Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÚY DIỆU MSV: 1101077

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÚY DIỆU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. Th.S Trần Thị Lan Hương 2. Th.S Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược- ĐH Dược HN Trung tâm đánh giá TĐSH - VKN thuốc TW

HÀ NỘI – 2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

Ơ

N

Lời đầu tiên, em xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến

N

H

Th.S Trần Thị Lan Hương - Giảng viên bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược

U Y

Hà Nội và Th.S Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung tâm Tương đương sinh học -

TP

dẫn em thực hiện khóa luận này.

ẠO

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hà Nội, Trung tâm Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương,

G

thầy cô và các anh, các chị đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời

H Ư

N

gian thực hiện khóa luận.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược

TR ẦN

Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để em có được thành quả ngày hôm nay.

10 00

B

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ em trong cuộc sống.

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Trần Thị Thúy Diệu

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

Em xin chân thành cảm ơn!

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tận tình chỉ bảo, hướng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1

N

MỤC LỤC

H

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................2

U Y

N

1.1. Tổng quan về Pantoprazol ...................................................................................2

TP

1.1.2. Tính chất hóa lý .................................................................................................2

ẠO

1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của PAN ........................................2

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường .......................................................................3

N

G

1.1.5. Một số phương pháp định lượng PAN trong dịch sinh học ..............................4

H Ư

1.2. Tổng quan về HPLC và thẩm định phương pháp định lượng thuốc

TR ẦN

trong dịch sinh học ......................................................................................................5 1.2.1. Tổng quan về HPLC..........................................................................................5

B

1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học .......................9

10 00

CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................11

Ó

A

2.1. Điều kiện thực nghiệm .......................................................................................11

H

2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................13

-L

Í-

2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................13

ÁN

2.4. Phương pháp xử lí kết quả .................................................................................19

TO

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ...............................................................20

ÀN

3.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng.......................................................20

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

1.1.1. Công thức hóa học ............................................................................................2

D

IỄ N

Đ

3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ........................................................27 3.3. Bàn luận .............................................................................................................40 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................41 4.1. Kết luận ..............................................................................................................41 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

N

: Pantoprazol

CV

: Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

IS

: Chất nội chuẩn (Internal standand )

LLOQ

: Nồng độ giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification)

ULOQ

: Nồng độ giới hạn định lượng trên (Upper Limit of Quantification)

QC

: Mẫu kiểm tra chất lượng (Quality Control Samples)

LQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Lower Quality Control Samples)

MQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples)

HQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

SKĐ

: Sắc ký đồ

Cmax

: Nồng độ đỉnh

T1/2

: Thời gian bán thải

ÁN

UV–VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visble)

ÀN

TO

US–FDA : Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

: Cơ quan quản lý thuốc Châu âu (European Medicine Agency)

D

IỄ N

Đ

EMA

(United States of American Food and Drug Administration)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

PAN

-L

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang

Ơ

N

Nội dung Một số chế phẩm pantoprazol trên thị trường

1.2

Một số nghiên cứu định lượng pantoprazol trong dịch sinh học

2.1

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

2.2

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.3

Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu

2.4

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.5

Chuẩn bị đường chuẩn

2.6

Chuẩn bị mẫu kiểm tra

3.1

Kết quả đáp ứng mẫu trắng

3.2

Kết quả thẩm định đường chuẩn

3.3

Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới

30

3.4

Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày

31

3.5

Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác khác ngày

32

3.6

Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn

33

3.7

Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi pantoprazol

34

3.8

Độ ổn định dung dịch nội chuẩn trong thời gian ngắn

35

3.9

Độ ổn định dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày

3.10

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã

3.11

Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

37

3.12

Độ ổn định của nồng độ 90 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài

38

Độ ổn định của nồng độ 3500 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài

38

Độ ổn định của mẫu trong auto – sampler

39

ÀN

N U Y

.Q TP ẠO Đ

G N H Ư

TR ẦN

B

10 00

A

Ó

H

Í-

-L

11 11 12 12 14 14 28 29

35 36

D

IỄ N

Đ

3.14

4

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TO

3.13

3

H

1.1

ÁN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Nội dung

Trang

Ơ

Hình

N

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Phổ hấp thụ UV-VIS của PAN

20

3.2

SKĐ PAN và omeprazol

3.3

SKĐ PAN và rabeprazol

3.4

SKĐ PAN và lansoprazol

3.5

SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 30:70

3.6

SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 36:64

SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3 (36:64) với tốc độ dòng 1,3 mL

21 21 22 23 23 24

SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3 (36:64) với tốc độ dòng 1,5 mL

3.9

Quy trình xử lý mẫu

24

10 00

B

3.8

25

A

SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS với quy trình xử lý mẫu được chọn

26

3.11

SKĐ mẫu huyết tương trắng

3.12

SKĐ mẫu huyết tương trắng có chứa nội chuẩn

27

3.13

SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa PAN

27

3.14

SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml.

27

Í-

H

Ó

3.10

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

27

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y .Q TP ẠO Đ

G

N H Ư

3.7

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

H

3.1

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 1

ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dạ dày - tá tràng là bệnh khá phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Hiện

H

Ơ

N

nay, đây đang là bệnh đứng đầu về tỉ lệ mắc trong số các bệnh về đường tiêu hóa.

Trên thế giới, ước tính khoảng 10% dân số mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân

U Y

N

biệt giới tính, tỉ lệ mắc bệnh ở người lớn cao hơn trẻ em và hàng năm tăng khoảng 0,2% [18]. Có nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm thuốc

ẠO

TP

nhóm thuốc ức chế bơm proton tác dụng nhanh, hiệu quả, tỷ lệ làm lành vết loét có thể đạt tới 95% sau tám tuần điều trị. Thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày[1]. Do đó, nhóm thuốc này được sử dụng rất nhiều trong các phác đồ điều trị loét dạ dày - tá tràng.

H Ư

N

G

Pantoprazol là thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton, thuốc dung nạp tốt, ít để lại tác dụng phụ nên là một trong những thuốc đang được sử dụng phổ biến tại

TR ẦN

Việt Nam. Để có được liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc kiểm soát nồng độ hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết. Ngoài ra, việc

B

giám sát chất lượng thuốc cũng như đánh giá tương đương sinh học thuốc chứa pantoprazol là vô cùng quan trọng nhằm nâng cao chất lượng thuốc và giúp bác sĩ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

lựa chọn được các thuốc an toàn, hiệu quả, kinh tế. Tuy vậy, hiện nay ở nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng pantoprazol trong huyết tương.

Xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ pantoprazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất pantoprazol chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 nội dung chính: 1. Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp HPLC. 2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng pantoprazol trong huyết tương theo tiêu chuẩn US-FDA và EMA.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

kháng acid, nhóm thuốc kháng H2, nhóm thuốc ức chế bơm proton... Trong đó,

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ PANTOPRAZOL

N

H

Ơ

N

1.1.1. Công thức hóa học - Pantoprazol (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S - Khối lượng phân tử : 383,37

- Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – 2 – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl) methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12].

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

1.1.2. Tính chất hóa lý - Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng.

- Khó tan trong nước, log P = 2,18.

- Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5 phân tử nước.

- Hấp thu UV do có liên kết đôi liên hợp [3,12,14].

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của pantoprazol * Cơ chế tác dụng: Sau khi được hấp thu, PAN tích lũy trong ống tiết acid của tế bào thành dạ dày. Ở đây, nó gắn kết với nhóm sulfhydryl của hệ enzyme H+/ K+ - ATPase trên bề mặt tiết gastrin của tế bào vách, gây ra sự ức chế tiết acid cơ bản và tiết acid do kích thích. PAN có thể ức chế sự tiết acid dạ dày mà không kể đến bản chất của kích thích (acetylcholin, histamin, gastrin…) [1,2,20]. * Dược động học: - Hấp thu: PAN được hấp thu nhanh. Nồng độ đỉnh Cmax của PAN là 2400

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

- Công thức cấu tạo :

ng/mL đạt được sau khoảng 2 – 2,5 giờ khi dùng PAN liều 40mg chia liều hoặc

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3

dùng liều duy nhất. Thức ăn làm tăng thời gian hấp thu nhưng không làm thay đổi Cmax và diện tích dưới đường cong AUC của PAN.

Ơ

N

- Phân bố: 98% PAN gắn kết với protein huyết tương. Thể tích phân bố khoảng 0,17 l/kg, phân bố chủ yếu trong dịch ngoại bào.

TP

.Q

- Thải trừ: Chất chuyển hoá bài tiết chủ yếu qua nước tiểu (80%), lượng còn lại thải trừ qua mật và phân. T1/2 khoảng 1 giờ và kéo dài trong suy gan, ở bệnh nhân

ẠO

xơ gan là 3 - 6 giờ.Vì vậy, cần xem xét hiệu chỉnh liều cho bệnh nhân suy gan [1,2,14,20].

