BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐẠO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC
BÀI TẬP MÔN HỌC ĐỀ TÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ NHANH SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: Hóa Công nghệ - Môi trường
Người hướng dẫn khoa học : Cô Phạm Thanh Nga Sinh viên
: Phạm Đăng Tuyên
Lớp
: K63B
Hà Nội - 2016
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Ơ
N
Mục lục
H
Trang Chuẩn bị mẫu: .................................................................................................................................3
U Y
N
I.
Lấy mẫu: .......................................................................................................................................3
2.
Pha loãng mẫu: ............................................................................................................................4
TP
.Q
1.
II.
Phương pháp định lượng vi sinh vật: ........................................................................................5
Nguyên tắc: ...............................................................................................................................5
b.
Phương pháp tiến hành:............................................................................................................5
c.
Ưu – nhược điểm: .................................................................................................................. 11
H Ư
N
G
Đ
a.
Phương pháp đo mật độ quang ................................................................................................ 11
TR ẦN
2.
Nguyên tắc: ............................................................................................................................ 11
b.
Cách tiến hành: ...................................................................................................................... 13
c.
Ưu – nhược điểm: .................................................................................................................. 14
10 00
B
a.
Phương pháp đo sinh khối: ...................................................................................................... 15 3.1.
Phương pháp đếm và xác định thể tích tế bào: .................................................................. 15
3.2.
Phương pháp xác định hàm lượng sắc tố chlorophyll a: ................................................... 17
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
3.
ẠO
Phương pháp đếm trực tiếp: ........................................................................................................5
A
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
1.
2
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
N
H
Ơ
N
Nghiên cứu các phương pháp đánh giá nhanh sinh trưởng của vi tảo trong điều kiện phòng thí nghiệm
I. Chuẩn bị mẫu:
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
Trong quá trình nuôi cấy, nghiên cứu vi sinh vật, việc đánh giá sinh trưởng của VSV là một công đoạn cần thiết. Có nhiều phương pháp giúp chúng ta ghi nhận các thông số của quá trình sinh trưởng ở VSV, với nguyên tắc chung nhất là dựa vào sự biến đổi số lượng, chất lượng VSV trong điều kiện nuôi cấy. Với yêu cầu cụ thể là đánh giá nhanh sinh trưởng của VSV, phòng thí nghiệm thường sử dụng một số phương pháp như: đếm trực tiếp trong buồng đếm (đếm tế bào), đo độ đục (mật độ quang – OD), đo sinh khối tế bào, đo gián tiếp nồng độ một số chất trong môi trường nuôi cấy, …v.v. Mỗi phương pháp có nhưng ưu nhược điểm riêng, phù hợp với từng điều kiện, từng trường hợp cụ thể.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
Trước khi tiến hành các phương pháp định lượng VSV thông thường phải thực hiện việc chuẩn bị mẫu: gồm thao tác lấy mẫu và pha loãng mẫu: 1. Lấy mẫu: Việc lấy mẫu có một số yêu cầu về khối lượng và số lượng để đảm bảo phù hợp với mục đích: − Lấy mẫu có tính chất đại diện − Lấy mẫu với lượng vừa phải, đủ để thực hiện phân tích các đặc tính lý hóa sinh − Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng − Lấy mẫu xong cần phân tích ngay, nếu ở nhiệt độ thường không để quá 30’, nếu hạ nhiệt độ xuống 0-5oC có thể để lâu hơn nhưng không để quá 24h − Mẫu phải có nhãn ghi vào sổ đặc điểm của mẫu cũng như nơi thu mẫu. Trên nhãn cần ghi thông tin sau: • Mã số mẫu • Loại và mục đích lấy mẫu • Tên và chức năng người lấy mẫu 3
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
• Yêu câu phân tích 2. Pha loãng mẫu:
N
H
Ơ
Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước cất vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút (1ml) vô trùng.
N
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
U Y
− Mẫu ở trạng thái lỏng :
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân:
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
Dùng pipet lấy 1ml dung dịch từ ống nuôi cấy gốc ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, ta được dung dịch có nồng độ bằng 10-1 dung dịch gốc (hay dung dịch có độ pha loãng 101 hoặc hệ số pha loãng 10-1) Dùng pipet lấy 1ml dung dịch có độ pha loãng 101 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta được dung dịch có độ pha loãng 102 (hoặc hệ số pha loãng 10-2). Tiếp tục như vậy ta được các dung dịch có độ pha loãng cao hơn − Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm) − Chuẩn bị 2 bình hình nón có dung tích 250 ml + Bình 1 chứa 90ml nước cất vô trùng + Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
− Khử trùng cối chày sứ bằng cách cho một ít cồn vào và đốt lên. Sau đó để nguội. − Cân 1 g đất (hoặc mẫu) cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu. − Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2. 4
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
N
H
Ơ
N
− Lắc 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng thái lỏng. − Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít
U Y
Sau khi có mẫu, bắt đầu tiến hành các phương pháp phân tích lí hóa sinh.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
II. Phương pháp định lượng vi sinh vật: 1. Phương pháp đếm trực tiếp: a. Nguyên tắc: − Sử dụng kính hiển vi quan sát mẫu VSV trên các buồng đếm, đếm trực tiếp số lượng tế bào vi khuẩn trong một thể tích phòng đếm, kết hợp với độ pha loãng để tính toán được mật độ tế bào trong dung dịch ban đầu.Đối với tế bào động vật nguyên sinh ta có thể dùng phòng đếm PetroffHausser, còn với các tế bào sinh vật nhân nguyên thủy và nhân chuẩn ta thường dùng phòng đếm Neubauer-Thomas (phòng đếm hồng cầu) để đếm. Với các tế bào sinh vật nhân sơ thường có thể nhuộm màu hoặc sử dụng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phaseconstrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát. − Có thể đếm số lượng tế bào VSV theo phương pháp đếm trực tiếp trên lam phết kính(Breed). Nguyên tắc đếm trực tiếp số tế bào trên một vi trường, lặp lại nhiều lần để có được số tế bào trung bình, kết hợp với diện tích một vi trường cùng độ pha loãng để tính toán ra mật độ VSV trong mẫu gốc. − Ngoài ra có thể sử dụng máy đếm điện tử Coulter Counter. Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thi cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên (hoặc tinh dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tin hiệu điện, máy đếm sẽ tự động ghi số. b. Phương pháp tiến hành: ∗ Phương pháp đếm trực tiếp trên lam phết kính: Tiêu bản VSV đã được nhuộm màu (nhuộm đơn) − Phết kính:
5
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
+ Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm2, ở mặt trên lam. Mục đích không cho vi sinh vật lan ra khỏi diện tích đếm. + Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam. + Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông. + Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen. + Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100. − Cách đếm: + Đếm số tế bào VSV trên 1 đơn vị vi trường (VT) + Đếm hết tất cả 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính
Sơ đồ di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính để đếm số VSV/1VT
6
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
N
. .
X là số vi khuẩn đếm được trong một V
N
Trong đó:
.
Ơ
Số tế bào/1ml mẫu =
H
− Công thức tính mật độ tế bào trong mẫu:
là diện tích 1 vi trường, πR2=0.0004mm2
ẠO
=> số lượng vi trường có trong S
TP
S
.Q
U Y
S là diện tích hình vuông phết kính (400mm2)
N
G
H là hệ số pha loãng mẫu
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
V là thể tích giọt vi khuẩn phết kính
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
∗ Phương pháp đếm trực tiếp trong buồng đếm: Để quan sát vi tảo thông thường sẽ sử dụng buồng đếm hồng ngoại. − Cấu tạo buồng đếm: + Buồng đếm là một phiến kính trong, dày từ 2-3mm, hình chữ nhật + Giữa phiến kính là một phần lõm phẳng làm đĩa đếm, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ, xung quanh có một rãnh nhỏ. Đĩa đếm thấp hơn bề mặt phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi phủ lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2. Bên ngoài buồng đếm có ghi tên loại buồng đếm và một số thông số kĩ thuật đặc trưng:
Cấu tạo buồng đếm
7
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
− Cấu tạo khung đếm đĩa đếm: khung đếm thường có cấu tạo + Trường hợp 1: khung đếm có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ. Một khung do đó có 400 ô nhỏ + Trường hợp 2: khung đếm có 25 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ. Một khung do đó có 400 ô nhỏ + Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400mm2 Vậy thể tích 1 ô nhỏ là V= 0.1mm x 1/400mm2 = 1/4000mm3
Cấu tạo khung đếm
8
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
− Cách tiến hành: + Trước khi tiến hành quan sát cần cho thêm vài giọt fomalin vào trong mẫu, trộn đều + Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm + Lắc mạnh dịch huyền phù đã pha loãng, sau đó dùng pipet hút dung dịch mẫu đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu. + Dùng đầu pipet đặt vào cạnh buồng đếm tiếp giáp lammen kính, dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt. + Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn sang các khoang. Khi đó dịch trong khoang có độ dày 0.1mm + Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm + Thao tác, điều chỉnh kính hiển vi, ban đầu dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó sử dụng vật kính x40 để quan sát và đếm. Chú ý bắt đầu đếm sau khi nhỏ giọt dung dịch từ 3-5’ + Đếm số tế bào có trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh và 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm các tế bào ở cạnh bên trên và bên phải ô + Đếm tất cả 80 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH1: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ) + Đếm tất cả 125 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH2: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ)
9
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
B
Thao tác thực hiện đếm số tế bào
10 00
− Công thức tính:
.
a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ V là thể tích của 1 ô nhỏ (tính theo ml) H là hệ số pha loãng
H
-L
Í-
Trong đó:
Ó
A
Số tế bào/1ml mẫu =
ÁN
− Một số chú ý:
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
+ Nên tiến hành nhuộm màu tiêu bản (methylen blue) để dễ quan sát và đếm chính xác + Nồng độ dịch huyền phù pha loãng thích hợp sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không úa 10 tế bào + Sử dụng buồng đếm xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô + Để đạt độ chính xác cao, mật độ trung bình của tế bào đếm được trong 1 ô nhỏ vào khoảng 2.5 < a < 10 10
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
TP
.Q
+ Dễ nhầm lẫn tế bào VSV với các dị thể trong mẫu
U Y
+ Không nhận biết được tế bào VSV sống và các tế bào chết
N
H
Ơ
N
c. Ưu – nhược điểm: − Ưu điểm: phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm là có thể nhanh chóng xác định được nhanh chóng mật độ VSV trong mẫu, thao tác đơn giản − Nhược điểm:
+ Độ chính xác ở mức tương đối
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
+ Không phù hợp với huyền phù VSV có mật độ thấp
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
2. Phương pháp đo mật độ quang a. Nguyên tắc: Số lượng VSV có trong mẫu có thể được xác định gián tiếp thông qua phương pháp đo độ đục hay đo mật độ quang. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sự tương quan giữa nồng độ, hay mật độ tế bào VSV và số lượng photon trong ánh sáng bị phân tán (thông thường với các mẫu không quá đậm đặc thì mật độ VSV tỉ lệ thuận với số photon bị phân tán). Việc đo độ đục có thể tiến hành theo 3 cách đó là: đo bằng quang phổ kế, dùng máy đếm điện tử và sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau. − Với việc đo bằng quang phổ kế: + Sử dụng chùm sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa VSV cần đo. Các tế bào VSV trong huyền phù sẽ làm phân tán bớt chùm tia sáng, tùy theo số lượng nhiều hay ít của chúng trong mẫu. Số tia sáng còn lại đi qua mẫu sẽ kích thích một tế bào quang điện. Cường độ chùm sáng đi qua sẽ làm dịch chuyển cây kim trên thước đo, cho ta biết phần trăm ánh sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị. Từ kết quả thu được ta mang đối chiếu với một bảng chuẩn và kết hợp với độ pha loãng để biết được mật độ VSV trong mẫu.
11
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
H Ư
N
G
Đ
+ Lượng ánh sáng truyền qua mấu sinh khối tỉ lệ thuận với lượng tế bào và có thể tính theo công thức sau: T=
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
T là độ truyền ánh sáng Trong đó: I là ánh sáng truyền tới mẫu & I là ánh sáng đi tới thiết bị phát hiện + Để có được đơn vị đo thích hợp, người ta sử dụng đơn vị hấp thụ ánh sáng của vật chất A (Absorance) thay cho đơn vị truyền ánh sáng T. Ta có mối liên hệ: ' = − log[,]
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
+ Độ hấp thụ tăng tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Thuật ngữ độ hấp thụ (A) còn được gọi là mật độ quang (OD) − Cách đo thứ 2 là sử dụng máy đếm điện tử, có thể đo được hàng ngàn tế bào trong vòng vài giây. Nguyên tắc của phép đo này là tế bào được đưa qua tia sáng của máy điện tử, VSV cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ đếm của máy. − Cách thứ 3 là sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm Macfaland). Một dãy ống nghiệm chứa BaSO4 có độ pha loãng khác nhau tương ứng với độ pha loãng có bảng đối chiếu của nồng độ vi khuẩn tương ứng. Đối chiếu độ đục của ống nghiệm chứa mẫu cần đo với dãy ống
12
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
nghiệm Macfaland, sau đó đối chiếu với bảng ta sẽ biết được nồng độ của vi khuẩn tương ứng. b. Cách tiến hành: ∗ Phương pháp đo bằng quang phổ kế: Tế bào VSV có chứa nhiều phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng khác nhau (AND từ 254-260nm; protein 280nm; xitocrom 400-500nm…) Khi đo độ đục tế bào người ta thường chọn các bước sóng có độ hấp thụ nhỏ, hay dùng nhất là bước sóng 600-620nm. Tùy vào đối tượng mang đo mà ta chọn bước sóng cho phù hợp. Bên cạnh đó, do sự ảnh hưởng của thành phần bên trong tế bào đối với sự khuếch tán hay hấp thụ ánh sáng mà phương pháp này có tính đặc thù riêng với mỗi loại VSV. Tiến hành đo: − Lấy 1 ống nghiệm chứa mẫu VSV cần đo và 4 ống nghiệm vô trùng, tiến hành pha loãng theo dãy thập phân. − Chuẩn bị máy quang phổ đo độ đục, có thể sử dụng máy quang phổ đơn giản hoặc máy quang phổ UV-vis − Tiến hành đo độ đục của các mẫu đã pha loãng trên quang phổ kế ở 620nm, ứng với mỗi độ pha loãng mẫu sẽ thu được một giá trị OD. Theo định luật Lambert thì độ hấp thụ chỉ tỉ lệ thuận với mật độ VSV trong khoảng giá trị từ 0.1-0.8. Nếu lớn hơn 0.8 thì mật độ vật chất cao, các VSV sẽ tạo ra các bóng che khuất nhau làm cho sai lệch kết quả. − Song song với việc đo độ đục cần tiến hành nuôi cấy và đếm số lượng tế bào ở các độ pha loãng tương ứng trên môi trường thạch, từ đó thiết lập hàm tương quan giữa độ hấp thụ và số lượng tế bào sống. Hàm có dạng bậc nhất: A = a.log . + b y là mật độ quang 2OD5của mẫu VSV tại bước sóng đo & Trong đó:
x là số tế bào VSV a, b là các hệ số tương quan − Sau khi xây dựng được hàm tương quan, các lần đo tiếp theo ta chỉ cần đo giá trị mật độ quang (OD) rồi sau đó dựa vào hàm tương quan để tính toán ra mật độ VSV trong mẫu
13
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
∗ Phương pháp dãy ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm Macfaland) − Dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau. Nhỏ vào mỗi ống một lượng dung dịch BaCl2 theo thứ tự từ ống 1 đến ống 10, ống 1 nhỏ 0,1ml, ống 2 nhỏ 0,2ml,.. cứ thế đến ống 10 là 1ml. Tiếp theo cho vào mỗi ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 và hàn kín miệng ống. − Lấy ống nghiệm chứa mẫu cần đo cho vào máy li tâm, gạn rửa. Cho nước cất vào tiếp tục li tâm, gạn rửa 2-3 lần nữa. Cuối cùng cho nước cất vào một lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy. − Đặt ống nghiệm chứa VSV đã gạn rửa vào giữa 2 ống Macfaland áng chừng có màu tương tự. Số lượng VSV có trong 1ml dung dịch sẽ nằm trong khoảng 2 mức chuẩn của ống Macfaland.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
c. Ưu – nhược điểm: − Ưu điểm: phương pháp đo mật độ quang cho kết quả nhanh chóng, dễ dàng, phương pháp đo với máy quang phổ thường được ứng dụng để theo dõi, nghiên cứu sự sinh trưởng của VSV trong PTN hoặc trong sản xuất. Việc đo độ đục với máy quang phổ có thể phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. − Nhược điểm: + Phương pháp đo với máy quang phổ dễ bị sai số do thao tác và sai số của máy đo + Phương pháp dãy ống nghiệm Macfaland cho kết quả rơi vào một khoảng, không phải mật độ cụ thể 14
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Ơ
N
+ Cần lưu ý khi pha loãng mẫu để đo trên máy quang phổ cần pha sao cho OD rơi vào khoảng <0.8
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
3. Phương pháp đo sinh khối: Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng về số lượng cá thể trong quần thể, khi số lượng tăng lên sẽ đi kèm với sự tăng lên của sinh khối. Mặt khác, hàm lượng độc tố có liên quan mật thiết với lượng chất khô trong mẫu hơn là số lượng cá thể, nên số lượng cá thể chưa phải là thước đo lý tưởng để đánh giá kích thước quần thể hay độc tính tiềm tàng. Do đó, trong nghiên cứu thường sử dụng phương pháp đo sinh khối vi sinh vật. Có 2 phương pháp đo sinh khối là đếm số lượng tế bào và xác định hàm lượng sắc tố. 3.1. Phương pháp đếm và xác định thể tích tế bào: Nguyên tắc: − Thể tích sinh học (biovolume) có thể đạt được từ số lượng tế bào bằng cách xác định thể tích trung bình của tế bào từng loài hay đơn vị đếm rồi nhân với số lượng tế bào hiện có trong mẫu. Kết quả là tổng thể tích của mỗi loài. − Với tế bào phù du thì 1mm3 được coi là 1mg, thể tích sinh học tương ứng với sinh khối. − Thể tích trung bình xác định bằng cách giả dịnh một kiểu hình học cho mỗi loài (đối với tế bào Microcystis được coi là hình cầu), đo độ dài hình học của 20-30 tế bào (phụ thuộc độ biến động) của loài và tính toán thể tích trung bình tương ứng.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
Ví dụ: để xác định 20 tế bào Microcystis, có đường kính trung bình là 5µm. Với giả định dạng hình học của tế bào là hình cầu ta sẽ tính được thể tích tế bào trung bình là 4/3πr3 = 65,4µm3. Theo thống kê có khoảng 1 triệu tế bào trong 1mL như vậy tổng thể tích sinh học là 65,4.106µm3mL-1 Xét ví dụ 2: Đo 30 tế bào hình sợi Planktothrix cho kết quả chiều dài trung bình là 225µm và đường kính trung bình là 6µm. Giả định tế bào có hình trụ, khi đó thể tích trung bình là 2πr2.L=6,359µm3. Thống kê cho thấy có khoảng 10000
15
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
tế bào sợi trong 1mL. Như vậy thể tích sinh học của Planktothrix là 63,6.106µm3mL-1.
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
Hình ảnh tế bào Microcystis
Hình ảnh tế bào sợi Planktothrix
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
Công thức tính thể tích tế bào hình cầu (V là thể tích tế bào hình câu; A là diện tích bề mặt; r là bán kính mặt cắt; d là đường kính mặt cắt)
Công thức thể tích tế bào hình trụ (h: đường cao, d: đường kính đáy)
16
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
Như vậy, mặc dù số lượng cá thể của Planktothrix nhỏ hơn 100 lần so với Microcystis, thể tích sinh khối của chúng khá tương đương nhau do thể tích của một cá thể Planktothrix lớn hơn 100 lần so với tế bào Microcystis. Cả hai loài đều mang độc tố microcystins, và có thể nhận thấy rằng mối giữa thể tích sinh học hay sinh khối với lượng độc tố sinh ra có quan hệ mật thiết hơn là khi so sánh về số lượng cá thể.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
3.2. Phương pháp xác định hàm lượng sắc tố chlorophyll a: a. Nguyên tắc: − Sắc tố chlorophyll a nói chung chiếm khoảng 0,5-1% trọng lượng sinh khối khô của các cơ thể thực vật phù du. Mặc dù hàm lượng sắc tố biến đổi theo từng giai đoạn sinh lý cơ thể, chlorophyll a vẫn được sử dụng rộng rãi và được chấp nhận như một thước đo sinh khối. Đây là một phép đo đặc biệt thông dụng đối với quá trình nở hoa của vi khuẩn xiano, khi các thực vật phù du chủ yếu bao gồm vi khuẩn xiano, thường chỉ của một loài. Tuy nhiên, khi phép xác định chlorophyll a được dùng với hỗn hợp quần thể thực vật phù du (gồm vi khuẩn xiano và các loài khác) sẽ gây ra sự ước tính quá cao sinh khối của vi khuẩn xiano. Việc ước lượng vi thô về mối quan hệ chia sẻ của tế bào vi khuẩn xiano giữa tập hợp thực vật phù du có thể sử dụng để hiệu chỉnh sự ước tính quá cao − Phân tích chlorophyll đòi hỏi dụng cụ tương đối đơn giản là thiết bị lọc, máy li tâm, máy đo quang phổ. Chlorophyll được tác chiết bằng cách xử lý mẫu tế bào VKL với một dung môi hữu cơ, thường là etanol. b. Hóa chất, dụng cụ: − Máy đo quang phổ phù hợp để đọc bước sóng 750nm − Cuvette thủy tinh độ dài sáng 1cm hoặc 5cm đôi với nồng độ thấp − Máy li tâm − Ống li tâm 15mL có nắp đậy − Bể điều nhiệt ở 75oC hoặc dụng cụ làm nóng để đun sôi etanol − Giấy lọc sợi thủy tinh (GF/C) đường kính 47 mm − Phễu lọc, máy hút chân không − Cối, chày nghiền mẫu hay máy siêu âm − Pipet hoặc các dụng cụ tương tự lấy axit 17
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
N
H
Ơ
N
Etanol (90%) Axit clohidric HCl 1M Lưu ý: Cần thực hiện các thao tác trong điều kiện ánh sáng yếu, vì sắc tố rất dễ mất màu dưới ánh sáng, đặc biệt là ánh sáng ban ngày và ánh sáng đèn huỳnh quang. Thêm một lượng nhỏ MgCO3 vào acetone trước khi nghiền. Điều này có thể loại bỏ lượng dư axit có từ dịch tảo hay mô tảo lớn đem phâm tích hay từ các dụng cụ thủy tinh. Axit sẽ loại Mg2+ từ chlorophyll hình thành phaeophytin Giữ dịch chiết trong điều kiện mát để tránh sắc tố bị phá hỏng, sử dụng dung môi đã được làm lạnh và thực hiện thao tác nghiền, giữ dịch chiết trong bể đá. Các bước tiến hành: Cô đặc tế bào: + Li tâm một thể tích đã biết dịch nuôi cấy thành một giọt và cẩn thận hút phần dịch ra + Lọc môt thể tích đã biết dịch nuôi cấy tảo trên một giấy lọc GF/C có bông thủy tinh. Khi giấy lọc khô, đặt chúng vào trong ống li tâm thủy tinh. Trong