“Ứng dụng của chiết pha rắn SPE trong việc nâng cao kết quả phân tích y dược"
1
Chiết pha rắn là gì?
SPE là một công nghệ chuẩn bị mẫu có sử dụng hạt rắn, vật liệu cơ bản dựa trên nguyên lý của sắc ký, là quá trình phân bố của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu chất mẫu ở dạng lỏng (pha nước, hay hữu cơ), chất chiết ở dạng rắn, dạng hạt nhỏ và xốp đường kính 25 - 70 µm được nhồi trong 1 loại thiết bị cột để tách các thành phần khác nhau của 1 mẫu. chiết pha rắn (Solid Phase Extraction ), hay chiết rắn-lỏng 2
Điều kiện chiết pha rắn SPE
Tính chọn lọc của pha tĩnh chiết. Các chất chiết và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng chiết phải lớn Quá trình chiết phải xẩy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và chất phân tích. Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình chiết bởi bất kỳ từ nguồn nào. Sự chiết phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù hợp, phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện thì càng tốt. 3
Kết hợp SPE với một số thiết bị hiện đại
4
MSMS EIC 20 ng/mL Salbutamol – 1 mL Urine 78:20:2 Elution Solvent (Dichloromethane:Isopropanol:Ammonium Hydroxide)
Relative Abundance
Relative Abundance
Relative Abundance
Relative Abundance
RT: 0.00 - 4.00 NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 cerex
100 80 60 1.90
40 20 0 100
NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 certify
1.97
80 60 40 20 0 100
NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 clean s crn
1.95
80 60
CLEAN SCREEN®
40 20
1.20
0 100
NL: 7.80E6 m/z= 221.60-222.60 F: + c ESI w Full ms2 240.10@32.00 [ 65.00-500.00] MS 81 oas is
80 60 40 20
1.94
0 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 Time (min)
2.5
3.0
3.5
4.0
5
So sánh kết quả thu hồi Benzoylecgonine từ 1ml nước tiểu ngựa ( quá trình làm sạch đường nền bằng chiết pha rắn) 10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS CleanScreen
PC: CONDOA BEG-TMS CleanScreen Abundance
Abundance
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3790.D
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3788.D 6000000
6000000
4000000
4000000
2000000
2000000
Time-->
0 5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
Abundance
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3793.D
6000000
6000000
4000000
4000000
2000000
2000000
Time-->
0 5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
5.00
11.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
PC: CONDOA BEG-TMS Cerex
10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS Cerex Abundance
0 Time-->
12.00
Time-->
Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3795.D
0 5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
6
Kỹ thuật chiết pha rắn được coi là “bước nhảy vọt” trong xử lý mẫu Nội dung 1. Thiết bị SPE 2. Cơ chế SPE 3. Kỹ thuật SPE 4. Tính khả thi của kỹ thuật SPE 7
THIẾT BỊ
8
Cartric, cột nhồi đơn giản
9
Chất nhồi cột SPE
10
Thiết bị đi kèm SPE
11
Thiết bị SPE kết nối
12
Cơ chế
13
2.1. Các kiểu tương tác chính 1. Phân cực 2. Không phân cực 3. Trao đổi ion 4. Cộng hóa trị 5. Liên kết polyme 14
2.2. Phân loại cơ chế Pha thường Pha đảo Cơ chế
Chiết rây phân tử Trao đổi ion
Trao đổi cation Trao đổi anion 15
2.2.1. Chiết pha thường NPE
Tính năng chính pha tĩnh: ái lực mạnh, phân cực (liên kết H)
Liên kết liên quan: pipi-pi và tương tác lưỡng cực
Chất hấp phụ: - silica, diol, diethylamino, cyanopropyl
Ứng dụng tách: - Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates, phenols, vitamins tan trong dầu
Phân tích: - amines, hydroxyls, carbonyls, vòng thơm, các dị tố (O, S, N, P)
Hỗn hợp: - Không phân cực, hữu cơ
Dung môi rửa giải: - Trung bình đến phân cực cao 16
2.2.2. Chiết pha đảo RPE
Tính năng chính pha tĩnh: Kỵ nước, không phân cực
Lực liên kết: Lực Vabvander, lực phân tán
Chất hấp phụ: - C2, C3,C4, iC4, tC4, C5, C6, C7, C8, C10, C12, C18, C20, C30 phenyl, cyclohexyl
Ứng dụng: - Dược phẩm, Thuốc trừ sâu
Phân tích: - Chất trung tính hoặc proton hóa, vòng thơm, chuỗi ankyl
Nền mẫu (maxtric): - Sinh học, nước, dung dịch đệm
Dung môi rửa giải: - Không phân cực đến phân cực yếu 17
Nguyên lý pha đảo
18
2.2.3. Chiết rây phân tử (loại cỡ, gel)
Các chất hấp thu là các hạt silicagen có diện tích bề mặt lớn, trên bề mặt hạt silic, có các mao quản kích thước lỗ lớn, 275275-300A 300Ao.
Áp dụng: dụng: Chiết tách các hợp chất có khối lượng lớn cỡ 2000D 2000 D
Tương tác tác:: Đi vào lỗ xốp nhờ tương tác phân cực, kỵ nước hay trao đổi ion ion.. Thí dụ chất hấp thụ kỵ nước kiểu butyl với hàm lượng Cacbon nạp khoảng 6%, loại khác là có gắn nhóm trao đổi ion –COOH, hàm lượng C khoảng 12 12,,2% 19
Cột chiết C8 và polyme (áp dụng chiết pha đảo đảo))
0
4
8
12
16
20
0
4
8
12
16
Time (minutes)
Time (minutes)
C8 Column
Copolymeric Column
20
20
Ảnh hưởng của độ dài chuỗi (Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE) 4
3.0e
3 2
4
4
3.0e
5
3
4
2
1
1
2.0e
2.0e
4
4
1.0e
1.0e
4
4
0
2
4
0
endogenous peaks: area = 71,628
5
6
8
0
C18 96% 94% 94% 96% 98%
2
4
6
8
0 C2 1 2 3 4 5
Butabarbital Amobarbital Pentobarbital Secobarbital Glutethimide
64% 87% 88% 89% 78%
endogenous peaks: area = 11,257 21
Ảnh hưởng của loại mạch (Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE) 4
4
3.0e 4
5
3.0e
IST D
3 2
4
1
3
2.0e
IST 5 D
2.0e
2
4
4
1
1.0e
1.0e
4
4
0
2
4
6
8
10
0
0
4
6
8
10
0
Cn4
Ct4 Đỉnh nội sinh: area = 1,336
2
28% 73% 84% 98% 70%
1 2 3 4 5
Butabarbital Amobarbital Pentobarbital Secobarbital Glutethimide
93% 97% 98% 98% 96%
Đỉnh nội sinh area = 18,271
22
2.2.4. Cơ chế trao đổi ion
Tương tác ion xảy ra giữa chất hấp phụ và chất phân tích
Duy trì pH thích hợp cho quá trình phân tích
Liên kết ion đủ mạnh, giữ lại chất phân tích
Loại bỏ các chất bẩn bằng dung môi thích hợp
Dung môi rửa giải có lực kéo mạnh hơn hoặc thay đổi pH
Cơ chế rửa giải bằng cách đồng thời phá vỡ tất cả các tương tác
Có 2 loại trao đổi ion là trao đổi cation và trao đổi anion 23
pKa, pH & trạng thái ion hóa % hợp chất ở trạng thái ion Chức
Acid Base
Trạng thái ion
Anion ((--) Cation (+)
2<
1< at pKa 1> 2>
1 99
9 91
50 50
91 9
Phase
Modification
Key feature
SB (SAX)
quaternary amine
strongly basic anion exchanger
SA (SCX)
benzenesulphonic acid
strongly acidic cation exchanger
PCA (WCX)
propylcarboxylic acid
weakly acidic cation exchanger
PSA
propylsulphonic acid
very strong cation exchanger
99 1
24
Chiết trao đổi cation
Chất trao đổi cation tích điện âm
Chất phân tích mạng điện tích dương
Hình thành liên kết mới
Chất hấp phụ – Benzenesulfonic acid (mạnh) – Propylsulfonic acid (mạnh) – Carboxylic acid (yếu)
Áp dụng: Dược phẩm, thuốc diệt cỏ Phân tích – Amines – Pyrimidines (cations)
Nền mẫu – nước Dung môi rửa giải trung hòa chất phân tích
25
Chiết trao đổi anion
Chất hấp phụ trao đổi anion mang điện tích dương
Chất phân tích có tính axit mang điện tích âm
Hình thành liên kết
Chất hấp phụ – Amin bậc 1, 2 – Aminopropyl (yếu) – Quaternary amine (mạnh) – Diethylamino (yếu) Áp dụng: phosphates, thuốc có tính axit, axit hữu cơ, axit béo, vitamins Phân tích – Phosphates – Carboxylic acids – Sulfonic acids (cations)
Nền mẫu – nước
Dung môi rửa giải có tính axit để trrung hòa chất phân tích
26
CAQAX
Cột trao đổi anion Độ chọn lọc
Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion (Standard anion exchanger carries Cl- )
CHQAX
Silica Backbone Quaternary Amine anion exchanger Acetate counter ion (Standard anion exchanger carries Cl- )
27
Độ chọn lọc ion Cations Ba2+ 2+
Khả năng thay thế của các ion
Strong Cation Exchanger
SO-3 Si Benzenesulfonic Acid (BCX)
Strong Anion Exchanger +
- Si - (CH2)3 N (CH3)3 Quaternary Amine (QAX)
Ag Pb2+ Hg2+ Cu+ Sr2+ Ca2+ Ni2+ Cd2+ Cu2+ CO2+ Zn2+ Cs2+ Rb+ K+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ NH4+ Na+ H+ Li+
8.7 7.6 7.5 7.2 5.3 4.9 3.9 3.0 2.9 2.9 2.8 2.7 2.7 2.6 2.5 2.5 2.5 2.3 1.9 1.5 1.0 0.8
Anions Benzene Sulfonate Citrate IPhenateHSO4CIO3NO3BrCN HSO BrO NO2 CI HCO3IO33Formate Acetate Propionate FOH -
500 220 175 110 85 74 65 50 28 27 27 24 22 6.0 5.5 4.6 3.2 2.6 1.6 1.0
28
Polymer được thế hóa bề mặt R (-CH-CH2)n-
R
N-CH3 C=O CH3
R
29
Polymer được thế hóa bề mặt R (-CH-CH2)n-
R
N-CH3 C=O CH3
SO3H or CH2N+R3
SO3H or CH2N+R3
Ảnh hưởng của pH đến khả năng thu hồi khi dùng cột SPE 3 4
3 4
5
5
1
2
2
1
pH 6
1 2 3 4 5
Ibuprofen Meprobamate Glutethimide Phenobarbital Phenytoin
pH 5
31
Kỹ thuật
32
Quy trình chiết SPE
Hoạt hóa cột
Đưa mẫu phân tích lên cột
Loại tạp chất
Rửa giải (giải hấp) chất phân tích
33
34
Bước 1
Hoạt
Làm ướt vật liệu nhồi Loại không khí trong các khoảng
trống trong lớp chất của cột
hóa cột sắc ký
Không được để chất trong cột bị
khô …
35
Chất phân tích được đưa lên cột Bước 2
Mẫu phân
Một vài thành phần ảnh hưởng
khác cũng có thể bị giữ lại
tích được
Các thành phần không tương
chảy qua
tác bị loại ra làm sạch chất phân
cột
tích
36
Giữ lại chất phân tích Bước 3
Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng
Nếu mẫu là dung dịch nước, sử
dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước-dung môi hữu cơ Nếu mẫu hoà tan trong dung
môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi đó
37
Dung môi được chọn đặc trưng
Bước 4
để phá vỡ tương tác giữa chất
Giải hấp
phân tích và chất hấp phụ với
chất phân tích bằng
mục đích rửa giải được chất phân tích với hiệu quả cao Dung môi sử dụng rửa giải đồng
dung môi
thời càng ít chất gây ảnh hưởng
thích hợp
tới phép phân tích càng tốt.
Meprobamate O NH2
C
CH3 O
CH2
C
O CH2 O C NH2
CH3
Polar Drug Copolymeric DAU Column
38
Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi Hexane/Ethyl Acetate
1
Methylene Chloride
2
1
1 2
2
Ibuprofen Meprobamate 39
Amphetamine Structures CH2
CH NH CH3
Amphetamine pKa = 9.9
2
Methamphetamine pKa = 9.9
CH 2
CH NH 2 CH3 CH 3
H H H C C N OH CH3
CH3
Ephedrine pKa = 9.6 40
Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
d-Amphetamine d-Methamphetamine PPA Pseudoephedrine Meperidine Lidocaine PCP Methadone Propoxyphene Cocaine Codeine Diazepam Nordiazepam Chlordiazepoxide
4 2 3 1
Elution: MeCl2 / IPA / NH4OH (78/20/2) 41
Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
d-Amphetamine d-Methamphetamine PPA Pseudoephedrine Meperidine Lidocaine PCP Methadone Propoxyphene Cocaine Codeine Diazepam Nordiazepam Chlordiazepoxide
2
3 4
1
Elution: EA / NH4OH (98/2) 42
Hoạt hóa cột 1. 2 x 2.5 ml MeOH 2. 2 x 2.5 ml đệm phosphat (0.1M, pH 7.0)
ROBINUL (GLYCOPYRROLATE) FROM EQUINE URINE BY SPE-LCMSMS 500 mg / 14 mL
Chuẩn bị mẫu 1. 5 ml nước tiểu + 3 ml đệm phosphate (0,1M , pH 7.0) 2. Thêm 12.5 (ng) of mepenzolate (chuẩn nội) 3. Thêm 5 ml H2O 4. Lắc, ly tâm 5 phút (800v/phút) 5. Đưa dịch trong lên cột SPE
Loại tạp 1. 5 ml MeOH 2. 5 ml H2O
GLYCOPYRROLATE
Rửa giải 4 ml MeOH + 4 ml ammoni acetate (0,5M, pH 3.0)
43
LCMSMS of Glycopyrrolate
44
45
Chuẩn bị mẫu 1 mL sản phẩm rau quả hòa tan trong 2 ml nước.
Ví dụ Chiết nhanh
Điều kiện cột Cột C18 SPE (nhồi khoảng 3ml) được hoạt hóa với 1 mL methanol và một thể tích tương đối nước cất Thêm mẫu/rửa:
hàm lượng chất sơ trong
Đưa mẫu phân tích lên cột khoảng 5 mL, nước cất được sử dụng loại bỏ đường và axit hữu cơ. Rửa giải:
sản phẩm rau
Chất khô [anthocyanines, flavonoids, tannins and/or alkaloids] được rửa giải với một lượng metanol.Thêm một chút propanol-2 sẽ cho kết quả tót hơn. Phân tích Dùng quang phổ để phân tích dịch chiết. Sử dụng bản mỏng TLC.
46
Đưa mẫu lên trên cột tách
47
Rửa loại bỏ chất bẩn
48
Rửa giải
Thảo luận
49
4.1. Phạm vi ứng dụng
Môi trường » Nước, đất
Dược phẩm, y học » Thuốc, nước tiểu, máu
Thực phẩm » Nước hoa quả, bảo quản, sữa
Hóa sinh » Nước, nước tiểu 50
4.2. So sánh phương pháp LLE
SPE
Dùng 200200-500 ml dung môi
Dùng 2 - 20 ml dung môi
Quá trình lắc liên tục
Quá trình lọc
Hình thành nhũ tương
Không hình thành nhũ tương
Độ chọn lọc thấp
Độ chọn lọc cao
Thời gian 1 - 2 giờ / mẫu
Thời gian 10 - 20 phút / mẫu
51
4.2. Ưu điểm
Có tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tích
Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch,
Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,
Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác,
Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích,
Chất chiết pha rắn không đắt (khoảng 50.000 đ.VN/1cột chiết)
52
Ưu điểm
Tinh chế nguyên liệu loại tạp chất
Kết hợp với nhiều phương pháp khác cho kết quả cao: SPE + HPLC, SPE + GCMS
Thu hồi các chất phân tích với hiệu suất cao
Dễ tự động hóa, phù hợp với sắc ky
Giảm lượng dung môi hữu cơ dẫn đến giảm giá thành 53
4.3. Vi chiết pha rắn
54
Khái niệm
Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích X giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau trong đó pha mẫu chứa chất X là chất lỏng, còn pha chiết là chất rắn.
Pha chiết (que chiết) là các hạt chất rắn xốp cỡ hạt vài micromet được tẩm lên thanh que nhỏ kim loại hay PE (1x4mm) tạo thành lớp màng chất chiết dầy khoảng 0,30,5mm bao xung quanh tạo ra que chiết.
Que chiết được để trong hệ xylanh và kim tiêm có thể cắm qua chiết vào qua nút cao su của bình chứa mẫu cần chiết.
55
Kiểu chiết và cơ chế chiết Kiểu chiết
Cơ chế chiết
Không gian mẫu
(chất ở dạng lỏng)
(chất chiết pha thường)
Không gian hơi
(chất dễ hóa hơi)
Hấp phụ pha thường
Hấp phụ pha ngược
(chất chiết pha ngược)
56
Các bước
57
58
59
60
61
62
63
64
65
THANKS!
66
TAX Column % Recovery of Pb at Various Concentrations 120 100 80 60 40 20 0
0.250 ppm
0.050 ppm
1.00 ppm
2.00 ppm
67
Metal Recoveries on Various Phases Cu (ll)
Zn (ll)
As (V)
Sn (Vl)
Se (lV)
Hg (ll)
Cr (lll)
PSA
5.50
4.47
0.00
9.11
23.82
57.07
3.39
BCX--HL BCX
18.01
19.21
0.00
29.43
0.62
58.97
9.81
CCX
0.67
0.03
0.00
16.99
0.00
10.66
0.55
TAX
3.73
3.58
0.00
33.69
0.00
23.97
0.55
THX
10.02
0.78
0.67
29.10
11.42
58.97
0.46
NAX
5.92
2.61
0.00
2.20
21.03
46.80
0.85
68
69
70
71
72
73
74
Solubility Best wash solvents are those in which the compound of interest is insoluble.
Example:Vancomycin Insoluble in Methanol Wash: 100% methanol
Soluble in H2O Elution: 80:20 methanol/H2O 75
Technical Document P-105
Purification of Small Molecule Libraries Desalting Samples Using Pharmasil™ Reverse Phase SPE Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. SPE has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. Samples that have been synthesized in aqueous salt, buffer solutions, or low polarity organic solvents containing salts may require the removal of those salts prior to analysis. Pharmasil TM Reverse Phase SPE can be used to desalt these libraries. Application: This application details the use of Pharmasil™ CEC18, a highly loaded reverse phase sorbent, for desalting synthetic mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis salts are sometimes present in the reaction mixtures. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the salts. If the salt is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded reverse phase SPE column to selectively remove the salt from the reaction mixture. 76
Chemistry of Pharmasil™ CEC18 Sorbent Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents CH3 H3C
Si
CH3
O
O
Si
(CH2)17
O H3C
Si
CH3
• Complete removal of salts • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods
CH3
CH3
77
Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasil™ CEC18 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of salts. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method. Sample Pre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using desalting columns is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally molecular. This may require the addition of an acid or base. Desalting can be done out of low polarity organic solvents such as hexane or methylene chloride as long as the compound of interest is protonated. Column Conditioning Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water. Column Equilibration Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH to be >9 If sample is an acid, you want the pH to be<2.5 Apply the sample to the column under gravity. The salts will flow through the column and the sample will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the compound of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest recovery. If you think this is a problem use a larger bed mass. Product Purification Wash the column with 1ml of DI water or hexane.
Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol, ethyl acetate, or the organic solvent of your choice.
78
Technical Document P-102
Purification of Small Molecule Libraries TIN (Sn) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule. Application: This application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loaded weak cation exchange sorbent, for the removal of tin catalysts from organic synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis tin compounds are common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.
79
Chemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent COOH
CH2
Si
H2 C
H2 C
H2 C
N
CH2CH2
N(CH2COOH)2
Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents • Complete removal of tin catalyst • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods 80
Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasil™ TAX 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of up to50mg of tin. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method. Sample Pre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of interest is ionized... Tin catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range. Column Conditioning Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water. Column Equilibration Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH at 7-8. If sample is an acid, you want the pH at 3-4. Sample Application Apply the sample to the column under gravity. The tin will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the tin of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest removal of tin. If you think this is a problem use a larger bed mass. Product Purification Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration. Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol.
81
Technical Document P-103
Purification of Small Molecule Libraries Palladium (Pd) Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule. Application: This application details the use of Pharmasil™ TAX, a highly loaded weak cation exchange sorbent, for the removal of palladium catalysts from organic synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis palladium compounds are common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tin catalyst from the reaction mixture.
82
Chemistry of Pharmasil™ TAX Sorbent COOH
CH2
Si
H2 C
H2 C
H2 C
N
CH2CH2
N(CH2COOH)2
Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents • Complete removal of palladium catalyst • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods 83
Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasil™ TAX 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of up to50mg of palladium. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method. Sample PrePre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of interest is ionized... ionized... Palladium catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range. Adjust the sample to pH 9 with buffer or ammonium hydroxide. Column Conditioning Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water. Column Equilibration Condition the column with buffer of pH 9. Sample Application Apply the sample to the column under gravity. The palladium will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the palladium exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest removal of palladium. If you think this is a problem use a larger bed mass. Product Purification Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration. Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol.
84
Technical Document PP-104
Purification of Small Molecule Libraries TFAA Removal by Pharmasil™ Ion Exchange SPE
Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule. Application: This application details the use of Pharmasil™ CHQAX, a highly loaded quaternary amine exchange sorbent, for the removal of acid catalysts from organic synthesis mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis TFAA is a common catalyst. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the products of the reaction from the catalyst. If the catalyst is not removed it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can be done using a highly loaded quaternary amine exchanger to selectively remove the acid catalyst from the reaction mixture. 85
Chemistry of Pharmasil™ CHQAX Sorbent
Si
H2 C
H2 C
H2 C
+ N
(CH3)3OH
Advantages of Pharmasil™ Based Sorbents • Complete removal of acid catalyst • Clean background • High recoveries • High levels of purification of anaytes • Applicable to a broad range of compounds • Simple easy to develop methods 86
Purification Profile This profile is based on the use of a Pharmasil™ CHQAX 500 mg column (columns are available with varying volumes). This column is capable of removal of up to 50mg of TFAA. The method can be scaled up as necessary by using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately. The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method. Sample Pre-treatment Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of a pH 7 buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound of interest is ionized... acid catalysts are strong anions and are charged across the complete pH range. Column Conditioning Condition the column with 1 ml of methanol followed by 1 ml of DI water. Column Equilibration Condition the column with pH 7 buffer. Application Apply the sample to the column under gravity. The TFAA will stick to the column. The volume of the sample is not important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity of the sorbent. If the concentration of the TFAA exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest removal of TFAA. If you think this is a problem use a larger bed mass. Product Purification Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration. Product Elution Elute compound of interest with 1ml of methanol.
87
88