Đ G N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

* Chỉ định - Loét dạ dày - tá tràng.

- Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản.

TR ẦN

- Hội chứng tăng tiết acid (hội chứng Zollinger Ellison).

- Dự phòng loét dạ dày - tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do stress [1,2,20].

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường Các chế phẩm có chứa PAN trên thị trường chủ yếu ở dạng: bột pha tiêm truyền tĩnh mạch, viên nang tan trong ruột hàm lượng 40mg [1]. Ngoài ra còn một số dạng như viên nén, viên giải phóng kéo dài... đáp ứng nhu cầu đa dạng của người sử dụng. Một số chế phẩm chứa PAN trên thị trường được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 [19].

Dạng bào chế

1

Viên nén bao tan trong ruột

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

STT

Bảng 1.1: Một số chế phẩm PAN trên thị trường

2

Bột đông khô pha tiêm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Tên biệt dược

H/lượng

Nhà sản xuất

Bio-panto

40mg

Biodeal Laboratories

Hasanloc

40mg

Hasan- Dermapharm

Pantoloc

40mg

Nycomed

Pantostad

40mg

STADA- VN J.V

SP Extream

40mg

Shinpoong Daewoo

Sozol

40mg

Atlantic Pharma

Pantoloc

40mg

Nycomed

Pantosec

40mg

Cipla

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

- Chuyển hoá: PAN được chuyển hoá chủ yếu ở gan nhờ enzym CYP2C19 của cytochrom P450 để thành demethylpantoprazol.

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 4

PMS-Pantoprazol

40mg

Pharmascience Inc

Viên nén GPKD

Proton-P

40 mg

Aristopharma

4

Viên nén

Nolpaza

40mg

KRKA

Ơ

N

3

TP

.Q

sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như HPLC, điện di mao quản, phóng xạ miễn dịch. Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số phương pháp định lượng PAN trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2.

Tủa

1 Huyết [17] tương chó

Cột

Rofecoxib

Chromasil C18 (250 mm x 4.6 mm)

Acetonitril : đệm phosphat UV, pH 3,15 = λ 272nm 42 :58 (v/v) Tốc độ dòng: 1ml/phút

Omeprazol

Acetonitril: Diamosil đệm phosphat UV, ODS C18 pH 6,8 = λ 288nm (150mm×4 32:68 (v/v) ,6mm) Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

Omeprazol

A

H -L

TO ÀN Đ

Huyết 3 tương [10] người

50:50 (v:v) Tủa protein bằng methanol (MeOH)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Detector

Acetonitril: 10mM amoni UV, acetat pH 6,0 λ 290nm Tốc độ dòng: 1ml/phút

Ó

Tủa protein bằng acetonitrilmethanol=

Pha động

Diamosil C18 (250 mm×4 mm)

10 00

protein bằng acetonitril

IS

Í-

Huyết tương người

ÁN

2 [6]

IỄ N D

Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký

TR ẦN

Mẫu

B

PP

H Ư

N

G

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng PAN trong dịch sinh học

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

1.1.5. Một số phương pháp định lượng pantoprazol trong dịch sinh học Hiện nay, định lượng PAN nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Định lượng PAN trong dịch

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 5

Nhận xét:

N

Phương pháp 1, 2 và 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung môi MeCN, MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa

N

H

Ơ

sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ, không thuận lợi cho quá trình phân tích mẫu.

TP

chuẩn là chưa thực sự hợp lý.

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

hóa của PAN, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng PAN trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam.

TR ẦN

1.2. TỔNG QUAN VỀ HPLC VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 1.2.1. Tổng quan về HPLC 1.2.1.1. Khái niệm chung Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chếphân bố [4,5]. * Pha tĩnh: Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của hỗn hợp các chất.

Loại pha tĩnh phổ biến được chế tạo trên nền Silica. Nhóm OH trên bề mặt hạt

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

Ngoài ra, với phương pháp 2 dùng nội chuẩn là rofecoxib, là một thuốc NSAID cấu trúc không có nhiều điểm tương đồng với pantoprazol nên dùng làm nội

Ở đây, R có thể là mạch thẳng có 18 hoạc 8 carbon hoặc nhóm hữu cơ khác như hydrocarbon thơm... Tính phân cực của pha thay đổi tùy thuộc gốc R [4,5].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 6

* Pha động:

N

Pha động là dung môi rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Yêu cầu của pha động:

N

H

Ơ

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

- Hòa tan chất cần phân tích.

TP

- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường [5,16]. * Phân loại sắc ký: dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà chia làm

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

2 loại: - Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân cực hơn.

Trong sắc ký pha thuận thì chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần.

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực hơn. Trong sắc ký pha đảo thì các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng dần [4,5].

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

1.2.1.2. Cấu tạo máy HPLC Hệ thống HPLC đơn giản, bao gồm các bộ phận chính sau: * Hệ thống cấp dung môi: Hệ thống cấp dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ.

Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm) và đuổi khí hòa tan. * Bơm: Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký. * Bộ phận tiêm mẫu: Để đưa mẫu phân tích vào cột, có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm tự động. * Cột sắc ký: Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký. * Detector:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

- Có độ tinh khiết cao.

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 7

Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân

N

tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [4,5].

N

H

Ơ

1.2.1.3. Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC * Thời gian lưu tR

TP

dài. Nếu tR quá nhỏ thì khả năng tách kém [4,5].

ẠO

* Hệ số chọn lọc α Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số

Đ =

=

H Ư

N

α =

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

chọn lọc α :

* Hệ số đối xứng của pic F

TR ẦN

Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α >1 Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [4,5].

B

F=

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [4,5]. * Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột:

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [4,5]. * Hệ số bất đối AF Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.

Thời gian lưu càng lớn, chất tan càng bị lưu giữ mạnh, thời gian phân tích kéo

AF = Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic[4,5]

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 8

* Độ phân giải Rs Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) Rs =

TP

Yêu cầu: RS > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [4,5].

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

1.2.1.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

TR ẦN

H Ư

N

G

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic. Có 4 phương pháp thường được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích.

Do đặc điểm của nền mẫu huyết tương có chứa nhiều thành phần khác nhau nên các phương pháp định lượng hoạt chất trong huyết tương thường có giai đoạn

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

xử lý chiết tách hoạt chất, loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng nên gây ra rất nhiều sai số.

Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương do phương pháp này có thể hạn chế được các sai số vừa nêu trên và các sai số gây ra do máy móc và kỹ thuật.

Phương pháp chuẩn nội: * Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử lượng bằng nhau của một chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là nội chuẩn. * Yêu cầu với chất nội chuẩn: - Trong cùng điều kiện sắc ký, chất nội chuẩn phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.

- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử.

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm. * Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa lượng chất chuẩn khác nhau nhưng cùng chứa một lượng nội chuẩn. Tiến hành sắc ký và ghi lại đáp ứng pic, từ đó vẽ đường

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

t(R)A; t(R)B : thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B). : độ rộng pic đo ở các đáy pic.

WA; WB W1/2A; W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.

N

Trong đó:

H

Ơ

N

hoặc

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 9

chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (chiều cao) pic của chuẩn trên

N

nội chuẩn với tỷ số nồng độ chuẩn trên nội chuẩn. Song song tiến hành sắc ký mẫu thử cũng được thêm chuẩn với lượng như trên. Tính tỷ số diện tích ( chiều cao ) pic

N

H

Ơ

của chất thử trên diện tích ( chiều cao ) pic của chất nội chuẩn rồi dựa vào đường chuẩn tìm nồng độ của chất thử [4,5].

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích thực tế.

G

1.2.2.2. Một số phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

dịch sinh học Do dịch sinh học chứa nhiều thành phần khác nhau nên khác với định lượng các dạng bào chế hay định lượng nguyên liệu, định lượng dược chất trong dịch sinh học thì khâu xử lý mẫu đóng vai trò rất quan trọng, nó có tính quyết định đến kết quả phân tích. Hiện nay thường áp dụng 3 phương pháp chính để xử lí mẫu huyết tương là : - Phương pháp chiết pha rắn: là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng chất rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp.

- Phương pháp kết tủa protein: là quá trình loại protein trong mẫu bằng tác nhân gây tủa protein như acid mạnh (percloric, tricloracetic, trifluoracetic) hoặc dung môi (MeOH, MeCN).

- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

1.2.2.3. Nội dung thẩm định * Tính chọn lọc – đặc hiệu Độ chọn lọc hay tính đặc hiệu thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể xác định (định tính - định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các thành phần khác có trong mẫu thử như các chất nội sinh, chuyển hóa, sản phẩm phân hủy hay các thuốc uống cùng [7,8,13,15]. * Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

.Q

U Y

1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học 1.2.2.1. Khái niệm Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 10

thấp nhất đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn phải

N

gồm ít nhất 6 nồng độ chất chuẩn pha trên cùng một mẫu dịch sinh học [7,8,13,15]. * Giới hạn định lượng dưới ( LLOQ)

Ơ

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (1/30-1/10 Cmax) thường

TP

.Q

Độ đúng: giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết [7,8,13,15].

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

* Độ chính xác Độ chính xác: là độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân

N

G

Đ

tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV (%)[7,8,13,15].

H Ư

* Tỷ lệ thu hồi Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui

TR ẦN

trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không qua chiết tách, được pha trong dung môi phù hợp [7,8,13,15].

Ó

A

10 00

B

* Độ ổn định Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử.

-L

Í-

H

Đánh giá độ ổn định gồm: - Độ ổn định của dung dịch nội chuẩn gốc và dung dịch gốc: Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài.

TO

ÁN

- Độ ổn định của dung dịch làm việc: Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài.

ÀN

- Độ ổn định của mẫu dịch huyết tương: sau 3 chu kỳ đông - rã, ở nhiệt

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

được chấp nhận là LLOQ [7,8,13,15]. * Độ đúng

D

IỄ N

Đ

độ phòng trong thời gian ngắn, trong thời gian dài, sau xử lý [7,8,13,15].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 11

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ơ

N

2.1. ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM

Pantoprazol

VKNT TP HCM

QT219011212

Pantoprazol natri

VKNTTW

0114306.01

Lansoprazol

VKNTTW

.Q Hàm lượng

Đ

G

93,87%

H Ư

N

93,72%

WS. 0106203

99,5%

Nơi sản xuất

HPLC

Merck, Đức

HPLC

Merck, Đức

Ó

Hóa chất

Dikali hydrophosphat

P.A

Merck, Đức

Tertbutyl methyl ether

P.A

Merck, Đức

P.A

Merck, Đức

10 00

B

Độ tinh khiết

-L

Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Acetonitril

Í-

H

A

Methanol

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Triethyelamin

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Số kiểm soát

TP

Nơi sản xuất

ẠO

Tên

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3.

Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

U Y

N

H

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 12

Bảo quản

01

13PN00493

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

02

13PN00196

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

03

13PN00237

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

04

13PN00343

Viện huyết học – truyền máu TW

05

13PN00083

Viện huyết học – truyền máu TW

06

13PN00228

Viện huyết học – truyền máu TW

07

15P006178

Viện huyết học – truyền máu TW

N

-35oC ± 5oC

G

N

TR ẦN

H Ư

-35oC ± 5oC

B

10 00

A

H

Í-

Cân phân tích

Ó

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

-L

Máy ly tâm lạnh

ÁN

TO

Tủ lạnh bảo quản chất chuẩn

Shimadzu, Nhật Sartorius-CP224S, Đức Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức Sanyo MDF – 236, Nhật Haier, Trung Quốc

Thiết bị lọc nước

TKA, Đức

Máy lắc xoáy

Velp, Ý

Máy lắc cơ học

GFL, Đức

Micropipet

Eppendorf, Đức

Đầu típ cho micropipet

Isolab, Đức

Ống chiết thủy tinh 15 mL

SUPELCO, Đức

Bình định mức, pipet class A

Prolabo, Pháp

ÀN Đ IỄ N

Nhà sản xuất

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

.Q TP

ẠO

-35oC ± 5oC

Bảng 2.4: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tủ lạnh sâu -35oC ± 5oC

D

-35oC ± 5oC

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4.

Thiết bị

N

Nơi cung cấp

Ơ

Lô

H

Mẫu

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 2.3: Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 13

Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Shimadzu gồm: Interface CBM - 2A; bơm

N

cao áp LC - 20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL - 20AC; Detector DAD SPD M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO - 20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC

H

Ơ

Solution Shimadzu.

TP

.Q

HPLC: lựa chọn phương pháp xử lí mẫu, điều kiện sắc ký, lựa chọn nội chuẩn cho phép định lượng PAN trong mẫu với độ chính xác thích hợp.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Thẩm định phương pháp về các chỉ tiêu: Tính chọn lọc - đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu

Đ

suất chiết, độ ổn định.

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo 2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc - Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn PAN trong methanol (MeOH) để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ PAN chính xác khoảng 1000 µg/mL. - Dung dịch nội chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn lansoprazol trong MeOH để thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1 mg/mL.

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu đường chuẩn - Từ dung dịch chuẩn gốc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (CC1 và CC2) có nồng độ PAN lần lượt khoảng 4000 ng/mL và 1000 ng/mL. - Từ dung dịch nội chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc trong hỗn hợp MeOH : H2O (1:1) có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/mL.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết tương trắng có pha nội chuẩn (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn PAN và IS. Tiến hành pha loãng CC1 VÀ CC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu chuẩn có nồng độ từ 30 – 4000 ng/mL như ở bảng 2.5.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 14

Nồng độ (ng/mL)

VHTtrắng (L)

VCC1 (L)

VCC2 (L)

Blank

-

1000

-

-

Zero

-

1000

-

-

S1

30

970

-

30

S2

100

900

-

S3

500

500

-

S4

1000

0

-

S5

2000

500

S6

2500

375

S7

3000

250

S8

4000

-

625

-

750

-

1000

-

Đ

-

G

Ơ H N

U Y .Q TP

ẠO

1000

500

N H Ư

500

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác có nồng độ PAN chính xác khoảng 1000 µg/mL. Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc (QC1, QC2) trong huyết tương có nồng độ PAN chính xác khoảng 4000 ng/mL và 1000 ng/mL. Tiến hành pha loãng QC1 và QC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu LQC (90 ng/mL), MQC (1800 ng/mL), HQC (3500 ng/mL) như ở bảng 2.6.

Bảng 2.6: Chuẩn bị mẫu kiểm tra LQC

MQC

HQC

Nồng độ (ng/mL)

90

1800

3500

VHT trắng (µL)

910

550

125

VQC1 (µL)

-

450

875

VQC2 (µL)

90

-

-

ÁN

Ký hiệu

TO ÀN Đ IỄ N D

100

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

2.3.1.3. Chuẩn bị mẫu kiểm tra

N

Mẫu

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 2.5: Chuẩn bị đường chuẩn

2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích 2.3.2.1. Xác định điều kiện sắc ký Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 15

- Lựa chọn bước sóng phát hiện

N

- Lựa chọn cột sắc ký - Lựa chọn pha động

N

H

Ơ

- Lựa chọn tốc độ dòng - Lựa chọn chất nội chuẩn

TP

DAD.

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

2.3.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách PAN từ huyết tương trên các mẫu chuẩn PAN hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như: - Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: MeOH, MeCN, acid perclorid - Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: chloroform, tert butyl methyl ether.

Í-

H

Ó

A

10 00

B

2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 2.3.3.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau và huyết tương trắng có pha chuẩn PAN ở nồng độ 30 ng/mL và IS. So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:

ÁN

-L

- Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu ( hệ số bất đối ~ 1; độ phân giải (Rs) giữa pic của

TO

chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn 1,5).

D

IỄ N

Đ

ÀN

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng PAN trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng [7,8,13,15].

2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung dịch có nồng độ như sau: 30 - 100 - 500 - 1000 - 2000 - 2500 - 3000 - 4000 ng/mL.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 16

Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Từ đáp ứng pic của

N

các chất tại các nồng độ, xác định tương quan giữa đáp ứng pic với nồng độ đã pha.

Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Từ phương trình

N

H

Ơ

hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng của mỗi nồng độ.

TP

LLOQ được chấp nhận 80% - 120%.

- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

LLOQ và ULOQ phải đạt tiêu chuẩn.

- Khoảng tuyến tính: có hệ số tương quan r ≥ 0,98 [7,8,13,15].

N

G

2.3.3.3. Giới hạn định lượng dưới

H Ư

Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL. Dựa theo

TR ẦN

đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu vừa khảo sát.

Nồng độ chuẩn thấp nhất được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn điều kiện

B

sau:

10 00

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic trung bình của mẫu trắng.

Ó

A

- Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80% - 120% so với nồng độ thực.

Í-

H

- Độ chính xác CV ≤ 20% [7,8,13,15].

ÁN

-L

2.3.3.4. Độ đúng Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương có nồng độ theo bảng 2.6.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện. Phân tích các mẫu theo phương pháp cần đánh giá. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic. Tính lại nồng độ các mẫu QC theo đường chuẩn. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh nồng độ phân tích được so với nồng độ thực đã pha.

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ đúng trung bình của từng lô mẫu phải nằm trong khoảng 85% - 115% nồng độ thực đã pha [7,8,13,15].

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: - Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm

2.3.3.5. Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày( độ chính xác) Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng. Xác định kết quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 17

Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị các

N

lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày.

Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị

N

H

Ơ

các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ lặp lại giữa các nồng

.Q

2.3.3.6. Tỷ lệ thu hồi

TP

Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC, HQC trong dịch sinh học, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 6 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các lô mẫu

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

QC trong pha động (phân tích định lượng trực tiếp không qua giai đoạn chiết tách).

N

G

Đ

Tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học (có qua chiết tách) với đáp

TR ẦN

H Ư

ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách).

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: - Tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ khác nhau không được quá 15%.

10 00

B

- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC có qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%.

Ó

2.3.3.7. Độ ổn định

A

- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 5% [7,8,13,15].

Í-

H

 Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch nội chuẩn sau bảo quản với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.

Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

độ phân tích được của mỗi lô mẫu có giá trị CV ≤ 15% [7,8,13,15].

 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC trong một thời gian nhất định (khoảng 6 ngày). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn PAN gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC những khoảng thời gian nhất định (khoảng 6 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.

Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 18

 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và

N

HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35oC ± 5oC và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau

TP

.Q

tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu).

Nồng độ PAN trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

Đ

 Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

N

G

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông.

Nồng độ PAN trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%. * Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35oC ± 5oC, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định khoảng sau 30, 53, 68 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu.

Nồng độ PAN trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

Ơ

khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12-24 giờ. Lặp lại chu kì đông - rã 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông - rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ PAN có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ PAN có trong các mẫu

D

IỄ N

Đ

ÀN

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong autosampler sau một thời gian xác định (khoảng 25 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý.

Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 19

N

2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ - Giá trị trung bình, độ đúng, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2010.

N

H

Ơ

- Nồng độ của PAN trong huyết tương được xác định dựa vào phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa tỉ lệ diện tích pic và nồng độ của mỗi chất

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

được xây dựng trong mỗi ngày phân tích.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

TP ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

175

N

G

Đ

150

H Ư

125

TR ẦN

100

250

50

10 00

291

B

75

-L

784

740

645

608

556

518

Í-

0

362

H

Ó

A

25

300

ÁN

200

400

500

600

700

nm

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Hình 3.1.Phổ hấp thụ UV-VIS của PAN Trên phổ UV, PAN có 2 cực đại hấp thụ ở các bước sóng λ = 201 nm và 291 nm. Trong hai cực đại, PAN có độ hấp thu cao hơn ở bước sóng λ = 201 nm. Tuy nhiên, đây là vùng bước sóng ngắn, cực đại hấp thụ không đặc trưng cho hoạt chất, có nhiều chất kể cả một số dung môi hữu cơ như MeOH cũng hấp thụ mạnh ánh sánh tử ngoại. Do vậy, kết quả phân tích độ hấp thụ UV của hoạt chất có thể bị ảnh hưởng và trên SKĐ cũng sẽ xuất hiện nhiều pic tạp, đường nền không “phẳng” ảnh hưởng đến kết quả tích phân xác định diện tích hay chiều cao của pic. Kết hợp tham khảo một số tài liệu về phương pháp định lượng PAN và điều kiện phòng thí

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

mAU 5.11/ 1.00

201

200

U Y

N

H

Ơ

N

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn 3.1.1.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ Quét phổ hấp thụ của mẫu chuẩn PAN dung dịch trong MeOH, ta được phổ của PAN như hình 3.1 sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 21

nghiệm, chúng tôi lựa chọn bước sóng phù hợp tiến hành chạy sắc ký là λ = 291± 2 nm.

N

H

Ơ

N

3.1.1.2. Lựa chọn nội chuẩn Chất được lựa chọn làm nội chuẩn cần có cấu trúc và tính chất vật lý gần giống với chất phân tích. Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của chất phân

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

Hình 3.2: SKĐ PAN và omeprazol

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

Sau đây là các sắc ký đồ thu được trong quá trình khảo sát IS:

.Q

U Y

tích và các chuẩn sẵn có ở phòng thí nghiệm chúng tôi khảo sát một số chất làm nội chuẩn như: omeprazol, rabeprazol, lansoprazol.

Hình 3.3: SKĐ PAN và rabeprazol

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 22

60

Ơ

50

N

Pantoprazol/5.430

mAU 70 290nm,4nm (1.00)

30

.Q

10

-10 0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

ẠO

TP

0

7.0

8.0

9.0

min

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hình 3.4: SKĐ PAN và lansoprazol

H Ư

N

G

Với nội chuẩn là omeprazol và rabeprazol ta thu được sắc ký đồ có thời gian lưu của chất phân tích và nội chuẩn gần nhau làm cho sắc ký đồ chồng lên nhau

10 00

B

TR ẦN

không tách ra được nên việc định lượng PAN với nội chuẩn omeprazol và rabeprazol sẽ gây khó khăn trong quá trình định lượng.

Với nội chuẩn là lansoprazol, ta thấy thời gian chạy sắc ký phù hợp(nhỏ hơn 10 phút), pic chất phân tích và nội chuẩn tách nhau rõ ràng. Do đó ta lựa chọn lansoprazol làm chất nội chuẩn cho việc định lượng PAN trong huyết tương.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

3.1.1.3. Lựa chọn cột sắc ký Do PAN là chất ít phân cực nên nếu tiến hành sắc ký pha thuận sẽ làm thời gian chạy sắc ký kéo dài gây khó khăn cho quá trình phân tích.

Tiến hành phân tích trên hệ sắc ký pha đảo: chất phân tích ít phân cực và pha động phân cực. Trong pha đảo, sử dụng hai loại cột chủ yếu là cột C8 và C18. Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi chỉ có cột C18 nên chúng tôi lựa chọn sử dụng cột C18. Ta tiến hành khảo sát cột C18 với các độ dài cột khác nhau: 100 mm, 150 mm, 250 mm. Với loại cột dài 100 mm, 150 mm, do chiều dài cột ngắn nên khi phân tích mẫu, pic chất phân tích và nội chuẩn không tách nhau hoàn toàn (Rs < 1,5).

Kết hợp tham khảo một số tài liệu định lượng PAN trong dịch sinh học, chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột sắc ký Rp18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) với bảo vệ cột Rp18 (4 x 3 mm; 5µm) kết quả thực nghiệm thấy cột Rp18 có khả năng tách tốt và chọn lọc PAN ra khỏi mẫu phân tích (hình 3.4).

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

20

N

IS/8.796

H

40

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 23

N

3.1.1.4. Lựa chọn pha động và tốc độ dòng - Tiến hành khảo sát pH của hệ đệm: do PAN có 2 pKa lần lượt là 9,15 và 3,55 nằm ở hai vùng pH acid và base nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát pH nằm

N

H

Ơ

trong vùng pH trung tính. Trong vùng pH trung tính chúng tôi khảo sát các pH từ 7,0 đến 7,5. Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi chọn pH hệ đệm phosphat 0,01M là

TP

các tỉ lệ khác nhau: ta thấy khi giảm tỉ lệ MeCN sẽ làm cho thời gian lưu của chất phân tích bị kéo dài hơn, gây kéo dài quá trình phân tích. Để đảm bảo phù hợp với

ẠO

quy trình phân tích ta lựa chọn tỉ lệ pha động MeCN : đệm phosphat 0,01M pH 7,3

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

(36 :64) .

- Khảo sát hệ pha động MeCN : đệm phosphat 0,01M pH 7,3 (36 : 64) với tốc độ dòng là 1,3 mL/phút và 1,5 mL/phút, kết quả sắc ký cho thấy ở tốc độ dòng 1,5

Hình 3.5: SKĐ của PAN và IS với pha động MECN: đệm tỷ lệ 30:70

Hình 3.6: SKĐ của PAN và IS với pha động MECN: đệm tỷ lệ 36:64

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

mL/phút, thời gian lưu tương ứng của chuẩn và nội chuẩn lần lượt là 5,5 và 8,8 phút, pic cân xứng, đáp ứng tốt. Do đó, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng của hệ sắc ký là 1,5 mL/phút.

Sau đây là một số sắc ký đồ thu được từ quá trình khảo sát:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

7,3 cho quy trình định lương PAN trong huyết tương.

- Tiến hành khảo sát với pha động MeCN: đệm phosphat 0,01M pH 7,3 với

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

30 25

40

0

0

H N

-5 3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0 min

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

Đ

2.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

min

G

1.0

Hình 3.8: SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat (36:64) với

với tốc độ dòng 1,3 mL

tốc độ dòng 1,5 mL

H Ư

N

Hình 3.7: SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat (36:64)

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

-10 0.0

TP

5

ẠO

10

.Q

10

10 00

B

Như vậy, để tách hoàn toàn và chọn lọc PAN và IS ra khỏi mẫu phân tích đồng thời đảm bảo thời gian phân tích một mẫu không quá dài chúng tôi thấy hệ pha động MeCN - đệm phosphat 0,01M pH 7,3 với tỷ lệ 36:64 (v/v) cùng với tốc độ dòng 1,5 ml/phút là phù hợp.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu chứa pantoprazol - Phương pháp tủa protein: PAN có tính thân dầu ( log P = 2,18) nên mặc dù việc chiết mẫu bằng tủa protein tiến hành đơn giản nhưng rất khó thu được chất cần phân tích nên chúng tôi không sử dụng phương pháp này.