trường hợp chưa có điều kiện phân tích ngay, các giấy lọc chứa mẫu có thể được giữ ở -20oC. Đặt giấy lọc vào trong cối nghiền, thêm 2-3mL etanol 90% đun sôi giữ trong đá lạnh, khuấy bằng que thủy tinh và nghiền cho đến khi các sợi tách ra. Rót dịch nổi (đối với tảo lọc) và một ống li tâm thủy tinh có chia độ và nếu cần thì tách chiết lại với etanol một lần nữa. Rót dịch nổi ra và gộp với các phần dịch nổi trước. Dùng etanol để đưa dịch chiết tới thể tích không đổi là 10mL. Đậy kín ống li tâm và giữ trong tối, ở 20oC trong 24-48 giờ. Li tâm trong 15 phút ở 3000-5000 vòng/phút để loại tất cả các chất cặn còn sót lại. Chuyển dịch nổi vào trong ống li tâm sạch khác. Đo thể tích dịch nổi
D
IỄ N
Đ
ÀN
TR ẦN
TO
−
ÁN
-L
−
Í-
H
Ó
A
10 00
B
c. −
H Ư
N
−
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
−
.Q
U Y
− − • −
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
−
18
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
− Đặt mẫu vào trong cuvette và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750 và 665mm (750a và 665a). − Thêm 0,01mL của dung dịch HCl 1M vào mẫu trong cuvette (điều chỉnh thể tích cho phù hợp với thể tích cuvette, khoảng 0,003mL của 1mol/L HCl/mL dịch etanol) và khuấy trong 1 phút. Đo độ hấp thụ pử 750 và 665nm (750b, 665b). d. Tính toán kết quả Sử dụng độ hấp thụ đã điều chỉnh để tính toán kết quả Chlorophyll a = 29,62(665a-665b). A .l (mg/m3) B
ẠO
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
A
Phaeophytin a = 20,73(665b). .l (mg/m3)
G
Đ
B
Ve là thể tích dịch chiết etanol (L) Vs là thể tích mẫu nước (L) l là độ dài ánh sáng (cm)
TR ẦN
H Ư
N
Trong đó:
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
Lưu ý rằng tỉ lệ của chlorophyll a so với phaepphytin a là dấu hiệu đánh giá trạng thái của quần thể vi khuẩn xiano, nhưng cũng có thể phản ánh hiệu quả của việc xử lý và bảo quản mẫu, do hàm lượng cao của phaeophytin a biểu thị sự suy giảm của chlorophyll a do quần thể suy thoái hoặc do quá trình nghiên cứu. Trong quá trình lọc mẫu, các tế bào có thể chết, dẫn đến hậu quả là ngay lập tức làm giảm chất phaeo. Nếu sau khi lọc mẫu không được chiết ngay hoặc làm lạnh, nồng độ chlorophyll a sẽ suy giảm. Bên cạnh đó, nhiều nguyên nhân trong quá trình nghiên cứu có thể làm giá trị chlorophyll a thu được rất nhỏ.
Chlorophyll a + Phaeophytin a =
CD,D.2EEF 5. A B .G
mg.m-3
Phép tính trên sẽ cho kết quả gần với tổng nồng độ các chất tính riêng rẽ.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
Xét biểu thức:
19
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Ý KIẾN CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
H
Ơ
N
Nhận xét chung :………………………................................................................................
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ....................Điểm số :……………………………………………………………………………………
Giáo viên phản biện
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
Hà Nội ngày….tháng….năm 2016
20
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Ơ
N
Ý KIẾN CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN Nhận xét chung : Điểm số
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
N
H
Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Giáo viên phản biện
21
Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial