Issuu

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN LÊ NHẬT MÃ SINH VIÊN: 1101377

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LINCOMYCIN VÀ CLINDAMYCIN TRONG NƢỚC THẢI BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN LÊ NHẬT MÃ SINH VIÊN: 1101377

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LINCOMYCIN VÀ CLINDAMYCIN TRONG NƢỚC THẢI BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. DS. Lê Xuân Kỳ 2. DS. Trần Thị Linh Anh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất 2. Bộ môn Vật lý – Hóa lý

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện, khóa luận “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng

lincomycin và clindamycin trong nƣớc thải bằng phƣơng pháp LC-MS/MS” đã

U Y

đƣợc hoàn thành. Bên cạnh sự cố gắng của bản thân, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự

khích lệ và giúp đỡ từ phía nhà trƣờng, bộ môn, gia đình và bạn bè.

Trƣớc tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc tới DS. Lê Xuân Kỳ,

ẠO

ngƣời thầy đã tận tình định hƣớng, chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS. Trần Thị Linh Anh, ngƣời đã trực

H Ư

tiếp hƣớng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện khoá luận.

TR ẦN

Em cũng xin gửi cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, bộ môn Vật lý - Hóa lý trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp

đỡ và tạo điều kiện cho em rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài.

10 00

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè là những ngƣời luôn động

viên, tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.

Trong quá trình thực hiện, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết mình nhƣng sẽ không

Í-

tránh khỏi những thiếu sót và sai sót, em rất mong sẽ nhận đƣợc những ý kiến chỉ

-L

bảo, phê bình, góp ý từ phía các thầy cô để khoá luận của em tiếp tục đƣợc hoàn

ÁN

thiện hơn.

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên

IỄ N

ÀN

Em xin trân trọng cảm ơn !

Nguyễn Lê Nhật

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 2

U Y

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.................................................. 2

1.1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm lincosamid .......................................................... 2

ẠO

1.1.2. Một số đặc điểm của lincomycin .......................................................................... 3

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.1.3. Một số đặc điểm của clindamycin ......................................................................... 4

1.1.4. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh ................................................ 6

H Ư

1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU ....... 8

TR ẦN

1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................... 8 1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ ....................................... 8

10 00

1.2.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn .......................................... 13 1.3. MỘT SỐ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CLINDAMYCIN VÀ

LINCOMYCIN TRÊN THẾ GIỚI................................................................................. 15

Í-

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 19

-L

2.1. ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .............................................. 19

ÁN

2.1.1. Hoá chất & thuốc thử .......................................................................................... 19

2.1.2. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................................ 19

IỄ N

ÀN

2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................... 20

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 20 2.2.1. Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu thô trƣớc khi tiến hành chiết tách ................. 20 2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu ...................................................................................... 20

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.2.3. Phƣơng pháp xây dựng quy trình định lƣợng lincosamid bằng HPLC MS/MS ........................................................................................................................... 21

2.2.4. Phƣơng pháp thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng .................................. 22

2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ..................................................................... 24

U Y

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................................ 25

3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ............................................................ 25

ẠO

3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ......................................................................... 25

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

3.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ................................................................................... 28

3.1.3. Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu ............................................................................. 33

H Ư

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ........................................................................... 34

TR ẦN

3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống .................................................................................. 34 3.2.2. Độ đặc hiệu, độ chọn lọc của phƣơng pháp ........................................................ 35

10 00

3.2.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn .................................................................... 37 3.2.4. Độ độ đúng và độ lặp lại ..................................................................................... 39

3.2.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng ............................................................. 40

Í-

4. CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ....................................................................................... 42

-L

4.1. VỀ LỰA CHỌN KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU ................................................ 42

ÁN

4.2. VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU ..................................................................... 42

4.3. VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ...................................................................... 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

IỄ N

ÀN

4.4. VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ..................................................................... 44

PHỤ LỤC

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Ký hiệu AOAC

LIN

Lincomycin

CLI 13 C3 TRI DAD ESI IS KS HPLC

Clindamycin 13 C3Trimethoprim Diode array detector Electrospray Ionizaton Internal standard

Clindamycin 13 C3Trimethoprim Detector chuỗi diod Ion hoá phun điện tử Chuẩn nội Kháng sinh Sắc ký lỏng hiệu năng cao

TO ÀN Đ IỄ N D

N U Y

ẠO

Solid Phase Extraction Recovery Standard Deviation Relative Standard Deviation

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Ion hoá bằng photon tại áp suất khí quyển Ion hoá áp suất khí quyển

TR ẦN

Í-

10 00

High performance liquid chromatography High quality control Liquid chromatography Tandem Mass Spectrometry Mass Spectrometry Retention time Area under the peak Methanol Middle quality control Limit of Detection Limit of Quantitation Low quality control Pure analysis

-L

HQC LC MS/MS MS tR Speak MeOH MQC LOD LOQ LQC PA TB TCCS SPE R(%) SD RSD

ÁN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

APPI

H Ư

APCI

Tiếng Việt Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống Ion hoá học ở áp suất khí quyển

API

Tiếng Anh Association of Official Analytical Chemists Atmospheric Pressure Chemical Ionization Atmospheric Pressure Photoionization Atmospheric Pressure Ionization

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kiểm soát ở mức độ cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần Khối phổ Thời gian lƣu Diện tích peak Methanol Kiểm soát ở mức độ giữa Giới hạn phát hiện Giới hạn định lƣợng Kiểm soát ở mức độ thấp Tinh khiết phân tích Trung bình Tiêu chuẩn cơ sở Chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn tƣơng đối

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lƣợng kháng sinh lincomycin và clindamycin sử

dụng LC-MS/MS trên thế giới. .................................................................................15

U Y

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu .............................................19

Bảng 3.1. Các thông số hoạt động của nguồn ion hoá ..............................................27

Bảng 3.2. Điều kiện phân mảnh của từng kháng sinh và chuẩn nội .........................27

ẠO

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống ...................................................34

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ...............................37

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp (mức MQC) ........................39

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

Bảng 3.6. Kết quả giá trị LOD, LOQ của phƣơng pháp ...........................................41

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hình 1.1. Công thức phân tử của lincomycin hydroclorid ..........................................3

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2. Công thức phân tử của clindamycin hydroclorid ........................................4

U Y

Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống thiết bị khối phổ .................................................................9

Hình 1.4. Sơ đồ tạo ion dƣơng bằng nguồn ESI .......................................................10

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba .....................................11

ẠO

Hình 3.1. Kết quả khảo sát ion hóa tạo ion mẹ của LIN và CLI...............................26

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hình 3.2. Phổ đồ khảo sát ion con của các kháng sinh LIN, CLI và 13C3TRI ..........27

Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn pha động ......................................................29

H Ư

Hình 3.4. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khi khảo sát thể tích tiêm mẫu .........31 Hình 3.5. Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khi khảo sát tốc độ dòng ..................33

TR ẦN

Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu và chọn lọc của phƣơng pháp .................36 Hình 3.7. Đƣờng chuẩn giữa tỉ lệ SKS/SIS với nồng độ dung dịch lincomycin .........38

Hình 3.8. Đƣờng chuẩn giữa tỉ lệ SKS/SIS với nồng độ dung dịch clindamycin .......38

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

Hình 3.9. Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ của phƣơng pháp ....................................40

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ĐẶT VẤN ĐỀ

khoẻ con ngƣời trên toàn thế giới. Các phƣơng pháp điều trị trƣớc đây sẽ không còn

Tình trạng kháng kháng sinh đang gia tăng nghiêm trọng đe doạ lớn đến sức

hiệu quả và khi kháng sinh không còn hiệu lực, chỉ cần một vết thƣơng nhỏ bị

U Y

nhiễm trùng cũng có thể khiến ngƣời bệnh tử vong.