- Phương pháp chiết pha rắn (SPE): phương pháp này có ưu điểm là khá chọn lọc với chất phân tích, thích hợp với việc phân tích lượng mẫu nhỏ, thao tác đơn giản, dễ thực hiện so với các phương pháp khác. Tuy nhiên, phương pháp này gây tốn kém về mặt kinh tế và chưa có sẵn ở các phòng thí nghiệm ở nước ta nên chưa được áp dụng rộng rãi.

- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: phương pháp phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm nước ta, mẫu xử lí sạch, ít tạp nên được áp dụng phổ biến trong xử lí mẫu.Ta tiến hành xử lí mẫu: chiết bằng các dung môi khác nhau theo qui trình xử lý mẫu như sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

20

15

U Y

IS/9.210

20 30

Ơ

50

35

IS /8.825

60

Pantoprazol/5.448

mAU 290nm,4nm (1.00)

Pantoprazol/5.815

mAU 290nm,4nm (1.00)

N

24

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 25

1 mL mẫu huyết tương 7 mL dung môi chiết (*)

(*)Dung

Lắc cơ học, ly tâm

1. Chloroform

Ơ

N

môi chiết:

N

H

2. TBME

TP

.Q

Ly tâm 3000 vòng/phút x 5 phút

ẠO G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hút 5 mL lớp dung môi

TR ẦN

Cắn

H Ư

N

Cô bằng khí N2 ở 370C

0,5 – 1 mL pha động

10 00

B

Lắc xoáy 1 phút và tiêm sắc ký

A

Hình 3.9: Quy trình xử lý mẫu

H

Ó

- Với dung môi chiết là chloroform: Do chloroform dễ tạo thành nhũ tương nên

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

mẫu sau khi chiết có khá nhiều tạp. Ngoài ra, chloroform nặng hơn nước nên lớp dung môi nằm ở bên dưới gây khó khăn cho quá trình hút mẫu.

- Với dung môi chiết là TBME : mẫu chiết tốt, tiến hành đơn giản. Dựa vào thực nghiệm tiến hành, xử lý mẫu với dung môi TBME, đáp ứng pic lớn, pic thu được cân đối, tách nhau hoàn toàn nên ta lưa chọn phương pháp chiết lỏng- lỏng với dung môi TBME để xử lý mẫu.

Sắc ký đồ chuẩn PAN và IS trong huyết tương được chiết bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi TBME được trình bày ở hình 3.10 sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Lắc

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 26

60

H

Ơ

50

N

Pantoprazol/5.430

mAU 70 290nm,4nm (1.00)

TP

20

ẠO

10

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

0

2.5

5.0

7.5

min

H Ư

N

0.0

G

-10

Hình 3.10: SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS

TR ẦN

3.1.3. Qui trình phân tích pantoprazol trong huyết tương Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được qui trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký có thể tách được PAN khỏi các pic tạp có trong mẫu huyết tương

10 00

B

như sau:

 Quy trình xử lý mẫu:

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

- Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng.

- Ngay sau khi rã đông, lấy 1,0 mL huyết tương và 100 L dung dịch IS , lắc xoáy 15 giây.

- Thêm 7 ml TBME, lắc cơ học ngang 5 phút.

- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.

- Hút 5ml lớp dịch trên, cô N2 37°C. - Hoà tan cắn trong 0,5 ml pha động, lắc xoáy 60 giây, tiêm sắc ký. * Điều kiện sắc ký: - Thiết bị : HPLC, Shimadzu.

- Cột sắc ký: Rp18; 250 x 4,6 mm; 5 µm.

- Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm; 5µm.

- Nhiệt độ cột: 40oC, nhiệt độ autosampler: 40C - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 7,3 - MeCN (64:36).

- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút, thể tích tiêm: 50 µL - Bước sóng phát hiện: 290 nm.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

30

U Y

IS/8.796

N

40

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 27

3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

N

3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu Tiến hành như mục 2.3.3.1, xử lý mẫu và phân tích với điều kiện sắc ký như

B 10 00 A Ó H Í-L ÁN TO

D

IỄ N

Đ

ÀN

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Hình 3.12: SKĐ mẫu huyết tương trắng có chứa IS.

TR ẦN

Hình 3.11: SKĐ mẫu huyết tương trắng.

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

mục 3.1.3. Kết quả thu được như sau:

Hình 3.13: SKĐ mẫu huyết tương trắng Hình 3.14: SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa PAN chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml.

Nhận xét: Từ sắc ký đồ : - Hình 3.11: ta thấy trong khoảng thời gian từ 5 – 9 phút trong mẫu huyết tương trắng không thấy xuất hiện pic.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 28

- Hình 3.14: ta thấy mẫu PAN chuẩn nồng độ 30 ng/mL trong huyết tương

N

trắng xuất hiện 1 pic có thời gian lưu khoảng 5,7 phút và mẫu IS trong huyết tương trắng xuất hiện 1 pic có thời gian lưu khoảng 8,4 phút

N

H

Ơ

Pic PAN trên sắc ký đồ cân đối, rõ nét, có thời gian lưu khoảng 5,7 phút và tách riêng biệt với IS và các thành phần tạp có trong mẫu. Phương pháp phân tích

TP

Theo qui định, phương pháp có độ chọn lọc-đặc hiệu thì ngoài khả năng nhận diện và phân biệt được hoạt chất như đã xác định ở trên, đáp ứng của mẫu trắng tại

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

thời điểm trùng với thời gian lưu của PAN và IS phải đạt các yêu cầu như đã nêu ở mục 2.3.3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng thời gian lưu của PAN và IS được trình bày ở bảng 3.1.

Đáp ứng mẫu trắng tại tR = tIS

Mẫu trắng (mAU.s)

Mẫu LLOQ (mAU.s)

Mẫu trắng (mAU.s)

Mẫu IS (mAU.s)

1

0

3421

0

217732

2

0

3159

0

204639

3

0

3396

0

211326

4

0

3283

0

216345

5

0

3683

0

210752

3835

0

228179

Í-

H

Ó

A

10 00

TT

B

TR ẦN

Đáp ứng mẫu trắng tại tR = tPAN

H Ư

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của đáp ứng mẫu trắng

0

-L

6

0

0

ÁN

Tỷ lệ đáp ứng pic (%)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Kết quả cho thấy, tại thời điểm trùng với thời gian lưu của PAN ( 5,7 phút) và IS (8,4 phút) đáp ứng của mẫu trắng đều là 0%. Như vậy, các số liệu thực nghiệm đã chứng minh phương pháp có độ đặc hiệu và chọn lọc đối với PAN.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

đã đảm bảo nhận diện, phân biệt được PAN và không bị ảnh hưởng bởi các tạp có trong huyết tương.

3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Tiến hành như mục 2.3.3.2 và xử lí mẫu với điều kiện sắc ký như mục 3.1.3 thu được kết quả ở bảng 3.2.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 29

Bảng 3.2: Kết quả thẩm định đường chuẩn

CC1

CC2

CC3

CC4

CC5

S1

26,8

99,1

100,1

96,8

98,5

99,2

S2

89,4

104,2

100,0

111,5

105,3

103,2

S3

446,8

94,5

96,5

97,9

99,6

S4

893,7

98,9

102,1

97,1

99,8

102,4

S5

1787,3

101,3

100,6

97,3

98,5

97,3

S6

2234,2

101,6

100,7

101,2

S7

2681,0

102,1

98,8

99,7

S8

3574,7

98,4

101,2

98,4

a = 0,0005

a = 0,0005

b = 0,0007 r = 0,9996

Ơ

H

N

U Y

98,0

100,7

101,4

a = 0,0005

a = 0,0005

a = 0,0005

b= -0,0015

b = 0,0023

b = -0,0021 b= -0,0042

r = 0,9998

r = 0,9996

r = 0,9999

r = 0,9996

G

B

(Y: tỷ lệ đáp ứng pic PAN/IS; X: nồng độ PAN trong mẫu huyết tương)

Í-

H

Ó

A

10 00

Như vậy, tất cả các điểm của đường chuẩn đều có độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ từ 85-115% và hệ số tương quan R của cả 5 đường chuẩn đều lớn hơn 0,98. Do đó, trong khoảng nồng độ từ 30 – 4000 ng/mL có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ PAN trong huyết tương với tỷ lệ diện tích pic PAN/IS thu được.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

3.2.3. Giới hạn định lượng dưới Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL với 6 mẫu độc lập. Tiến hành như mục 2.3.3.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 .

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

TP ẠO

99,3

Đ

101,3

N

97,3

98,3

H Ư

Phương trình hồi quy (Y = aX + b)

N

(ng/mL)

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Độ đúng (%)

Nồng độ

Mẫu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 30

Bảng 3.3: Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới

Độ

tìm thấy(a)

đúng(b)

(ng/mL)

(%)

217732

27,0

90,0

3159

204639

26,46

88,2

0

3396

211326

27,72

92,4

4

0

3283

216345

26,5

88,3

5

0

3683

210752

30,48

ẠO

Đạt

101,6

Đạt

6

0

3835

228179

29,16

97,2

Đạt

TB

0

3463

214829

27,89

93,0

5,8

5,8

0

3

TR ẦN

CV (%) Đáp ứng TB của mẫu LLOQ/mẫu trắng (a)

: tính từ phương trình hồi quy

(b)

Đạt

+

Đạt Đạt

Đạt

: % so với nồng độ thực, (+): không xác định

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Kết quả cho thấy phương pháp có: - Độ đúng nằm trong khoảng từ 80 – 120% so với nồng độ thực (88,2– 101,6%).

- Độ chính xác với giá trị CV ≤ 20% (5,8%).

Như vậy, mẫu chuẩn chứa PAN có nồng độ 30 ng/mL đáp ứng yêu cầu LLOQ về độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích trong dịch sinh học.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

3.2.4. Độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày 3.2.4.1. Độ đúng, độ chính xác trong ngày Pha các mẫu LQC, MQC, HQC như mục 2.3.1. Mỗi loại QC gồm 6 mẫu độc lập có cùng nồng độ. Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại trong ngày được trình bày ở bảng 3.4:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

2

Ơ

3421

H

0

N

1

đạt

U Y

(mAu.s)

.Q

(mAu.s)

Đạt/Không

TP

(mAu.s)

Đ

IS

G

PAN

H Ư

PAN

N

Nồng độ

STT

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Mẫu chuẩn (≈ 30 ng/mL)

N

Mẫu trắng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 31

Bảng 3.4: Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày

1

0,044

89,5

99,4

0,843

1706,8

94,8

1,597

2

0,048

98,3

109,2

0,851

1722,1

95,6

1,607

3

0,043

86,7

96,3

0,828

1675,9

93,1

4

0,044

88,8

98,6

0,852

1724,3

5

0,043

87,3

97,0

0.851

1722,2

6

0,040

82,5

91,6

0,845

88,9

98,7

N

Độ

đúng(b) (%) 92,3

3252,7

92,9

1,586

3211,2

91,7

95,8

1,608

3254,4

92,9

95,6

1,605

3250,2

92,8

1710,7

95,0

1,651

3342,4

95,5

1710,3

95,0

3257,1

93,0

H Ư

N

Đ

ẠO

TP

3232,0

10 00

B

TB

(ng/mL)

PAN/IS

G

PAN/IS

đúng(b) (%)

Nồng độ(a)

diện tích pic

CV (%)

5,4

1,0

(a) tính từ phương trình hồi qui, (b) % so với nồng độ thực

-L

Í-

H

Ó

A

Kết quả cho thấy, phương pháp định lượng có độ đúng nằm trong khoảng 91,6 – 109,2%, độ lệch nằm trong giới hạn cho phép ± 15%, độ lặp lại trong ngày với giá trị CV% nhỏ (1,0 – 5,4%), đáp ứng yêu cầu về độ đúng, chính xác của phương pháp phân tích trong dịch sinh học.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

3.2.4.2. Độ đúng, độ chính xác khác ngày Tiến hành phân tích các mẫu LQC, MQC, HQC được chuẩn bị tương tự như xác định độ đúng, độ lặp lại trong ngày theo phương pháp đã xây dựng tại các ngày khác nhau. Xác định nồng độ PAN trong các mẫu QC dựa vào đường chuẩn tiến hành song song trong từng ngày. Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của phương pháp được trình bày ở bảng 3.5.

1,3

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

(ng/mL)

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

PAN/IS

Nồng độ(a)

Ơ

đúng(b) (%)

(ng/mL)

diện tích pic

Tỷ số

Độ

H

Nồng độ(a)

Tỷ số

N

diện tích pic

Độ

HQC (3500,2 ng/mL)

U Y

Tỷ số

MQC (1800,1 ng/mL)

.Q

LQC (90,0 ng/mL)

Mẫu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 32

Nồng độ(a)

Độ đúng(b)

Nồng độ(a)

Độ đúng(b)

(ng/mL)

(%)

(ng/mL)

(%)

(ng/mL)

(%)

89,5

99,4

1706,8

94,8

3232,0

92,3

N

98,3

109,2

1722,1

95,6

3252,7

92,9

86,7

96,4

1675,9

93,1

3211,2

88,8

98,7

1724,3

95,8

3254,4

92,9

87,3

97,0

1722,2

95,6

3250,2

92,8

82,5

91,6

1710,7

95,0

3342,4

95,5

80,2

89,1

1849,2

102,6

3524,3

100,6

84,1

93,4

1818,9

101,0

3573,3

102,0

81,6

90,7

1804,3

100,2

3501,3

100,0

77,2

85,8

1776,3

98,6

3364,2

96,0

83,8

93,1

1835,2

101,9

3516,3

100,4

86,9

96,5

1859,1

103,2

3488,6

99,6

86,1

95,7

1774,8

98,6

3421,7

97,7

95,7

1727,6

96,0

3402,8

97,2

95,7

1760,2

97,8

3434,3

98,1

95,0

1803,0

100,1

3297,4

94,2

87,2

96,9

1752,4

97,3

3483,3

99,5

95,4

1759,0

97,7

3418,2

97,6

H

Ó

85,5

A

86,1

-L

85,9

ÁN

TB

TO

CV (%)

H

U Y

.Q

TP

ẠO

Đ

G

N

H Ư

TR ẦN

91,7

95,3

98,1

96,7

5,0

3,0

3,4

(a) tính từ phương trình hồi qui, (b) % so với nồng độ thực

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

86,1 III

B

II

Ơ

Độ đúng(b)

I

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

HQC ( 3500 ng/mL)

Nồng độ(a)

10 00

Ngày

MQC ( 1800 ng/mL)

Í-

LQC ( 90 ng/mL)

N

Bảng 3.5: Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác khác ngày

D

IỄ N

Đ

ÀN

Kết quả thực nghiệm cho thấy ở cả 3 nồng độ (90, 1800, 3500 ng/mL), phương pháp đều cho độ đúng trong khoảng 85% đến 115%, độ lặp lại khác ngày với giá trị CV ≤ 15% (3,0 – 5,0%) chứng tỏ phương pháp được nghiên cứu có độ đúng, độ chính xác cao, đáp ứng yêu cầu đối với phương pháp dùng trong dịch sinh học.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 33

3.2.5. Tỷ lệ thu hồi của phương pháp

N

3.2.5.1. Tỷ lệ thu hồi nội chuẩn Xử lý các lô mẫu QC theo qui trình đã lựa chọn. Tiến hành phân tích xác định

N

H

Ơ

diện tích pic của IS trong huyết tương. Song song, xác định diện tích pic của IS trong mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua xử lý). Kết quả xác định

Đáp ứng của IS/pha động

(mAU.s)

(mAU.s)

2

215987

3

221362

4

225837

5

225289

6

228284

138874

7

222756

142224

8

221527

139068

9

226001

10 00

142448

217320

139726

214449

143592

218248

143690

203578

139516

214774

139907

15

219806

139659

16

211146

141115

17

204469

140374

18

219947

139338

TB

218330

140259

CV (%)

3,1

1,3

Í-

H

12

TO

-L

13

ÀN

G N H Ư

TR ẦN

Ó

11

Đ

138029

B

A

10

IỄ N

ẠO

219153

Đ

1

14

D

TP

Đáp ứng của IS/huyết tương

ÁN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

STT

.Q

Bảng 3.6: Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi IS

Tỷ lệ thu hồi *

137641 137809 140936 140712

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

tỷ lệ thu hồi của IS được trình bày ở bảng 3.6.

99,1

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn đạt 99,1% (thỏa mãn điều kiện nằm trong khoảng 30 – 110%) và CV ở nồng độ của IS đều ≤ 15%

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 34

(3,1 và 1,3%). Do vậy qui trình xử lý mẫu huyết tương đã được nghiên cứu là phù hợp để chiết tách chất nội chuẩn.

N

H

Ơ

N

3.2.5.2. Tỷ lệ thu hồi PAN Chuẩn bị các lô mẫu QC như mục 2.3.1 và xử lý mẫu chuẩn PAN pha trong huyết tương theo phương pháp đã xây dựng. Tiến hành sắc ký, xác định nồng độ

TP

bảng 3.7.

ẠO

Bảng 3.7: Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi PAN

LQC (≈ 90 ng/mL)

6664

2

10415

6742

3

9409

4

9830

5

9639

Huyết tương

Pha động

187772

132853

325013

257581

188414

133227

345086

256564

187056

132899

348659

257966

6848

185064

132993

339432

257805

6665

182395

132449

328273

256979

9224

6787

184390

133243

363146

258886

9689

6749

185849

132944

341602

257630

4,3

1,1

1,2

0,2

4,1

0,3

10 00

H

Ó

A

6785

-L

ÁN

TO IỄ N

Đ

ÀN

Tỷ lệ thu hồi * (%)

H Ư

9614

CV(%)

D

Pha động

TR ẦN

1

91,4

Huyết tương

B

Pha động

HQC (≈ 3500 ng/mL)

Í-

Huyết tương

TB

MQC (≈ 1800 ng/mL)

N

STT

6

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Đáp ứng PAN (mAu.s)

89,0

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

PAN có trong các mẫu. Song song, định lượng mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua xử lý). Kết quả xác định tỷ lệ thu hồi của PAN được trình bày ở

84,4

(*): Giá trị đã được hiệu chỉnh theo hệ số pha loãng

Kết quả thực nghiệm cho thấy ở cả 3 khoảng nồng độ (90, 1800, 3500 ng/mL), phương pháp đều cho hiệu suất chiết nằm trong khoảng 30 – 110% ( 91,4; 89,0; 84,4%), giá trị CV mỗi nồng độ của PAN đều ≤ 15% (từ 0,2 – 4,3%). Do đó phương pháp xử lý mẫu đã được xây dựng là phù hợp để chiết tách PAN từ huyết tương.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 35

3.2.6. Độ ổn định

N

H

Ơ

N

3.2.6.1. Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng Pha dung dịch nội chuẩn gốc như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7.

Kết quả độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

U Y

được trình bày ở bảng 3.8.

1

743160

738252

2

740169

3

738216

TB

740515

CV (%)

0,3

ẠO Đ G N

H Ư

750460 750764 746492 1,0

0,8

A

10 00

B

Kết quả cho thấy, nồng độ dung dịch nội chuẩn làm việc trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng lệch so với nồng độ ban đầu 0,8% (< 2%), và có CV lần lượt là 0,3%, 1,0 % (<2%). Như vậy, dung dịch nội chuẩn làm việc ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng.

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

3.2.6.2. Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày Pha dung dịch chuẩn gốc như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7.

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn PAN gốc dài ngày ở nhiệt độ 2 oC - 8oC được trình bày ở bảng 3.9 Bảng 3.9: Độ ổn định dung dịch chuẩn PAN gốc dài ngày Mẫu

Nồng độ (µg/mL) Ban đầu Sau 6 ngày

1

4,415

4,464

2

4,413

4,461

3

4,413

4,464

TB

4,414

4,463

CV (%)

0,03

0,03

Độ lệch so với ban đầu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Đáp ứng IS sau 5 giờ

Độ lệch so với ban đầu

IỄ N D

.Q

Đáp ứng IS ban đầu

TP

Mẫu

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 3.8: Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn

1,1

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 36

Ơ

nhiệt độ 2oC - 8oC sai khác với nồng độ dung dịch mới pha là 1,1% (<2%). Như vậy, dung dịch chuẩn gốc đạt độ ổn định thời gian dài (6 ngày) ở nhiệt độ 2oC 8oC

N

Kết quả cho thấy, nồng độ dung dịch chuẩn gốc sau bảo quản 6 ngày ở

TP

.Q

Pha các mẫu LQC và HQC như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. Xác định nồng độ PAN trong mẫu LQC, HQC sau 3 chu kỳ đông - rã và các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) được trình bày trong bảng 3.10.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Bảng 3.10: Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

1

86,7

Sau 3 chu kỳ đông-rã 87,0

2

85,9

3

86,1

4 5

Ban đầu

83,1

3404,6

3330,4

84,3

3709,0

3394,4

85,6

83,1

3666,1

3279,9

87,4

82,8

3660,4

3228,9

89,9

84,2

3654,2

3262,6

86,9

84,1

3588,7

3304,6

1,7

1,7

3,3

1,6

10 00

B

TR ẦN

3438,0

A H Í-

-L

TB

ÁN

CV (%)

Sau 3 chu kỳ

Ban đầu

đông-rã 3331,1

Ó

6

Mẫu HQC ( 3500 ng/mL)

N

H Ư

Mẫu LQC ( 90 ng/mL)

Mẫu

G

Nồng độ (ng/mL)

TO

Độ lệch

-3,2

-7,9

D

IỄ N

Đ

ÀN

Kết quả cho thấy, nồng độ PAN trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã đông đều sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 15% (LQC: -3,2% và HQC: -7,9%) và giá trị CV giữa các kết quả định lượng đều ≤ 15%. Như vậy, mẫu huyết tương ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã. * Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn Pha các mẫu LQC và HQC như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. Xác định nồng độ PAN trong mẫu LQC, HQC để ở nhiệt độ phòng sau 5 giờ và nồng độ PAN được xử lí ngay sau khi rã đông được trình bày trong bảng 3.11.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

3.2.6.3. Độ ổn định của mẫu huyết tương * Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 37

Bảng 3.11: Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn Nồng độ (ng/mL)

Ơ

N

Mẫu HQC ( 3500 ng/mL)

Sau 5 giờ

Xử lý ngay

Sau 5 giờ

1

99,6

91,8

3871,9

3496,8

2

98,3

91,1

3887,0

3

97,8

86,1

3877,4

4

97,9

89,4

3896,1

5

96,6

90,0

3658,2

3380,7

6

97,2

91,8

3654,3

3304,6

TB

97,9

90,0

CV (%)

1,0

2,2

N

.Q

G

Đ

ẠO

TP

3304,0 3315,4

3384,5

2,8

2,6

N

3807,5 -11,1

A

10 00

B

Kết quả cho thấy, nồng độ PAN trong mẫu được xử lí sau khi để 5 giờ ở nhiệt độ phòng đều sai khác so với nồng độ mẫu xử lí ngay không quá 15% (LQC: -8,1% và HQC: -11,1%) và giá trị CV giữa các kết quả định lượng đều ≤ 15%. Như vậy, mẫu huyết tương ổn định ở nhiệt độ phòng sau 5 giờ. * Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

Pha các mẫu LQC và HQC như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương được trình bày ở bàng 3.12, 3.13.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

-8,1

3505,6

TR ẦN

Độ lệch

H

Xử lý ngay

U Y

Mẫu LQC ( 90 ng/mL)

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Mẫu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 38

Bảng 3.12: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu nồng độ 90 ng/mL

Ngày đầu

1

86,7

86,6

89,6

96,4

2

85,9

85,3

94,2

100,6

3

86,1

84,4

99,1

4

85,6

85,8

95,5

5

87,4

86,1

98,5

6

89,9

85,6

TB

86,9

85,6

CV (%)

1,7

0,8

Ơ

102,6 101,0

94,8

100,7

95,3

99,9

3,3

2,3

9,6

15,0

Đ G N

TR ẦN

H

N

U Y

ẠO

TP

.Q

98,0

B

Bảng 3.13: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu nồng độ 3500 ng/mL

Sau 30 ngày

Sau 53 ngày

Sau 68 ngày

1

3438,0

3205,8

3281,5

3706,4

3404,6

3334,4

3512,2

3913,0

3709,0

3522,2

3537,6

4049,7

4

-L

3666,1

3334,0

3743,0

4069,3

5

3660,4

3214,0

3700,2

4034,0

6

3654,2

3448,6

3663,1

3994,7

TB

3588,7

3343,2

3572,9

3961,2

CV (%)

3,3

3,4

4,3

3,4

-6,8

-0,4

10,4

Ó

A

Ngày đầu

ÁN

Nồng độ (ng/mL)

( 3500 ng/mL)

ÀN

TO

Í-

3

H

2

Đ

10 00

Mẫu HQC

IỄ N D

-1,5

Sau 68 ngày

Độ lệch so với ban đầu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Độ lệch so với ban đầu

Sau 30 ngày Sau 53 ngày

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

( 90 ng/mL)

N

Nồng độ (ng/mL)

Mẫu LQC

Kết quả cho thấy, nồng độ LQC, HQC của PAN trong mẫu sau khi bảo quản 30, 53 và 68 ngày sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 39

các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ đều nhỏ hơn 15%. Như vậy mẫu huyết tương

N

đạt chỉ tiêu độ ổn định dài ngày. * Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

N

H

Ơ

Pha các mẫu LQC và HQC như mục 2.3.1 và tiến hành như mục 2.3.3.7. Kết quả độ ổn định trong auto-sampler ở 4oC được trình bày trong bảng 3.14.

Mẫu HQC ( 3500 ng/mL) Tiêm ngay

Sau 25 giờ/4oC

1

89,5

80,0

3232,0

3237,7

2

98,3

81,5

3252,7

3321,7

3

86,7

81,8

4

88,7

80,2

5

87,3

6

82,5

TB

88,8

CV (%)

5,4

-7,9

Đ

G N

3451,2

3251,7

3437,2

83,8

3248,2

3430,2

83,5

3342,4

3423,2

81,8

3256,4

3383,5

1,8

1,3

2,3

H Ư

3211,2

3,9

A

Độ lệch (%)

ẠO

Sau 25 giờ/4oC

B

Tiêm ngay

TR ẦN

TP

Mẫu LQC ( 90 ng/mL)

10 00

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Mẫu

.Q

Nồng độ (ng/mL)

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

Kết quả cho thấy, nồng độ mẫu LQC, HQC của PAN sau khi bảo quản 25 giờ trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu LQC, HQC tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ đều nhỏ hơn hoặc bằng 15%. Như vậy, mẫu huyết tương đạt độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler).

D

IỄ N

Đ

ÀN

* Nhận xét chung Từ những kết quả thẩm định độ đặc hiệu - chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng - độ chính xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định thu được ở trên cho thấy phương pháp đã được xây dựng đáp ứng các yêu cầu của một phương pháp phân tích dùng trong sinh học.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Bảng 3.14: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto-sampler

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 40

3.3. BÀN LUẬN

N

3.3.1. Phương pháp xử lý mẫu PAN trong huyết tương Xử lý mẫu giúp loại bỏ một hoặc nhiều thành phần tạp chất có trong mẫu, tạo

N

H

Ơ

điều kiện thuận lợi cho quá trình phân tách, định lượng PAN bằng phương pháp HPLC. Dựa vào đặc tính của PAN, tham khảo một số tài liệu và khảo sát thực tế

TP

So với phương pháp tủa protein, phương pháp xử lý mẫu sử dụng trong khóa luận - chiết lỏng lỏng với dung môi TBME - hiệu suất chiết cao, mẫu thu được ít tạp

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

nên tạo điều kiện tối ưu cho định lượng PAN trong huyết tương.

H Ư

N

G

Đ

3.3.2. Phương pháp định lượng PAN trong huyết tương Phương pháp HPLC định lượng PAN trong huyết tương sử dụng trong nghiên cứu này đã được thẩm định theo các chỉ tiêu của US - FDA và EMA bao gồm: độ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

đặc hiệu - chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng - độ chính xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định.

Với một điều kiện sắc ký không quá phức tạp, dễ dàng triển khai tại các phòng thí nghiệm của Việt Nam, chất phân tích PAN đã tách hoàn toàn khỏi các thành phần tạp có trong huyết tương với thời gian triển khai sắc ký là 10 phút. Thời gian triển khai sắc ký không quá dài cho phép định lượng được một số lượng mẫu lớn trong một ngày, giúp tiết kiệm được thời gian và chi phí, đặc biệt là trong điều kiện hạn hẹp về thiết bị hiện đại và tài chính. Độ ổn định của phương pháp: chúng tôi đã tiến hành đánh giá được chỉ tiêu căn bản về độ ổn định của phương pháp, cho thấy sự sai khác rất nhỏ giữa nồng độ PAN sau 3 chu kỳ đông rã, sau thời gian 5 giờ ở nhiệt độ phòng và sau thời gian 30, 53, 68 ngày so với dung dịch ngay sau khi pha, đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

chúng tôi đã xây dựng được một phương pháp xử lý mẫu dùng định lượng PAN trong huyết tương.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 41

H

Ơ

N

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

ẠO

 Quy trình xử lý mẫu:

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng.

G

- Ngay sau khi rã đông, lấy 1,0 mL huyết tương và 100 L dung dịch IS, lắc

TR ẦN

H Ư

N

xoáy 15 giây.

- Thêm 7 ml TBME, lắc cơ học ngang 5 phút.

- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.

- Hút 5ml lớp dịch trên, cô N2 37°C. - Hoà tan cắn trong 0,5 ml pha động, lắc xoáy 60 giây, tiêm sắc ký.

10 00

B

 Điều kiện sắc ký:

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

- Thiết bị : HPLC, Shimadzu.

- Cột sắc ký: Rp18, 250 x 4,6 mm, 5 µm.

- Bảo vệ cột: Rp18, 4 x 3 mm, 5µm.

- Nhiệt độ cột: 40oC, nhiệt độ autosampler: 40C - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH 7,3 - MeCN (64:36).

- Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút, thể tích tiêm: 50 µL - Bước sóng phát hiện: 290 nm.

2. Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng PAN với các chỉ tiêu: độ đặc hiệu/chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng - độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định. Kết quả cho thấy: - Phương pháp có độ đặc hiệu - chọn lọc với PAN. - Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ PAN trong khoảng nồng độ khảo sát với r > 0,999.

- Phương pháp có độ đúng tốt (88,2% - 103,2%), độ lặp lại với giá trị CV ≤ 15%.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

đối hoàn thiện bao gồm xử lý mẫu và điều kiện sắc ký. Cụ thể là:

.Q

U Y

N

4.1 KẾT LUẬN Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được 2 mục tiêu đề ra như sau: 1. Xây dựng được quy trình phân tích PAN trong huyết tương một cách tương

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 42

- Đáp ứng yêu cầu của phương pháp phân tích các chất trong dịch sinh học của US – FDA và EMA.

N

H

Ơ

N

4.2 KIẾN NGHỊ Ứng dụng phương pháp để tiến hành định lượng PAN trong huyết tương nhằm theo dõi hiệu quả điều trị và đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm chứa

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

PAN trên thị trường.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 43

N

TÀI LIỆU THAM KHẢO

H

Ơ

TIẾNG VIỆT

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

3. Bộ Y tế (2007), Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr. 18 4. Bộ y tế (2007), Hóa phân tích, Trường đại học Dược Hà Nội, tập 2, nhà xuất bản

N

G

Y học, tr.123-142, tr.168-200 5. Bộ y tế (2011), Kiểm nghiệm, Trường đại học Dược Hà Nội, nhà xuất bản Y học,

H Ư

tr.84-110

TR ẦN

TIẾNG ANH

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

6. B. Koc¸ yig˘it-Kaymakc¸og˘ lu, S. nsalan, S. Rollas (2006), “Determination and validation of ketoprofen, pantoprazole and valsartan together in human plasma by high performance liquid chromatography”, Pharmazie 61: 586–589.

7. Dong M., Ahuja S. (2005), Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC, Academic Press - United Kingdom, p.19-45 8. European Medicine Agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation.

9. European Union (2008), European Pharmacopoeia 6th edition, p. 3518-3519 10. Honggang Lou, Hong Yuan, Zourong Ruan, Donghang Xu, Quan Zhou (2008) “LC Determination and Bioequivalence Study of Pantoprazole in Human Plasma” Chromatographia, 67, p. 795–799 11. Medicine and Healthcare products Regulatory Agency (2010), British Pharmacopoeia 2010, p.1607-1609.

12. Merck and Company Incorporated (2006), Merck index (14th edition) 13. Riley C., Rosanske T. (1996), Development and Validication of Analytical Methods, Elsevier Science Ltd; pp.3-99, 249-282 14. Royal Pharmaceutical Society (2012), Martindale The Complete Drug Reference 36th edition, Pharmaceutical Press, p. 1760.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

2. Bộ y tế (2015), Dược thư quốc gia, nhà xuất bản Y học, tr.1115

U Y

N

1. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, trường Đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr.106 – 108

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 44

15. U.S Department of Health and Human Services Food and Drug administration

Ơ

(2005),

H

Zhong

N

Scientists , Wiley & Sons. Publisher, p.75-132, 139-188.

17. Zhiyong Xie, Xiaoyan Chen, Fengdan Jin, Dafang

N

(2001), Guidance for Industry – Bioanalytical Method Validation, page 5 – 101 16. Yuri V. Kazakevich, Rosario LoBrutto (2007), HPLC for Pharmaceutical

TP

Trang web:

ẠO

18. http://www.giaoduc.edu.vn/loet-da-day-ta-trang-co-chua-dut.htm

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

19. https://www.mims.com/Vietnam/drug/search?q=pantoprazol 20. http://www.vietphupharma.com/pantalek-40/

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

“Simultaneous Determination of Pantoprazole and Its Two Metabolites in Dog Plasma by HPLC”, Journal of Chromatographic Science, Vol. 43.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

PHỤ LỤC

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

45

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial