (đặc biệt đối với tăng huyết áp nhẹ), rẻ tiền, dễ sử dụng và giúp tăng tác dụng của các thuốc điều trị tăng huyết áp phối hợp. Các thuốc lợi tiểu hay được lựa chọn: lợi tiểu thiazide (hydroclorothiazid) là thuốc được sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất trong các thuốc lợi tiểu để điều trị tăng huyết áp nhẹ và trung bình khi tim thận bình thường, lợi tiểu quai (furosemide) tác dụng nhanh, mạnh, thời gian ngắn nên chỉ điều trị cơn tăng huyết áp kịch phát. Hiện nay trên thị trường có nhiều chế phẩm dạng phối hợp của 2 hoặc 3 nhóm thuốc trong điều trị tăng huyết áp như: Lostad HCT (lorsartan 50 + HCT 12,5mg ), Diovan HCT ( valsartan 80 + HCT 12,5mg) …

3

Các thuốc tim mạch đều là những thuốc có khoảng điều trị hẹp, nguy cơ gây tai biến và tương tác thuốc với nhiều loại thuốc khác cho nên đây đều là những thuốc nằm trong danh sách 30 danh mục thuốc cần phải kê đơn và bán theo đơn của bộ y tế và phải có sự theo dõi của bác sĩ.

1.1.2. Amlodipin Cấu trúc hóa học, tính chất vật lí

CTPT: C20H25ClN2O5 Tên khoa học: 3-ethyl 5-methyl (4RS)-2-[(2- aminoethoxy)methyl]-4-(2clorophenyl)-6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat KLPT: 408,9 - Bột màu trắng hoặc gần như trắng - Dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol khan, khó tan trong nước và 2-propanol.

- Dung dịch trong HCl 0,1N trong MeOH có cực đại hấp thụ tại 360 nm [3], [5] Tác dụng dược lý - Có tác dụng làm giãn mạch, giảm hậu gánh, hạ huyết áp.

- Amlodipin có thể sử dụng cho bệnh nhân suy thận có tăng huyết áp.

- Tác dụng không mong muốn: Giãn mạch gây hạ huyết áp quá mức khi không có điều chỉnh liều, nhất là khi phải dùng thuốc kéo dài. Hoa mắt, chóng mặt, đau đầu, phù cổ chân [2], [9].

Liều dùng: Uống 5 - 10 mg/ lần/ngày [9]

4

1.1.3. Nifedipin Cấu trúc, tính chất vật lí

CTPT: C17H28N2O6 Tên

khoa

học:

Dimethyl

2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-1,4-

dihydropyridine -3,5-dicarboxylat KLTP: 346,3 - Bột kết tinh màu vàng.

- Không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol, methanol.

- Dưới ánh sáng ban ngày hoặc ánh sáng nhân tạo ở bước sóng nhất định, chế phẩm dễ dàng chuyển thành dẫn chất nitrosophenylpyridin. Dưới ánh sáng tử ngoại chế phẩm chuyển thành dẫn chất nitrophenylpyridin.

- Tiến hành các phép thử trong điều kiện tránh ánh sáng hay dưới ánh sánh có bước sóng dài. Dung dịch chế phẩm phải pha ngay trước khi dùng và để trong bình tối màu tránh ánh sáng [3], [5].

- Dung dịch trong methanol có 2 đỉnh hấp thụ cực đại ở khoảng 340 nm, 235nm.

Tác dụng dược lý - Là thuốc chẹn kênh Calci thuốc nhóm dihydropyridine, có tác dụng chống cơn đau thắt ngực, chống tăng huyết áp và điều trị bệnh Raynaud [2], [9].

- Tác dụng không mong muốn:

5

Gây rối loạn tiêu hóa Tăng enzyme gan, tăng sản lợi, đau cơ, rối loạn thị giác.

Liều dùng: uống từ 20 - 60 mg/ngày 1.1.4. Varsatan Cấu trúc, tính chất vật lí

CTPT: C24H29N5O3 Tên khoa học: L-valine, N-(1-oxopentyl)-N-[[2’-(1H-tetrazol-5-yl)[1,1’biphenyl]-4-yl] methyl]-N-[p-(o-1H-Tetrazol-5-ylphenyl]-N-valeryl-L-valine KLPT: 435,52 - Bột màu trắng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm.

- Không tan trong nước, tan tự do trong ethanol khan, hơi tan trong methylene clorid, tan tốt trong methanol [5], [16].

Tác dụng dược lý - Valsartan ức chế chọn lọc angiotensin II thông qua gắn vào thụ thể AT1 ở nhiều mô khác nhau trong đó có cơ trơn mạch máu, tuyến thượng thận.

Có tác dụng làm giãn mạch, giảm hậu gánh, hạ huyết áp.

- Tác dụng không mong muốn: Suy thận cấp, tăng K+ máu.

Phát ban, dị ứng, giảm bạch cầu, phù, mất vị giác, ….[9], [2].

Liều dùng: uống 40 – 80 mg/ngày [9].

6

1.1.5. Atenolol Cấu trúc, tính chất vật lí

CTPT: C14H22N2O3.HCl Tên khoa học: 2-[4-[(2RS)-2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy] phenyl]-acetamid.

KLPT: 266,3 - Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, hơi tan trong nước, methanol, tan trong ethanol khan, khó tan trong methylene clorid.

- Dung dịch trong MeOH có đỉnh hấp thu cực đại tại 275 nm và 282nm [3], [5].

Tác dụng dược lý - Atenolol thuộc nhóm thuốc chẹn β giao cảm có tác dụng giảm huyết áp nhẹ và vừa, điều trị rối loạn nhịp tim, cơn đau thắt ngực.

- Tác dụng không mong muốn: Yếu cơ, mệt mỏi, ớn lạnh các đầu chi, hạ huyết áp thể đứng Tim đập chậm, ỉa chảy, buồn nôn, khó thở Có nguy cơ làm trầm trọng thêm bệnh suy tim, lo âu mất ngủ, trầm cảm, giảm ham muốn tình dục, liệt dương [9], [2].

Liều dùng: uống 50 - 100 mg/ngày [9]

7

1.1.6. Hydroclorothiazid Cấu trúc, tính chất vật lí

CTPT: C7H8ClN3O4S2 Tên khoa học: 6 -chloro-1,1-dioxo-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazin-7sulfonamide KLTP: 297,74 - Bột kết tinh màu trắng, ít tan trong nước; hơi tan trong ethanol 96%, methanol; tan trong aceton, các dung dịch kiềm loãng và dimethylformamid [3], [5], [16].

- Dung dịch trong MeOH và HCl có đỉnh hấp thụ UV 226, 271, 317nm.

Tác dụng dược lý - Tăng bài tiết natri clorid và nước kèm theo do ức chế tái hấp thu các ion Na+ và Cl- ở ống lượn xa.

- Có tác dụng hạ huyết áp do giảm thể tích huyết tương và dịch ngoại bào liên quan đến sự bài niệu natri. Tác dụng hạ huyết áp của HCT thể hiện chậm ra sau 1-2 tuần, còn tác dụng lợi tiểu xảy ra ngay sau khi dùng thuốc vài giờ.

Chỉ định dùng trong các trường hợp: phù do các bệnh tim, gan, thận; tăng huyết áp, tăng calci niệu không rõ nguyên nhân.

- Tác dụng không mong muốn: Dùng lâu gây rối loạn điện giải (mệt mỏi, nhức đầu, buồn nôn, chuột rút).

Nhiễm toan chuyển hóa, tăng nguy cơ bị gout hoặc làm bệnh gout nặng thêm, làm nặng thêm bênh đái tháo đường.

8

Có thể gây hôn mê gan ở những người bị xơ gan [9], [2].

Liều dùng: uống 12,5 mg - 500 mg/lần x 2 lần/ngày [9] 1.1.7. Furosemid Cấu trúc, tính chất vật lí

CTPT: C12H11ClN2O5S Tên

khoa

học:

acid

4-cloro-2-[(fural-2-ylmethyl)amino]-5-

sulfamoylbenzoic KLPT: 330,75 - Không tan trong nước; tan trong aceton, methanol, hơi tan trong ethanol, tan trong dung dịch kiềm loãng, rất tan trong dimethyl formamid [3], [5].

- Dung dịch trong NaOH 0,1M có các đỉnh hấp thụ cực đại tại 228, 270, 333nm.

Tác dụng dược lý, liều dùng - Furosemid ức chế đồng vận chuyển natri, kali, clorid ở nhánh lên của quai Henle. Có tác dụng lợi tiểu nhanh, mạnh. Được sử dụng cho các trường hợp: phù nặng, phù phổi cấp, tăng huyết áp, tăng calci niệu cấp tính.

- Tác dụng không mong muốn: Rối loạn điện giải do tác dụng nhanh, mạnh nên gây mỏi mệt, chuột rút, nặng có thể dẫn đến tiền hôn mê gan, hạ huyết áp thế đứng.

9

Gây nhiễm toan chuyển hóa (tăng acid uric máu dẫn tới gout, tăng glucose máu, tăng cholesterol máu ,…), có thể gây xuất huyết tiêu hóa [9], [2].

Liều dùng: uống 20 - 80 mg /ngày [9].

1.2. Một số các dược liệu và chế phẩm đông dược dùng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu.

Cao huyết áp trong đông y được gọi là chứng huyễn vựng. Có nhiều nguyên nhân gây ra và tùy từng nguyên nhân có những bài thuốc và sử dụng các dược liệu điều trị khác nhau như tinh thần căng thẳng, lo âu, cáu ngắt, tức giận (Âm hư dương xung) sử dụng bài thuốc thiên ma câu đằng ẩm; khi mắc chứng thiên về âm hư có lục vị quy thược; thiên về dương xung can hỏa thịnh có long đởm tả can thanh. Can thận âm hư có kỷ cúc địa hoàng thang, can thận dương hư dùng lục vị địa hoàng thanh gia giảm, thể tâm tỳ hư điều trị theo bài quy tỳ thang gia giảm… [34] - Trong đó các dược liệu thường được lựa chọn sử dụng như hòe hoa, cúc hoa, câu đằng, ba gạc, nhàu……được dùng riêng hoặc phối hợp trong các bài thuốc điều trị cao huyết áp.

- Các dược liệu được sử dụng để đem lại tác dụng lợi tiểu như râu ngô, mã đề, trạch tả, bạch phục linh… Các dược liệu này thường được sử dụng phối hợp trong các bài thuốc, chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết áp.

- Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm đông dược dùng trong điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp. Sau đây là một số chế phẩm đông dược có chỉ định hỗ trợ điều trị cao huyết áp đang được lưu hành trên thị trường:

10

Bảng 1.1. Một số sản phẩm nguồn gốc đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết áp trên thị trường STT

Tên sản phẩm Viên nang

1

cứng Hạ áp ích nhân

Nhà sản xuất, số

Thành phần

đăng ký

Địa long, Nattokinase, hòe hòa, huyền sâm, câu đằng, hạ khô thảo

CT Nam Dược 1464/2014/ATTPXNCB

Liều dùng

2 viên/lần 2 lần/ngày

Cao lá dâu tằm, cao

2

Viên nén

cần tây, cao tỏi, cao

CT IMC

Định áp

hoàng bá,

23135/2017/ATTP-

vương

Nattokinase, …

XNCB

3 viên/lần 2 lần/ngày

Dạ giao đằng, câu đằng, thiên ma, ích

3

Cốm Dưỡng

mẫu, phục linh, đỗ

CT CPDP PQA

huyết thanh

trọng, thạch quyết

6950/2012/ATTP-

não PQA

minh, hoàng cầm,

XNCB

1 gói/lần 2 lần/ngày

ngưu tất, tang ký sinh.

CT TNHH tư vấn y 4

Viên nang Nattospes

Nattokinase

dược Quốc Tế

2viên/lần

15649/2014/ATTP-

Ngày 3 lần

XNCB Táo nhân, đỗ trọng,

5

Viên nén Hạ hồi đơn

câu đằng, ngưu tất, hạ khô thảo, bạch thược, đảng sâm, sinh địa, linh chi

11

Công ty CP Dược VTYT Hải phòng

2-3 viên/lần

13689/2013/ATTP-

Ngày 2 lần

XNCB

Công ty TNHH

6

Viên nang

Cao xa tiền thảo, hòe

IPHA công nghệ

Thanh áp

hoa, ngọc mễ tu, hạ

Giấy XNNDQC số:

đan

khô thảo, tinh lá sen

356/2015/

2-3 viên/lần Ngày 3 lần

XNQC-ATTP Công ty TNHH thảo 7

Viên hoàn

Cao giảo cổ lam, cao

dược Kiên Minh

Ích áp cao

vương tôn

29530/2017/ATTPXNCB

Viên hoàn 8

Hạ áp đan Medi Happy

9

Ba gạc, Ba kích, Cúc hoa, Hòe hoa, ALA, L-arginin, Coenzyme Q10

10 viên/lần.

Ngày 2-3 lần

Công ty trách nhiệm hữu hạn Medistar Việt Nam 4556/2017/ATTP-

3 viên/lần Ngày 2 lần

XNCB

Viên hoàn

Thục địa, sơn thù,

Hoàn lục vị

trạch tả, hoài sơn,

bổ thận âm

phục linh, đơn bì

CTCP DP OPV

10 hoàn/lần

VD-2464-07

2 lần/ngày

Thục địa, sơn thù,

10

Viên hoàn

trạch tả, hoài sơn,

Tư âm bổ

phục linh, đơn bì,

thận hoàn

mạch môn, thạch hộc,

Viên hoàn mềm

2 viên/lần 3 lần/ngày

đỗ trọng, ngưu tất Hoàng cầm, hạ khô

11

thảo, hoa hòe, ngưu

CTCP DP Phúc

Viên nang

tất, đương quy, sinh

Vinh

mềm Hạ

địa, đan sâm, câu

1253/2009/YT-

huyết áp PV

đằng, thảo quyết

CNTC

minh, địa long, trân châu.