Việc sử dụng kháng sinh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát dẫn tới tình trạng vi

khuẩn kháng lại kháng sinh với mức độ ngày càng trầm trọng. Dƣ lƣợng kháng sinh

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

trong môi trƣờng là một trong những nguyên nhân của tình trạng kháng thuốc này.

Để giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn đồng nghĩa với việc

giảm thiểu việc đƣa kháng sinh ra ngoài môi trƣờng, giảm sự tiếp xúc giữa vi khuẩn

H Ư

với kháng sinh. Do vậy, bên cạnh việc kiểm soát sử dụng kháng sinh chặt chẽ, đúng

TR ẦN

cách, lƣợng kháng sinh thải ra môi trƣờng từ nƣớc thải y tế và công nghiệp dƣợc phẩm cần phải đƣợc kiểm soát và hạn chế.

10 00

Trong những năm gần đây tại Việt Nam, số lƣợng và chủng loại kháng sinh đƣợc sản xuất ngày càng nhiều, trong đó nhóm kháng sinh lincosamid là một trong

những nhóm có số lƣợng sản xuất và sử dụng tƣơng đối phổ biến. Vì vậy trong quá

trình sản xuất và sử dụng nhóm kháng sinh này, cần kiểm soát đƣợc dƣ lƣợng kháng

Í-

sinh thải ra môi trƣờng. Điều này đòi hỏi cần thiết phải xây dựng đƣợc một phƣơng

-L

pháp định lƣợng có độ tin cậy để làm công cụ đánh giá.

ÁN

Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Xây

dựng phƣơng pháp định lƣợng kháng sinh lincomycin và clindamycin trong

IỄ N

ÀN

nƣớc thải bằng phƣơng pháp LC-MS/MS”. Đề tài đƣợc thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Lựa chọn được các điều kiện xử lý mẫu, điều kiện sắc ký lỏng khối phổ và xây dựng được quy trình định lượng đồng thời hai kháng sinh lincomycin và clindamycin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS. 2. Thẩm định được quy trình định lượng đã xây dựng.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1. Tổng quan về kháng sinh nhóm lincosamid

Kháng sinh nhóm lincosamid bao gồm lincomycin, là một kháng sinh thiên

U Y

nhiên phân lập từ môi trƣờng nuôi cấy Streptomyces lincolensis và các dẫn xuất bán

tổng hợp gồm clindamycin và pirlimycin. Thế hệ kháng sinh này lần đầu tiên đƣợc

định hình trong những năm 1960 và hiện đang đƣợc sử dụng để điều trị một loạt các

ẠO

bệnh nhiễm trùng. Phổ tác dụng của lincosamid chủ yếu đối với vi khuẩn gram

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

dƣơng, tuy nhiên cũng đƣợc sử dụng để chống lại vi khuẩn kỵ khí gram âm và các

sinh vật đơn bào. Cơ chế tác dụng của lincosamid là ngăn chặn sử tổng hợp protein

H Ư

của vi sinh vật thông qua liên kết với các 23S rRNA của tiểu đơn vị 50S và bắt chƣớc các trung gian đƣợc hình thành trong giai đoạn đầu của chu kỳ kéo dài. Các

TR ẦN

lincosamid thƣờng đƣợc sử dụng để điều trị các nhiễm khuẩn do Streptococcus và tụ cầu và đặc biệt hữu ích trong việc điều trị nhiễm khuẩn mô liên kết ở da, xƣơng

do khả năng hấp thu và tác dụng chống lại các chủng sản xuất độc tố hoại tử [25].

10 00

1.1.1.1. Cấu trúc nhóm lincosamid

Lincomycin có cấu trúc amid, tạo ra giữa acid 4-n-propyl hygric (acid 1- methyl

-4-propyl-2-pyrolidincarboxylic) với đƣờng amin có nhóm thế -SCH3 (methylthio).

Í-

Amino acid đóng vòng có tính base, tạo đƣợc muối với acid. Clindamycin đƣợc tạo

-L

thành khi thay nhóm OH (7) của đƣờng amin của lincomycin bằng Cl, kèm theo

ÁN

quay ngƣợc cấu hình C(7), có tính base nhƣ lincomycin [8].

1.1.1.2. Phổ tác dụng

ÀN

Kháng sinh lincosamid nhạy cảm với Clostridium perfringens, Staphylococus

IỄ N

aureus nhƣng không nhạy cảm với vi khuẩn ruột Clostriduim difficile, nhạy cảm với các chủng vi khuẩn yếm khí nói chung, loại nguồn gốc ruột và sinh dục nói riêng, thuận lợi khi dùng lincosamid điều trị nhiễm khuẩn vùng bụng và chậu [7],[8]. 1.1.1.3. Sự kháng thuốc của vi khuẩn

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Vi khuẩn cũng kháng lại lincosamid. Có sự kháng chéo giữa lincosamid với các kháng sinh cùng phổ tác dụng là macrolid và streptogramin (ngƣời ta còn nói

lincosamid, macrolid và streptogramin là các kháng sinh đồng loại) [7].

1.1.1.4. Tác dụng phụ

Viêm ruột kết màng giả khi dùng kháng sinh lincosamid. Nguyên nhân không

U Y

phải trực tiếp do kháng sinh mà do sự phát triển thuận lợi của chủng khuẩn ruột

Clostridium difficile không nhạy cảm với lincosamid, giải phóng lƣợng độc tố cao gây viêm ruột. Hiện tƣợng này thƣờng gặp ở hơn đối với clindamycin [7],[8].

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.1.2. Một số đặc điểm của lincomycin

H Ư

1.1.2.1. Công thức cấu tạo

TR ẦN

Công thức: C18H34N2O6S.HCl.H2O

Phân tử lượng: 461,01g/mol [8].

10 00

.HCl.H2O

Hình 1.1. Công thức phân tử của lincomycin hydroclorid

Tên khoa học: Methyl 6,8-dideoxy-6-[[[(2S,4R)-1-methyl-4-propylpyrrolidin-2-

yl]amino]-1-thio]-D-erythro-α-D-galacto-octopyranosid hydroclorid [8].

-L

Í-

1.1.2.2. Tính chất hóa lý

ÁN

a) Tính chất vật lý

- Bột kết tinh màu trắng hoặc gần nhƣ trắng, vị đắng, hút ẩm. - Rất tan trong nƣớc, dung dịch bền, khó tan trong ethanol 96%, rất khó tan

IỄ N

ÀN

trong aceton và nhiều dung môi hữu cơ [6], [8]. b) Tính chất hóa học - Phản ứng màu: sau khi thuỷ phân trong dung dịch HCl, tác dụng với natri nitroprusiat và Na2CO3: xuất hiện màu đỏ tím (chung cho cả 2 chất) - Dung dịch nƣớc cho phản ứng của ion Cl- [8]. 1.1.2.3. Phổ tác dụng

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Thuốc có tác dụng đối với nhiều vi khuẩn ƣa khí gram dƣơng, bao gồm các Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, B. anthracis, C. diphtheriae, không

có tác dụng với Enterococcus.

Lincomycin có phổ tác dụng rộng đối với các vi khuẩn kỵ khí. Các vi khuẩn kỵ

khí gram dƣơng nhạy cảm bao gồm Eubacterium, Propionibacterium, Peptococcus,

U Y

Peptostreptococcus và nhiều chủng Clostridium perfringens và C. tetani.

Với liều cao, lincomycin có tác dụng đối với các vi khuẩn kỵ khí gram âm, trong đó có Bacteroides spp. [7].

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.1.2.4. Chỉ định

Nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt Staphylococcus,

Streptococcus, Pneumococcus ở ngƣời bệnh có dị ứng với penicilin nhƣ áp xe gan;

H Ư

nhiễm khuẩn xƣơng do Staphylococcus; nhiễm khuẩn phụ khoa nhƣ nhiễm khuẩn ở

TR ẦN

âm đạo, viêm màng trong tử cung, viêm vùng chậu; viêm màng bụng thứ phát; áp xe phổi; nhiễm khuẩn huyết; mụn nhọt biến chứng và loét do nhiễm khuẩn kỵ khí.

Nhiễm khuẩn do các khuẩn đã kháng penicilin.

10 00

Nhiễm khuẩn ở các vị trí thuốc khác khó tới nhƣ viêm cốt tủy cấp tính và mạn tính, các nhiễm khuẩn do Bacteroides spp [7].

1.1.3. Một số đặc điểm của clindamycin

ÁN

-L

Í-

1.1.3.1. Công thức cấu tạo

Công thức: C18H33ClN2O5S.HCl

IỄ N

ÀN

Phân tử lượng: 461,47 g/mol [8].

.HCl Hình 1.2. Công thức phân tử của clindamycin hydroclorid

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Tên khoa học: Methyl 7-cloro-6,7,8-trideoxy-6-[[[(2S,4R)-1-methyl-4-propyl pyrrolidin-2-yl]

carbonyl]

amino]-1-thio-L-threo-α-D-galacto-octopyranosid

hydroclorid [8].

1.1.3.2. Tính chất hóa lý

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

U Y

a) Tính chất vật lý - Bột kết tinh trắng hoặc gần nhƣ trắng. Vị đắng nhẹ, hút ẩm. - Dễ tan trong nƣớc, tan nhẹ trong ethanol; hầu nhƣ không tan trong dung môi hữu cơ [8] b) Tính chất hoá học - Phản ứng màu: tƣơng tự lincomycin HCl [6], [8]. 1.1.3.3. Phổ tác dụng

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

Tác dụng in vitro của clindamycin đối với các vi khuẩn sau đây: Cầu khuẩn gram dƣơng ƣa khí: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcius (trừ S. faecalis), Pneumococcus. Trực khuẩn gram âm kỵ khí: Bacteroides (B. fragilis) và Fusobacterium spp. Trực khuẩn gram dƣơng kỵ khí không sinh nha bào: Propionibacterium, Eubacterium và Actinomyces spp. Cầu khuẩn Gram dƣơng kỵ khí: Peptococcus và Peptostreptococcus spp., Clostridium perfringens (trừ C. sporogenes và C. tertium). Các vi khuẩn khác: Chlamydia trachomatis, Toxoplasma gondii, Plasmodium falciparum, Pneumocystis carinii, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma brominn. Các loại vi khuẩn sau đây thƣờng kháng clindamycin: các trực khuẩn Gram âm ƣa khí; Streptococcus faecalis; Nocardia sp; Neisseria meningitidis; Staphylococcus aureus kháng methicillin; H. influenzae [7]. 1.1.3.4. Chỉ định

Điều trị những bệnh nhiễm vi khuẩn nhạy cảm với clindamycin nhƣ B. fragilis

ÀN

và Staphylococcus aureus, đặc biệt điều trị những ngƣời bệnh dị ứng với penicilin.

IỄ N

Clindamycin đƣợc dùng trong những trƣờng hợp sau: - Phòng ngừa viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn do cấy ghép phẫu thuật cho

ngƣời bệnh dị ứng với penicilin hoặc những ngƣời đã điều trị lâu bằng penicilin. - Viên phổi sặc và áp xe phổi, nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp nặng do các vi khuẩn kỵ khí Streptoccocus, Staphylococcus và Pneumococcus.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Nhiễn khuẩn trong ổ bụng nhƣ viêm phúc mạc và áp xe trong ổ bụng. Vì có nguy cơ gây viêm đại tràng giả mạc nên clindamycin không phải là thuốc

đƣợc lựa chọn đầu tiên [7], [8].

- Nhiễm khuẩn vết thƣơng mƣng mủ (phẫu thuật hoặc chấn thƣơng).

U Y

1.1.4. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh

Báo cáo toàn cầu của WHO về tình trạng đề kháng kháng sinh năm 2014 đã chỉ

ra rằng việc các loại vi khuẩn biến đổi khiến cho các loại kháng sinh bị vô hiệu hoá

ẠO

không còn là một dự đoán ở tƣơng lai mà đã trở thành hiện thực và đang diễn ra

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

trên toàn thế giới [26], [27].

Trên thế giới, nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh đã trở nên ngày càng kháng thuốc

H Ư

kháng sinh, các kháng sinh “thế hệ một” gần nhƣ không đƣợc lựa chọn trong nhiều

TR ẦN

trƣờng hợp. Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí cả một số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” cũng đang mất dần hiệu lực [12]. Vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi

10 00

trội ở các nƣớc đang phát triển với sự tiến triển của các bệnh nhiễm khuẩn nhƣ nhiễm khuẩn tiêu hoá, hô hấp, các bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục, nhiễm

khuẩn bệnh viện... [5].

Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao. Trong số các nƣớc

Í-

thuộc mạng lƣới giám sát các căn nguyên kháng thuốc châu Á (ANSORP), Việt

-L

Nam có mức độ kháng penicillin cao nhất (71,4%) và kháng erythromycin (92,1%)

ÁN

[31]; 75% các chủng Pneumococci kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh; 57%

Haemophilus influenzae kháng với ampicillin. Những năm 1990, tại thành phố Hồ

IỄ N

ÀN

Chí Minh, chỉ có 8% các chủng Pneumococcus kháng với penicillin. Đến năm 1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên 56% [17]. Tình trạng kháng phổ biến ở các vi khuẩn Gram âm. Theo kết quả nghiên cứu công bố năm 2009 cho thấy 42% các chủng Enterobacteriaceae kháng với ceftazidim, 63% kháng với gentamicin và

74% kháng với nalidixic acid. Tỉ lệ kháng cao này đƣợc ghi nhận ở ngƣời khỏe

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

mạnh trong cộng đồng. Nhiều liệu pháp kháng sinh đƣợc khuyến cáo trong các tài Mặc dù khó đánh giá một cách định lƣợng nhƣng rõ ràng thực trạng kháng kháng

sinh đã, đang và sẽ gây ra những tác động tiêu cực đối với ngành y tế và kinh tế

liệu hƣớng dẫn điều trị đã không còn hiệu lực [19].

Việt Nam.

U Y

Riêng đối với các kháng sinh nhóm lincosamid, tình trạng bị đề kháng bởi vi

khuẩn cũng không phải là ngoại lệ.

Trong nghiên cứu về sự kháng kháng sinh nhóm MLSB của Staphylococci đƣợc

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

phân lập ở Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ đăng trên tạp chí “The Journal of Microbiology”

năm 2007, Zerrin Aktas và các cộng sự đã chỉ ra rằng clindamycin thƣờng đƣợc sử

dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên da, mô mềm và xƣơng bởi khả năng

H Ư

dung nạp thuốc tại các vị trí này, giá thành phù hợp, dạng đƣờng uống cũng nhƣ khả

TR ẦN

năng thâm nhập vào các mô. Tuy nhiên đã có một số lƣợng lớn các báo cáo về thất bại trong điều trị bằng clindamycin hoặc lincomycin trong các nhiễm khuẩn nghiêm

trọng do sự kháng kháng sinh nhóm MLSB của Staphyloccoci. Trong số 78 mẫu

10 00

bệnh phẩm chứa Staphylococci gram âm coagulase đƣợc đem thử độ nhạy cảm với kháng sinh clindamycin thì chỉ có 42,1% còn nhạy cảm, trong khi đó có đến 55,9%

mẫu bệnh phẩm kháng lại kháng sinh ngay cả ở MIC90 [16].

Theo nghiên cứu “Cơ chế của sự kháng thuốc đối với nhóm kháng sinh macrolid

-L

Í-

và lincosamid - Bản chất của các yếu tố kháng thuốc và ý nghĩa lâm sàng của

ÁN

chúng” của Roland Leclercq, việc kháng kháng sinh nhóm macrolide và lincosamid

đang gia tăng nhanh chóng trong các báo cáo về các ca lâm sàng đƣợc phân lập có chứa các vi khuẩn gram dƣơng, với các cơ chế kháng kháng sinh đa dạng bao gồm kháng thuốc. Sự kháng thuốc không chỉ xuất hiện đối với chủng Staphylococci mà còn xuất hiện trên Streptococci và Enterococci [24].

IỄ N

ÀN

thay đổi cấu trúc ribosom, bất hoạt thuốc và kết quả là tạo ra rất nhiều phenotype

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1.1. Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự

phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha

ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [3], [4].

U Y

động lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi 1.2.1.2. Nguyên tắc

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong dung môi và đƣợc cho qua cột bằng một

dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển

qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất

H Ư

tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tƣơng tác với pha tĩnh khác nhau nên tốc độ di

TR ẦN

chuyển qua cột của các chất phân tích khác nhau, do vậy các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lƣợng.

1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

10 00

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với khối phổ là phƣơng pháp phân tích dụng cụ quan trọng và đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay để phân tích thành

phần và cấu trúc các chất với khả năng xác định hàm lƣợng siêu vết, giới hạn phát

hiện có thể lên đến 10-14 gam [3].

-L

Í-

Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ÁN

(HPLC) sử dụng detector khối phổ. Sau khi loại bớt tạp chất, ion hoá và tách ra từ

cột sắc ký, các chất phân tích đi vào thiết bị khối phổ. Trong thiết bị khối phổ, các chất đƣợc chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó đƣợc ion hoá bằng các phƣơng

IỄ N

ÀN

pháp thích hợp. Các ion tạo thành đƣợc đƣa vào bộ phận phân tích khối, tại đây các ion sẽ đƣợc tách thành từng phần riêng biệt nhờ vào tác dụng của điện trƣờng hoặc từ trƣờng dựa trên số khối m/z khác nhau và cuối cùng đi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu. Hình 1.3 mô tả sơ đồ hệ thống thiết bị khối phổ.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ẠO

a) Bộ nạp mẫu (inlet)

Một thiết bị khối phổ bao gồm các bộ phận chính nhƣ sau:

1.2.2.1. Thiết bị khối phổ

U Y

Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống thiết bị khối phổ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối phổ. Trong

sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký. Mẫu ở dạng

H Ư

lỏng hoặc rắn sẽ đƣợc chuyển sang dạng hơi bằng các phƣơng pháp thích hợp để tạo

TR ẦN

ra sự tƣơng thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Đầu dò khối phổ đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ, trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với

10 00

một lƣợng dung môi tƣơng đối lớn, nhiệt độ tƣơng đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (API) ra đời đã giải quyết đƣợc vấn đề

này và tạo ra bƣớc đột phá thật sự cho phƣơng pháp LC-MS/MS.

b) Bộ nguồn ion hóa (ion source)

Í-

Tại đây các phân tử ở trạng thái hơi bị bắn phá tạo ra ion phân tử hoặc các ion

-L

mảnh, mỗi ion có khối lƣợng m và điện tích z nhất định. Tỉ số m/z (số khối) của

ÁN

mỗi ion là một thông số quan trọng mà nhờ nó, bộ phận phân tích khối có thể tách

IỄ N

ÀN

riêng đƣợc các ion này. Có ba kiểu hình thành ion: ESI, APCI, APPI. Trong nghiên cứu này, chúng tôi

sử dụng máy phân tích với bộ phận ion hóa bằng kỹ thuật ESI để ion hoá các phân tử trung hoà thành các ion phân tử, các mảnh ion hoặc các gốc mang điện tích. Đây là kỹ thuật ion hóa đƣợc ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lƣợng phân tử lớn và đƣợc xem là kỹ thuật ion hóa “êm dịu” hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học nhƣ protein hoặc các polyme.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ESI đƣợc thực hiện ở áp suất khí quyển. Tại đầu ống dẫn mao quản, dƣới ảnh sƣơng nhỏ mang điện thích tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt

năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sƣơng. Đến một giới hạn, các hạt sƣơng bị

hƣởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu đƣợc phun thành những hạt

phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá

U Y

trình này đƣợc lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Sau đó các ion

phân tích đƣợc chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phận

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

phân tích khối.

10 00

Hình 1.4. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI c) Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)

Sau khi đƣợc tạo thành thì các ion sẽ đƣợc gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z

nhờ tác dụng của điện trƣờng và từ trƣờng để đi đến bộ phận phát hiện.

-L

Í-

Một số bộ phân tích khối thƣờng dùng: tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap),

ÁN

ống đo thời gian bay (time-of-flight tube).

Bộ phân tích khối tứ cực chập ba đƣợc sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-

MS/MS và đây cũng là kỹ thuật đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này. Bộ

IỄ N

ÀN

phận phân tích khối tứ cực có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Khi một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng

một chiều (DC) và điện thế tần số (RF) cao, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số m/z và trƣờng RF. Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua đƣợc bộ lọc này. Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bộ phân tích tứ cực chập ba gồm 3 tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 để ghi định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2. Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp suất

cao, các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt nhƣ khí N2, Ar, He.

phổ. Ttứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất

Sau đó tất cả các ion con đƣợc chuyển qua bộ tách Q3, có nhiệm vụ tách các ion

U Y

đƣợc chuyển từ Q2, để tới bộ phận phát hiện. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này

đƣợc gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thƣờng đƣợc dùng để khẳng định cấu trúc

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần.

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba

10 00

d) Bộ phận phát hiện ion (detector)

Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron

(electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier). Bộ phận

phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao.

Í-

Các ion đập vào bề mặt dinod làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó

-L

đƣợc dẫn tới các dinod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo

ÁN

thành dòng các electron. Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị

nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinod tạo ra dòng các electron. Khác

ÀN

với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn

IỄ N

phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ

nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân electron. Các ống nhân quang đƣợc đặt trong chân không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn. e) Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system) Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo

1.2.2.2. Một số kỹ thuật ghi phổ

Trong phân tích khối phổ việc xác định chính xác 1 ion rất quan trọng cho việc

cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu đƣợc.

xác định đƣợc hợp chất cần phân tích. Một hợp chất xác định trong những điều kiện

U Y

nhất định sẽ cho 1 ion có số khối xác định trên phổ đồ. Tuy nhiên, một ion có số

khối xác định trên phổ đồ lại có thể xuất phát từ nhiều hợp chất khác nhau vì vậy trong phân tích một hỗn hợp hoặc lẫn nhiều tạp chất nếu điều kiện sắc kí chƣa đảm

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

bảo việc phân tách thì việc nhận định các ion thông qua số khối tên phổ đồ có thể bị

ảnh hƣởng. Đối với trƣờng hợp này khối phổ 1 lần (MS) có thể cho kết quả không

chính xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần (2 lần MS/MS).

H Ư

a) Quét toàn phổ (Full Scan)

TR ẦN

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận đƣợc tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thƣờng

dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu

10 00

dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thƣờng đƣợc lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thƣờng đƣợc sử dụng

để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất.

b) Selected Ion Monitoring (SIM)

-L

Í-

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trƣng

ÁN

cho chất cần xác định và cho tín hiệu của các ion đã đƣợc lựa chọn trƣớc đó, do vậy

không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thƣ viện có sẵn. Chế độ SIM thƣờng đƣợc lựa chọn để khảo sát năng lƣợng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

IỄ N

ÀN

c) SR

Selected Reaction

onitoring và

ultiple Reaction

onitoring

Đối với máy khối phổ tứ cực chập ba, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thƣờng

đƣợc sử dụng là SRM và MRM. - SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đƣa vào đầu dò để phát hiện.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đƣa vào đầu dò để phát hiện [2], [11].

1.2.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ

tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu đƣợc các ion con, cô lập 2 (hoặc

LC-MS có tính chọn lọc và độ nhạy cao, thƣờng đƣợc sử dụng để xác định

U Y

lƣợng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp nhƣ định tính, định lƣợng thuốc và

các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, độc chất học, định lƣợng dƣ lƣợng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm, dƣợc liệu, môi trƣờng...

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Ngoài ra sắc ký lỏng khối phổ còn đƣợc sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của

chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích.

1.2.3. Phƣơng pháp xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn

H Ư

Mẫu nƣớc thải từ các công ty sản xuất dƣợc phẩm thƣờng có thành phần rất

TR ẦN

phức tạp, hàm lƣợng chất cần phân tích thấp, khó phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký. Vì vậy cần làm giàu mẫu trƣớc khi phân tích, dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn

lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian... để chọn phƣơng pháp chiết mẫu sao

10 00

cho hiệu quả nhất.

Các phƣơng pháp chiết mẫu dùng trong nƣớc thải thông thƣờng là: chiết lỏng -

lỏng và chiết pha rắn (SPE), trong đó chiết pha rắn đƣợc lựa chọn phổ biến hơn do

những ƣu điểm của nó.

-L

Í-

SPE là phƣơng pháp chiết dựa vào sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha

ÁN

lỏng và rắn, trong đó các chất đƣợc chiết từ pha lỏng vào pha rắn. Pha rắn thƣờng là

các hạt nhỏ, xốp đƣợc nhồi vào các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tƣơng tác với pha rắn sẽ đƣợc giữ lại trên ống. Các chất này đƣợc rửa giải khỏi

IỄ N

ÀN

pha rắn bằng một dung môi khác phù hợp. Thông thƣờng thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể tích dung dịch mẫu. Vì thế chiết pha rắn ngoài tác dụng làm sạch có thể thực hiện thêm bƣớc làm giàu mẫu. Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tƣơng tự nhƣ trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết. a) Cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Các tạp chất đƣợc rửa giải khỏi cột, chất phân tích đƣợc lƣu giữ lại sao cho đƣợc rửa giải bằng một dung môi rửa giải, bay hơi tới cắn hoặc trực tiếp đem đi

phân tích.

lƣợng tạp chất trong chất phân tích đƣợc giảm thiểu tối đa, chất phân tích sau đó

- Tạp chất đƣợc giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha lỏng đƣợc thu hồi.

U Y

b Các bước trong quy trình chiết pha rắn

Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào lƣợng chất phân tích trong mẫu để lựa chọn

ẠO

Quy trình chiết (SPE cột pha đảo) gồm 4 giai đoạn:

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

cột có lƣợng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau.

Giai đoạn 1: Hoạt hóa cột chiết. Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt

H Ư

hóa các nhóm hoạt động, loại bỏ các khí trong cột.

TR ẦN

Giai đoạn 2: Nạp mẫu. Trƣớc khi nạp, xử lý mẫu sơ bộ để đƣa mẫu vào môi trƣờng sao cho lƣu giữ đƣợc nhiều nhất chất phân tích trên cột, các tạp chất đi ra

10 00

của chất phân tích với pha tĩnh.

khỏi cột càng nhiều càng tốt tránh cạnh tranh và ảnh hƣởng đến quá trình tƣơng tác Giai đoạn 3: Rửa tạp chất. Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất

khác có liên kết với pha tĩnh. Phải chọn đƣợc dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa

tan và kéo đƣợc các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích.

-L

Í-

Giai đoạn 4: Rửa giải. Chất phân tích lƣu giữ trên cột đƣợc hòa tan và kéo ra

ÁN

khỏi cột bằng một dung môi phù hợp. Cần tối ƣu loại dung môi, thể tích, pH dung

môi rửa giải, tốc độ rửa giải… để có thể rửa giải đƣợc tối đa chất phân tích và rửa

IỄ N

ÀN

giải tối thiểu các tạp chất còn trên cột [3], [13]. SPE là kỹ thuật có khả năng chiết chất phân tích hiệu quả hơn, dung môi sử

dụng ít, dễ dàng tập trung chất phân tích, kỹ thuật tiến hành thuận tiện, khả năng làm giàu mẫu tốt, là cơ chế chiết đa dạng phù hợp với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn. Tuy nhiên phƣơng pháp có nhƣợc điểm là giá thành còn cao, khó áp dụng ở quy mô rộng.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.3. MỘT SỐ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CLINDAMYCIN VÀ ảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng kháng sinh lincomycin và clindamycin

H N

Khoảng tuyến tính

LOD LOQ

- Cột Agilent LC-18 (33x4,6mm; 3µm) - Pha động: hỗn hợp methanol/nƣớc/acid formic với tỉ lệ 90:10:0,05; - Tốc độ dòng pha động là 4ml/phút

- ESI-MS/MS - Nhiệt độ nguồn phun ion: 300oC - Nebulizer: 40 psi - Hiệu điện thế nguồn phun ion: 5,5 kV - Ion mẹ có m/z = 426,0 - Ion con có m/z = 126,0 - ESI-MS/MS - Ion mẹ có m/z = 425,3 - Ion con có m/z = 126,3

- Khoảng tuyến tính 0,05-3,2µg /ml - Hệ số tƣơng quan r = 0,9993

- LOD = 0,015 µg /ml

- Khoảng tuyến tính 0,0520µg/ml - Hệ số tƣơng quan r > 0,998

- LOQ = 0.05µg/ml, - LOD = 1,3ng/ml

- ESI-MS/MS - Nhiệt độ nguồn phun ion: 300oC - Nebulizer: 40 psi - Hiệu điện thế nguồn phun ion: 3 kV - Ion mẹ có m/z = 407,0 - Ion con có m/z = 126,0 - Cột Synergi Hydro-RP - ESI-MS/MS

- Khoảng tuyến tính 5500 ng/g thịt và sữa với - Hệ số tƣơng quan r > 0,996.

- LODLIN = 5µg/kg sữa và 10µg/kg thịt. - LOQLIN = 10µg/kg sữa và 15µg/kg thịt

- Khoảng

- LOD =

ẠO

U Y

Điều kiện MS

CLI/ huyết tƣơng ngƣời

Điều kiện LC

TR ẦN

H Ư

[28]

Hoạt chất/nền mẫu

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Tài liệu

sử dụng LC- S/ S trên thế giới.

LINCOMYCIN TRÊN THẾ GIỚI

CLI/ huyết tƣơng động vật

ammonium

acetat

trong

nƣớc; kênh B là acetonitril

[21]

10 00

- Cột RP-18 Hypersil (5µm, 100mm×3mm) phối hợp với cột (25 mm×3mm) - Pha động: kênh A 0.01M

[22]

LIN/ thịt và sữa

[18]

LIN/ mật

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

(chạy gradient nồng độ) - Tốc độ dòng 0,2 ml/phút - Cột Discovery HS C18 (3µm;15cm×2,1mm). - Pha động: kênh A nƣớc loại ion với acid formic 0,1%, kênh B acetonitril với acid formic 0,1%. (Chạy gradient nồng độ) - Tốc độ dòng 0,25ml/phút - Nhiệt độ cột sắc ký là 25oC.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

0,03 µg/kg

- ESI-MS/MS - Nhiệt độ nguồn phun ion: 450oC - Nebulizer: 20 psi - Hiệu điện thế nguồn phun ion: 5,5 kV - Ion mẹ có m/z = 407,0 - Ion con có m/z = 126,0 và 359 - ESI-MS/MS - Nhiệt độ nguồn phun ion: 325oC - Nebulizer: 60 psi - Hiệu điện thế nguồn phun ion: 2 kV - Ion mẹ có m/z = 407,3 - Ion con có m/z = 126,3 và 359,3 - ESI-MS/MS - Ion mẹ có m/z = 425,0 - Ion con có m/z = 126,0

- Khoảng tuyến tính 25-250 µg/l - Hệ số

- Khoảng tuyến tính 0,0520,0µg/ml - Hệ số tƣơng quan r = 0,998

- LOD = 0,015µg/ ml. - LOQ = 0,05µg /ml

- ESI-MS/MS - Nhiệt độ nguồn phun ion: 500oC - Nebulizer: 40

- Khoảng tuyến tính 01000µg/kg thịt và 0-

- LOD = 0,61,5µg/kg - LOQ =

U Y

tuyến tính 0,102,0µg/kg - Hệ số tƣơng quan r > 0,999

- LOD = 0,6ng/g. LOQ = 2ng/g

ẠO

tƣơng quan

r>0,99

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

TR ẦN

H Ư

[23]

LIN/thịt gia cầm, trứng và sữa

- Ion mẹ có m/z = 407,0 - Ion con có m/z = 126,0 và 358,9.

(150×2,0mm; 4µm). - Pha động kênh A là nƣớc có ammonium acetat 0,01M; kênh B là acetonitril. - Tốc độ dòng pha động là 0,25ml/phút. Chạy gradient nồng độ. - Cột Capcell Pak C18 (5 µm, 2,0 mm×150 mm) - Nhiệt độ 40oC. - Pha động (A) 10mM ammonium format 0,1% acid formic trong nƣớc và (B) methanol (chạy gradient). - Tốc độ dòng 0,3ml/phút

ong

LIN/thuốc

ÁN

-L

Í-

[35]

10 00

- Cột Eclipse Plus C18 (50mm×4,6 mm, 1,8µm). - Nhiệt độ 25oC. - Pha động (A) nƣớc, acid triflouroacetic 0,05%, NH3 điều chỉnh pH 3 (B) acetonitril. - Chạy đẳng dòng tỉ lệ A:B 90:10. - Tốc độ dòng 0,5mL/phút

CLI/huyết tƣơng

[30]

LIN/thịt, gan, thận lợn

IỄ N

ÀN

[36]

- Cột Hypersil C18 (50mm×4,6mm, 5µm). - Nhiệt độ 25oC. - Pha động: acetonitril : nƣớc : acid triflouroacetic 80:20:0,01. Chạy đẳng dòng. - Tốc độ dòng 0,8ml/phút - Cột Hypersil BDS C18 (5µm, 2,1mm×250mm) - Nhiệt độ 25oC. - Pha động (A) amonium

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

- Khoảng tuyến tính 10,00100,00µg/ml - Hệ số

- LOD = 4,21ng/ml. - LOQ = 14,03ng/ml

tƣơng quan r = 0,9999

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

25-50 µg/kg

U Y

3000 µg/kg gan hoặc thận - Hệ số tƣơng quan r = 0,9990 đến 0,9999

- LOD = 0,03ng/ml. - LOQ = 10ng/ml

- Khoảng tuyến tính 0,0550µg/ml - Hệ số tƣơng quan r = 0,9996

- LOD = 0,007µg/g

- Khoảng tuyến tính 253000µg/kg - Hệ số tƣơng quan r = 0,995

- LOD = 1,5-8,8 µg/kg - LOQ = 25-50 µg/kg

- Khoảng tuyến tính 0,05 – 0,15µg/ml - Hệ số tƣơng quan r = 0,991

ẠO

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

[20]

CLI/ huyết tƣơng và nƣớc bọt

psi - Hiệu điện thế nguồn phun ion: 5kV - Ion mẹ có m/z = 407,2 - Ion con có m/z = 126,1 và 359,2 - Cột Agilent Zorbax SB- - Ion mẹ có m/z C18 (3,5 µm, 21 mm×30 = 425,1 mm) - Ion con có m/z o - Nhiệt độ 50 C. = 126,1 - Pha động methanol : nƣớc : acid triflouracetic 40:60:0,01 - Tốc độ dòng 0,6 ml/phút - Cột Zorbax C18 (5µm, - APCI-MS/MS 2,1mm×150mm), cột bảo - Nhiệt độ nguồn vệ C8 (4mm × 2,0mm) phun ion: 550oC - Pha động (A) methanol - Tốc độ khí (B) acetonitril, acid phun: 90-175l/h triflouroacetic 0,1% (C) - Ion mẹ có m/z nƣớc, acid triflouroacetic = 407,2 0,1%. Tỉ lệ A:B:C - Ion con có m/z 10:22,5:67,5 sau đó 7 phút = 126,1 chuyển sang 10:90:0. - Tốc độ dòng 0,5 ml/phút - Cột Hypersil C18 (5µm, - ESI-MS/MS 2,1mm×250mm) và cột bảo - Nhiệt độ nguồn vệ C18 (7,5mm, 4,6mm) phun ion: 500oC o - Nhiệt độ 25 C. -Nebulizer: 40psi - Pha động (A) acetonitril, - Hiệu điện thế acid triflouroacetic 0,1% nguồn phun ion: (B) ammonium format : 5kV formic acid : acetonitril : - Ion mẹ có m/z nƣớc, 1:5:50:950. A:B 3:7 = 407,2 - Tốc độ dòng 0,2 ml/phút - Ion con có m/z = 126,1 và 359,2

formate:formic acid: acetonitril : nƣớc , 1:5:50:950; (B) acetonitril (0,1% acid formic). Chạy gradient nồng độ. - Tốc độ dòng 0,2 ml/phút

LIN/ mật ong

-L

Í-

10 00

[33]

ÁN

LIN/ mô động vật và sữa bò

IỄ N

ÀN

[29]

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Nhận xét Qua tham khảo các nghiên cứu định lƣợng 2 kháng sinh lincomycin và

clindamycin sử dụng phƣơng pháp LC-MS/MS chúng tôi thấy rằng:

- Bộ nguồn ion hoá đƣợc sử dụng phổ biến là ion hoá phun điện tử (ESI). acetonitril, methanol, nƣớc có pha thêm acid để ion hoá kháng sinh.

U Y

- Hệ dung môi pha động đƣợc sử dụng đa dạng, chủ yếu là các dung môi

- Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ tuỳ thuộc vào nền mẫu, nhƣng nhìn chung 2 kháng sinh có khoảng tuyến tính khá rộng, LOD và LOQ thấp, độ nhạy cao.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

- Các nghiên cứu đều xác định lincomycin có 1 ion mẹ có m/z ~ 407 và 2 ion

con có m/z ~126 và ~359 còn clindamycin có 1 ion mẹ có m/z ~425 và 2 ion con có

m/z~ 126 và và 377.

H Ư

- Lincomycin và clindamycin đƣợc nghiên cứu xác định hàm lƣợng trên rất

TR ẦN

nhiều nền mẫu phong phú (thực phẩm, huyết tƣơng, các cơ quan của ngƣời hoặc động vật), tuy nhiên chƣa có các nghiên cứu định lƣợng 2 kháng sinh này trong

nƣớc thải công nghiệp, y tế hoặc nƣớc thải sinh hoạt.

10 00

- Chƣa có nghiên cứu định lƣợng đồng thời cả 2 loại kháng sinh này. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mong muốn xây dựng đƣợc

phƣơng pháp định lƣợng đồng thời cả hai kháng sinh lincomycin và clindamycin

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

trong nền mẫu nƣớc thải.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2. CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG & PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1. Hoá chất & thuốc thử

Chuẩn VKN

Clindamycin hydroclorid

Chuẩn VKN

H N

Lincomycin hydroclorid

Nguồn gốc

U Y

Tiêu chuẩn

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng SKS: 0311013.02 (Nguyên trạng) Hàm lƣợng: 836,5µg/mg Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng SKS: 0515098.03 (Nguyên trạng) Hàm lƣợng: 855,4µg/mg CIL - Mỹ SKS: SDED-002 Hàm lƣợng: 50µg/ml

Nguyên vật liệu

ẠO

STT

TCCS

H Ư

C3Trimethoprim

TR ẦN

Methanol

HPLC

Merck - Đức

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

Acid formic

Merck - Đức

Acid hydrocloric

Trung Quốc

Natri edetat

Merck - Đức

Nƣớc cất 2 lần

Tinh khiết

Bộ môn Bào chế, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội

-L

Í-

10 00

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

2.1.2. Thiết bị - dụng cụ

ÁN

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu:

IỄ N

ÀN

- Sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS, Mỹ

- Cột sắc ký Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5µm) - Bộ chiết pha rắn LiChrolut, Đức

- Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 6mL, 200mg, Waters - Mỹ - Thiết bị siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Hàn Quốc. - Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Mỹ - Máy lọc hút chân không.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Màng lọc 0,2µm và 0,45µm Cellulose acetat filter, Mỹ. - Cân phân tích AB204 Mettler Toledo (chính xác đến 0,1mg), Mỹ

- Cân phân tích XP105 Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg), Mỹ.

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Pierce Reacti – Therm / #18822, Mỹ.

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích

U Y

2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu

- Mẫu trắng: mẫu nƣớc thải của nhà máy sản xuất dƣợc phẩm không sản xuất kháng sinh nghiên cứu, đã đƣợc kiểm tra bằng LC-MS/MS không phát hiện có

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

kháng sinh nghiên cứu (dƣới mức LOD).

- Mẫu tự tạo: mẫu trắng đƣợc pha thêm lincomycin và clindamycin với nồng độ

xác định.

TR ẦN

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

H Ư

- Các chất nghiên cứu: lincomycin, clindamycin, 13C3trimethoprim. 2.2.1. Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu thô trƣớc khi tiến hành chiết tách

- Lấy nƣớc thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh.

10 00

- Xử lý mẫu thô: lọc nhiều lần qua giấy lọc - Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2 - 8oC nếu tiến hành phân tích trong 24h hoặc

bảo quản mẫu ở -30 oC nếu tiến hành phân tích trong 1 tháng.

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu

-L

Í-

Mẫu phân tích có tính chất phức tạp và lƣợng chất phân tích trong mẫu (nếu có)

ÁN

rất nhỏ, lựa chọn phƣơng pháp chiết pha rắn để làm giàu mẫu và tách loại tạp. Do

giá thành cột chiết cao gây khó khăn trong việc khảo sát các thông số của quá trình xử lý mẫu, bên cạnh đó với mong muốn xây dựng đƣợc một quy trình chung để

IỄ N

ÀN

phân tích nhiều kháng sinh đồng thời nên chúng tôi tham khảo và lựa chọn quy trình tối ƣu để chiết tách và làm giàu mẫu từ các nghiên cứu đã có trƣớc đó. Loại cột chiết sử dụng là cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 6ml, 200mg (Waters – Mỹ).

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.2.3. Phƣơng pháp xây dựng quy trình định lƣợng lincosamid bằng HPLC Xây dựng quy trình phân tích sao cho có thể sử dụng định lƣợng đồng

lincomycin và clindamycin. Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

MS/MS

2.2.3.1. Lựa chọn chất chuẩn nội

U Y

Chất chuẩn nội cần có bản chất hoá học gần với chất phân tích, đảm bảo đáp

ứng của chuẩn nội tốt, phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài. Do khó khăn trong việc tìm kiếm các chất đồng vị của lincomycin và clindamycin làm

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

chuẩn nội, chúng tôi lựa chọn chuẩn nội để tiến hành nghiên cứu là

trimethoprim. Đây là đồng vị không có sẵn trong tự nhiên của trimethoprim do vậy

sẽ không có trong nền mẫu. Ngoài ra, việc sử dụng

C3 trimethoprim làm chất

H Ư

chuẩn nội giúp việc phân tích đồng thời nhiều kháng sinh đƣợc thực hiện dễ dàng

TR ẦN

hơn tƣơng tự các nghiên cứu trƣớc đó [1], [15]. 2.2.3.2. Khảo sát điều kiện khối phổ

Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba, lựa

10 00

chọn và khảo sát các điều kiện khối phổ phù hợp: - Nguồn ion hóa: Lựa chọn loại nguồn ion ESI tạo ion dƣơng. Lựa chọn các

nguồn ion hoá.

thông số của nguồn ion hoá về nhiệt độ khí phun, tốc độ khí, áp suất đầu phun, thế

-L

Í-

- Điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con: khảo sát các giá trị năng lƣợng va

ÁN

chạm (CE) và thế phân mảnh (Frag) để tạo đƣợc mảnh ion con có cƣờng độ tín hiệu

lớn phù hợp. - Lựa chọn ion con có cƣờng độ lớn nhất để định lƣợng, định tính.

