ỨNG DỤNG CỦA CHIẾT PHA RẮN SPE TRONG VIỆC NÂNG CAO KẾT QUẢ PHÂN TÍCH Y DƯỢC

“Ứng dụng của chiết pha rắn SPE trong việc nâng cao kết quả phân tích y dược"

1

Chiết pha rắn là gì?

SPE là một công nghệ chuẩn bị mẫu có sử dụng hạt rắn, vật liệu cơ bản dựa trên nguyên lý của sắc ký, là quá trình phân bố của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất mẫu ở dạng lỏng (pha nước, hay hữu cơ), chất chiết ở dạng rắn, dạng hạt nhỏ và xốp đường kính 25 - 70 µm được nhồi trong 1 loại thiết bị cột để tách các thành phần khác nhau của 1 mẫu. chiết pha rắn (Solid Phase Extraction ), hay chiết rắn-lỏng 2

Điều kiện chiết pha rắn SPE

Tính chọn lọc của pha tĩnh chiết.

Các chất chiết và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng chiết phải lớn Quá trình chiết phải xẩy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và chất phân tích.

Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình chiết bởi bất kỳ từ nguồn nào.

Sự chiết phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù hợp, phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện thì càng tốt.

3

Kết hợp SPE với một số thiết bị hiện đại

4

MSMS EIC 20 ng/mL Salbutamol – 1 mL Urine 78:20:2 Elution Solvent (Dichloromethane:Isopropanol:Ammonium Hydroxide)

Relative Abundance

Relative Abundance

Relative Abundance

Relative Abundance

RT: 0.00 - 4.00 NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 cerex

100 80 60 1.90

40 20 0 100

NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 certify

1.97

80 60 40 20 0 100

NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 clean s crn

1.95

80 60

CLEAN SCREEN®

40 20

1.20

0 100

NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 oas is

80 60 40 20

1.94

0 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 Time (min)

2.5

3.0

3.5

4.0

5

So sánh kết quả thu hồi Benzoylecgonine từ 1ml nước tiểu ngựa ( quá trình làm sạch đường nền bằng chiết pha rắn) 10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS CleanScreen

PC: CONDOA BEG-TMS CleanScreen Abundance

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3790.D

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3788.D 6000000

6000000

4000000

4000000

2000000

2000000

Time-->

0 5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3793.D

6000000

6000000

4000000

4000000

2000000

2000000

Time-->

0 5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

5.00

11.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

PC: CONDOA BEG-TMS Cerex

10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS Cerex Abundance

0 Time-->

12.00

Time-->

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3795.D

0 5.00

6.00

7.00

8.00

9.00

10.00

11.00

12.00

6

Kỹ thuật chiết pha rắn được coi là “bước nhảy vọt” trong xử lý mẫu Nội dung 1. Thiết bị SPE 2. Cơ chế SPE 3. Kỹ thuật SPE 4. Tính khả thi của kỹ thuật SPE 7

THIẾT BỊ

8

Cartric, cột nhồi đơn giản

9

Chất nhồi cột SPE

10

Thiết bị đi kèm SPE

11

Thiết bị SPE kết nối

12

Cơ chế

13

2.1. Các kiểu tương tác chính 1. Phân cực 2. Không phân cực 3. Trao đổi ion 4. Cộng hóa trị 5. Liên kết polyme 14

2.2. Phân loại cơ chế Pha thường Pha đảo Cơ chế

Chiết rây phân tử Trao đổi ion

Trao đổi cation Trao đổi anion 15

2.2.1. Chiết pha thường NPE

Tính năng chính pha tĩnh: ái lực mạnh, phân cực (liên kết H)

Liên kết liên quan: pipi-pi và tương tác lưỡng cực

Chất hấp phụ: - silica, diol, diethylamino, cyanopropyl

Ứng dụng tách: - Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates, phenols, vitamins tan trong dầu

Phân tích: - amines, hydroxyls, carbonyls, vòng thơm, các dị tố (O, S, N, P)

Hỗn hợp: - Không phân cực, hữu cơ

Dung môi rửa giải: - Trung bình đến phân cực cao 16

2.2.2. Chiết pha đảo RPE

Tính năng chính pha tĩnh: Kỵ nước, không phân cực

Lực liên kết: Lực Vabvander, lực phân tán

Chất hấp phụ: - C2, C3,C4, iC4, tC4, C5, C6, C7, C8, C10, C12, C18, C20, C30 phenyl, cyclohexyl

Ứng dụng: - Dược phẩm, Thuốc trừ sâu

Phân tích: - Chất trung tính hoặc proton hóa, vòng thơm, chuỗi ankyl

Nền mẫu (maxtric): - Sinh học, nước, dung dịch đệm

Dung môi rửa giải: - Không phân cực đến phân cực yếu 17

Nguyên lý pha đảo

18

2.2.3. Chiết rây phân tử (loại cỡ, gel)

Các chất hấp thu là các hạt silicagen có diện tích bề mặt lớn, trên bề mặt hạt silic, có các mao quản kích thước lỗ lớn, 275275-300A 300Ao.

Áp dụng: dụng: Chiết tách các hợp chất có khối lượng lớn cỡ 2000D 2000 D

Tương tác tác:: Đi vào lỗ xốp nhờ tương tác phân cực, kỵ nước hay trao đổi ion ion.. Thí dụ chất hấp thụ kỵ nước kiểu butyl với hàm lượng Cacbon nạp khoảng 6%, loại khác là có gắn nhóm trao đổi ion –COOH, hàm lượng C khoảng 12 12,,2% 19

Cột chiết C8 và polyme (áp dụng chiết pha đảo đảo))

0

4

8

12

16

20

0

4

8

12

16

Time (minutes)

Time (minutes)

C8 Column

Copolymeric Column

20

20

Ảnh hưởng của độ dài chuỗi (Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE) 4

3.0e

3 2

4

4

3.0e

5

3

4

2

1

1

2.0e

2.0e

4

4

1.0e

1.0e

4

4

0

2

4

0

endogenous peaks: area = 71,628

5

6

8

0

C18 96% 94% 94% 96% 98%

2

4

6

8

0 C2 1 2 3 4 5

Butabarbital Amobarbital Pentobarbital Secobarbital Glutethimide

64% 87% 88% 89% 78%

endogenous peaks: area = 11,257 21

Ảnh hưởng của loại mạch (Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE) 4

4

3.0e 4

5

3.0e

IST D

3 2

4

1

3

2.0e

IST 5 D

2.0e

2

4

4

1

1.0e

1.0e

4

4

0

2

4

6

8

10

0

0

4

6

8

10

0

Cn4

Ct4 Đỉnh nội sinh: area = 1,336

2

28% 73% 84% 98% 70%

1 2 3 4 5

Butabarbital Amobarbital Pentobarbital Secobarbital Glutethimide

93% 97% 98% 98% 96%

Đỉnh nội sinh area = 18,271

22

2.2.4. Cơ chế trao đổi ion

Tương tác ion xảy ra giữa chất hấp phụ và chất phân tích

Duy trì pH thích hợp cho quá trình phân tích

Liên kết ion đủ mạnh, giữ lại chất phân tích

Loại bỏ các chất bẩn bằng dung môi thích hợp

Dung môi rửa giải có lực kéo mạnh hơn hoặc thay đổi pH

Cơ chế rửa giải bằng cách đồng thời phá vỡ tất cả các tương tác

Có 2 loại trao đổi ion là trao đổi cation và trao đổi anion 23

pKa, pH & trạng thái ion hóa % hợp chất ở trạng thái ion Chức

Acid Base

Trạng thái ion

Anion ((--) Cation (+)

2<

1< at pKa 1> 2>

1 99

9 91

50 50

91 9

Phase

Modification

Key feature

SB (SAX)

quaternary amine

strongly basic anion exchanger

SA (SCX)

benzenesulphonic acid

strongly acidic cation exchanger

PCA (WCX)

propylcarboxylic acid

weakly acidic cation exchanger

PSA

propylsulphonic acid

very strong cation exchanger

99 1

24

Chiết trao đổi cation

Chất trao đổi cation tích điện âm

Chất phân tích mạng điện tích dương

Hình thành liên kết mới

Chất hấp phụ – Benzenesulfonic acid (mạnh) – Propylsulfonic acid (mạnh) – Carboxylic acid (yếu)

Áp dụng: Dược phẩm, thuốc diệt cỏ Phân tích – Amines – Pyrimidines (cations)

Nền mẫu – nước Dung môi rửa giải trung hòa chất phân tích

25

Chiết trao đổi anion

Chất hấp phụ trao đổi anion mang điện tích dương

Chất phân tích có tính axit mang điện tích âm

Hình thành liên kết

Chất hấp phụ – Amin bậc 1, 2 – Aminopropyl (yếu) – Quaternary amine (mạnh) – Diethylamino (yếu) Áp dụng: phosphates, thuốc có tính axit, axit hữu cơ, axit béo, vitamins Phân tích – Phosphates – Carboxylic acids – Sulfonic acids (cations)

Nền mẫu – nước

Dung môi rửa giải có tính axit để trrung hòa chất phân tích

26

CAQAX

Cột trao đổi anion Độ chọn lọc

Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion (Standard anion exchanger carries Cl- )

CHQAX

Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion (Standard anion exchanger carries Cl- )

27

Độ chọn lọc ion Cations Ba2+ 2+

Khả năng thay thế của các ion

Strong Cation Exchanger

SO-3 Si Benzenesulfonic Acid (BCX)

Strong Anion Exchanger +

- Si - (CH2)3 N (CH3)3 Quaternary Amine (QAX)

Ag Pb2+ Hg2+ Cu+ Sr2+ Ca2+ Ni2+ Cd2+ Cu2+ CO2+ Zn2+ Cs2+ Rb+ K+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ NH4+ Na+ H+ Li+

8.7 7.6 7.5 7.2 5.3 4.9 3.9 3.0 2.9 2.9 2.8 2.7 2.7 2.6 2.5 2.5 2.5 2.3 1.9 1.5 1.0 0.8

Anions Benzene Sulfonate Citrate IPhenateHSO4CIO3NO3BrCN HSO BrO NO2 CI HCO3IO33Formate Acetate Propionate FOH -

500 220 175 110 85 74 65 50 28 27 27 24 22 6.0 5.5 4.6 3.2 2.6 1.6 1.0

28

Polymer được thế hóa bề mặt R (-CH-CH2)n-

R

N-CH3 C=O CH3

R

29

Polymer được thế hóa bề mặt R (-CH-CH2)n-

R

N-CH3 C=O CH3

SO3H or CH2N+R3

SO3H or CH2N+R3

Ảnh hưởng của pH đến khả năng thu hồi khi dùng cột SPE 3 4

3 4

5

5

1

2

2

1

pH 6

1 2 3 4 5

Ibuprofen Meprobamate Glutethimide Phenobarbital Phenytoin

pH 5

31

Kỹ thuật

32

Quy trình chiết SPE

Hoạt hóa cột

Đưa mẫu phân tích lên cột

Loại tạp chất

Rửa giải (giải hấp) chất phân tích

33

34

Bước 1

Hoạt

Làm ướt vật liệu nhồi Loại không khí trong các khoảng

trống trong lớp chất của cột

hóa cột sắc ký

Không được để chất trong cột bị

khô …

35

Chất phân tích được đưa lên cột Bước 2

Mẫu phân

Một vài thành phần ảnh hưởng

khác cũng có thể bị giữ lại

tích được

Các thành phần không tương

chảy qua

tác bị loại ra làm sạch chất phân

cột

tích

36

Giữ lại chất phân tích Bước 3

Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng

Nếu mẫu là dung dịch nước, sử

dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ Nếu mẫu hoà tan trong dung

môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi đó

37

Dung môi được chọn đặc trưng

Bước 4

để phá vỡ tương tác giữa chất

Giải hấp

phân tích và chất hấp phụ với

chất phân tích bằng

mục đích rửa giải được chất phân tích với hiệu quả cao Dung môi sử dụng rửa giải đồng

dung môi

thời càng ít chất gây ảnh hưởng

thích hợp

tới phép phân tích càng tốt.

Meprobamate O NH2

C

CH3 O

CH2

C

O CH2 O C NH2

CH3

Polar Drug Copolymeric DAU Column

38

Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi Hexane/Ethyl Acetate

1

Methylene Chloride

2

1

1 2

2

Ibuprofen Meprobamate 39

Amphetamine Structures CH2

CH NH CH3

Amphetamine pKa = 9.9

2

Methamphetamine pKa = 9.9

CH 2

CH NH 2 CH3 CH 3

H H H C C N OH CH3

CH3

Ephedrine pKa = 9.6 40

Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

d-Amphetamine d-Methamphetamine PPA Pseudoephedrine Meperidine Lidocaine PCP Methadone Propoxyphene Cocaine Codeine Diazepam Nordiazepam Chlordiazepoxide

4 2 3 1

Elution: MeCl2 / IPA / NH4OH (78/20/2) 41

Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

d-Amphetamine d-Methamphetamine PPA Pseudoephedrine Meperidine Lidocaine PCP Methadone Propoxyphene Cocaine Codeine Diazepam Nordiazepam Chlordiazepoxide

2

3 4

1

Elution: EA / NH4OH (98/2) 42

Hoạt hóa cột 1. 2 x 2.5 ml MeOH 2. 2 x 2.5 ml đệm phosphat (0.1M, pH 7.0)

ROBINUL (GLYCOPYRROLATE) FROM EQUINE URINE BY SPE-LCMSMS 500 mg / 14 mL

Chuẩn bị mẫu 1. 5 ml nước tiểu + 3 ml đệm phosphate (0,1M , pH 7.0) 2. Thêm 12.5 (ng) of mepenzolate (chuẩn nội) 3. Thêm 5 ml H2O 4. Lắc, ly tâm 5 phút (800v/phút) 5. Đưa dịch trong lên cột SPE

Loại tạp 1. 5 ml MeOH 2. 5 ml H2O

GLYCOPYRROLATE

Rửa giải 4 ml MeOH + 4 ml ammoni acetate (0,5M, pH 3.0)

43

LCMSMS of Glycopyrrolate

44

45

Chuẩn bị mẫu 1 mL sản phẩm rau quả hòa tan trong 2 ml nước.

Ví dụ Chiết nhanh

Điều kiện cột Cột C18 SPE (nhồi khoảng 3ml) được hoạt hóa với 1 mL methanol và một thể tích tương đối nước cất Thêm mẫu/rửa:

hàm lượng chất sơ trong

Đưa mẫu phân tích lên cột khoảng 5 mL, nước cất được sử dụng loại bỏ đường và axit hữu cơ.

Rửa giải:

sản phẩm rau

Chất khô [anthocyanines, flavonoids, tannins and/or alkaloids] được rửa giải với một lượng metanol.Thêm một chút propanol-2 sẽ cho kết quả tót hơn.

Phân tích Dùng quang phổ để phân tích dịch chiết.

Sử dụng bản mỏng TLC.

46

Đưa mẫu lên trên cột tách

47

Rửa loại bỏ chất bẩn

48

Rửa giải

Thảo luận

49

4.1. Phạm vi ứng dụng

Môi trường » Nước, đất

Dược phẩm, y học » Thuốc, nước tiểu, máu

Thực phẩm » Nước hoa quả, bảo quản, sữa

Hóa sinh » Nước, nước tiểu 50

4.2. So sánh phương pháp LLE

SPE

Dùng 200200-500 ml dung môi

Dùng 2 - 20 ml dung môi

Quá trình lắc liên tục

Quá trình lọc

Hình thành nhũ tương

Không hình thành nhũ tương

Độ chọn lọc thấp

Độ chọn lọc cao

Thời gian 1 - 2 giờ / mẫu

Thời gian 10 - 20 phút / mẫu

51

4.2. Ưu điểm

Có tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tích

Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch,

Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,

Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác,

Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích,

Chất chiết pha rắn không đắt (khoảng 50.000 đ.VN/1cột chiết)

52

Ưu điểm

Tinh chế nguyên liệu loại tạp chất

Kết hợp với nhiều phương pháp khác cho kết quả cao: SPE + HPLC, SPE + GCMS

Thu hồi các chất phân tích với hiệu suất cao

Dễ tự động hóa, phù hợp với sắc ky

Giảm lượng dung môi hữu cơ dẫn đến giảm giá thành 53

4.3. Vi chiết pha rắn

54

Khái niệm

Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích X giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau trong đó pha mẫu chứa chất X là chất lỏng, còn pha chiết là chất rắn.

Pha chiết (que chiết) là các hạt chất rắn xốp cỡ hạt vài micromet được tẩm lên thanh que nhỏ kim loại hay PE (1x4mm) tạo thành lớp màng chất chiết dầy khoảng 0,30,5mm bao xung quanh tạo ra que chiết.

Que chiết được để trong hệ xylanh và kim tiêm có thể cắm qua chiết vào qua nút cao su của bình chứa mẫu cần chiết.

55

Kiểu chiết và cơ chế chiết Kiểu chiết

Cơ chế chiết

Không gian mẫu

(chất ở dạng lỏng)

(chất chiết pha thường)

Không gian hơi

(chất dễ hóa hơi)

Hấp phụ pha thường

Hấp phụ pha ngược

(chất chiết pha ngược)

56

Các bước

57

58

59

60

61

62

63

64

65

THANKS!

66

TAX Column % Recovery of Pb at Various Concentrations 120 100 80 60 40 20 0

0.250 ppm

0.050 ppm

1.00 ppm

2.00 ppm

67

Metal Recoveries on Various Phases Cu (ll)

Zn (ll)

As (V)

Sn (Vl)

Se (lV)

Hg (ll)

Cr (lll)

PSA

5.50

4.47

0.00

9.11

23.82

57.07

3.39

BCX--HL BCX

18.01

19.21

0.00

29.43

0.62

58.97

9.81

CCX

0.67

0.03

0.00

16.99

0.00

10.66

0.55

TAX

3.73

3.58

0.00

33.69

0.00

23.97

0.55

THX

10.02

0.78

0.67

29.10

11.42

58.97

0.46

NAX

5.92

2.61

0.00

2.20

21.03

46.80

0.85

68

69

70

71

72

73

74

Solubility Best wash solvents are those in which the compound of interest is insoluble.

Example:Vancomycin Insoluble in Methanol Wash: 100% methanol

Soluble in H2O Elution: 80:20 methanol/H2O 75

Technical Document P-105

Purification of Small Molecule Libraries Desalting Samples Using Pharmasilâ&#x201E;˘ Reverse Phase SPE Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. SPE has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. Samples that have been synthesized in aqueous salt, buffer solutions, or low polarity organic solvents containing salts may require the removal of those salts prior to analysis.

Pharmasil TM Reverse Phase SPE can be used to desalt these libraries.

Application: This application details the use of Pharmasilâ&#x201E;˘ CEC18, a highly loaded reverse phase sorbent, for desalting synthetic mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis salts are sometimes present in the reaction mixtures. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the salts. If the salt is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded reverse phase SPE column to selectively remove the salt from the reaction mixture.

76

Chemistry of Pharmasil™ CEC18 Sorbent Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents CH3 H3C

Si

CH3

O

O

Si

(CH2)17

O H3C

Si

CH3

• Complete removal of salts • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods

CH3

CH3

77

Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasilâ&#x201E;˘ CEC18 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of salts. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using desalting columns is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally molecular. This may require the addition of an acid or base. Desalting can be done out of low polarity organic solvents such as hexane or methylene chloride as long as the compound of interest is protonated.

Column Conditioning Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH to be >9 If sample is an acid, you want the pH to be<2.5 Apply the sample to the column under gravity. The salts will flow through the column and the sample will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the compound of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest recovery. If you think this is a problem use a larger bed mass.

Product Purification Wash the column with 1ml of DI water or hexane.

Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol, ethyl acetate, or the organic solvent of your choice.

78

Technical Document P-102

Purification of Small Molecule Libraries TIN (Sn) Removal by Pharmasilâ&#x201E;˘ Ion Exchange SPE Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.

Application: This application details the use of Pharmasilâ&#x201E;˘ TAX, a highly loaded weak cation exchange sorbent, for the removal of tin catalysts from organic synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis tin compounds are common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.

79

Chemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent COOH

CH2

Si

H2 C

H2 C

H2 C

N

CH2CH2

N(CH2COOH)2

Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents • Complete removal of tin catalyst • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods 80

Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasilâ&#x201E;˘ TAX 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of up to50mg of tin. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of interest is ionized... Tin catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range.

Column Conditioning Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH at 7-8.

If sample is an acid, you want the pH at 3-4.

Sample Application Apply the sample to the column under gravity. The tin will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the tin of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest removal of tin. If you think this is a problem use a larger bed mass.

Product Purification Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.

Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol.

81

Technical Document P-103

Purification of Small Molecule Libraries Palladium (Pd) Removal by Pharmasilâ&#x201E;˘ Ion Exchange SPE Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.

Application: This application details the use of Pharmasilâ&#x201E;˘ TAX, a highly loaded weak cation exchange sorbent, for the removal of palladium catalysts from organic synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis palladium compounds are common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.

82

Chemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent COOH

CH2

Si

H2 C

H2 C

H2 C

N

CH2CH2

N(CH2COOH)2

Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents • Complete removal of palladium catalyst • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods 83

Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasilâ&#x201E;˘ TAX 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of up to50mg of palladium. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample PrePre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of interest is ionized... ionized... Palladium catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range. Adjust the sample to pH 9 with buffer or ammonium hydroxide.

Column Conditioning Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration Condition the column with buffer of pH 9.

Sample Application Apply the sample to the column under gravity. The palladium will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the palladium exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest removal of palladium. If you think this is a problem use a larger bed mass.

Product Purification Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.

Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol.

84

Technical Document PP-104

Purification of Small Molecule Libraries TFAA Removal by Pharmasilâ&#x201E;˘ Ion Exchange SPE

Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.

Application: This application details the use of Pharmasilâ&#x201E;˘ CHQAX, a highly loaded quaternary amine exchange sorbent, for the removal of acid catalysts from organic synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis TFAA is a common catalyst. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the catalyst. If the catalyst is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded quaternary amine exchanger to selectively remove the acid catalyst from the reaction mixture.

85

Chemistry of Pharmasil™ CHQAX Sorbent

Si

H2 C

H2 C

H2 C

+ N

(CH3)3OH

Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents • Complete removal of acid catalyst • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods 86

Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasilâ&#x201E;˘ CHQAX 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of up to 50mg of TFAA. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately.

The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of a pH 7 buffer.

Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of interest is ionized... acid catalysts are strong anions and are charged across the complete pH range.

Column Conditioning Condition the column with 1 ml of methanol followed by 1 ml of DI water.

Column Equilibration Condition the column with pH 7 buffer.

Application Apply the sample to the column under gravity. The TFAA will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the TFAA exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest removal of TFAA. If you think this is a problem use a larger bed mass.

Product Purification Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.

Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol.

87

88