12

3 viên/lần 3 lần/ngày

1.3. Tình hình nghiên cứu xác định thuốc dược dược hạ huyết áp, lợi tiểu trộn lẫn trong chế phẩm đông dược 1.3.1. Trên thế giới Các chế phẩm từ đông dược ngày càng được sử dụng rộng rãi với các mục đích điều trị và hỗ trợ điều trị bệnh. Nhu cầu sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên ngày càng tăng đặc biệt ở Nhật Bản, Trung Quốc và một số nước ở Đông Nam Á. Tuy việc bổ sung tùy ý các chất phụ gia không được phê duyệt, các dược chất không công bố vào các sản phẩm này bị nghiêm cấm nhưng hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu, báo cáo cho thấy hiện nay việc trộn lẫn trái phép các dược chất tổng hợp vào các sản phẩm bổ sung, thuốc đông y cổ truyền diễn ra rất phổ biến, đặc biệt ở các nhóm PDE-5, corticoid, NSAID, glucocorticoid….[30], [26], [25]. Riêng các chất hóa dược điều trị tăng huyết áp, hiện nay trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu được tiến hành và phát hiện ra nhiều trường hợp trộn trái phép các chất nhóm này trong các chế phẩm đông dược như: Lu Yaling và các cộng sự (2009) tiến hành phân tích 8 loại thuốc hóa dược trộn bất hợp pháp trong thực phẩm bổ sung chống tăng huyết áp bằng phương pháp HPLC-MS sử dụng cột Spherigel C18, pha động là dung dịch đệm amoni format 0,005M (pH 3,0) - ACN - MeOH, sử dụng ciaslis làm chuẩn nội. Chế độ ESI+, LOD thấp nhất là 2,5 µg/l; LOQ thấp nhất là 8,3 µg/l.

Chế độ ESI-, LOD thấp nhất là 50 µg/l. Độ thu hồi trung bình từ 63,3 – 107,4% [27].

Y.L. Lu và cộng sự (2010) tiến hành nghiên cứu phân tích 18 dược chất được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, thuốc chẹn kênh calci và thuốc ức chế men chuyển được trộn trong thực phẩm bổ sung và các loại thuốc truyền thống Trung Quốc bằng sắc ký khối phổ ion hóa điện tử (LC/ESI-MS) sử dụng cột Xtimate TM C18, pha động là hỗn hợp MeOH, ACN và dung dịch đệm amoni format 20 mM (pH 3.2). Phương pháp xây 13

dựng có khoảng tuyến tính từ 0,03 đến 21,52 mg/kg, LOD trong khoảng 6,5 86,0 mg/ kg, độ thu hồi từ 71 - 109%. Tiến hành phân tích 35 mẫu thực phẩm bổ sung và các thuốc cổ truyền phát hiện 9 mẫu có hydrochlorothiazid, 2 mẫu phát hiện clonidin, 2 mẫu triamteren [28].

Tại Brazil, Ana Paula Lançanova Moreira và các cộng sự (2016) đã tiến hành nghiên cứu phân tích đồng thời 13 loại thuốc điều trị huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, β-blockers, thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II và thuốc ức chế men chuyển angiotensin trong các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược bằng phương pháp UHPLC-ESI-MS / MS, cột Zorbax ® SB-C18, pha động: MeOH – dung dịch acid acetic 0,1% và dung môi chiết mẫu là MeOH 100%.

Phương pháp có giới hạn phát hiện 0,02 – 2,51 mg/l và độ chính xác 80,56 – 111,28%. Kết quả phân tích 34 mẫu sản phẩm đã phát hiện 3 mẫu chứa thuốc lợi tiểu hydrochlorothiazid và 2 mẫu có furosemid [24].

Seok Heo và các cộng sự (2016) tiến hành phân tích đồng thời 35 chất hóa dược điều trị tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng LC/MS/MS sử dụng cột Waters Atlantis dC18, pha động: dung dịch acid acetic 0,5 mM trong nước và dung dịch acid acetic 0,5 mM trong ACN. Phương pháp có LOD, LOQ dao động từ 0,20 – 20,0 ng/g và 0,50 – 60 ng/g, độ tuyến tính r2 > 0,999; độ chính xác trong ngày và khác ngày là 84,36-115,82% và 83,78 – 118,69%.

Thực hiện thử nghiệm trên 97 mẫu thực phẩm bổ sung có sẵn trên thị trường chưa phát hiện mẫu có chứa 35 dược chất trên [18].

Kesting J. R. và các cộng sự (2009) khi phân tích viên nang mềm Gold Night (một thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp) bằng phương pháp LC–HRMS, cột C18, pha động sử dụng là ACN – nước có acid formic 0,1% và LC–MS–SPE/NMR cột C12, pha động: ACN – nước có acid formic 0,1% đã phát hiện ba chất amlodipin (1,3mg), indapamin (1,3mg), valsartan (30,8mg) được trộn trái phép trong viên [22].

14

Zhu và các cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu phát hiện nhanh 4 loại chất hóa dược chống tăng huyết áp: nicardipin.HCl, doxazosin mesylat, propranolol.HCl, hydroclorothiazid bằng phương pháp TLC- SERS cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện khoảng 0,005 µg. Kết quả phát hiện 2 trong số 10 thuốc y học cổ truyền phát hiện dương tính [33].

Nghiên cứu của Seok Heo và các cộng sự (2016) xây dựng phương pháp xác định đồng thời 25 hợp chất chống tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng phương pháp UPLC detector UV 205 nm sử dụng cột C18, pha động: natri hexansulfonat 0,5 mM (H3PO4 0,1%) – ACN, chiết mẫu đơn giản bằng MeOH. Phương pháp có LOD, LOQ của mẫu rắn 0,20 – 1,00 µg/ml và 0,603,00 µg/ml, mẫu lỏng là 0,30 – 1,20 µg/ml và 0,90 - 3,6 0 µg/ml. Độ chính xác trong ngày và khác ngày 82,25 – 111,42 % và 80,70 – 115,64 %. Phân tích 97 mẫu thực phẩm bổ sung trên thị trường phát hiện 2 mẫu có chứa atenolol với hàm lượng từ 16,81 – 28,07 µg/g [19].

Các nghiên cứu đã cho thấy bên cạnh các phương pháp TLC, cận hồng ngoại, HPLC detector UV thì việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS hiện đang là phương pháp phân tích được lựa chọn tối ưu trong nghiên cứu các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm có nguồn gốc thảo dược. Phương pháp giúp cho phân tích được số lượng lớn các hoạt chất cùng lúc với độ đặc hiệu, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp tới nanogam.

1.3.2. Tại Việt Nam Trong Hội nghị “Tăng cường kiểm soát nguồn gốc và chất lượng dược liệu”, tổ chức ngày 14/9/2016 tại Hà Nội, ông Nguyễn Đăng Lâm, Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cho biết có thực trạng phát hiện thuốc đông dược trộn cả tân dược. Trước đây, có loại đông dược trộn 1 loại thuốc tây y, nhưng gần đây qua công tác kiểm tra, cơ quan chức năng phát hiện có thuốc trộn đến 3 đến 4 loại thuốc tây y [35].

15

Các thuốc đông y, thuốc cổ truyền bị pha trộn thêm thuốc tân dược hay gặp như: thuốc giảm đau, thuốc chữa khớp, thuốc chữa ho, thuốc tễ cho trẻ em và các dược chất thường được trộn: paracetamol trong thuốc đông dược điều trị cảm sốt, đau nhức xương khớp; corticoid trong thuốc trị khớp, hen, ăn uống kém. Glibenclamid và metformin trộn vào thuốc đông dược chữa tiểu đường, sildenafil, tadafil trộn trong thuốc có tác dụng bổ dương, tăng cường sinh lực cho nam giới. Năm 2012, Sở Y Tế tỉnh Quảng Nam thu hồi hai thuốc đông y là ‘’Thấp khớp tê bại đơn’’, SĐK: V196 – H12 – 10 của cơ sở đông dược Lợi Hoà Đường do thuốc có chứa tân dược paracetamol và thuốc ‘‘Thấp khớp hoàn’’, SĐK: VND – 3345 – 05 của cơ sở Linh Trung sản xuất do thuốc có chứa dexamethason. Năm 2015, Sở Y Tế Hải Phòng thu hồi thực phẩm chức năng “Thận lực phiến” do Công ty cổ phần dược phẩm Khang Đạt sản xuất đã phát hiện có hoạt chất sildenafil citrat, với hàm lượng 18,18 mg/viên. Tháng 5/2016, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm ra thông báo số 3133TB/ATTP về thu hồi thực phẩm bảo vệ sức khỏe Avena plus do dương tính với sildenafil. Năm 2018, sản phẩm tăng cân, giảm cân của công ty Tiến Hạnh qua phân tích Viện khoa học hình sự Bộ Công an đã phát hiện các có chứa cinnarizine, sibutramine [6], [35], [7], [4].

Nhóm nguyên cứu của Cao Công Khánh và các cộng sự đã xây dựng quy trình xác định đồng thời sibutramine, furosemid, dexamethason và piroxicam trong thực phẩm chức năng giảm cân và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh về xương, khớp, gout bằng kỹ thuật HPLC detector UV 225nm.

Nghiên cứu sử dụng cột Waters Symmetry C18 (250 mm x 4,6mm, 5µm), pha động là dung dịch đệm acetat (pH 3,5) – MeOH. Quy trình xây dựng có khoảng tuyến tính 0,5 – 50 µg/ml với furosemid; LOD và LOQ khoảng 0,1 mg/100g và 0,4 mg/100g; độ thu hồi từ 98,4 -102,7% cho tất cả các chất phân tích [10].

16

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Trần Lệ Hoa và các cộng sự đã xây dựng quy trình xác định đồng thời 4 chất trong nhóm huyết áp: amlodipin, nifedipin, valsartan, felodipin bằng phương pháp HPTLC và HPLC. Phương pháp HPTLC sử dụng hệ pha động Cloroform – ethylacetat - acid acetic (6 : 5 : 0,2) cho LOD từ 20 – 40 µg/ml. Phương pháp HPLC sử dụng dung môi chiết mẫu là MeOH, hệ pha động MeOH – dung dịch đệm phosphat 0,05M (pH 3,0) với thời gian phân tích 50 phút, LOD từ 0,25 – 0,50 µg/ml; LOQ từ 0,83 – 1,67 µg/ml; độ thu hồi từ 80,27 – 109,97% và RSD 0,89 – 5,16% [8].

Từ tổng quan tài liệu cho thấy cần có một phương pháp xác định các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược với độ chính xác, độ nhạy cao đến ppb sẽ là đem lại hiệu quả và lợi ích rất lớn cho việc kiểm nghiệm và phát hiện chất trộn trái phép.

1.4. Tổng quan về phương pháp LC-MS/MS Hiện nay sắc ký lỏng nối khối phổ (LC-MS) được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, thực phẩm, vật liệu công nghiệp.

Sắc ký lỏng (LC) cho phép tách các thành phần khác nhau trong cùng một mẫu dựa vào sự khác biệt về tính ái lực giữa pha tĩnh và pha động và tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích mà chúng có thể được phát hiện bằng detector UV, huỳnh quang, MS…Phương pháp sắc ký cho phép tách riêng các chất nhưng việc định danh hay định lượng một cách tin cậy sẽ phụ thuộc vào detector.

Khối phổ MS là phương pháp phát hiện có độ nhạy cao. Đầu tiên các chất phân tích được ion hóa bằng kĩ thuật khác nhau sau đó trong chân không các ion tạo thành này được phân loại dựa trên cơ sở tỉ lệ khối lượng - điện tích của mỗi ion (m/z) và sau cùng tiến hành đo cường độ của chúng. Phổ khối thu được cho thấy mức độ xuất hiện các ion sao cho mỗi ion đi kèm với một số

17

khối, do đó MS hỗ trợ rất lớn trong phân tích định lượng, đồng thời từ số khối của các ion thu được trực tiếp từ khối phổ giúp cho việc định danh chất đó.

Hình 1.1.a). Hệ thống LC-MS/MS

Hình 1.1. b). Tứ cực chập ba gấp

Bruker

cong trong hệ thống máy LC-MS/MS Brucker [13].

Hệ thống phân tích khối phổ kế gồm: bộ phận nạp mẫu (trong LC-MS bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký), bộ phận ghép nối giữa bộ phận tiêm mẫu và những bộ phân của hệ thống MS, nguồn ion hóa mẫu (có nhiệm vụ ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh các phân tử trung hòa thành các mảnh ion, gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao), các thấu kính tĩnh điện giúp tạo ion một cách hiệu quả, khối phổ kế phân tách ion theo tỉ lệ m/z (khối lượng ion/điện tích) và các ion sau khi lọc sẽ đi vào đầu dò, được khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ. Cuối cùng là bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system) [1].

Có ba kiểu hình thành ion: ion hóa điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI). Trong đó, kiểu ion hóa điện tử (ESI) được sử dụng phổ biến nhất, thực hiện ở áp suất khí quyển. Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời, các dung dịch mẫu này được

18

phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da [17]. Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube).

Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole) được cấu tạo gồm 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực. Hiện nay còn sử dụng ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ trong đó Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là buồng để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để định danh cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần.

Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm: + Quét toàn phổ (SCAN): cho khối phổ toàn ion của tất cả các chất.

Trong đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS/MS thường được sử dụng để khảo sát ion mẹ, quét tất cả các ion con tạo thành nhằm xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất + Chọn lọc ion (SIM): ở chế độ quét ion chọn lọc SIM chỉ ghi nhận tín hiệu của một số mảnh ion đặc trưng của chất cần phân tích căn cứ vào số khối.

Thường không dùng để nhận danh hay so sánh trong các thư viện có sẵn mà được dùng để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã xác định được ion mẹ. + SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring). Trong đó chế độ SRM sẽ cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.

19

+ MRM do yêu cầu trên thực tế về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên cần xác định 2 ion con trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện [13].

Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách cao của LC và vừa có khả năng phát hiện, định lượng chính xác của MS đối với các chất hữu cơ ít hoặc không bay hơi. Do đó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích với phổ mẫu đa dạng.

20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu  Hóa chất - Dung môi: methanol, acetonitril, ethanol loại dùng cho HPLC loại của Merck - Đức.

- Hóa chất: acid formic loại tinh khiết phân tích của Merck- Đức  Chất chuẩn Bảng 2.2.Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu STT 1

Chất chuẩn Amlodipin besilat

Hàm lượng 99,69%

Số lô

Nguồn gốc

WS. 0212213.02 Viện kiểm

2

Valsartan

98,38% (NT) WS.0116335.01

thuốc

100,17%, 3

Atenolol

ẩm: 0,11%

nghiệm

WS.0123093

Trung Ương

4

Furosemid

99,51% (NT) WS.0103128 100,19%,

5

Nifedipin

ẩm: 0,08%

Viện kiểm 0106200

nghiệm thuốc Hồ

6

Hydroclorothiazid

99,55% (NT) 0114308.01

Chí Minh

2.1.2. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu - Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Brucker EVOQ Qube-Mỹ - Cân phân tích Mettler – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1mg)

21

- Cân phân tích SHIMAZU – Nhật Bản (d = 0.1mg/0.01mg) - Máy ly tâm Hermle Z306 – Đức - Máy lắc siêu âm Daihan-Wuc A22H – Hàn Quốc - Thiết bị đuổi dung môi bằng khí Nitơ Hanon – Đài Loan - Tủ sấy Memmert ULM 500 – Đức - Máy lọc hút chân không - Các dụng cụ : các loại pipet, micropipet, bình định mức class A- Đức, ống đong, màng lọc mẫu (syringe filter), cốc có mỏ, vial, …

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu - Nền mẫu: được xây dựng dựa trên nguyên tắc gia giảm từ các bài thuốc y học cổ phương, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng dược lý lợi tiểu, hạ huyết áp đã công bố và một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu có thị phần lớn trên thị trường Việt Nam hiện nay.

- Mẫu chuẩn tự tạo : Các chất chuẩn trộn vào cùng nền mẫu với tỉ lệ nhất định.

- Mẫu thử : thu thập các mẫu chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường theo các yêu cầu sau : + Lựa chọn theo công dụng công bố: điều trị, hỗ trợ điều trị giảm huyết áp, chống tai biến do huyết áp cao; tăng huyết áp đi kèm tiểu đường; phù; có tác dụng lợi tiểu trong các trường hợp bí tiểu tiện, hoặc hỗ trợ giảm cân. + Theo các dạng bào chế rắn: bột cốm/nang, viên nén, viên hoàn, trà. + Cách thức thu thập: nhà thuốc, cửa hàng bán chế phẩm bảo vệ sức khỏe, phòng chuẩn trị lương y, qua mạng internet, mẫu gửi …. + Dạng chế phẩm: có SĐK hoặc không

22

2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1: Xử lý mẫu Dựa vào khả năng hòa tan của các nhóm thuốc tân dược, và tham khảo nhiều bài báo nghiên cứu [11], [18], [19], [24] lựa chọn khảo sát : - Khảo sát dung môi chiết: sử dụng các dung môi chiết: MeOH, EtOH 96%, hỗn hợp MeOH – H2O (50:50), hỗn hợp MeOH - H2O (70:30) để tiến hành chiết các chất phân tích khi thêm chuẩn vào nền mẫu. Xác định hiệu suất chiết thông qua lượng chất phân tích thu hồi để đánh giá khả năng chiết của từng dung môi.

- Khảo sát phương pháp chiết: sau khi tiến hành lựa chọn dung môi chiết khảo sát các phương pháp chiết sau: siêu âm 10 phút, 15 phút, 25 phút. Xác định hiệu suất chiết các chất phân tích thông qua lượng chất phân tích thu hồi được khi thêm chuẩn vào từng nền mẫu để đánh giá khả năng chiết của từng phương pháp.

2.2.2: Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS: - Khảo sát điều kiện sắc ký: lựa chọn pha động, cột sắc ký, tốc độ dòng để tách các chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.

- Khảo sát điều kiện khối phổ: lựa chọn nguồn ion, năng lượng bắn phá, điều kiện mảnh ion mẹ và các mảnh ion con để phát hiện và phân tích đồng thời hỗn hợp các chất nghiên cứu [29], [32], [21], [24], [23].

2.2.3: Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng: Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2016 [20], [12] với các tiêu chí: - Độ đặc hiệu - Độ phù hợp của hệ thống - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

23

- Khoảng nồng độ tuyến tính - Độ đúng và độ chụm 2.2.4: Ứng dụng phân tích các mẫu chế phẩm đông dược đã thu thập được trên thị trường - Sử dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng tiến hành phân tích một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị huyết áp, bí tiếu, phù để định tính, phát hiện các chất đã nghiên cứu dựa vào các thông số về thời gian lưu, mảnh ion.

- Định lượng các dược chất hóa dược trộn lẫn trong mẫu đã thu thập được dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của 6 chất.

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu - Kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm MSDR5 có sẵn của thiết bị LC-MS/MS. Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán.

24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xây dựng phương pháp phân tích 3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch  Dung dịch chuẩn gốc đơn (1 mg/ml): Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn amlodipin besilat, nifedipin, valsartan, hydroclorothiazid, atenolol và furosemid vào bình định mức 10 ml, hòa tan bằng dung môi methanol thu được dung dịch chuẩn gốc đơn mỗi chất nồng độ chính xác 1 mg/ml.  Dung dịch chuẩn đơn (4 µg/ml): dùng micropipet hút chính xác một thể tích khoảng 200 µl dung dịch chuẩn gốc đơn cho vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn đơn mỗi chất nồng độ chính xác 4 µg/ml.  Dung dịch chuẩn hỗn hợp (100 ng/ml): dùng micropipet lần lượt hút chính xác 250 µl dung dịch chuẩn đơn cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung môi methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 6 chất có nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml.

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ 3.1.2.1. Khảo sát điều kiện khối phổ Trong phương pháp phân tích LC-MS/MS, đầu tiên cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ), và ion sản phẩm (ion con) đối với từng hoạt chất.

Với kỹ thuật ion hóa ESI ở cả 2 chế độ âm và dương. Trong chế độ dương (positive), các ion phân tử có thể được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++ còn trong chế độ âm, các ion phân tử được tạo thành do mất đi một proton [M]- . Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng trong định tính và định lượng.

25

Sử dụng các dung dịch chuẩn đơn nồng độ 4 µg/ml, tiêm không qua cột vào hệ thống MS để xác định ion mẹ và các ion con. Các điều kiện bắn phá ion mẹ tạo thành các ion con được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ.

Từ kết quả tối ưu hóa, lựa chọn 2 ion con có tín hiệu lớn, trong đó ion con có cường độ tín hiệu lớn và ổn định hơn được lựa chọn làm ion con định lượng, ion con còn lại dùng để định tính. Điều kiện khối phổ lựa chọn và phổ đồ các chất phân tích được trình bày trong Bảng 3.1 và Bảng 3.2: Bảng 3.1.Tối ưu điều kiện khối phổ của các chất nghiên cứu Thông số (đơn vị)

Giá trị tối ưu

Điện áp đầu phun

Positive (V)

3500

(Capillary)

Negative (V)

3500

Khí chắn 20 Cone Gas Flow (l/phút) Nhiệt độ nón 350

0

Cone Temperature ( C) Nhiệt độ ion hóa (0C)

250

Nebulizer (psi)

40

Probe (psi)

45

CID gas

Ar 1.5 mTorr

26

Bảng 3.2. Điều kiện khối phổ của các chất phân tích Tên chất

Ion mẹ

Ion con

(m/z)

(m/z)

Amlodipin besilat

Nifedipin

Atenolol

Valsartan

Hydroclorothiazid

Furosemid

CE (eV)

Tỷ lệ (%)

237,8 (*)

9

100,0

293,9

9

61,7

315,3 (*)

7

100,0

253,5

17

35,1

190,0 (*)

17

100,0

145,0

20

105,9

179,1 (*)

23

100,0

350.3

13

63,2

78,0 (*)

27

100,1

268,0

14

24,0

285,1 (*)

10

100,0

205,1

18

92,2

409,2

347,1

267,0

434,2

296,2

329,3

(*): Ion con định lượng Nhận xét: Các giá trị thông số tối ưu được lựa chọn ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 đã xác định được điều kiện khối phổ để phân tích các chất nghiên cứu. Kết quả khảo sát cho thấy: 3 chất phân tích atenolol, amlodipin, nifedipine có ion mẹ ở dạng [M-H+] có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M + 1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất. 3 chất phân tích hydroclorothiazid, furosemide, valsartan có ion mẹ ở dạng [M-] có số khối nhỏ hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M-1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất.

27

Lựa chọn chế độ MRM để tiến hành ghi phổ trong đó mỗi chất phân tích được xác định bởi một ion mẹ và hai ion con trong đó một ion con dùng để định lượng, một ion con dùng để định tính. Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định Châu Âu (2002/657/EC) với điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ: 1,0 điểm và 2 ion con với mỗi ion con: 1,5 điểm).

3.1.2.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Dựa trên các tài liệu tham khảo đã tổng hợp cùng với điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm, cố định một số thông số chạy sắc ký sau: - Pha động: ACN – dung dịch acid formic 0,1% - Thể tích tiêm: 2 µl - Nhiệt độ cột: 40oC - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút Tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 6 chất nghiên cứu nồng độ 100 ng/ml và khảo sát các thông số khác:  Cột sắc ký Tiến hành khảo sát trên hai cột: - Cột Ultra II C18 (100 mm x 2,1 mm; 1,9µm) - Cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ng/ml sắc ký với điều kiện khối phổ đã xác định ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2.

Kết quả được trình bày trong hình sau:

28

AML

AML

ATE

ATE

NIF

NIF

FUR

FUR

VAL

VAL

HCT

HCT

(a) Cột Ultra C18

(b) Cột InertSustain AQ -C18

Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký Nhận xét: Từ Hình 3.1 cho thấy: Cột Ultra C18 có khả năng rửa giải làm các chất phân tích tách nhau rõ ràng: pic atenolol, nifedipin, HCT, furosemid, valsartan được rửa giải ra sớm.

Riêng amlodipin phải sử dụng tỷ lệ pha động ACN – dung dịch acid formic 0,1% là 90:10 được rửa giải ra chậm ở 7,1 phút và pic bị tù.

Cột InertSustain AQ-C18 cho kết quả rửa giải các chất phân tích tách nhau rõ ràng, chân pic gọn, các chất được rửa giải ra từ 2,1 đến 5,9 phút. Pha động cần sử dụng tỉ lệ ACN cao nhất là 70% để rửa giải ra 6 chất.

Do đó lựa chọn cột InertSustain AQ -C18 để tiến hành phân tích.

29

 Khảo sát tỷ lệ pha động Dựa vào các tài liệu tham khảo để lựa chọn khảo sát một số tỷ lệ pha động A: B, trong đó kênh A là dung dịch acid formic 0,1% và kênh B là ACN. Sử dụng cột InertSustain AQ - C18 tiến hành khảo sát các chế độ gradient sau: Bảng 3.3. Khảo sát điều kiện pha động theo chế độ gradient Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3 T (phút) 0

A (%) 100

B (%) 0

T (phút) 0 - 1,0

A (%) 90

4,0

30

70

1,0 - 5,0

4,1 - 6,0

30

70

6,1 - 8,5

100

5 FUR

10

0 – 1,5

95

5

30

70

1,6 – 4,1

60

40

5,1 - 8,0

30

70

4,1 - 6,0

30

70

8,1 - 10,0

90

10

6,1 – 8,5

95

5

FUR

FUR

HCT

HCT

VAL

AML

B (%) T (phút) A (%) B (%)

NIF

(a) Chế độ Gradient 1

VAL

VAL

AML

AML

ATE

HCT

ATE

NIF

(b) Chế độ Gradient2

ATE

NIF

(c) Chế độ Gradient3

Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát chế độ gradient thành phần pha động

30

Từ Hình 3.2 cho thấy: - Chương trình gradient 1: thời gian lưu của các chất từ 2,7 phút đến 5,9 phút; pic atenolol bị kéo chân trước, đỉnh pic không gọn. 5 chất còn lại cho pic gọn, cân xứng.

- Chương trình gradient 2: thời gian lưu của các chất từ 1,6 phút đến 5,9 phút; pic atenolol bị chẻ đầu, nhiễu nền không ổn định.

- Chương trình gradient 3: thời gian lưu của các chất từ 2,1 phút đến 5,8 phút; các chất phân tích thu được pic gọn, rõ ràng, đường nền ổn định.

- Như vậy lựa chọn chương trình gradient 3 để tiến hành phân tích Từ kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện LC-MS/MS như sau: - Cột: InertSustain AQ-C18 (100mm x 2,1 mm; 3,0 µm) - Nhiệt độ buồng cột: 400C - Thể tích tiêm mẫu: 2 µl - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút - Pha động: Kênh A: dung dịch acid formic 0,1% Kênh B: ACN - Chương trình pha động: chế độ gradient 3: 0 -1,5 phút: 5% pha động B; từ 1,6 - 4,0 phút: 40% pha động B; 4,1 – 6,0 phút: 70% pha động B; 6,18,5 phút: 5% pha động B. - Các điều kiện khối phổ: theo Bảng 3.1 và Bảng 3.2.

3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu Chuẩn bị các dung dịch sau: - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol có nồng độ amlodipin 20 ng/ml; hydroclorothiazid 50 ng/ml, valsartan 160 ng/ml và 3 chất còn lại có nồng độ 80 ng/ml.

31

- Dung dịch thử: xác định khối lượng trung bình của mỗi nền mẫu, nghiền mịn và đồng nhất. Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng (0,12 g với viên nang; 0,15 g với viên nén và 0,26 g với viên hoàn) cho vào ống falcon 50 ml. Thêm chính xác một lượng chuẩn vào nền mẫu sao cho nồng độ các chất phân tích sau khi xử lý tương đương với dung dịch chuẩn. Thêm 25 ml dung môi chiết, lắc đều. Lắc xoáy nhẹ, siêu âm ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy phần dịch trong, pha loãng thích hợp. Lọc qua màng lọc 0,22 µm. Tiến hành tiêm vào hệ thống LCMS/MS. Tiến hành chiết mẫu thử bằng các dung môi khác nhau và thời gian siêu âm khác nhau. Mỗi quá trình được thực hiện lặp lại 3 lần. Tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử so sánh với dung dịch chuẩn.

3.1.3.1. Khảo sát dung môi chiết Chuẩn bị các dung dịch thử theo quy trình trên. Thêm lần lượt 25 ml dung môi chiết sau: ethanol 96%, methanol, methanol – nước (50-50), methanol – nước (70-30). Lắc xoáy nhẹ, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy phần dịch trong, pha loãng thích hợp. Lọc qua màng lọc 0,22 µm. Tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.4 như sau:

32

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc vào dung môi

Hoạt chất ATE

AML

NIFE

VAL

HCT

FUR

Dung môi Nền viên nang m thêm vào

79,07

20,15

79,89

156,88

48,19

74,67

76,96

18,51

76,71

157,80

45,34

80,04

H (%)

97,34

91,86

96,02

100,59

94,16

107,19

± RSD

±3,09

± 3,85

± 2,93

± 2,32

± 3,05

± 6,81

67,33

19,04

76,96

138,91

34,22

65,97

H (%)

85,15

94,48

96,34

88,55

71,02

88,34

± RSD

±2,31

± 3,66

± 3,39

± 1,62

± 2,10

± 3,39

77,26

19,25

76,98

146,17

46,49

70,03

H (%)

97,71

95,53

96,35

93,17

96,47

93,78

± RSD

±1,65

± 1,55

± 1,34

± 1,34

± 5,81

± 5,59

62,17

16,26

73,11

106,00

43,47

44,03

(ng/ml) ** m tìm lại (ng/ml) MeOH

m tìm lại MeOHH2O (50-50)

(ng/ml)

m tìm lại MeOH – H2O (70-30)

(ng/ml)

m tìm lại EtOH

(ng/ml)

96%

H (%)

76,82

80,72

91,72

64,40

90,20

88,45

± RSD

±6,36

± 5,88

± 3,05

± 7,36

± 7,20

± 12,94

33

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc vào dung môi (tiếp) Hoạt chất Dung môi

ATE

AML

NIFE

VAL

HCT

FUR

Nền viên nén m thêm vào (ng/ml) ** m tìm lại (ng/ml) MeOH H (%) ± RSD m tìm lại MeOH(ng/ml) H2O (50H (%) 50) ± RSD m tìm lại MeOH(ng/ml) H2O (70H (%) 30) ± RSD m tìm lại (ng/ml) EtOH 96% H (%) ± RSD m thêm vào (ng/ml) ** m tìm lại (ng/ml) MeOH H (%) ± RSD m tìm lại MeOH(ng/ml) H2O (50H (%) 50) ± RSD m tìm lại MeOH(ng/ml) H2O (70H (%) 30) ± RSD m tìm lại (ng/ml) EtOH 96% H (%) ± RSD

79,07

20,15

79,89

156,88

48,19

74,67

76,54

19,14

76,85

157,41

47,43

72,29

96,79 ± 1,93

94,98 ± 1,39

96,20 ± 2,73

100,34 ± 0,43

98,42 ± 5,89

96,81 ± 1,12

64,59

18,91

77,36

147,62

37,75

71,14

81,69 ± 0,90

93,85 ± 2,24

90,58 ± 2,92

94,10 ± 5,71

78,33 ± 1,20

95,28 ± 3,69

76,10

19,65

74,94

155,15

47,54

72,39

96,25 ± 0,62

97,52 ± 2,12

93,81 ± 2,95

98,90 ± 5,09

88,65 ± 2,08

96,95 ± 4,81

71,72

16,89

71,41

140,35

34,61

68,29

83,83 89,39 ± 1,05 ± 4,88 Nền viên hoàn

89,46 ± 9,45

71,81 ± 6,72

91,45 ± 9,12

90,70 ± 2,88 79,07

20,15

79,89

156,88

48,19

74,67

71,86

19,49

77,55

145,93

46,42

67,39

90,88 ± 5,49

96,70 ± 2,33

97,07 ± 1,30

93,02 ± 2,50

96,32 ± 2,68

90,25 ± 1,81

68,11

18,51

74,52

118,22

40,84

59,79

86,14 ± 5,22

91,88 ± 8,33

93,28 ± 3,05

75,36 ± 2,39

84,75 ± 4,33

80,07 ± 4,40

73,67

19,31

77,38

149,37

46,75

70,05

93,11 ± 4,03

95,83 ± 2,94

96,86 ± 2,01

95,31 ± 4,69

97,02 ± 3,10

93,81 ± 6,23

93,11

18,60

75,81

143,57

39,16

58,51

92,51 ± 4,00

92,31 ± 5,12

94,90 ± 2,22

91,52 ± 4,88

81,26 ± 6,65

78,36 ± 5,14

**: lượng chất chuẩn thêm tính trong 1ml dung dịch mẫu sắc ký

34

Từ Bảng 3.4 cho thấy: hiệu suất chiết của các dung môi trên từng nền mẫu không có sự khác biệt lớn nhưng hiệu suất chiết giữa các dung môi có sự chênh lệch đáng kể.

Sử dụng dung môi chiết là ethanol 90% hiệu suất chiết từ 64,40 – 94,90%; RSD từ 1,05 – 12,94%. Dung môi chiết là methanol – nước (50:50) hiệu suất chiết từ 71,02 – 96,34%; RSD từ 0,90 – 8,33%. Dung môi chiết là methanol cho hiệu suất chiết từ 90,25 – 107,19%; RSD từ 0,43 – 6,81%.

Dung môi chiết methanol – nước (70:30) cho hiệu suất chiết từ 93,11 – 97, 52%; RSD từ 0,62 – 6,23%.

Như vậy dung môi chiết methanol – nước (70: 30) cho hiệu suất chiết đồng đều giữa các hoạt chất. Do đó chọn dung môi chiết là hỗn hợp methanol – nước (70:30) cho phương pháp phân tích.

3.1.3.2. Khảo sát thời gian siêu âm Tiến hành chuẩn bị mẫu như qui trình chung. Sử dụng dung môi chiết là methanol - nước = 70: 30. Tiến hành khảo sát 3 quy trình: chiết siêu âm 10 phút, 15 phút và 25 phút.

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá hiệu suất chiết theo vào thời gian siêu âm Hoạt chất ATE

AML

NIFE

VAL

HCT

FUR

Thời gian Nền viên nang m thêm vào (ng/ml) ** m tìm lại (ng/ml) 10 phút H (%) ± RSD m tìm lại (ng/ml) 15 phút H (%) ± RSD m tìm lại (ng/ml) 25 phút H (%) ± RSD

79,07

20,15

79,89

156,88

48,19

74,67

69,66

17,47

71,92

137,90

43,39

63,63

88,09 ±4,81

86,68 ±2,45

90,03 ±3.88

87,90 ±3,44

90,04 ±1,92

89,23 ±4,07

77,31

19,29

150,58

46,49

70,10

97,77 ±1,53

95,75 ±1,45

96,10 ±4,69

95,98 ±5,13

96,48 ±2,04

93,87 ±2,29

74,75

18,67

71,97

147,76

45,45

69,14

94,53 ±4,47

92,66 ±2,92

90,08 ±5,32

94,19 ±7,32

94,31 ±3,11

92,59 ±5,07

76,78

35

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá hiệu suất chiết theo vào thời gian siêu âm (tiếp)

Hoạt chất ATE

AML

NIFE

VAL

HCT

FUR

Thời gian Nền viên nén m thêm vào (ng/ml) ** 10 m tìm lại (ng) phút H (%) ± RSD 15 m tìm lại phút (ng/ml) H (%) ± RSD 25 m tìm lại phút (ng/ml) H (%) ± RSD

79,07

20,15

79,89

156,88

48,19

74,67

68,27 86,34 ± 4,29

17,68 87,76 ± 5,78

72,84 91,17 ± 5,42

146,87 93,62 ± 4,01

42,99 89,22 ± 8,78

68,01 91,08 ± 6,27

76,18

19,66

78,17

146,82

47,45

72,34

96,35 ± 1,84

97,56 ± 0,50

97,81 ± 1,76

93,59 ± 3,36

98,46 ± 1,26

96,88 ± 1,15

74,11

17,80

73,68

145,14

47,57

73,52

93,72 ± 3,26

88,34 92,23 ± 9,21 ± 4,45 Nền viên hoàn

92,52 ± 3,44

98,71 ± 1,14

98,46 ±6,80

m thêm vào 79,07 20,15 79,89 156,88 48,19 (ng/ml) ** 10 m tìm lại 69,90 18,95 75,57 149,94 41,26 phút (ng/ml) H (%) 88,40 94,06 94,59 95,58 85,62 ± RSD ± 9,83 ± 4,46 ± 3,97 ± 4,77 ± 1,62 15 m tìm lại 72,20 19,77 77,48 152,60 45,83 phút (ng/ml) H (%) 91,31 98,11 96,98 97,27 95,11 ± RSD ± 4,10 ± 1,34 ± 2,66 ± 2,90 ± 4,06 25 m tìm lại 73,13 19,42 77,15 155,02 47,47 phút (ng/ml) H (%) 92,49 96,39 96,57 98,81 98,51 ± RSD ± 9,60 ± 3,43 ± 3,16 ± 3,02 ± 5,98 **: lượng chất chuẩn thêm tính trong 1ml dung dịch mẫu sắc ký 36

74,67 63,40 85,50 ± 9,34 68,79 92,13 ± 6,93 70,77 94,78 ± 6,98

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy hiệu suất chiết thu được ứng với cả 6 chất nghiên cứu của 3 nền tương tự nhau. Thời gian siêu âm 10 phút cho hiệu suất chiết từ 85,50 – 95,58%, RSD từ 1,62-9,83%. Thời gian siêu âm 25 phút hiệu suất chiết 88,34 – 98,81% và RSD từ 1,14 – 9,60%. Siêu âm 15 phút thì hiệu suất chiết từ 91,31 – 98,46%; RSD từ 0,50% - 6,94%. Cho thấy phương pháp siêu âm 15 phút cho hiệu xuất chiết của các hoạt chất trên cả 3 nền tốt, ổn định; thời gian phân tích thích hợp. Vì vậy chọn phương pháp siêu âm 15 phút cho phương pháp phân tích mẫu tiếp theo.

Từ kết quả khảo sát thu được lựa chọn điều kiện xử lý mẫu như sau: - Mẫu thuốc đông dược, xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, đồng nhất mẫu và nghiền mịn.

- Cân chính xác lượng bột tương ứng 1/10 liều dùng vào ống ly tâm 50 ml.

- Thêm chính xác 25 ml hỗn hợp methanol – nước (70:30) vào ống ly tâm, lắc nhẹ, siêu âm 15 phút, ly tâm 6000 vòng/phút.

- Lấy phần dịch trong, pha loãng 50-200 lần bằng methanol, lọc qua màng lọc 0,22 µm.

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1. Độ phù hợp của hệ thống Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm: amlodipin besilat, valsartan, atenolol, nifedipin và furosemid 30 ng/ml; hydroclorothiazid 100 ng/ml.

Tiêm lặp lại 6 lần chuẩn hỗn hợp trên vào hệ thống LC- MS/MS và ghi nhận được kết quả phân tích được trình bày trong Bảng 3.6

37

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) Hoạt

C1

chất

tR (phút) 2,158 ATE

S (Cps.s)

S (Cps.s)

S (Cps.s)

S (Cps.s)

S (Cps.s)

S (Cps.s)

2,134

2,148

2,173

2,147

2,153

TB

RSD (%)

2,152 0,60

4,289

4,299

4,322

4,294

4,308

4,303 0,27

5,755

5,767

5,792

5,769

5,777

5,772 0,21

5,766

5,756

5,763

5,754

5,782

5,763 0,18

3,102

3,105

3,100

3,094

3,120

3,104 0,28

238896 231267 235292 231967 218809 221538 229628 3,42

tR (phút) 4,687 FUR

C6

169529 169098 164394 162301 177047 166674 168174 3,06

tR (phút) 3,103 HCT

C5

557643 567418 568297 520731 536030 534400 547420 3,61

tR (phút) 5,757 VAL

C4

309509 321642 318896 307152 311994 321858 315175 2,04

tR (phút) 5,771 NIF

C3

97517 109116 111576 112041 108769 109358 108063 4,94

tR (phút) 4,305 AML

C2

4,691

4,690

4,694

4,684

4,714

4,693 0,23

196489 199395 199917 201901 202562 196602 199478 1,28

Nhận xét: Từ Bảng 3.6 cho thấy RSD của thời gian lưu thấp (<1%) và RSD của diện tích pic dao động trong khoảng 0,18 – 4,94 % tùy mỗi chất.

Như vậy hệ thống đáp ứng yêu cầu theo AOAC 2016 (RSD < 15% đối với mức nồng độ chất 10 ppb ÷ 100 ppb).

38

3.2.2. Độ đặc hiệu của phương pháp Theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC), đối với phương pháp LCMS/MS cần phải đáp ứng yêu cầu về điểm IP ít nhất là 4 điểm. Tương đương với khi tiến hành phân tích có 1 ion mẹ (1 điểm) và 2 ion con (1,5 điểm) với mỗi chất. Do vậy phương pháp xây dựng đạt yêu cầu theo quy định của Châu Âu.

Sử dụng phần mềm so sánh thời gian lưu; ion mẹ; ion con; tỷ lệ cường độ của ion con định tính và ion con định lượng của mẫu thử so với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng (pass) hay nghi ngờ (fail) sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử.

Chuẩn bị các dung dịch mẫu nền, mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn như sau: Mẫu nền: cân một lượng nền mẫu tương ứng với 1/10 liều, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng.

Mẫu nền thêm chuẩn: cân một lượng nền mẫu tương đương với 1/10 liều; thêm một lượng dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc, để bay hơi đến khô rồi tiến hành xử lý theo quy trình đã xây dựng sao cho nồng độ các chất đem phân tích sắc ký tương đương với mẫu chuẩn.

Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa các chất với nồng độ tương ứng như sau: hydroclorothiazid 100 ng/ml; amlodipin besilat, nifedipin, atenolol, valsartan và furosemid 30 ng/ml.

Tiến hành phân tích sắc ký mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn lần lượt trên từng nền viên nén, nền viên nang và nền viên hoàn.

Kết quả phổ khối được trình bày ở hình 3.3a, 3.3b và phụ lục 5.

Kết quả sắc ký đồ được minh họa trên hình 3.4a, 3.4b, 3.4c

39

Hình 3.3a. Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của amlodipin trên nền viên nang

Hình 3.3b. Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của furosemid trên nền viên nang

40

Sắc ký đồ của các chất trong từng nền mẫu được trình bày trong hình sau: FUR

FUR

HCT

HCT

VAL

AML

VAL

AML

ATE

ATE

NIF

NIF

Mẫu nền

Mẫu nền thêm chuẩn

Mẫu chuẩn

Hình 3.4a. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nang

FUR

FUR

HCT

HCT

VAL

VAL

AML R

AML

ATE

NIF

ATE

NIF

Hình 3.4b. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên nén

41

FUR

FUR

HCT

HCT

VAL

VAL

AML R

AML R

Mẫu nền

ATE

ATE

NIF

NIF

Mẫu nền thêm chuẩn

Mẫu chuẩn

Hình 3.4c. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp trên nền viên hoàn

Nhận xét: Từ Hình 3.3a và Hình 3.3b cho thấy mỗi chất phân tích đều được xác định bởi 1 ion mẹ và 2 ion con do vậy phương pháp xây dựng đạt yêu cầu 4 điểm IP theo quy định của Hội đồng Châu Âu (2002/657/EC) cho phương pháp LC-MS/MS. Kết quả cho thấy thời gian lưu; phân tử khối của ion mẹ; ion con; tỷ lệ cường độ của ion con định tính và ion con định lượng của mẫu viên nang thêm chuẩn so với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng (pass).

Trên sắc ký đồ Hình 3.4a, 3.4b và 3.4c cho kết quả: - Mẫu nền không xuất hiện pic trùng thời gian lưu của các chất phân tích.

- Mẫu nền thêm chuẩn cho các pic có thời gian lưu trùng thời gian lưu với các pic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. Các pic đều có hình dạng cân đối.

Như vậy phương pháp xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu trên 3 nền mẫu: viên nén, viên nang, viên hoàn cứng.

42

3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các mẫu placebo thêm chuẩn ở các nồng độ thấp và xác định giá trị tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N). LOD được xác định tại nồng độ có S/N khoảng 3 và LOQ được xác định ở nồng độ có S/N khoảng 10.

Mẫu thử được chuẩn bị bằng cách cân một lượng nền mẫu tương đương với 1/10 liều; thêm một lượng chính xác dung dịch chuẩn hỗn hợp, để bay hơi tự nhiên đến khô rồi tiến hành chiết như quy trình đã xây dựng. Pha loãng dần dung dịch chiết của chuẩn bằng dịch chiết mẫu trắng để được các nồng độ thấp hơn. Tiến hành phân tích sắc ký để xác định giá trị S/N của 6 chất trên sắc ký đồ thu được. Thực hiện phân tích lần lượt trên cả 3 nền mẫu.

Từ nồng độ thực phân tích tiến hành ngoại suy nếu mức S/N gần bằng 3 với LOD và S/N gần bằng 10 để xác định nồng độ LOD có S/N = 3 và LOQ có S/N = 10 Kết quả được trình bày trong Bảng 3.7 và được minh họa trong Hình 3.5 (nền viên nén).

Bảng 3.7. LOD của các chất phân tích trên nền mẫu Hoạt chất

Nền 1

Nền 2

Nền 3

S/N LOD S/N LOQ S/ LOD S/N LOQ S/N LOD S/N LOQ (ppb)

(ppb) N

(ppb)

(ppb)

(ppb)

(ppb)

ATE

4

0,043 11

0,14

4 0,043 11

0,14

3

0,043 11

0,14

AML

4

0,035 10

0,18

3 0,035 10

0,18

3

0,18

10

0,35

NIF

3

0,13

10

0,36

3

0,13

11

0,36

3

0,13

10

0,36

VAL

4

0,47

10

1,19

3

0,47

10

1,19

3

0,47

11

1,19

HCT

3

0,92

10

4,56

3

0,76

11

4,56

3

0.46

10

4,56

FUR

3

0,46

10

1,41

3

0,46

10

1,41

3

0,46

10

1,41

43

AML R

AML R

NIF NIF

ATE ATE

FUR

FUR

HCT

HCT

VAL VAL

LOD

LOQ

Hình 3.5. Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD, LOQ trên nền viên hoàn

Nhận xét: Từ Bảng 3.7 cho thấy LOD, LOQ của các chất thấp; giới hạn phát hiện (LOD) của các chất trên cả 3 nền mẫu nằm trong khoảng từ 0,035 – 0,92 ng/ml; giới han định lượng (LOQ) của các chất trên cả 3 nền mẫu nằm trong khoảng 0,14– 4,56 ng/ml.

44

3.2.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 có nồng độ amlodipin besilat 1,5 µg/ml; HCT 4 µg/ml ; atenolol và furosemid 1,2 µg/ml; nifedipin và valsartan có nồng độ 1 µg/ml.  Pha dãy các dung dịch chuẩn theo Bảng 3.8: Bảng 3.8. Cách pha dãy các dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn

Thể tích dung dịch

Thể tích MeOH vừa

chuẩn hỗn hợp 1 (µl)

đủ (ml)

C1

30

10

C2

50

10

C3

80

10

C4

125

10

C5

250

10

C6

500

10

C7

1000

10

C8

2000

10

Tiến hành sắc ký và xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic với nồng độ các chất tính % tìm lại của các chất từ đường chuẩn. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.9

45

Bảng 3.9. Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu Hoạt chất

ATE

C1

C2

C3

C4

C5

C6

C7

C8

C (ppb)

3,80

6,33

10,12

15,81

31,63

63,26

126,51

252,03

S (Cps.s)

6708

20326

34480

60653

159572

288456

664687

1283899

% thu hồi

90,93

92,87

105,96

107,77

93,32

107,20

96,01

100,62

Đường

Y = 5163,95 x – 14668,58; R2 = 0,9990

chuẩn

AML

C (ppb)

4,65

7,75

12,40

19,38

38,75

77,50

155,00

310,00

S (Cps.s)

11758

46959

90425

166329

367411

692059

1692880

3139376

% thu hồi

103,20

98,13

102,53

99,85

99,89

109,56

92,52

101,27

Đường

Y = 10371,52 x – 34925,84; R2 = 0,9974

chuẩn

NIF

C (ppb)

3,20

5,33

8,52

13,31

26,63

53,26

106,52

213,03

S (Cps.s)

22553

80723

165839

297991

612023

1174816

2337313

5155096

% thu hồi

87,94

87,43

88,19

87,25

94,68

103,49

106,45

98,33

Đường chuẩn

Y = 24095,71 x – 63734,38; R2 = 0,9981

46

Bảng 3.9. Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất nghiên cứu (tiếp) Hoạt chất

HCT

C1

C2

C3

C4

C5

C6

C7

C8

C (ppb)

12,05

20,08

32,13

50,20

100,40

200,79

401,58

803,17

S (Cps.s)

5714

18589

44670

77110

162375

363572

787349

1503042

% thu hồi

101,52

107,38

99,66

101,98

106,57

100,88

95,25

101,02

Đường

Y = 1911,99x – 16970,68; R2 = 0,9992

chuẩn

FUR

C (ppb)

3,73

6,22

9,95

15,55

31,10

62,19

124,39

248,78

S (Cps.s)

6727

25844

58077

102911

205551

445308

1011455

1965658

% thu hồi

85,99

93,43

93,17

95,82

106,92

105,59

96,28

100,51

Đường

Y = 8052,93x – 27532,74; R2 = 0,9994

chuẩn

VAL

C (ppb)

3,14

5,23

8,37

13,07

26,14

52,29

104,58

209,16

S (Cps.s)

6547

20564

46712

82702

170864

375329

811310

1565057

% thu hồi

100,02

104,68

99,56

99,62

105,59

101,52

96,09

100,79

Đường chuẩn

Y = 7626,27 x – 17373,25; R2 = 0,9991

47

Nhận xét: Từ Bảng 3.9 cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic thể hiện trên đường chuẩn có R2 ≥ 0,9974; độ thu hồi trên từng điểm đạt từ 85,99 – 109,56% đáp ứng yêu cầu theo AOAC 2016 (1 ≥ R2 ≥ 0,99; độ thu hồi cho phép từ 60 – 115% ở mức nồng độ dưới 10 ppb; từ 80 – 110 % ở mức nồng độ 10 – 1000 ppb).

3.2.5. Độ đúng và độ chính xác Độ chính xác được xác định thông qua độ đúng và độ chụm của phương pháp.

Tiến hành phân tích được xác định trên mẫu trắng thêm chuẩn của cả 3 nền mẫu ở các mức nồng độ thấp, trung bình và cao. Mỗi mức nồng độ tiến hành lặp lại 7 lần trên từng nền mẫu. Xác định độ thu hồi và độ lặp lại trong ngày. Tiến hành tương tự như trên xác định độ thu hồi và độ lặp lại vào một ngày khác.

Cân chính xác một lượng nền mẫu đã nghiền thành bột mịn tương đương 1/10 liều (0,12 g với nền viên nang; 0,15 g với nền viên nén; 0,26 g với nền viên hoàn) vào ống ly tâm 50ml. Thêm các lượng chuẩn chuẩn hỗn hợp ở 3 mức nồng độ, trong khoảng làm việc. Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn.

Kết quả được trình bày trong bảng sau:

48

Bảng 3.10. Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại trong ngày của phương pháp (n=7) m Hoạt

thêm

chất vào ** (ng/ml)

ATE

Nền viên nang m tìm lại (ng/ml)

Độ đúng (%)

Nền viên nén

RSD m tìm lại (%) (ng/ml)

Độ đúng (%)

Nền viên hoàn

RSD m tìm lại (%) (ng/ml)

Độ đúng (%)

RSD (%)

4,51

4,08

90,49 6,46

4,43

98,22

7,41

4,42

97,73

7,49

32,23

29,96

92,96 4,16 31,32

97,18

6,46

32,09

99,58

3,64

3,09 192,37 94,98

5,68

193,38 185,07 95,70 3,86 192,74 99,67 7,01 AML 31,16

7,22

103,03 4,36

7,20

102,76 2,22

32,09 102,99 4,99 32,81 105,30 4,56

7,11

101,47 3,71

32,61 104,65 3,65

202,54 212,84 105,09 4,08 212,10 104,72 2,65 208,72 107,93 3,18

NIF

6,53

6,65

101,9 6,49

6,18

27,20

22,87

84,08 8,42 25,52

100,16 3,80

6,54

98,78

8,63

93,80

23,25

85,46

9,51

4,20

163,23 168,27 101,10 8,13 145,40 89,08

7,99 174,24 106,75 5,29

24,30

23,41

96,33 1,22 23,19

95,44

2,57

22,06

90,81

4,30

HCT 101,24

99,09

97,88 4,20 95,96

97,22

2,76

97,82

96,62

3,59

2,89 515,57 90,94

3,82

566,96 561,53 99,04 4,28 557,41 98,32

FUR

VAL

6,97

7,00

100,44 3,49

103,67 9,32

6,59

94,56

3,00

31,69

30,94

97,64 1,99 30,81

97,22

30,76

97,06

2,05

190,16 188,28 99,01 3,31 190,27 100,06 1,98 185,41 97,50

2,55

100,27 2,29

7,23

5,94

2,13

5,62

5,63

105,73 3,17

24,51

24,86 101,44 1,44 25,28 105,08 1,28

5,39

95,90

3,61

25,33 103,35 3,00

142,97 151,62 106,05 1,42 151,29 105,82 1,87 151,00 105,62 3,57

**: lượng chất chuẩn thêm tính trong 1ml dung dịch mẫu sắc ký

49

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại khác ngày của phương pháp (n=7) Nền viên nang Nền viên nén Nền viên hoàn m thêm Hoạt Độ Độ Độ ** m tìm lại RSD m tìm lại RSD m tìm lại RSD chất vào đúng đúng đúng (ng/ml) (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) (%) (%) (%) 6,07 6,35 104,64 4,07 6,02 99,13 2,57 6,05 99,66 4,94 ATE

31,62

32,33 102,26 4,99

183,37 181,57 99,02 7,75 AML 36,44

8,05

30,89

97,70 4,54 30,18

95,44 4,17

6,55 183,14 99,87 3,80 181,80 99,14 6,12

103,81 2,44

36,87 101,17 5,86

7,73

99,69 4,42

7,50

96,76 2,82

37,91 104,04 5,07 37,83 103,80 4,49

248,07 248,74 100,27 4,24 233,47 94,12 6,37 235,16 94,79 4,79

NIF

5,23

5,13

98,00

6,04

5,36

102,41 5,29

5,21

99,63 7,41

21,34

21,01

98,45

8,60

21,51 100,80 5,70 21,85 102,40 3,15

83,24

82,64

99,28

6,15

81,26

22,89

22,20

97,00

5,61

23,64 103,25 2,52 23,63 103,24 4,31

97,62 5,80 85,56 102,79 6,40

HCT 136,55 136,98 100,32 4,20 137,75 100,88 1,67 140,07 102,57 2,19 843,41 857,90 101,72 3,35 854,11 101,27 3,84 836,44 99,17 3,72

FUR

7,09

7,06

99,51

2,56

7,42

104,60 1,94

6,41

90,36 1,27

28,62

28,41

99,26

3,16

28,40

99,25 1,48 28,41

95,87 1,54

174,23 176,06 101,05 2,73 174,25 100,01 2,23 176,06 96,72 1,33

VAL

5,26

5,22

99,23

2,70

24,06

24,51 101,86 2,87

5,28

100,40 3,17

5,00

95,13 1,67

25,28 105,08 1,28 24,18 100,51 2,49

156,89 159,26 101,51 2,59 158,74 101,18 1,79 156,89 101,77 1,69 **: lượng chất chuẩn thêm tính trong 1ml dung dịch mẫu sắc ký

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.10 và Bảng 3.11 cho thấy: Độ thu hồi của 6 chất trong nền viên nang nằm trong khoảng từ 97,00 ÷104,65% và RSD dao động trong khoảng 2,44 ÷8,60%. Độ thu hồi của 12 chất trong khoảng từ 84,08 – 106,05% và độ lặp lại khác ngày từ 1,22 ÷ 8,60%.

50

Độ thu hồi của 6 chất trong nền viên nén nằm trong khoảng từ 94,12 ÷ 105,08% và RSD dao động trong khoảng 1,28 ÷ 6,37% và độ thu hồi của 12 chất trong khoảng từ 89,08 ÷ 105,82% và độ lặp khác ngày từ 1,28 ÷ 9,32%. Độ thu hồi của 6 chất trong nền viên hoàn nằm trong khoảng từ 94,79 ÷ 103,80% và có RSD dao động trong khoảng 1,27 ÷ 7,41% và có độ thu hồi của 6 chất trong khoảng từ 85,46 ÷ 107,93% và độ lặp khác ngày từ 1,28 ÷ 9,51%.

Vậy trên cả 3 nền mẫu phương pháp được xây dựng cho độ thu hồi đáp ứng theo yêu cầu của AOAC 2016 (độ thu hồi cho phép từ 60 – 115 %, RSD ≤ 32 % ở mức nồng độ dưới 10 ppb và trong khoảng 80 – 110 % ở mức nồng độ 100 - 1000 ppb, RSD ≤ 22% ở nồng độ 10 - 100 ppb và RSD ≤ 16% ở nồng độ 100ppb – 1000ppb ).

3.3. Ứng dụng phân tích trên mẫu thực Tiến hành phân tích 30 mẫu chế phẩm đông dược thu thập được bao gồm: 13 mẫu viên nang, 11 mẫu viên hoàn, 2 mẫu bột cốm và 4 mẫu viên nén.

Trong đó có 15 mẫu có chỉ định hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu và 15 mẫu có chỉ định hỗ trợ điều trị các chứng bí tiểu, tiểu buốt, sỏi và giảm cân.

Có 14 mẫu mua tại nhà thuốc; 3 mẫu mua tại phòng khám đông y, 1 mẫu mua ở cửa hàng đông y tại Lãn Ông, 1 mẫu gửi đến kiểm nghiệm và 11 mẫu mua qua internet của các công ty và các cơ sở đông y gia truyền. Các mẫu được lưu hành ở Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa, Hồ Chí Minh. Các chế phẩm có số công bố hoặc không.  Định tính: định tính các hoạt chất có thể có trong mẫu thử dựa vào so sánh thời gian lưu, phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) và tỷ lệ đáp ứng của hai mảnh con đặc trưng của mỗi chất phân tích trong mẫu thử so sánh với mẫu chuẩn để cho kết luận đúng (pass) hay nghi ngờ (fail) về sự có mặt của các chất phân tích trong mẫu thử.

51

 Định lượng: tính nồng độ các chất phân tích trong dịch chiết dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của các chất phân tích được thiết lập trong ngày có R2 > 0,997. Từ nồng độ các chất phân tích trong dịch chiết, tính hàm lượng chất phân tích trong 1 liều chế phẩm ban đầu thông qua hệ số pha loãng sau quá trình xử lý mẫu.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.12, phụ lục 7 và minh họa ở Hình 3.6, 3.7 và 3.8 Bảng 3.12. Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực Mẫu thực

Dạng bào chế

ATE

AMLO NIFE

HCT

FURO

VAL

NHA01

-

-

-

-

-

-

NHA02

-

-

-

-

-

-

NHA06

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

NHA13

-

-

-

-

-

-

NHA14

-

-

-

-

-

-

NHA15

-

-

-

-

-

-

NHA17

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

NHA09

HHA02 HHA03 HHA04

Viên nang

Viên hoàn cứng

HHA06

Viên hoàn mềm

-

-

-

-

-

-

HHA11

Viên hoàn cứng

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

NEHA01 NEHA02

Viên nén

NELT03 NLT03

Viên nang

52

Bảng 3.12. Kết quả ứng dụng phân tích mẫu thực (tiếp) Mẫu

Dạng bào

thực

chế

NLT04 NLT08

Viên nang

NLT12 BLT01 HLT05 HLT06 HLT07 HLT08

Cốm Viên hoàn cứng Viên hoàn cứng

ATE

AMLO NIFE

HCT

FURO

VAL

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

BLT01

Cốm

-

-

-

-

-

-

NLT16

Viên nang

-

-

-

-

-

-

HLT09

Viên hoàn

-

-

-

-

-

-

NELT03

Viên nén

-

-

-

-

-

-

HLT10

Viên hoàn

-

-

-

-

-

-

(-): dưới LOD

53

Hình 3.6. Phổ đồ định tính amlodipin trong mẫu NHA01

54

Hình 3.7. Phổ đồ định tính furosemid trong mẫu NHA01

55

Hình 3.8. Sắc ký đồ phân tích mẫu NHA01

56

Chương IV: BÀN LUẬN 4.1. Về nền mẫu Đối tượng nghiên cứu của đề tài thực hiện chủ yếu trên các sản phẩm dạng rắn, do đó trong quá trình xây dựng nền mẫu dựa trên các bài thuốc cổ phương lựa chọn 3 dạng bào chế là dạng viên nén, viên nang và viên hoàn.

Thành phần nền viên nang dựa trên bài thuốc cổ phương giáng áp hợp tễ của Thiên gia diệu phương, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với thành phần các chế phẩm đang được lưu hành trên thị trường và tác dụng điều trị. Nền mẫu bao gồm các dược liệu: huyền sâm, hạ khô thảo, táo nhân, địa long, dạ giao đằng, câu đằng. Nền viên nén được xây dựng dựa trên bài thuốc Thập toàn bố chính thang gia giảm, bao gồm các vị dược liệu như: táo nhân, đỗ trọng, câu đằng, ngưu tất, hạ khô thảo, bạch thược, đẳng sâm, sinh địa, hòe hoa. Thành phần nền viên hoàn bao gồm có các dược liệu: thục địa, sơn thù, trạch tả, hoài sơn, phục linh, đơn bì. Các nền mẫu này tương tự các sản phẩm được cấp số đăng ký trên thị trường như: ‘‘Hạ áp ích nhân’’ của công ty Nam Dược; ‘‘Hạ hồi đơn’’ của công ty cổ phần dược vật tư y tế Hải Dương; ‘‘Hoàn lục vị bổ thận âm’’ của công ty cổ phần dược phẩm OPC. Do đó lựa chọn 3 nền mẫu trên để đại diện cho các chế phẩm đông dược dạng rắn có tác dụng hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, chức năng bài tiết của thận trên thị trường.

4.2. Về phương pháp phân tích Phương pháp phân tích LC-MS/MS hiện nay được sử dụng phổ biến trên thế giới trong việc phân tích các thuốc hóa dược trộn trái phép đặc biệt là trên các nền mẫu phức tạp như các nền mẫu thuốc đông dược, thuốc y học cổ truyền do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Ở Việt Nam, phương pháp LCMS/MS được đưa vào sử dụng trong phân tích các chất trên nhiều nền mẫu khác nhau: thực phẩm, dịch sinh học, nước thải… nhưng trên nền các mẫu đông dược thì chưa được ứng dụng nhiều. Đặc điểm của các sản phẩm đông dược là nền mẫu rất đa dạng, mỗi sản phẩm có thành phần dược liệu không 57

đồng nhất, ngoài ra do được bào chế từ thành phần dược liệu và cao dược liệu nên dịch chiết thường có rất nhiều tạp chất kèm theo. Khiến cho việc phát hiện các chất hóa dược trộn trên nền mẫu đông dược bằng các phương pháp sắc ký thông thường: TLC, HPLC gặp nhiều khó khăn. Việc phát hiện và định danh các chất cấm trộn trong nền mẫu đông dược khi chỉ sử dụng Rf trong TLC có thể dẫn tới kết quả dương tính giả, phát hiện được nhiều mẫu dương tính hơn so với thực tế do trùng với vết dược liệu. Hoặc khi sử dụng HPLC nếu dùng detector UV-VIS dựa vào thời gian lưu thì có thể dẫn tới dương tính giả do có nhiều chất trong dược liệu cùng được rửa giải ra hoặc do ảnh hưởng của các chất trong nền khiến cho hệ số chồng phổ Match bị sai lệch gây dương tính giả hoặc âm tính giả. Vì vậy đề tài chúng tôi lựa chọn xây dựng phương pháp LC-MS để khắc phục những khó khăn trên. Với những ưu điểm về độ nhạy và độ đặc hiệu giúp hạn chế tối đa những ảnh hưởng của nền mẫu dược liệu đến sự phát hiện các chất phân tích. Cùng với những ưu điểm của LC-MS/MS phát hiện các chất dựa trên số khối m/z của ion mẹ và 2 ion con giúp cho việc phát hiện các chất có tính chất gần giống nhau có cùng thời gian lưu, các chất không tách nhau giúp cho thời gian phân tích của phương pháp được rút ngắn hơn.

Lựa chọn phương pháp LC-MS/MS trong nghiên cứu phù hợp với xu hướng của thế giới trong phân tích các chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược [18], [22], [24], [28].

4.3. Về phương pháp xử lý mẫu Với mục tiêu nghiên cứu để xác định chất tân dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược thì mục tiêu đặt ra của việc xử lý mẫu là phải tách và làm sạch tối ưu để có thể phát hiện các chất tân dược trong một nền mẫu rất phức tạp. Việc lựa chọn dung môi chiết, phương pháp để hòa tan tối ưu các chất phân tích và hạn chế hòa tan các hoạt chất trong dược liệu, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí phù hợp với điều kiện phân tích là rất cần thiết. Qua tham 58

khảo một số tài liệu [24], [19], [18], [11]; chúng tôi lựa chọn khảo sát một số các hệ dung môi chiết: methanol, methanol – nước, ethanol và khảo sát thời gian siêu âm 10 phút, 15 phút, 25 phút. Kết quả thu được cho thấy lựa chọn phương pháp chiết siêu âm 15 phút và sử dụng hỗn hợp MeOH – H2O =70:30 trong quá trình xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao 93,11 – 98,90% và dịch chiết mẫu tương đối sạch giúp cho quy trình phát hiện bằng LC-MS/MS đạt tính đặc hiệu cao và giới hạn phát hiện thấp.

4.4. Về thẩm định phương pháp phân tích Tiến hành thẩm định phương pháp LC-MS/MS trên các chỉ tiêu độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chính xác theo hướng dẫn của AOAC 2016 trên cả 3 nền mẫu tự tạo. Kết quả cho thấy phương pháp đã xây dựng đáp ứng về độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác theo AOAC 2016 trên cả 3 nền mẫu rắn.

Về độ đặc hiệu, trên sắc ký đồ của dung dịch trắng không cho pic có thời gian lưu với chất phân tích khi so sánh với chất chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn cho pic có thời gian lưu trùng với pic trên sắc ký đồ của chất chuẩn và các pic đều cân đối. Phương pháp đạt yêu cầu theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) cho phương pháp LC-MS/MS với 4 điểm IP (1 ion mẹ, 2 ion con).

Trong phương pháp xây dựng, các chất phân tích có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp LOD từ 0,043 - 0,92 ng/ml và LOQ từ 0,14 – 4,56 ng/ml dịch chiết mẫu sắc ký. So sánh với các nghiên cứu của Lu Yaling bằng phương pháp HPLC – MS cho thấy ở chế độ ESI+ phương pháp xây dựng có giới hạn phát hiện thấp hơn (LOD ≥ 2,5 µg/L và LOQ ≥ 8,5 µg/L); chế độ ESI- cũng thấp hơn (LOD ≥ 50 µg/L) [28] . Chế độ ESI+ cho kết quả tương đương hoặc cao hơn so với nghiên cứu Seok Heo bằng LC-MS/MS (LOD từ 0,02 -20,0 ng/g và LOQ từ 0,50 – 60 ng/g). [18] Các chất đều có sự tương quan tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát rộng, mức nồng độ thấp (cỡ vài ppb) với R2 > 0,997 và độ thu hồi tính lại theo 59

đường chuẩn tại từng điểm đạt 85,99 – 109,56%. Độ thu hồi của phương pháp trong ngày 94,12 – 105,08%; RSD từ 1,27 – 7,50% và khác ngày từ 84,08% 107,93 %, với RSD từ 1,22 – 9,51% trên cả 3 nền mẫu dạng rắn là viên nén, viên nang và viên hoàn cứng. Kết quả này tương đương hoặc cao hơn nghiên cứu của Lu Yaling là 63,3 – 107,4% [28] 4.5. Về ứng dụng phương pháp Nhóm nghiên cứu đã ứng dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng trong kiểm nghiệm 30 mẫu đông dược 13 mẫu viên nang, 11 mẫu viên hoàn, 2 mẫu bột cốm và 4 mẫu viên nén. Trong đó có 15 mẫu có chỉ định hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu và 15 mẫu có chỉ định hỗ trợ điều trị các chứng khó tiểu, tiểu buốt, sỏi và giảm cân. Các mẫu thuốc được mua tại nhà thuốc; phòng khám đông y, cửa hàng đông y tại Lãn Ông, mẫu gửi đến kiểm nghiệm, mua qua internet của các công ty và các cơ sở đông y gia truyền. Các mẫu được lưu hành ở Hà Nội, Bắc Giang, Thanh Hóa, Hồ Chí Minh.

Dựa trên các căn cứ về thời gian lưu và phổ khối (1 ion mẹ và 2 ion con) của mỗi chất để định dạng và phát hiện sự có mặt của các chất phân tích trong các mẫu thu thập được.

Kết quả nghiên cứu chưa phát hiện các chất phân tích bị trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược điều trị cao huyết áp đã thu thập được.

Trong quá trình nghiên cứu, do đặc điểm bệnh lý của tăng huyết áp cần bệnh nhân đến khám bệnh và kê đơn nên nhóm nghiên cứu chưa tiếp xúc được với các chế phẩm y học cổ truyền tại các phòng khám đông y và các cơ sở đông y gia truyền mà mới tập trung ở một bộ phận các sản phẩm hỗ trợ điều trị tăng huyết áp được rao bán trên thị trường.

60

KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1) Đã xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời 6 dược chất: atenolol, amlodipin, nifedipin, valsartan, hydroclorothiazid và furosemid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược điều trị, hoặc hỗ trợ điều trị cao huyết áp bằng phương pháp LC-MS/MS ở chế độ lấy phổ MRM. Phương pháp được thực hiện với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, dung môi chiết ít độc hại, cho tính đặc hiệu cao với số điểm IP = 4, thời gian phân tích ngắn (8,5 phút) đáp ứng các yêu cầu của AOAC 2016 cho các phép phân tích.

2) Đã thẩm định phương pháp phân tích xây dựng theo hướng dẫn của AOAC trên 3 nền mẫu tự tạo là viên nén, viên nang và viên hoàn. Phương pháp có độ đặc hiệu cao với số điểm IP = 4; giới hạn phát hiện thấp; khoảng tuyến tính của các chất có hệ số tương quan R2 ≥ 0,9974 và độ thu hồi tính lại theo đường chuẩn từ 85,99 – 109,56%. LOD của phương pháp từ 0,04 – 0,92 ng/ml và LOQ từ 0,14 – 4,56 ng/ml; độ thu hồi trong ngày 94,12 – 105,08%; RSD từ 1,27 – 7,50% và khác ngày từ 84,08% - 107,93 %, với RSD từ 1,22 – 9,51% trên cả 3 nền mẫu dạng rắn là viên nén, viên nang và viên hoàn cứng. Điều đó cho thấy phương pháp đã xây dựng đáp ứng yêu cầu của AOAC 2016, đủ tin cậy và chính xác để ứng dụng xác định các chất phân tích trộn lẫn trong chế phẩm đông dược.

3) Đã ứng dụng phương pháp phân tích trên 30 mẫu đông dược có chỉ định cho người cao huyết áp thu thập trên thị trường. Kết quả chưa phát hiện trường hợp trộn lẫn 6 chất phân tích trong chế phẩm.

61

KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu và phát triển phương pháp để phát hiện thêm các hoạt chất khác trong nhóm huyết áp và lợi tiểu khác nhằm phát hiện đồng thời nhiều hoạt chất hơn, phát huy tối đa ưu thế của detector khối phổ. Mở rộng phương pháp nghiên cứu trên các dạng bào chế khác: viên nang mềm, hoàn mềm, dạng dung dịch.

Tiếp tục thu thập các mẫu đông dược, thuốc cổ truyền trên thị trường như các thuốc gia truyền, không có số đăng ký, …

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt: [1]

Trần Tử An (2012), Hóa phân tích tập 2: Phân tích dụng cụ, tr.107-215.

[2]

Bộ Y tế (2014), Dược lý học, tr.309-326.

[3]

Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, 3 tập, Tập 1,3, Nhà xuất bản Y học, tr. 74 -75, tr.116-117, tr.425 - 426, tr. 483-484 , tr. 679-680.

[4]

Thái Khoa Bảo Châu (2018), Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS, Luận văn thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội.

[5]

Trần Đức Hậu (2007), Hóa dược, 2 tập, Tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr.

174-209.

[6]

Lê Thị Bích Hiền (2017), Trộn lẫn hoạt chất tân dược trong chế phẩm đông dược: các báo cáo điển hình về nhóm hoạt chất và độc tính, Trường đại học Y Dược Huế, Khoa Dược.

[7]

Vũ Văn Hiếu (2011), "Phát hiện Corticoid trộn trong các chế phẩm đông dược bằng kỹ thuât sắc ký lớp mỏng", Tạp chí Y Dược học Hồ CHí Minh. 15(1), tr.617-621.

[8]

Trần Lệ Hoa (2018), Xây dựng phương pháp xác định một số dược chất nhóm hạ huyết áp trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC và HPLC, Luận văn thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội.

[9]

Hội đồng Dược thư quốc gia Việt Nam và Trung tâm Dược điển - Dược thư Việt Nam (2018), Dược thư quốc gia, 2 tập, Nhà xuất bản y học, tr.187-188,

tr.219-220,

tr.702-703,

tr.777-778,

tr.1056-1057,

tr14521453.

[10] Cao Công Khánh (2013), "Nguyên cứu quy trình xác định đồng thời sibutramin, furosemid, dexamethason và piroxicam trog thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật HPLC", Tạp chí Dược học. S.5, tr.36-39.

[11] La Thị Kem Ly (2014), Xác định đồng thời Valsartan, Lorsatan, Hydroclorothiazid, Captopril và Enalapril bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Huế.

[12] Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội, Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, tr.16-59.

Tiếng Anh: [13] Bruker ( 2013), "''Functional Description'', EVOQ

TM

LC-TQ System

User Guide", pp.27-35.

[14] Chen Y. et al. (2009), "Determination of synthetic drugs used to adulterate botanical dietary supplements using QTRAP LC-MS/MS", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 26 (5), pp. 595-603.

[15] Ching C. et al. (2018), "Adulteration of proprietary Chinese medicines and health products with undeclared drugs: experience of a tertiary toxicology laboratory in Hong Kong", Br J Clin Pharmacol. 1 (84), pp. 172-178.

[16] Convention U. S. P. (2013), The United States Pharmacopeia 36, 36, Vol. 3, p.5537.

[17] Dr Alison E. Ashcroft ( 1997), An Introduction to Mass Spectrometry, Astbury Centre for Structural Molecular Biology, The University of Leeds.

[18] Heo S. et al. (2017), "Simultaneous analysis of 35 specific antihypertensive adulterants

in

dietary

supplements

using

LC/MS/MS",

Biomed

Chromatogr. 31 (4), pp. 38-56.

[19] Heo S. et al. (2016), "A rapid method for the simultaneous determination of 25 anti-hypertensive compounds in dietary supplements using ultra-highpressure liquid chromatography", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 33 (11), pp. 1627-1636.

[20] International A. O. A. C. (2016), Guidelines for dietary supplements and botanicals: Appendix K. [21] Kallem R. et al. (2013), "Simultaneous estimation of amlodipine and atenolol in human plasma: a sensitive LC-MS/MS method validation and its application to a clinical PK study", Bioanalysis. 5 (7), pp. 827-837.

[22] Kesting J. R. et al. (2010), "Identification of adulterants in a Chinese herbal medicine by LC-HRMS and LC-MS-SPE/NMR and comparative in vivo study with standards in a hypertensive rat model", J Pharm Biomed Anal. 51 (3), pp.705-711.

[23] Kumar V. et al. (2009), "Compatibility of atenolol with excipients: LCMS/TOF characterization of degradation/interaction products, and mechanisms of their formation", J Pharm Biomed Anal. 49(4), pp.880-888.

[24] Lanรงanova Moreira A. P. et al. (2016), "Simultaneous analysis of antihypertensive drugs and diuretics as adulterants in herbal-based products by ultra-high performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry", Analytical Methods. 8 (8), pp.1881-1888.

[25] Liang Q. et al. (2006), "Rapid and reliable determination of illegal adulterant in herbal medicines and dietary supplements by LC/MS/MS", J Pharm Biomed Anal. 40 (2), pp.305-311.

[26] Liu Y. et al. (2017), "Adulterated pharmaceutical chemicals in botanical dietary supplements: novel screening approaches", Reviews in Analytical Chemistry. 36 (3), pp.36-41.

[27] Lu Y. et al. (2009), "Simultaneous determination of 8 illegal synthetic drugs in antihypertensive dietary supplements by high performance liquid chromatography-mass spectrometry", Se Pu. 27 (1), pp.44-49.

[28] Lu Y. L. et al. (2010), "Detection of adulteration of anti-hypertension dietary supplements and traditional Chinese medicines with synthetic drugs using LC/MS", Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 27 (7), pp.893-902.

[29] Vaclavik L. et al. (2014), "Mass spectrometric analysis of pharmaceutical adulterants in products labeled as botanical dietary supplements or herbal remedies: a review", Anal Bioanal Chem. 406 (27), pp.6767-6790.

[30] Wang X. B. et al. (2018), "Simultaneous analysis of 23 illegal adulterated aphrodisiac chemical ingredients in health foods and Chinese traditional patent medicines by ultrahigh performance liquid chromatography

coupled

with

quadrupole

time-of-flight

mass

spectrometry", J Food Drug Anal. 26 (3), pp.1138-1153.

[31] WHO (2013), "A global brief on hypertension : silent killer, global public health crisis: World Health Day 2013".

[32] Wilfried M. A. Niessen Ricardo A. Correa C. (2017), Interpretation of MS‐ MS Mass Spectra of Drugs and Pesticides, Wiley Series on Mass Spectrometry), ed, Vol. 2, 6 January 2017, pp. 416.

[33] Zhang R. et al. (2014), "Detection of illegally added drugs in dietary supplements by near-infrared spectral imaging", Journal of Innovative Optical Health Sciences. 07 (06), pp.321-327.

Trang web: [34] Thúy Hường (2018), Bệnh tăng huyết áp theo y học cổ truyền, Nhà thuốc gia truyền Thọ Xuân Đường, dongythoxuanduong.com.vn, ngày truy cập 15/3/2019 [35] Nguyễn Đăng Lâm (2012), Chất lượng dược liệu, đông dược trên thị trường hiện nay, những thách thức, Hội dược liệu Việt Nam, Báo điện tử Cây thuốc quý, caythuocquy.info.vn, ngày truy cập 15/03/2019 [36] Sở Y tế (2019), Nguy hại đến sức khỏe khi sử dụng thuốc đông dược trộn tân dược, Sở y tế - Ủy ban nhân dân thành phố Hà Nội, http://soyte.hanoi.gov.vn, ngày truy cập 23/4/2019.

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1: Qui trình phân tích 2. Phụ lục 2: Qui trình bào chế các nền mẫu 3. Phụ lục 3: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ 4. Phụ lục 4: Sắc ký đồ khảo sát nồng độ tuyến tính 5. Phụ lục 5: Phổ đồ xác định điểm IP dùng trong định tính 6. Phụ lục 6: Danh mục mẫu chế phẩm đông dược được phân tích 7. Phụ lục 7: SKĐ và phổ đồ của một số mẫu đại diện

PHỤ LỤC 1: Qui trình phân tích các thuốc hóa dược hạ huyết áp, lợi tiểu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS 1.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ STT

Chất chuẩn

1

Amlodipin besilat

2

Valsartan

Chất chuẩn

3

Dung môi, hóa chất 1.2.

-

Atenolol

Hàm lượng 99,69% 98,38%

Số lô

Nguồn gốc

WS.0212213.02 WS.0116335.01

Viện KN

100,17%, ẩm: 0,11%

WS.0123093

thuốc Trung

(NT)

Ương

4

Furosemid

99,51% (NT)

WS.0103128

5

Nifedipin

100,19%, ẩm: 0,08%

0106200

6

Hydroclorothiazid

99,55% (NT)

0114308.01

1

Acetonitril

LC-MS

Merck- Đức

2

Acid formic

LC-MS

Merck- Đức

3

Methanol

LC-MS

Merck-Đức

Viện KN thuốc Hồ Chí Minh

Thiết bị Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Brucker EVOQ Qube-Mỹ Cân phân tích Mettler Toledo – Thụy sĩ (d = 0,1mg) Cân phân tích SHIMAZU – Nhật Bản (d = 0.1mg/0.01mg) Máy ly tâm Hermle Z306 – Đức Máy lắc siêu âm Daihan-Wuc A22H – Hàn Quốc Thiết bị đuổi dung môi bằng khí Nitơ Hanon – Đài Loan Tủ sấy Memmert ULM 500 – Đức Các dụng cụ : các loại pipet, micropipet, bình định mức class A- Đức, ống đong, màng lọc mẫu (syringe filter), cốc có mỏ, vial, …

2. Quy trình phân tích 2.1. Điều kiện khối phổ Thông số (đơn vị) Điện áp đầu phun (Capillary)

Giá trị tối ưu

Positive (V)

3500

Negative(V)

3500

Khí chắn Cone Gas Flow (l/min)

20

Nhiệt độ nón Cone Temperature (0C)

350

Nhiệt độ ion hóa (0C)

250

Nebulizer (psi)

40

Probe (psi)

45

CID gas

Ar 1.5 mTorr

Chế độ ghi phổ

MRM

Tên chất

Ion mẹ (m/z)

Amlodipin besilat

409,2

Nifedipin

347,1

Atenolol

267,0

Valsartan

434,2

Hydroclorothiazid

296,2

Furosemid

329,3

(*): Ion con định lượng

Ion con (m/z)

CE (eV)

Tỷ lệ (%)

237,8 (*)

9

100,0

293,9

9

61,7

315,3 (*)

7

100,0

253,5

17

35,1

190,0 (*)

17

100,0

145,0

20

105,9

179,1 (*)

23

100,0

350.3

13

63,2

78,0(*)

27

100,1

268

14

24,0

285,1 (*)

10

100,0

205,1

18

92,2

2.2. Điều kiện sắc ký - Cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) - Thể tích tiêm: 2 µl - Nhiệt độ cột: 40oC - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút - Pha động: + Pha động A: dung dịch acid formic 0,1% + Pha động B: ACN Chạy theo chương trình gradient: t (phút)

A (%)

B (%)

0 - 1,5

95

5

1,6 - 4,1

60

40

4,1 - 6,0

30

70

6,1 – 8,5

95

5

2.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 có nồng độ amlodipin besilat 1,5 µg/ml; HCT 4 µg/ml ; atenolol và furosemid 1,2 µg/ml; nifedipin và valsartan có nồng độ 1 µg/ml.  Pha dãy các dung dịch chuẩn sau: Thể tích dung dịch chuẩn

Thể tích MeOH vừa đủ

hỗn hợp 1 (µl)

(ml)

C1

30

10

C2

50

10

C3

80

10

C4

125

10

C5

250

10

C6

500

10

C7

1000

10

C8

2000

10

Dung dịch chuẩn

2.4. ChuẊn báť&#x2039; dung dáť&#x2039;ch tháť­ - Mẍu thuáť&#x2018;c Ä&#x2018;Ă´ng dưᝣc, xĂĄc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh kháť&#x2018;i lưᝣng trung bĂŹnh Ä&#x2018;ĆĄn váť&#x2039; mẍu, Ä&#x2018;áť&#x201C;ng nhẼt mẍu vĂ nghiáť n máť&#x2039;n.

- Cân chĂ­nh xĂĄc lưᝣng báť&#x2122;t cháşż phẊm tĆ°ĆĄng ᝊng 1/10 liáť u dĂšng vĂ o áť&#x2018;ng falcon 50ml.

- ThĂŞm chĂ­nh xĂĄc 25 ml háť&#x2014;n hᝣp methanol â&#x20AC;&#x201C; nĆ°áť&#x203A;c (70:30) vĂ o áť&#x2018;ng ly tâm, lắc nháşš, siĂŞu âm 15 phĂşt, ly tâm 6000 vòng/phĂşt.

- LẼy phần dáť&#x2039;ch trong, pha loĂŁng 50-200 lần báşąng methanol, láť?c qua mĂ ng láť?c 0,22 Âľm.

- Tiáşżn hĂ nh sắc kĂ˝ cĂĄc dung dáť&#x2039;ch trĂŞn.

3. Tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch vĂ Ä&#x2018;ĂĄnh giĂĄ káşżt quả: - Ä?ĂĄnh giĂĄ Ä&#x2018;áť&#x2122; phĂš hᝣp cᝧa háť&#x2021; tháť&#x2018;ng: RSD â&#x2030;¤ 15% - Xây dáťąng Ä&#x2018;Ć°áť?ng chuẊn tháť&#x192; hiáť&#x2021;n máť&#x2018;i tĆ°ĆĄng quan tuyáşżn tĂ­nh giᝯa diáť&#x2021;n tĂ­ch pic vĂ náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; chẼt phân tĂ­c: y = ax + b. YĂŞu cầu: háť&#x2021; sáť&#x2018; tĆ°ĆĄng quan (R2 > 0,99), Ä&#x2018;áť&#x2122; thu háť&#x201C;i tᝍng Ä&#x2018;iáť&#x192;m 80 â&#x20AC;&#x201C; 110% áť&#x; mᝊc náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; 10-1000 ppb vĂ 60 â&#x20AC;&#x201C; 115% áť&#x; mᝊc náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; dĆ°áť&#x203A;i 10 ppb.

- Phân tĂ­ch mẍu tháť­: ď&#x201A;ˇ Ä?áť&#x2039;nh tĂ­nh: Ä&#x2018;áť&#x2039;nh tĂ­nh cĂĄc hoất chẼt cĂł tháť&#x192; cĂł trong mẍu tháť­ dáťąa vĂ o so sĂĄnh tháť?i gian lĆ°u, pháť&#x2022; kháť&#x2018;i (ion máşš vĂ 2 ion con) vĂ tᝡ láť&#x2021; Ä&#x2018;ĂĄp ᝊng cᝧa hai mảnh con Ä&#x2018;ạc trĆ°ng cᝧa máť&#x2014;i chẼt phân tĂ­ch trong mẍu tháť­ so sĂĄnh váť&#x203A;i mẍu chuẊn Ä&#x2018;áť&#x192; cho káşżt luáş­n Ä&#x2018;Ăşng (pass) hay nghi ngáť? (fail) váť sáťą cĂł mạt cᝧa cĂĄc chẼt phân tĂ­ch trong mẍu tháť­. ď&#x201A;ˇ Ä?áť&#x2039;nh lưᝣng: theo cĂ´ng thᝊc X (ppb/ml) =

(đ?&#x2018;&#x2020;â&#x2C6;&#x2019;đ?&#x2018;?) đ?&#x2018;&#x17D;

x HSPL

TĂ­nh hĂ m lưᝣng chẼt phân tĂ­ch trong 1 liáť u cháşż phẊm ban Ä&#x2018;ầu.

PHỤ LỤC 2: Bào chế nền mẫu

2.1. Công thức bào chế

Nền 1 : Viên nang cứng Giáng áp hợp tễ (thiên gia diệu phương, quyển thượng) Nền 2: Viên nén (bài thuốc thập toàn bố chính thang gia giảm) Nền 3: Viên hoàn cứng (bài thuốc hoàn lục vị gia giảm)

Thành phần cao 1 Huyền sâm 2 1 Hạ khô thảo 2 1 Táo nhân 6 1 Địa long 6 1 Dạ giao đằng 6 Câu đằng 6 Táo nhân 6 Đỗ trọng 12 Câu đằng 8 Ngưu tất 12 Hạ khô thảo 10 Bạch thược 12 Đẳng sâm 10 Sinh địa 8 Hòe hoa 4

Hoài sơn Mẫu đơn bì Thục địa Sơn thù du Trạch tả Bạch linh

16 12 32 16 12 12

g g g g g g g g g g g g g g g

g g g g g g

2.2.

Quy trình bào chế Cách tiến hành:  Mỗi nền mẫu tiến hành trên 10 thang thuốc theo thành phần tỷ lệ một

thang nêu trên.  Thêm lượng nước ngập dược liệu, đun sôi  Giảm nhiệt độ, tiếp tục đun sôi trong 3 giờ, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu.  Sau 3 giờ, lọc qua vải xô thu được dịch chiết lần 1  Lặp lại qui trình trên tiếp tục đun sôi trong 2 giờ  Gộp dịch chiết 2 lần  Cô cách thủy đến cao đặc a. Tạo nền viên nang  Sấy khô cao đặc đến khi thu được cao khô.  Xay cao khô thu được bột cao khô.  Cao dược liệu khô 170 g. Lấy 60 g hoa hòe sấy khô, rây qua rây 0,32 mm. Trộn lẫn với bột cao dược liệu. Trộn tá dược silic keo tỷ lệ 10% so với bột cao dược liệu, sát hạt. Sấy khô. Rây qua rây 1,00 mm. Trộn với các tá dược talc 1,5%; magie stearat 0,5%. Đóng nang số 0. Khối lượng trung bình viên 0,5228g.  Liều dùng: ngày 2 lần, mỗi lần 2 viên. b. Tạo nền viên nén  Sấy khô cao đặc đến khi thu được cao khô. Xay cao khô thu được bột cao khô.  Cao dược liệu 48,6 g. Trộn lẫn với các tá dược silic keo, lactose, glucose với tỷ lệ 10%. Sát hạt ướt. Sấy khô. Trộn với các tá dược talc 1,5%, magie stearat 0,5%. Đóng gói. Khối lượng trung bình viên 0,8734g.

 Liều dùng: ngày 2 lần mỗi lần 2 viên c. Tạo nền viên hoàn cứng  Điều chế bột mịn dược liệu: các dược liệu như hoài sơn, bạch linh, trạch tả sấy khô, xay nhỏ, nghiền thành bột mịn. Rây qua rây kích thước 0,2 mm.  Trộn bột dược liệu với cao đặc, vê thành viên tròn. Sấy khô viên  Dịch bao màu: cân than hoạt, bộ Talc, tinh bột, nước. Tạo hồ tinh bột sau đó hòa than hoạt, talc vào hồ tinh bột tạo dịch bao màu  Bao màu đến khi viên có màu đồng nhất  Sấy khô viên và đóng gói 50 viên. Khối lượng trung bình viên: 0,2526g/viên

PHỤ LỤC 3: Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ

Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của atenolol

Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của amlodipin

Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của nifedipin

Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của valsartan

Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của hydroclorothiazid

Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ của furosemid

PHỤ LỤC 4: Sắc ký đồ khảo sát nồng độ tuyến tính

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C1

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C2

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C3

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C4

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C5

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C6

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C7

Sắc ký đồ các chất phân tích tại nồng độ C8

PHỤ LỤC 5: Phổ đồ xác định điểm IP dùng trong định tính

a) Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của amlodipin trên nền viên nang

b) Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của nifedipin trên nền viên nang

c) Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của atenolol trên nền viên nang

d) Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của HCT trên nền viên nang

e) Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của furosemid trên nền viên nang

f) Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của valsartan trên nền viên nang

PHỤ LỤC 6: Danh mục mẫu chế phẩm đông dược được phân tích ST T

Mã SP

Tên thuốc

Dạng bào chế

1

NHA01

Viên nang Thanh áp đan

Nhà thuốc

2

NHA02

Viên nang Nattospes

Nhà thuốc

NHA06

Viên nang Apharin

Mua trên trang web công ty Nefaco

NHA09

Viên nang Thông tâm lạc

Nhà thuốc

5

NHA13

Viên nang Hoạt huyết Nam Dược

Nhà thuốc

6

NHA14

Viên nang NattoEnzym

Nhà thuốc

NHA15

Viên nang Tiền đình khang Kigona

Nhà thuốc

HHA02

Viên hoàn cứng Hạ áp dưỡng huyết hoàn

Mua trên trang web Gia minh thảo dược (HCM)

3

4

7

8

Nơi sản xuất

Liều dùng

Công ty TNHH 2-3 IPHA công nghệ viên/lần Giấy XNNDQC Ngày 3 số: 356/2015/ lần XNQC-ATTP Công ty TNHH 2viên/ tư vấn y dược lần Quốc Tế Ngày 3 15649/2014/ATT lần P-XNCB 1viên/ Công ty cổ phần lần Nefaco Ngày 3 lần Shijiazhuang 2-4 Yiling viên/lần PharmaceuticalNgày 3 Trung Quốc lần VN-9380-09 Công ty TNHH 2 viên/ dược phẩm Nhất lần Nhất Ngày 2 1007/2018/ĐKSP lần Công ty TNHH 1 viên/ MTV dược phẩm lần.

DHG Ngày 2 3724/2016/ATTP lần -XNCB CT CP liên 3 viên doanh dược /lần phẩm Éloge Ngày 3 France Việt Nam lần Gia minh thảo dược

1 gói/ lần.

Ngày 2 lần

9

HHA03

Hoàn cứng Định áp khang

Mua trên trang web công ty Difoco (HCM)

10

HHA04

Viên hoàn cứng Ích áp cao

11

NHA16

Viên nang Tâm mạch 2

Nhà thuốc

HHA06

Hoàn mềm Tongren NiuHuan Qing xin wan

Mua qua internet

HHA11

Trang web Viên hoàn ‘‘ Thuốc hạ và ổn định nam Lương huyết áp Y Triệu Thị Triệu Hòa Hòa ’’

12

13

14

15

16

Nhà thuốc

Công ty cổ phần Difoco 32 viên/ 8528/2017/ATTP lần -XNCB Công ty TNHH 10 viên/ thảo dược Kiên lần.

Minh Ngày 229530/2017/ATT 3 lần P-XNCB Công ty TNHH 2 viên/ SX KD TM Công lần. Đức Ngày 3 49471/2017/ATT lần.

P-XNCB Beijing Tong Ren Tang 1 viên/ Limited lần Company-Trung Quốc Lương y Triệu Thị Hòa

30 - 40 viên/lần Ngày 3 lần

Công ty trách nhiệm hữu hạn Medistar Việt Nam 4556/2017/ATTP -XNCB

3 viên/ lần Ngày 2 lần

NEHA01

Viên nén Hạ áp đan Medi Happy

Nhà thuốc

NEHA02

Viên nén ZHENJU JIANGYAPI AN

Cửa hàng thuốc đông y 42 Lãn ông

Trung Quốc

Nhà thuốc

Công ty CP Dược VTYT Hải phòng 13689/2013/ATT P-XNCB

NELT03

Viên nén Hạ hồi đơn

1 viên/ lần.

Ngày 3lần 2-3 viên/ lần Ngày 2 lần

17

NLT03

18

NLT04

19

NLT08

20

NLT12

21

BLT01

22

HLT05

23

HLT06

24

HLT07

25

HLT08

2 viên/ Công ty dược lần phẩm Truepharco Ngày 2Việt Nam 3 lần 1-2 Viên nang Công ty TNHH viên/ Nhà thuốc Sỏi mật trái United Soft lần sung media Việt Nam Ngày 2 lần Công ty TNHH 2 viên/ Viên nang Mua qua dược phẩm và lần cứng Tán internet thương mại và Ngày 2 thảo khang Thành Công lần Viên nang American Mẫu gửi để 1 viên/ Giảm cân Biological and kiểm lần/ngà hồng hạc Technologynghiệm y Phục Linh Hồng Koong 1 Viên hoàn Công ty cổ phần gói/lần cứng Tiêu sỏi Trang web Dược Thiên Y Ngày 3 an thận Phúc lần Phòng khám đông 3 viên/ Viên hoàn Phòng khám y gia truyền lần cứng Thuốc đông y gia truyền Trần Ngọc Ngày 2 trị sỏi Trần Ngọc Sinh Sinh (Bắc lần Giang) Trang web phòng khám 15 viên/ Viên hoàn đông y gia Đông y gia lần cứng An thận truyền An truyền Ca Công Ngày 2 hoàn Ca Công lần (Thanh Hóa) Viên hoàn Nhà thuốc Cơ sở y dược 1 cứng SoThadi Yến Trang Diệu Phương gói/lần Trang web Viên hoàn đông y gia Đông y gia 5 viên/ Hoạt thạch truyền Mộc truyền Mộc Tân lần tán Tâm Đường Đường Viên nang Kim liệu khang

Phòng khám YHCT

26

27

28

29

30

BLT01

Viên hoàn cứng Tiêu sỏi an thận

Phòng khám đông y Y Phúc Đường

Phòng khám đông y Y Phúc Đường

NLT16

Viên nang Thanh quả Áo Đình

Nhà thuốc

Công ty CP TBYT Phú Hải

HLT09

Trang web Viên hoàn ‘‘ Thuốc Thuốc chữa nam Lương sỏi thận Triệu Y Triệu Thị Hòa Hòa ’’

NELT03

Viên nén Bài thạch Phúc Thọ

HLT10

Viên hoàn chữa đái rắt, đái buốt

Lương y Triệu Thị Hòa

1 gói/lần Ngày 3 lần 1 viên/ lần /ngày 1 thìa café/lần.

Ngày 3 lần

Công ty TNHH quốc tế Phúc Thọ 2 viên/ Mua qua Pharma lần internet XNCB: Ngày 214686/2017/ATT 3 lần P-XNCB Phòng Nhà thuốc gia 1 gói/ khám đông truyền Bách Thảo lần/ngà y Đường y

PHỤ LỤC 7: SKĐ và phổ đồ của một số mẫu đại diện Mẫu NHA 01 Viên nang Thanh áp đan NSX: Công ty TNHH IPHA công nghệ Nơi mua: Mua tại nhà thuốc Hải Đăng

a) Phổ đồ của valsartan

b) Phổ đồ của furosemid

c) Phổ đồ của atenolol

d) Phổ đồ của HCT

e) Phổ đồ của amlodipin

f) Phổ đồ của nifedipin

Phổ khối (ion mẹ và 2 ion con) của 6 chất phân tích trên mẫu viên nang NHA 01

Sắc ký đồ phân tích mẫu viên nang NHA 01

Mẫu NEHA 2 Viên nén ZHENJU JIANGYAPIAN NSX: Trung Quốc Nơi mua: Cửa hàng thuốc đông y 42 Lãn Ông

a) Phổ khối của HCT

b) Phổ khối của atenolol

c) Phổ khối của nifedipin

e) Phổ khối của furosemid

d) Phổ khối của valsartan

f) Phổ khối của amlodipin

Phổ khối (ion mẹ và ion con) 6 chất phân tích trên mẫu NEHA 2

Sắc ký đồ mẫu NEHA 2

Mẫu HLT 05 Viên hoàn cứng Thuốc trị sỏi NSX: Phòng khám đông y gia truyên Trần Ngọc Sinh Mua tại phòng khám

a) Phổ khối của furosemid

b) Phổ khối của HCT

c) Phổ khối của valsartan Phổ khối ( ion mẹ và ion con) 3 chất phân tích trên mẫu HLT 05

Sắc ký đồ mẫu HLT 05

Mẫu HHA06 Hoàn mềm Tongren NiuHuan Qing xin wan Beijing Tong Ren Tang Limited Company-Trung Quốc Mua qua internet

a) Phổ khối của HCT

b) Phổ khối của amlodipine

c) Phổ khối của Atenolol

d) Phổ khối của Valsartan

d) Phổ khối của Nifedipin

f) Phổ khối của Furosemid

Phổ khối khối (ion mẹ và ion con) của 6 chất phân tích trên mẫu HHA 06

Sắc ký đồ mẫu HHA 06