IỄ N

ÀN

2.2.3.3. Khảo sát điều kiện sắc ký - Lựa chọn cột sắc ký. - Lựa chọn thành phần và tỉ lệ pha động: lựa chọn khảo sát 3 dung môi là nƣớc, acetonitril vào methanol có thêm HCOOH để tách các kháng sinh trong nƣớc thải. Pha động đƣợc chọn phải đảm bảo peak cần phân tích trong sắc ký đồ không bị

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

chập với các peak nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng peak, thời gian lƣu - Tốc độ dòng: khảo sát các tốc độ 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút để xác định tốc độ phù

hợp. Chọn tốc độ cho peak cân đối, ít doãng và thời gian lƣu vừa đủ.

không quá dài.

tiêm phù hợp cho sắc ký đồ cân đối, diện tích peak và độ đáp ứng cao.

2.2.4. Phƣơng pháp thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

U Y

- Thể tích tiêm mẫu: thay đổi thể tích tiêm 3; 5;10l để xác định đƣợc thể tích

Xử lí các mẫu nghiên cứu theo phƣơng pháp đã xây dựng, tiến hành sắc ký các

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

dung dịch thu đƣợc theo điều kiện đã khảo sát, theo hƣớng dẫn của các tài liệu [14],

[32], thẩm định phƣơng pháp dựa trên các chỉ tiêu:

2.2.4.1. Tính thích hợp của hệ thống

H Ư

Đánh giá độ lặp lại của hệ thống về thời gian lƣu và diện tích peak của các

TR ẦN

kháng sinh và chất chuẩn nội.

Tiến hành: Pha dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp kháng sinh và chất nội chuẩn.

Tiêm mẫu và chạy sắc ký lặp lại 6 lần liên tiếp. Ghi lại sắc ký đồ và diện tích peak.

10 00

Yêu cầu

Giá trị RSD của thời gian lƣu của chất chuẩn nội và kháng sinh < 1%.

Giá trị RSD của tỷ số diện tích peak mỗi kháng sinh và chất chuẩn nội < 5%.

Í-

2.2.4.2. Độ đặc hiệu của phương pháp

-L

Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt nền mẫu. Độ

ÁN

đặc hiệu thƣờng liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích. Độ đặc hiệu

của đƣợc đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng, mẫu tự tạo.

IỄ N

ÀN

Tiến hành Pha các mẫu nhƣ sau: - Dung dịch chuẩn: pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc và dung dịch

chuẩn nội với dung môi MeOH. - Mẫu trắng: nƣớc thải thu thập đƣợc xử lý theo quy trình đã lựa chọn.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Mẫu tự tạo: pha loãng dung dịch chuẩn gốc các kháng sinh và chuẩn nội Tiến hành tiêm mẫu và chạy sắc ký phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng,

mẫu tự tạo theo các điều kiện sắc ký lỏng khối phổ đã chọn. Ghi lại sắc ký đồ.

trong nƣớc thải đã xử lý theo quy trình lựa chọn.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, mẫu trắng phải không xuất hiện peak có tR tƣơng ứng

U Y

với tR của các mảnh khối phổ tƣơng ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu

chuẩn và mẫu IS. Nếu có đáp ứng peak, Speak thu đƣợc phải < 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính. Ngoài ra, theo quy định của châu Âu (2002/657/EC) về

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

phân tích dƣ lƣợng, phƣơng pháp đạt yêu cầu khi có ít nhất 4 điểm IP.

2.2.4.3. Khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ

H Ư

thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích.

TR ẦN

Tiến hành

- Từ dung dịch chuẩn gốc các kháng sinh, pha các dung dịch chuẩn với 7 mức

10 00

chuẩn nội cố định là 10 ng/ml.

nồng độ của mỗi chất chính xác khoảng từ 0,5 ng/ml đến 50 ng/ml và nồng độ - Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.

- Xây dựng đồ thị và phƣơng trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mỗi quan hệ

giữa tỷ lệ diện tích peak của kháng sinh và diện tích peak của chuẩn nội với nồng

-L

Í-

độ kháng sinh.

ÁN

- Tính hệ số tƣơng quan r giữa nồng độ và tỷ lệ giữa diện tích peak của chất

phân tích và diện tích peak của chuẩn nội. Yêu cầu: 0,995 ≤ r ≤ 1

IỄ N

ÀN

2.2.4.4. Độ thu hồi, độ đúng và độ lặp lại của phương pháp Độ đúng là sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy thực tế với giá trị lý thuyết. Độ

lặp lại là độ chụm của các kết quả đo đƣợc trong cùng điều kiện thí nghiệm. Tiến hành - Thêm một lƣợng chất chuẩn xác định vào 6 mẫu nƣớc thải (đƣợc lấy ở các thời điểm khác nhau) ở mức MQC.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình (chiết qua cột) và chạy sắc ký. định độ thu hồi.

- Tính RSD để xác định độ lặp lại của phƣơng pháp. Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại

- Tính nồng độ kháng sinh thu hồi sau khi chiết (dựa vào đƣờng chuẩn) để xác

đƣợc và lƣợng chuẩn thêm vào để có đƣợc độ đúng của phƣơng pháp.

U Y

Yêu cầu: Với nồng độ kháng sinh từ 10 - 100 ng/ml thì phƣơng pháp cần có:

- Độ thu hồi từ 60% - 115% - RSD của độ thu hồi ≤ 21 %.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.2.4.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn định lƣợng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích có trong

mẫu thử mà ta có thể định lƣợng đƣợc với độ đúng và độ chính xác thích hợp. Giới

H Ư

hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát

TR ẦN

hiện đƣợc những chƣa thể định lƣợng đƣợc .Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng đƣợc tính dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N = Signal to noise).

Tiến hành

10 00

- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp hai kháng sinh với MeOH đƣợc các dung dịch có nồng độ loãng dần.

- Tiêm mẫu và chạy sắc ký theo quy trình đã xây dựng.

- Ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đƣờng nền (thông thƣờng

-L

Í-

S/N = 10) xác định giá trị LOQ.

ÁN

- Ở nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đƣờng nền (thông thƣờng

S/N = 3) xác định giá trị LOD. - Ngoài ra LOD còn có thể tính theo công thức LOD = LOQ/3,3

IỄ N

ÀN

2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU - Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để tính toán và xử lý thống kê. - Nồng độ kháng sinh trong mẫu đƣợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tƣơng quan giữa tỷ số diện tích pic chất phân tích với diện tích pic chuẩn nội và nồng độ chất phân tích với hệ số tƣơng quan không nhỏ hơn 0,995.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial