TỔNG QUAN CƠ CHẾ PHÁT HUỲNH QUANG - ỨNG DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLON TRONG DƯỢC

LUẬN VĂN SIÊU CẤP CHANNEL

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection DẠY KÈM QUY NHƠN PHARMACY PHÁT TRIỂN NỘI DUNG

TỔNG QUAN CƠ CHẾ PHÁT HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLON TRONG DƯỢC PHẨM (2019) WORD VERSION | 2019 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN CƠ CHẾ PHÁT HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLON TRONG DƯỢC PHẨM

NGƯỜI THỰC HIỆN: KIM THỊ THU HÀ GV HƯƠNG DẪN: ThS. NGUYỄN THỊ MINH DIỆP

Việt Trì, ngày 30 tháng 5 năm 2019

LỜI CẢM ƠN Xuất phát từ một vai trò của một sinh viên ngành dược trường cao đẳng y-dược Phú Thọ cùng với sự ham học hỏi, muốn tìm hiểu về lĩnh vực phân tích dược phẩm bằng phương pháp phổ huỳnh quang, em đã chọn đề tài “Tổng quan cơ chế phát huỳnh quang - ứng dụng để định lượng kháng sinh họ fluoroquinolon trong dược phẩm” để làm khóa luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Minh Diệp bộ môn hóa-lý đã hết lòng hướng dẫn em trong suốt quá trình tìm hiểu và hoàn thành khóa luận. Đồng thời em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa lý và các bạn sinh viên khóa CD8 đã giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này. Với sự hiểu biết có hạn, khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý kiến của các thầy cô, các anh chị, các bạn cùng với những người quan tâm để nội dung khóa luận được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Kim Thị Thu Hà

MỤC LỤC I. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 II. TỔNG QUAN VỀ PHẢN ỨNG QUANG HÓA VÀ CƠ CHẾ PHÁT QUANG. 2 II.1. Các khái niệm cơ bản...................................................................................... 2 II.2. Các quá trình xảy ra khi phân tử bị kích thích. Giản đồ Jablonski ................. 3 II.2.1. Các bước chuyển điện tử trong phân tử ................................................... 3 II.2.2. Giản đồ Jablonski ..................................................................................... 4 II.3. Bản chất của phản ứng quang hóa .................................................................. 6 II.3.1. Điều kiện để xảy ra phản ứng quang hóa ................................................ 6 II.3.2. Các thông số của phản ứng quang hóa .................................................... 8 II.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang ................................................ 9 II.4. Phương pháp phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian .............................................................................................................................. 12 II.4.1. Mối quan hệ giữa phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian ............................................................................................................ 12 II.4.2. Phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved fluorescence) ..................................................................................................... 13 II.4.3. Phương pháp định lượng trên cơ sở phản ứng hóa phát quang............. 15 III. ỨNG DỤNG HIỆU ỨNG PHÁT HUỲNH QUANG TRONG PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONES ............................. 17 III.1. Tính chất quang của một số chất chất kháng sinh họ fluoroquinolones ...... 17 III.1.1. Tính chất quang của một số kháng sinh họ flouroquinolones thế hệ 2 . 19 III.1.1.1-Công thức cấu tạo ............................................................................... 19 III.1.1.2- Tính chất quang ................................................................................. 19 III.1.2. Một nghiên cứu khác về tính chất quang của kháng sinh họ flouroquinolone thế hệ 3 và 4 ............................................................................ 24 III.2. Phân tích định lượng trên cơ sở phản ứng quang hóa ................................. 28

IV. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 34

DANH MỤC HÌNH Hình 2- 1. Các bước chuyển điện tử trong phân tử ................................................... 3 Hình 2- 2. Giản đồ năng lượng Jablonski ................................................................. 4 Hình 2- 3. Hiện tượng huỳnh quang trễ .................................................................... 5 Hình 2- 4. Sự hấp thụ ánh sáng trong lớp mỏng ....................................................... 7 Hình 2- 5. So sánh phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian ................................................................................................................................. 13 Hình 2- 6. Biểu diễn Stern-Volumer ........................................................................ 14 Hình 2- 7. Các bước cơ bản của quá trình định lượng bằng phát quang hóa học. 15 Hình 2- 8. Biêu diễn Stern-Volumer, sự phụ thuộc của tỷ lệ cường độ phát quang (hoặc lifetime) và nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang trong hai trường hợp tắt huỳnh quang động và tắt huỳnh quang tĩnh ........................................................... 17 Hình 3- 1. Cấu trúc chung của quinolone và fluoroquinolone………………………...

18 Hình 3- 2. Công thức cấu tạo của (a) Norfloxacin; (b) Ciprofloxacin; (c) fleroxacin ................................................................................................................................. 19 Hình 3- 3. Phổ hấp thụ của một số FQs tiêu biểu, trong đệm phosphat tại nồng độ 5.10-3 M, pH 7.4, 20oC, ............................................................................................ 20 Hình 3- 4. Phổ hấp thụ của CIP tại các nồng độ khác nhau của HCl 1-10M, C=5.10-5M ............................................................................................................... 21 Hình 3- 5. Phổ huỳnh quang ở nhiệt độ phòng của norfloxacin tại pH 1.2 (1); 3.4 (2); 7.4 (3) và 10.8 (4) ............................................................................................ 22

Hình 3- 6. Hiệu suất huỳnh quang Φ và thời gian sống huỳnh quang τ của Norfloxacin.. ............................................................................................................ 22 Hình 3- 7. Phổ phân giải theo thời gian của CIP 10-5M, HCl 1M .......................... 23 Hình 3- 8. Phổ hấp thụ của MOX (a) và LEV (b) trong ─ACN, -- H2O, …PBS .... 25 Hình 3- 9. Phổ huỳnh quang của MOX (a), LEV (b) trongdung môi ─ACN, -H2O,..PBS ................................................................................................................ 26 Hình 3- 10. Phổ hấp thụ phân giải theo thời gian của (a) MOX và (b) LEV trong đệm PBS ................................................................................................................... 27 Hình 3- 11. Phổ huỳnh quang của 4-FQ trước và sau khi tạo phức với axit Cloranilic ................................................................................................................. 29 Hình 3- 12. Cơ chế dịch chuyển điện tử và sự hình thành phức của axit cloranilic với 4-FQs tương ứng (1)-LOM; (2)-FLE; (3)-CIP; (4)-NOR ................................. 30 Hình 3- 13. Phổ kích thích và phát xạ của LEV (1µg/ml) (A) trong dung dịch chưa tạo mixen (B) trong dung dịch tạo mixen với SDS 8mM ......................................... 32 Hình 3- 14. Phổ phát xạ (a), phổ kích thích (b) của Eu3+–MOX–SDBS. (1)Eu3+; (2)MOX; (3)Eu3+–MOX; (4)Eu3+–MOX–SDBS, pH 9.2 ......................................... 33

DANH MỤC BẢNG Bảng 3. 1. Đặc tính quang của FQ ở dạng trung hòa và dạng proton hóa, CFQ = 5.10-5M ..................................................................................................................... 23 Bảng 3. 2. Tính chất huỳnh quang của MOX và LEV trong các dung môi ............. 26 Bảng 3. 3. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên ............... 28 Bảng 3. 4. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên ............... 31

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Tiếng anh

1

FQs

Fluoroquinolones

2

UV-Vis

Ultraviolet – visible

Tia tử ngoại – khả kiến

3

Nor

Norfloxacin

Norfloxacin

4

CIP

Ciprofloxacin

Ciprofloxacin

5

FLE

Fleroxacin

Fleroxacin

6

LEV

Levofloxacin

Levofloxacin

7

MOX

Moxifloxacin

Moxifloxacin

8

PBS

-

Đệm muối phosphat

9

ACN

Acetonitril

Acetonitril

10

CL

Cloranilic

Cloranilic

7,7,8,8,11

TCNQ

tetracyanoquino dimetan

12

SDS

13

SDBS

14 15

Sodium dodecyl sulfat

Tiếng việt Kháng sinh họ fluoroquinolone

7,7,8,8,- tetracyanoquino dimetan Sodium (natri)dodecyl sulfat

Sodium dodecyl benzen

Sodium (natri) dodecyl

sulfat

benzen sulfat

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Lilit of quantitation

Giới hạn định lượng

High Performance 16

HPLC

Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

17

Q

Quencher

Chất làm tắt huỳnh quang

18

IR

Infra red

Tia hồng ngoại

19

F

Fluorescence

Huỳnh quang

20

P

Phosphorescence

Lân quang

21

VR

Relaxation of vibration

Sự phục hồi do dao động

22

A

Adsorption

Hấp thụ

23

IC

Internal conversion

Chuyển hóa nội phân tử

24

IEC

Internal and external

Chuyển hóa nội và ngoại

conversion

phân tử- dưới dạng nhiệt

25

ISC

Intersystem crossing

Kết hợp nội phân tử

26

DF

delay phosphorescence

Huỳnh quang trễ

27

S

singlet

Trạng thái đơn bội

28

T

Tripllet

Trạng thái tam bội

29

ADN

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxy ribonucleic

30

VN

-

Viên nén

31

NT

-

Nước tiểu

32

HT

-

Huyết thanh

I. MỞ ĐẦU Fluoroquinolones (FQs) là một trong những loại thuốc kháng sinh phổ rộng, có hiệu quả điều trị cao, thuốc được dung nạp tốt và tác dụng phụ tương đối hạn chế.FQs có các nhóm thế hoạt động, chứa nguyên tử oxy và ni tơ, chúng được biết đến là yếu tố cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của thuốc. Tuy nhiên, có những cải tiến về mặt cấu trúc chỉ ra rằng quinolone khi bổ sung các nhóm thế sẽ có hoạt tính kháng khuẩn và sinh khả dụng tốt hơn[1][2], vì vậy dựa vào cấu trúc và các nhóm thế mà cho tới thời điểm hiện tại FQs đã được nghiên cứu và phân loại đến thế hệ thứ 4 với nhiều loại thuốc khác nhau phù hợp cho từng đối tượng. Đối với các FQs trong dược phẩm,một trong số các yêu cầu nghiêm ngặt đó là cần phải đúng công thức về hàm lượng như đã ghi trên nhãn của nhà sản xuất, đối với thuốc đã được sử dụng điều trị thì cần phải biết được quá trình chuyển hóa, thải trừ, sinh khả dụng…, hoặc cần phải định lượng chính xác trong giai đoạn nghiên cứu điều chế thuốc mới. Do đó việc nghiên cứu phương pháp định lượng FQs trong thuốc và trong dịch sinh học (nước tiểu, huyết tương, huyết thanh…) đã được các nhà phân tích trong và ngoài nước nghiên cứu từ rất lâu. Có rất nhiều phương pháp định lượng FQs được nghiên cứu thành công, trong đó có phương pháp phát quang, đó là phương pháp định lượng chất phân tích dựa trên cường độ ánh sáng phát xạ.

Trong đó có thể là phương pháp phổ huỳnh quang, phản ứng hóa phát quang hoặc phản ứng quang hóa… Không chỉ là những nghiên cứu định lượng thông thường mà các nhà phân tích còn quan tâm tới tính chất quang, cơ chế phản ứng, cơ chế phát quang, để hiểu được bản chất và có những cải tiến cho phương pháp để có được kết quả chính xác, dễ thực hiện và giảm chi phí. Trong chuyên đề này chúng tôi tìm hiểu cơ bản về cơ chế phát huỳnh quang nói chung trong các phương pháp phân tích bằng huỳnh quang. Chủ yếu là trong phản ứng quang hóavà ứng dụng cơ chế này vào định lượng FQs trong dược phẩm và dịch sinh học, dựa trên các nghiên cứu đã được công nhận. Về cơ bản thì sự phát huỳnh quang phụ thuộc vào 1

cấu trúc của FQs, dung môi và pH của dung dịch.Dựa vào các yếu tố đó có thể khắc phục các sai khác trong quá trình định lượng.

II. TỔNG QUAN VỀ PHẢN ỨNG QUANG HÓA VÀ CƠ CHẾ PHÁT QUANG II.1. Các khái niệm cơ bản Quang hóa học(photochemistry)là lĩnh vực nghiên cứu: phản ứng hóa học dưới tác dụng của tia bức xạ thuộc vùng tử ngoại xa đến hồng ngoại; và hiệu ứng phát xạ của phản ứng hóa học.

Phản ứng quang hóa (photochemical reaction):là phản ứng hóa học xảy ra do hấp thụ tia bức xạ tử ngoại (UV) hoặc nhìn thấy (VIS) hoặc hồng ngoại (IR)[3][4].

Cơ chế phát quang:hiện tượng phát quangbao gồm - Phát quang âm cực

- Phát quang hóa học

- Phát quang nhiệt

- Phát quang sinh học

- Quang phát quang

- Phát quang điện và phát quang ma sát

- Nếu phân tử được kích thích bằng tia bức xạ (UV, VIS, IR) mà phát sáng thì sự phát quang đó gọi là quang phát quang (photoluminescence).

- Nếu năng lượng của một phản ứng được phát ra dưới dạng ánh sáng thì sự phát quang đó gọi là hóa phát quang (chemiluminescence). …

Mọi dạng phát sáng trên đều giống nhau về bản chất được gọi chung là phát quang (luminescence)[5][6].

2

II.2. Các quá trình xảy ra khi phân tử bị kích thích. Giản đồ Jablonski II.2.1. Các bước chuyển điện tử trong phân tử Khi nhận năng lượng, một electron ở orbital liên kết hoặc không liên kết có thể chuyển lên các orbital phản liên kết còn trống ở mức năng lượng cao hơn. Khi đó xảy ra các bước chuyển điện tử sau: -

 →   Bước chuyển mức N → V   →  

-

n →   Bước chuyển mức N →Q  n →  

- Bước chuyển mức N →R

Hình 2- 1.Các bước chuyển điện tử trong phân tử

3

II.2.2. Giản đồ Jablonski

Hình 2- 2.Giản đồ năng lượng Jablonski So : trạng thái cơ bản S1 : trạng thái kích thích có độ bội đơn T1 : trạng thái kích thích có độ bội 3 A: hấp thu (adsorption) F: huỳnh quang (fluorescence) P: lân quang (phosphorescence) → Quá trình phát xạ ~~–> Quá trình không phát bức xạ SR(VR) Relaxation of vibration – Hồi phục do dao động Khi phân tử hấp thụ năng lượng dạng nhiệt (phonon) hoặc dạng quang (photon). Ở trạng thái cơ bản So, phân tử hấp thụ năng lượng từ môi trường bên ngoài và chuyển thành năng lượng của các electron, nhận năng lượng, các electron này sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn, gọi là trạng thái kích thích S*, đây là 4

một trạng thái không bền, do đó electron sẽ mau chóng nhường năng lượng dưới dạng nhiệt để về trạng thái kích thích nhưng năng lượng thấp hơn So*, thời gian tồn tại của electron giữa mức năng lượng So→So* vào khoảng 10-9 đến 10-12 giây, sau khi về trạng thái kích thích So*, electron lại một lần nữa phát năng lượng dưới dạng photon để về mức thấp hơn, hiện tượng này gọi là huỳnh quang phân tử. Cùng là hiện tượng này còn có hiện tượng lân quang (phosphorescence) và huỳnh quang trễ (delay phosphorescence), hình vẽ 2-4.

Hình 2- 3.Hiện tượng huỳnh quang trễ Các quá trình giải tỏa năng lượng phân tử Quátrình hấp thụ năng lượng (A): Khi hấp thu sóng điện từ, phân tử bị kích thích điện tử chuyển từ trạng thái So → S1 hoặc S2, t= 10-16 - 10-15giây (femo giây) Trạng thái này không bền, electron có xu hướng giải tỏa năng lượng đã hấp thu để trở về trạng thái có năng lượng thấp, bền vững hơn. Sự giải tỏa năng lượng có thể thực hiện theo nhiều cách tùy thuộc vào cấu trúc phân tử. Quá trình làm mất hoạt tính năng lượng ở trạng thái kích thích có thể không kèm theo sự phát proton hν.

- IC (chuyển hóa mội phân tử)–năng lượng cho quá trình chuyển vị nội phân tử (S2 →S1) - VR (sự phục hồi do dao động) – mất năng lượng do dao động và do sự quay (S1 (v’)→ S1(0); T1 (v’) → T1 (0)).

5

- IEC (sự chuyển hóa dưới dạng nhiệt) – chuyển năng lượng cho các phần tử xung quanh (dung môi) dưới dạng nhiệt.

- ISC (kết hợp nội phân tử)– chuyển năng lượng giữa các mức có độ bội khác nhau (S1 (v’= 0) →T1 (v’=1,2,3…), khi thỏa mãn 2 điều kiện: - Nếu trong phân tử đường cong thế năng S1 và T1cắt nhau, khi ΔE =ES1 - ET1<10kcal

- Mức dao động v’= 0 của S1 bằng với v’cao của T1.

- F (phát xạ huỳnh quang) – bức xạ phát ra khi thực hiện bước chuyển S1 (v’= 0) →So (v=0,1,2…), thời gian thực hiện bước chuyển 10-9 -10-6 s.

- P (phát xạ lân quang) – bức xạ phát ra khi thực hiện bước chuyển T1 (v’= 0) → So (v=0,1,2,3…); thời gian thực hiện bước chuyển 10-4 -10-2 .

- DF (huỳnh quang trễ): do trước khi bức xạ photon, phân tử ở trạng thái triplet một thời gian, sau đó trở về trạng thái So. II.3. Bản chất của phản ứng quang hóa II.3.1. Điều kiện để xảy ra phản ứng quang hóa Các định luật quang hóa: phản ứng quang hóa chỉ xảy ra theo các định luật sau đây 1- Định luật Grotthuss và Draper: Chỉ ánh sáng bị hệ hấp thụ mới có khả năng gây ra phản ứng, nói cách khác, phản ứng quang hóa chỉ có khả năng xảy ra nếu phân tử bị hấp thụ ánh sáng.

2- Định luật Einstein: Một photon hay lượng tử ánh sáng bị hấp thụ chỉ có khả năng kích thích một phân tử trong giai đoạn sơ cấp, định luật này còn gọi là định luật đương lượng quang hóa.

3- Quy luật do Kashe tổng kết: Khi hấp thụ photon, phân tử có xác xuất nhất định bị kích thích lên trạng thái singlet thấp nhất S1 hoặc triplet thấp nhất T1.

Trong phần lớn phản ứng quang hóa hữu có trong dung dịch phân tử bị kích thích lên trạng thái S1 hoặc T1. Quy luật này do Kasha tổng kết từ thực nghiệm chủ yếu đối với các phản ứng quang hóa hữu cơ.

6

4- Đinh luật Lambert – Beer về sự hấp thụ ánh sáng: giả thiết có một luồng ánh sáng đơn sắc có cường độ Io ec/cm2.s đi qua một dung dịch có tiết diện 1cm2.

Hình 2- 4.Sự hấp thụ ánh sángtrong lớp mỏng Giả thiết ở độ sâu l, cường độ ánh sáng là I, khi đi qua lớp mỏng δl cường độ giảm đi δI. Gọi n là số phân tử chất hấp thụ ánh sáng trong 1cm3. Như vậy số phân tử trong lớp mỏng δl là δn và δn = nδl. Vì số photon bị hấp thụ tỉ lệ với số phân tử hấp thụ ánh sáng nên có thể viết

 

= kδn = knδl

(2.1)

Trong đó k là hệ số tỉ lệ.phương trình (II.1) là biểu thức toán học của định luật lambert Beer. Lấy tích phân (2.1) và chú ý đến điều kiện đầu I = Io, khi Io = 0 ta được ln

I I I = -knl (2.2) hoặc = e-knl (2.3). Tỉ số T = gọi là độ truyền quang, Io Io Io

-logT = A gọi là độ hấp thụ (trước đây gọi là mật độ quang).

Trong các biểu thức trên, n là nồng độ tính bằng phân tử/cm3. Nống độ tính bằng mol/l và ký hiệu C, ta có: kn = ɛC (2.4) Nghĩa là

 C

=

6,023 .10 23.C n = = 6.1020 1000 C C

Khi đó biểu thức (2.3) trở thành

I = e-ɛCl (2.5) Io

k: hệ số hấp thụ phân tử ɛ: hệ số tắt hay hệ số hấp thụ 7

Theo định luật Lambert Beer thì tỉ sô δI/I không phụ thuộc vào cường độ I của ánh sáng. Điều này chỉ đúng với sự chiếu sáng thông thường, nếu ánh sáng có cường độ rất lớn thì định luật này bị vi phạm.

Phản ứng quang hóa bao gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn hấp thụ photon: trong đó phân tử chuyển từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích electron. + Giai đoạn quang hóa sơ cấp: trong đó các phân tử bị kích thích tham gia trực tiếp vào phản ứng. + Giai đoạn quang hóa thứ cấp: còn gọi là giai đoạn phản ứng tối hoặc phản ứng nhiệt, trong đó có các sản phẩm của giai đoạn sơ cấp tham gia phản ứng.

II.3.2. Các thông số của phản ứng quang hóa 1-Cường độ huỳnh quang: Khi chiếu một chùm tia tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy có bước sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cường độ phụ thuộc vào hàm lượng của chúng[6].

2- Hiệu suất phát quang: đánh giá sự biến đổi hiệu dụng giữa Eex sang Eem. Có 2 loại hiệu suất phát quang: Hiệu suất năng lượng (ΦNL: là tỉ số năng lượng huỳnh quang của chất khảo sát Eem và năng lượng ánh sáng kích thích Eex. ФNL =

E E

em

≤1

(2.6)

ex

Hiệu suất lượng tử (ΦLT ): là tỉ số giữa số lượng tử huỳnh quang Nem và số lượng tử ánh sáng kích thích (hấp thu).

ФLT =

N N

em

≤1

ex

8

(2.7)

3- Thời gian sống huỳnh quang (lifetime)τ0 hay thời gian của trạng thái kích thích là thời gian cần thiết để số phân tử kích thích ban đầu giảm e lần[7]. τ 0 =

1  ki i

Trong đó ki là hằng số tốc độ của quá trình giải hoạt i ( bức xạ hoặc phi bức xạ).

4- Nồng độ mol/l các chấtở các trạng thái tương ứng [S1], [T1]…

II.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát quang 1-Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang •Cấu tạo phân tử: - Các chất có dây nối đôi liên hợp thì có khả năng phát quang. Càng nhiều dây nối đôi liên hợp thì khả năng phát quang càng cao. Ví dụ: Các chất vô cơ hay các chất hydrocacbon no hầu như không phát quang. Các hợp chất thơm có khả năng phát quang và càng nhiều vòng thơm ngưng tụ thì hiệu suất huỳnh quang càng lớn.

- Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang.

Ví dụ: -OH, -OCH3..

- Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang.

Ví dụ: -NO2, -COOH, -CHO,......

- Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc làm giảm hiệu suất huỳnh quang. Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trên nhân thơm, cũng làm tăng hiệu suất huỳnh quang. Ngược lại vị trí meta thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang.

- Đồng phân cis làm tăng khả năng phát quang và đồng phân trans làm giảm khả năng phát quang của hợp chất.

• Độ cứng nhắc của phân tử.Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát quang cao và ngược lại. Ví dụ: Flourene, Flourescein: Phát quang mạnh Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang 9

• Chất tạo dẫn: Có những hợp chất bình thường phát quang yếu nhưng khi tạo dẫn chất thì phát quang mạnh.

Ví dụ:Không phát quang Phát quang mạnh Tetracyclin Tetracyclin + Ca2++ Barbiturat Hydrocortison Hydrocortison + H2SO4+ ethanol Vitamin B1 Thiocrom Adrenalin Adrenochrom 2-Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang •Sự có mặt của các chất tan khác nhau: Có thể gây ra hiện tượng sau: - Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác nhau có thể không phát quang nhưng lại hấp thụ ánh sáng của chất phát quang làm giảm cường độ huỳnh quang.

- Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt một phần hay toàn bộ cường độ phát quang do va chạm hay làm biến đổi cấu trúc hóa học của chất phát quang.

Cơ chế: F + hν→F* F* →F + hν Trong đó F là chất phân tích có khả năng phát huỳnh quang (→ F*). Do va chạm nên: F* + Q → F + Q* Khi đó Q đóng vai trò là chất làm tắt huỳnh quang (quencher).

Ví dụ: Cl- là Q của Quinin cho nên trong môi trường HCl thì Quinin không phát quang. ADN là Q của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụng Acridin trong định lượng.

•Nồng độ ion H+, vai trò của pH:

10

pH có ảnh hưởng lớn đến cường độ phát quang. Một số chất có tính axit yếu hay bazơ yếu thì cường độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH. Ví dụ: Ta có axit AH, trong nước AH phân ly theo phương trình: AH → A- +H+ Nếu dạng phát quang là AH thì khi H+ tăng, phản ứng xảy ra theo chiều nghịch, khi đó

F

tăng. Nếu dạng phát quang là A- thì F sẽ giảm trong môi trường axit và tăng trong môi trường kiềm.

• Ảnh hưởng của dung môi: Cường độ phát quang và bước sóng cực đại thay đổi theo dung môi và những tác động khác nhau. Ví dụ: - Sự tắt huỳnh quang do dung môi: Quininsulfat phát quang mạnh trong môi trườngH2SO4, nhưng không phát quang trong môi trường HCl. - Oxi hòa tan trong dung môi làm biến đổi hóa học chất phát quang, do đó oxi có ảnh hưởng đến cường độ phát quang.

- Độ nhớt làm tăng cường độ phát quang.

- Độ tinh khiết của dung môi: Dung môi có tạp huỳnh quang làm sai lệch kết quả của phép đo.

• Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ tăng làm giảm cường độ phát quang do làm tăng tần số va chạm của phân tử làm cho hiện tượng bất hoạt tăng lên. Do vậy trong máy quang phổ huỳnh quang, đèn nguồn có công suất lớn nên phải có kính cách nhiệt hoặc có bộ phận làm mát đèn.

• Ánh sáng kích thích: Khi λex ngắn (ánh sáng kích thích có năng lượng lớn) phân tử chất huỳnh quang có thể bị phân li, điển hình như: - Liên kết C – C có thể đứt khi sử dụng λex ~ 200nm; 11

- Liên kết C – N có thể đứt khi sử dụng λex ~ 250nm Trong phổ huỳnh quang thường λex ≥ 250nm.

• Ảnh hưởng của oxi: do sự che phủ của vân phổ huỳnh quang và vân phổ hấp thụ mặc dù không có và chạm đàn hồi.

II.4. Phương pháp phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian II.4.1. Mối quan hệ giữa phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian Phương pháp đo huỳnh quang có hai loại, một là đo huỳnh quang tĩnh hay huỳnh quang ở trạng thái dừng và phương pháp đo huỳnh quang phân giải theo thời gian. Mẫu được chiếu tia bức xạ liên tục sau đó cường độ và phổ phát xạ được ghi lại như hình vẽ 2-5bằng thang đo thời gian ns ở trạng thái dừng, khi mẫu đầu tiên được chiếu sáng, trạng thái dừng gần như đạt được tức thì. Thứ 2 là đo huỳnh quang phân giải theo thời gian, sử dụng phép đo cường độ phân giải hoặc dị hướng phân giải. Mẫu được đặt vào xung ánh sáng, độ rộng của xung ngắn hơn thời gian phân giải mẫu, hình vẽ 2-5, cường độ phân giải được ghi bằng hệ thống phát hiện tốc độ cao, cho phép đo cường độ bằng thang thời gian ns. Mối quan hệ giữa trạng dừng và thời gian phân giải được biểu thị bằng biểu thức: I = I0.e-t/τ(2.8) Giá trị I0 là thông số phụ thuộc vào nồng độ của chất phát huỳnh quang và một số thông số của thiết bị đo. Do đó huỳnh quang trạng thái dừng tỷ lệ với thời gian sống huỳnh quang. Điều này chứng tỏ được hiệu suất huỳnh quang Φ tỷ lệ với τ. Đo huỳnh quang ở trạng thái tĩnh có thể hiểu rằng đó là thời gian trung bình của phép đo huỳnh quang phân giải theo thời gian[8].

12

HÌnh 2- 5.So sánh phổ huỳnh quang tĩnh và huỳnh quang phân giải theo thời gian Phương pháp huỳnh quang tĩnh (steady - state luminescence) là phương pháp đo cường độ phát xạ tương ứng ở λex/λem thích hợp, khi phân tử đã trở về trạng thái cơ bản. Do cường độ huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ chất phát huỳnh quang trong dung dịch, đó là cơ sở để định lượng.

II.4.2. Phươngpháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved fluorescence) 1) Phức ở trạng thái kích thích phân hủy theo phương trình động học bậc 1: [P*]t = [P*]oe-t/τ (2.9) Hay It = Ioe-t/τ(2.10) Trong đó: [P*]o.và [P*]t là nồng độ của phức chất ở trạng thái kích thích thời điểm t = 0 và sau thời gian t.

I0 và It là cường độ phát xạ huỳnh quang của phức chất ở trạng thái kích thích thời điểm t = 0 và sau thời gian t. τ: thời gian “sống” (lifetime) của phức ở trạng thái kích thích trong dung dịch nghiên cứu.

Nếu dung dịch nghiên cứu chỉ có phức chất (phức không tham gia phản ứng hóa học) thì τ = τ0 và k0 =1/τ0 với k0 được gọi là hằng số tốc độ phân hủy (decay) của phức chất ở trạng thái kích thích.

13

2) Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (kq) được xác định theo phương trình Stern-Volumer [9]: 0 = 1 +  0 kq[Q] (2.11) 

0⁄ − 1 = k  [TyrOH]  q 0 Trong đó: 0 và tương ứng là thời gian sống của phức ở trạng thái kích thích trong dung dịch nghiên cứu không có và có chất phân tích (Q); các giá trị này thu được từ dữ liệu thực nghiệm ghi phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của phức chất.

[Q]: nồng độ chất phân tích trong dung dịch.

Giá trị kq được tính từ hệ số góc của đường thẳng biểu diễn mối quan hệ giữa đại lượng

0⁄

 − 1 và [Q].

0/ - 1

0/ - 1

2

1

0

[Q]/M

Hình 2- 6.Biểu diễn Stern-Volumer Từ 1), 2) cho thấy đây là cơ sở của phương pháp định lượng bằng huỳnh quang phân giải theo thời gian. Một số nghiên cứu đã thành công, định lượng FQ trong dược phẩm [10], sữa [11], dịch sinh học [12]..

14

II.4.3. PhĆ°ĆĄng phĂĄp Ä&#x2018;áť&#x2039;nh lưᝣng trĂŞn cĆĄ sáť&#x; phản ᝊng hĂła phĂĄt quang 1)-Phản ᝊng hĂła phĂĄt quang (chemiluminescence)hay phĂĄt quang hĂła háť?c lĂ sáťą phĂĄt sĂĄng tᝍ máť&#x2122;t phản ᝊng hĂła háť?c khi phân táť­ cĂł Ä&#x2018;iáť&#x2021;n táť­ áť&#x; trấng thĂĄi kĂ­ch thĂ­ch chuyáť&#x192;n váť trấng thĂĄi cĆĄ bản, tháť?i gian tháťąc hiáť&#x2021;n bĆ°áť&#x203A;c chuyáť&#x192;n 10-9-10-6s.

KhĂĄc váť&#x203A;i phản ᝊng quang hĂła, phĂĄt quang hĂła háť?c lĂ sáťą phĂĄt xấ ĂĄnh sĂĄng tᝍ máť&#x2122;t phản ᝊng hĂła háť?c mĂ khĂ´ng cần nguáť&#x201C;n ĂĄnh sĂĄng kĂ­ch thĂ­ch tᝍ bĂŞn ngoĂ i vĂ o. Tuy nhiĂŞn káťš thuáş­t phân tĂ­ch huáťłnh quang dáťąa trĂŞn cĆĄ sáť&#x; tĆ°ĆĄng táťą nhau.

Hiáť&#x2021;u suẼt lưᝣng táť­ cᝧa quĂĄ trĂŹnh phĂĄt quang hĂła háť?c ÎŚCL Ä&#x2018;ưᝣc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh nghÄŠa lĂ : đ?&#x2018;&#x2020;áť&#x2018; đ?&#x2018;?â&#x201E;&#x17D;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x203A; đ?&#x2018;?â&#x201E;&#x17D;ĂĄđ?&#x2018;Ą đ?&#x2018;&#x;đ?&#x2018;&#x17D;

ÎŚCL = đ?&#x2018; áť&#x2018; đ?&#x2018;?â&#x201E;&#x17D;đ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;Ąđ?&#x2018;&#x153;đ?&#x2018;&#x203A; đ?&#x2018;?â&#x201E;&#x17D;ảđ?&#x2018;&#x203A; ᝊđ?&#x2018;&#x203A;đ?&#x2018;&#x201D; ÎŚCLph᝼ thuáť&#x2122;c vĂ o Ä&#x2018;iáť u kiáť&#x2021;n tháťąc nghiáť&#x2021;m Ä&#x2018;Ăł lĂ tᝡ láť&#x2021; giᝯa cĆ°áť?ng Ä&#x2018;áť&#x2122; phĂĄt quang hĂła háť?c vĂ sáťą giảm náť&#x201C;ng Ä&#x2018;áť&#x2122; cᝧa chẼt phản ᝊng, nĂł Ä&#x2018;ưᝣc biáť&#x192;u tháť&#x2039; báşąng biáť&#x192;u thᝊc Ä&#x2018;ấi sáť&#x2018; [13]: ÎŚCL = ICL.

d (C ) dt

HĂŹnh 2- 7. CĂĄc bĆ°áť&#x203A;c cĆĄ bản cᝧa quĂĄ trĂŹnh Ä&#x2018;áť&#x2039;nh lưᝣng báşąng phĂĄt quang hĂła háť?c (a) háť&#x2014;n hᝣp phản ᝊng cᝧa thuáť&#x2018;c tháť­ vĂ chẼt phân tĂ­ch, ĂĄnh sĂĄng phĂĄt xấ Ä&#x2018;ưᝣc xĂĄc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh báť&#x;i máť&#x2122;t dectector, (b) Ä&#x2018;Ć°áť?ng biáť&#x192;u diáť&#x2026;n sáťą ph᝼ thuáť&#x2122;c cᝧa cĆ°áť?ng Ä&#x2018;áť&#x2122; phĂĄt quang vĂ o tháť?i gian sau háť&#x2014;n hᝣp bắt Ä&#x2018;ầu phản ᝊng hay sáťą phân giải tĂ­n hiáť&#x2021;u báť&#x;i sáťą tiĂŞu

15

thụ của chất phản ứng và sự thay đổi của hiệu suất huỳnh quang vào thời gian, (c) đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích vào thời gian phản ứng.

2)- Sự tắt huỳnh quang của phản ứng hóa học là sự giảm một phần hay hoàn toàn hiệu ứng huỳnh quang, bởi sự tương tác hay va chạm của các chất trong phản ứng. Do đó nếu quan sát thấy hiện tượng tắt huỳnh quang có nghĩa là phản ứng phát quang hóa học kết thúc. Tắt huỳnh quang có hai loại đó là tắt huỳnh quang tĩnh và tắt huỳnh quang động. Tắt huỳnh quang tĩnh là sự tương tác của phân tử chất phát huỳnh quang và chất làm tắt huỳnh quang ở trạng thái cơ bản (trạng thái tĩnh) tạo thành phức chất không phát huỳnh quang, hiệu suất huỳnh quang này ảnh hưởng bởi sự hình thành hệ số của phức cũng như bởi nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang, ví dụ như sự tắt huỳnh quang của axit salicylic bởi Cu(II).

Sự tắt huỳnh quang động(hay sự tắt huỳnh quang theo thời gian) là chất làm tắt huỳnh quang phản ứng với chất phát huỳnh quang trong suốt thời gian “sống” ở trạng thái kích thích (τq). Hiệu suất tắt huỳnh quang Φq phụ thuộc vào độ nhớt của dung dịch, τ0 ở trạng thái kích thích của chất phát quang và nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang.

Công thức Stern-Volumer [13]:

 0f f

=

 0f f

=

0 = 1 + k q 0 Q  

(2.12)

Trong đó kq là hằng số tốc độ của phản ứng giữa chất làm tắt huỳnh quang và chất phát huỳnh quang; Φ, Φq là hiệu suất huỳnh quang khi không và có nồng độ Q của chất làm tắt huỳnh quang, tương ứng.

16

Hình 2- 8. Biêu diễn Stern-Volumer, sự phụ thuộc của tỷ lệ cường độ phát quang (hoặc lifetime) và nồng độ của chất làm tắt huỳnh quang trong hai trường hợp tắt huỳnh quang động và tắt huỳnh quang tĩnh [13] Từ 1) và 2) là cho thấy đây là cơ sở của phép phân tích định lượng bằng kỹ thuật phát quang hóa học.

Phương pháp hóa phát quang có nhiều ưu điểm so với phương pháp phổ huỳnh quang: đo trưc tiếp ánh sáng phát ra, không ảnh hưởng bởi hiện tượng tán xạ của nền, tín hiệu phân tích phân biệt được với tín hiệu phát quang của dung dịch vì không có nguồn ánh sáng bên ngoài để đưa phân tử lên trạng thái kích thích.

III. ỨNG DỤNG HIỆU ỨNG PHÁT HUỲNH QUANG TRONG PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ FLUOROQUINOLONES III.1. Tính chất quang của một số chất kháng sinh họ fluoroquinolones Trong cấu tạo của nhóm quinolone có hai loại cấu trúc vòng: Một là nhân naphthyridine với nitrogen ở vị trí 1 và 8 (như trong nalidixic acid), và một là nhân quinoline chỉ có một nitrogen ở vị trí 1 (như trong oxolinic acid) (hình 3-1). Tất cả các hợp chất, cả quinolone và naphthyridone đều chứa nhóm xeton ở vị trí 4 và bên cạnh là nhánh carboxylic acid ở vị trí 3.Các dẫn xuất của quinolone là những hợp chất có gắn thêm nhánh các hợp chất hữu cơ tại vị trí 1, 2, 6, 8 trong nalidixic acid hoặc oxolinic acid.

17

Hình 3- 1.Cấu trúc chung của quinolone và fluoroquinolone Quinolone được fluoro hóa gọi là fluoroquinolones, cấu trúc hóa học của Fluoroquinolones (FQs) có chứa một số vị trí liên kết proton với hoạt động tương tự như acid-base, cụ thể là các nhóm cacboxyl, carbonyl và amino.Các nhóm trên được proton hóa một cách cạnh tranh. Do thực tế này, các tính chất của FQs chịu ảnh hưởng bởi các đặc tính hóa lý của dung môi, và do đó, hoạt tính kháng khuẩn của chúng phụ thuộc mạnh mẽ vào pH [2].

Phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang và phổ kích thích huỳnh quang của hợp chất vòng phụ thuộc vào chiều dài của hệ nối đôi liên hợp của vòng thơm. Cường độ phát quang ảnh hưởng rất lớn bởi tương tác spin-orbital của các electron nguyên tử.

Do đó mối quan hệ giữa đặc tính phổ và mức độ dịch chuyển electron của các nguyên tử khác nhau trong hệ liên hợp π của các vòng thơm trong FQs là những nghiên cứu cơ bản[2].

Nghiên cứu tính chất quang của một số kháng sinh họ fluoroquinolone bằng cách sử dụng phương pháp huỳnh quang tĩnh (steady - state luminescence),phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian (time-resolved fluorescence), đo phổ hấp thụ 18

UV-Vis. Sau đây là một số nghiên cứu đã được công bố về tính chất quang của fluoroquinolones.

III.1.1. Tính chất quang của một số kháng sinh họ flouroquinolones thế hệ 2 (norfloxacin, ciprofloxacin, fleroxacin…)

III.1.1.1-Công thức cấu tạo

(a)

(b)

(c) Hình 3- 2.Công thức cấu tạo của (a) Norfloxacin; (b) Ciprofloxacin; (c)fleroxacin III.1.1.2-Tính chất quang 1- Quang phổ hấp thụ FQs trong môi trường trung tính (tức là dạng ion lưỡng cực của chúng) được đặc trưng bởi cường độ hấp thụ với cực đại hấp thụ tại 260-300nm, hệ số hấp thụ phân tử ɛmax = 2.0 – 2.5.104 M-1cm-1. Một cực đại yếu hơn ở trung tâm 320-340nm, gọi là bước sóng dài với ɛmax = 104 M-1cm-1 và một chân píc yếu kéo qua 350nm. Vị trí và cường độ của các phổ hấp thụ dưới 250nm phụ thuộc nhiều vào cấu trúc phân tử (hình vẽ 3-3), là dạng phổ hấp thụ của một số FQ tiêu biểu tại nồng độ 5.10-3M, đệm phosphat tại pH 7.4[14].

19

Hình 3- 3.Phổ hấp thụ của một số FQs tiêu biểu, trong đệm phosphat tại nồng độ 5.10-3M, pH 7.4, 20oC, Cell 1cm.-·-Rufloxacin 2.4.10-5M; –— Ofloxacin 2.52.10-5 M; +++ Norfloxacin 2.79.10-5M; ---Lomefloxacin 2.71.10-5 M; ……Enoxacin 2.53.10-5 M.[14] Theo sự giải thích cân bằng acid-bazơ ở trên thì sự thay đổi pH gây ra sự thay đổi lớn đến đặc điểm hấp thụ của FQs. Sự định tính phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, ví dụ, trong điều kiện đi từ axit đến kiềm, dải bước sóng dài của norfloxacin (NOR) chuyển sang màu đỏ và tăng cường độ, trong khi dải bước sóng ngắn lại chuyển sang màu xanh lam và giảm cường độ. Đặc điểm của sự hấp thụ bước sóng ngắn ở pH <3 rất phức tạp bởi sự có mặt của các vị trí proton hóa bổ sung tại trung tâm 1-N và 1’-N[14].

Như đã trình bày ở trên phổ hấp thụ và phát xạ của FQs phụ thuộc vào pH của dung dịch, các nghiên cứu cho thấy các cực đại đều bị dịch chuyển khi pH thay đổi. Quá trình proton hóa của nhân quinonlone và nhân naphtyridin cũng được nghiên cứu là ảnh hưởng đến quang phổ hấp thụ do trong hai nhân này có số nguyên tử nito khác nhau. Ví dụ, phổ hấp thụ của CIP trong dung dịch nước ở các giá trị pH khác nhau (HCl từ 1-10 M).Có thể thấy rằng các dải phổ tương ứng với 20

sự chuyển tiếp π → π* và n → π* rất nhạy với sự thay đổi pH. Khi pH giảm thì dải có bước sóng ngắn sẽ tăng cường độ hấp thụ, ngược lại dải có bước sóng dài thì giảm cường độ. Để giải thích sự khác biệt này trong phổ phát quang và phổ hấp thụ theo cấu trúc hình học và cấu trúc electron, kết quả phân tích X-ray của tinh thể FQ được tổng hợp khi thực hiện trong dung dịch acid mạnh [2].

Hình 3- 4.Phổ hấp thụ của CIP tại các nồng độ khác nhau của HCl 1-10M, C=5.10-5M 2-Phổ huỳnh quang Phổ hấp thụ phụ thuộc rất lớn vào giá trị pH của dung dịch, nó cũng được phản ánh trong phổ phát xạ huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang đáng kể trong môi trường trung tính và môi trường acid vừa phải, phát xạ yếu trong môi trường ba zơ và acid mạnh.Điều này phù hợp với sự tồn tại của sự phát huỳnh quang đáng kể ở các dạng cation và lưỡng tính, phát xạ kém ở dạng anion.

21

Hình 3- 5.Phổ huỳnh quang ở nhiệt độ phòng của norfloxacin tại pH 1.2 (1); 3.4 (2); 7.4 (3) và 10.8 (4) [14] Ngoài ra pH còn gây ra sự thay đổi về hiệu suất huỳnh quang và thời gian sống huỳnh quang- lifetime.

Hình 3- 6.Hiệu suất huỳnh quang Φ và thời gian sống huỳnh quang τ của Norfloxacin.[14] 3-Phổ huỳnh quang phân giải theo thời gian [2]Ví dụ: quang phổ phân giải theo thời gian của CIP trong dung dịch HCl 1M như hình vẽ 3-7, kết quả cho thấy phổ phát quang đầu tiên ở cực đại λ=417nm là dạng trung tính của CIP, sau đó đến cực 22

đại thứ 2 ở λ=445nm, đó là dạng proton hóa CIPH 32 + .Bảng 3.1. thời gian sống của CIP ở dạng trung tính, (pH 7.4) và dạng proton hóa CIPH 22 + (pH 0) và dạng diproton hóaCIPH 32 + .

Hình 3- 7.Phổ phân giải theo thời gian của CIP 10-5M, HCl 1M Bảng 3.1. Đặc tính quang của FQ ở dạng trung hòa và dạng proton hóa, CFQ = 5.10-5M FQ

λabs, nm

λfl, nm

Φfl

τ,ns

kfl.10-7

CIP

273

417

0.12

5.0

5.8

CIPH 22 +

277

445

0.18

1.5

5.5

CIPH 32 +

277

430

0.09

0.7

13

Nói chung để nghiên cứu tính chất quang hóa của kháng sinh họ FQ các nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp thực nghiệm và hóa lượng tử. Kết quả cho thấy tính chất quang phụ thuộc vào khả năng proton hóa của chúng và số nguyên tử nitơ trong các vòng thơm, có số cặp e độc thân khác nhau, tương tác với liên kết π của 23

vòng thơm. Kết quả tính toán hóa học lượng tử chứng minh rằng, sự kích thích quang học FQs dẫn đến sự dịch chuyển mật độ điện tử trong phân tử.Định hướng của chúng phụ thuộc vào số proton và vị trí trong trung tâm phản ứng của các FQs. Mức độ proton hóa gây ra sự va chạm với vị trí có cặp e độc thân của ni tơ, kết quả làm giảm tương tác spin-orbital của n-electron với hệ liên hợp π trong các vòng thơm. A. V. Polishchukvà cộng sự đã tính toán các dạng anion và lưỡng cực của FQs được đăc trưng bởi π* →n (electron chuyển tiếp), trong khi các dạng còn lại là sự chuyển tiếp π*→π, điều này cũng là chứng minh cho sự phụ thuộc của sự phát quang vào giá trị pH của dung dịch.

III.1.2. Một nghiên cứu khác về tính chất quang của kháng sinh họ flouroquinolone thế hệ 3 và 4.(levofloxacinvà moxifloxacin)

Levofloxacin và moxifloxacin làhai kháng sinh họ FQs được nghiên cứu để đánh giá tính chất quang học và để khám phá cơ chế gây độc khi có ánh sáng. Các thí nghiệm được thực hiện trong dung dịch nước bằng phương pháp quang phổ ở trạng thái dừng và phân giải theo thời gian bằng ánh sáng đèn laser, để thu được con đường phân giải của các trạng kích thích của thuốc và trạng thái trung gian ngắn, khi chiếu xạ. Kết quả thu được cho thấy LEV có khả năng nhạy quang với sự phân rã của hồng cầu một cách độc lập với oxy. Và MOX một kháng sinh họ FQs được thay thế nhóm –MeO tại vị trí thứ 8, ít độc hại hơn so với các FQs khác. Thực nghiệm để làm sáng tỏ điều này được Giampietro Viola và cộng sự thực hiện [15].

24

Với phạm vi của chuyên đề, chúng tôi chỉ tìm hiểu một phần đó là tính chất quang của hai hợp chất trên để làm cơ sở cho mục đíchnghiên cứu định lượng bằng phương pháp quang hóa mà không đề cập đến khả năng gây độc tính của hai chất này khi bị chiếu xạ.

1- Quang phổ hấp thụ Nghiên cứu phổ hấp thụ của levofloxacin (LEV) và moxifloxacin (MOX) trong acetonitril (ACN) và trong các dung dịch nước ở các giá trị pH khác nhau, hình 3-8.Cả hai chất trong vùng UV-Vis đều có vị trí cực đại hấp thụ ảnh hưởng bởi độ bền, độ phân cực của dung môi.Cụ thể là, trong nước, dải chính là trung tâm quanh giá trị 290nm và thứ hai là ở 330-335nm. Trong ACN, phổ chuyển sang màu đỏ, và một vai xuất hiện ở cạnh đỏ của phổ (khoảng 360nm), chứng tỏ rằng trong dung môi ít phân cực và dung môi không protic (dung môi không chứa H+), trạng thái kích thích thấp nhất singlet được ổn định. Các dải chính có độ hấp thụ phân tử ɛ = 1-3.104 M-1cm-1 và cho phép e chuyển hoàn toàn từ π→π*, trong khi dải thứ hai trong ACN có ɛ = 0.5-0.7.104 M-1cm-1 và có thể là do trạng thái chuyển tiếp bị cấm một phần do cùng bản chất.

Hình 3- 8. Phổ hấp thụ của MOX (a) và LEV (b) trong ─ACN, -- H2O, …PBS 25

1- Phổ huỳnh quang và huỳnh quang phân giải theo thời gian Phổ huỳnh quang của MOX và LEV tương ứng cho các cực đại khác nhau phụ thuộc vào dung môi, hình vẽ 3-9.

Hình 3- 9.Phổ huỳnh quang của MOX (a), LEV (b) trongdung môi ─ACN, -H2O,..PBS Tính chất huỳnh quang của MOX và LEV trong dung môi ACN, H2Ovà PBS được thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Tính chất huỳnh quang của MOX và LEV trong các dung môi FQ

LEV

MOX

Dung môi

λmax (nm)

Φf

τf (%),(ns)

PBS

462

0.35

6.2

H2O

465

0.25

6.9

ACN

500

5.10-4

-

PBS

472

0.21

3.2

H2O

482

0.19

-

ACN

497

4.10-2

-

26

Cả hai MOX và LEV trong ACN có cực đại phát xạ ở 500nm trong khi trong dung dịch nước thì màu xanh dịch chuyển 20-30nm. Trong bảng 1 cho thấy đặc tính quang của MOX và LEV khác nhau trong các dung môi khác nhau. Mất hoạt tính ở trạng thái kích thích thấp nhất S1 bị ảnh hưởng lớn bởi dung môi thể hiện ở hiệu suất huỳnh quang Φ. Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào pH của dung dịch, hiệu suất huỳnh quang trong ACN là thấp nhất đặc biệt là LEV, nói cách khác thì trong dung môi không protic sự phát huỳnh quang là không đáng kể.

Thực nghiệm sự phân hủy quang học bằng đèn laser được tiến hành với cả hai hợp chất trong dung môi đệm PBS và ETN, kết quả ghi lại như hình vẽ 3-9, kết quả tương tự với LEV trong ETN. Quang phổ được ghi lại khi kết thúc xung laser, quan sát thấy có hai cực đại hấp thụ ở 390 và 720nm. Phân tích động học của các tín hiệu chỉ ra rằng các dải sóng phân hủy cả hai FQs trên là động học bậc nhất và tương ứng thời gian sống là 0.08µs và nó không ảnh hưởng bởi sự có mặt của phân tử oxy.

Hình 3- 10.Phổ hấp thụ phân giải theo thời gian của (a) MOX và (b) LEV trong đệm PBS 27

Phổ hấp thụ phân giải theo thời gian của MOX được ghi lại tương ứng 0.08 (○), 0.13 (∆) và 1.6 (◊) µs sau khi kết thúc xung bức xạ, động học phân hủy đo được ở 390 nm. LEV ghi lại được tương ứng 0.2 (○), 0.6 (∆), 2.4 (  ), và 8.0 (◊) µs, sau khi kết thúc xung bức xạ cực đại đo được ở 308 nm.

III.2. Phân tích định lượng trên cơ sở phản ứng quang hóa Định lượng bằng phương pháp huỳnh quang tĩnh, đó là phương pháp đo cường độ phát xạ tương ứng ở λex/λem thích hợp, khi phân tử đã trở về trạng thái cơ bản. Do cường độ huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ chất phát huỳnh quang trong dung dịch, đó là cơ sở để định lượng. Sau đây là bảng tổng hợp một số công trình nghiên cứu đã được công bố,điển hình cho việc định lượng FQs bằng phương pháp huỳnh quang tĩnh. Điều đó cho thấy sự đóng góp của phương pháp phổ huỳnh quanglà rất lớn, nó không chỉ phục vụ cho nghiên cứu đặc tính quang (mục III.1) của FQs giúp trong lĩnh vực y sinh, y học mà còn có thể định lượng chúng trong dược phẩm và dịch sinh học và trong nhiều lĩnh khác.

1-Định lượng 4-FQs trong dược phẩm thuốc viên bằng cơ chế phản ứng dịch chuyển điện tử, thuốc thử tạo phức huỳnh quang với các FQs là axít cloranilic (CL), cường độ huỳnh quang tăng lên 4-14 lần so với FQs trước khi phản ứngcủa tác giả Li Ming Du và cộng sự [16], sau đây là kết quả đã được công bố và chứng nhận.

Bảng 3.3. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên Tên 4-FQ/kết quả

LOM

FLE

CIP

NOR

TL TK

Axít cloranilic, dung môi axeton(đã được khảo sát) Tác chất, dung môi

và các điều kiện phản ứng đã tối ưu, phổ huỳnh quang trạng thái dừng, hình vẽ 3.11

Nhiệt độ phản ứng

35

30 28

35

30

[16]

Thời gian phản ứng

30

30

20

30

Thời gian ổn định

60

80

60

70

λex/λem

335/438

334/436

332/427

334/431

0.14-8.2

0.16-11.4

0.10-7.2

0.08-5.6

LOD (µg/ml)

0.08

0.09

0.06

0.02

LOQ (µg/ml)

0.14

0.16

0.10

0.08

R2

0.9995

0.9998

0.9991

0.9992

99.809±

99.939±

99.239±

99.179±

1.22

0.92

1.36

0.81

Khoảng tuyến tính (µg/ml)

Độ thu hồi (%), n = 5

Hình 3- 11.Phổ huỳnh quang của 4-FQ trước và sau khi tạo phức với axit Cloranilic (1’-9’) phổ kích thích, (1-9) phổ phát xạ.

29

Phổ kích thích và phát xạ của CL và 4-FQ trước khi tạo phức:(1, 1’) CL (3.10-4 mol/l), (2,2’) CIP (1.06 µg/ml), (3, 3’) NOR (1.02µg/ml), (4, 4’) FLE(1.18 µg/ml), (5, 5’) LOM (1.12 µg/ml).

Sau khi tạo phức thì cường độ huỳnh quang tăng lên khoảng từ 4-14 lần: (6, 6’) FLE(1.18 µg/ml) –CL, (7, 7’) LOM (1.12 µg/ml)-CL (8, 8’),CIP (1.06 µg/ml)-CL,(9, 9’) NOR (1.02 µg/ml)-CL. Cơ chế phản ứng quang hóa: CL đóng vai trò là chất nhận e và LOM, FLE, CIP, NOR là các hợp chất chứa Ni tơ, phức chất CL được tạo thành với các thuốc này, tỷ lệ mol phản ứng được xác định là 1:1, tỷ lệ này có thể do sự có mặt của nguyên tử flo hoạt động như một nhóm hút e trong phân tử 4-FQ. Vòng benzen có mật độ thấp hơn, nhưng nguyên tử nitơ trong 4 piperarin có mật độ e cao hơn và ít bị cản trở không gian.Vì vậy phức n-π được tạo thành, hình vẽ 3-12.

Hình 3- 12.Cơ chế dịch chuyển điện tử và sự hình thành phức của axit cloranilic với 4-FQs tương ứng (1)-LOM; (2)-FLE; (3)-CIP; (4)-NOR 2- Một nghiên cứu tương tự ngay sau đề tài trên của tác giả Li Ming Du vàcộng sự năm 2004 [17]. Định lượng ofloxacin,levofloxacin, lomefloxacin, và axit 30

pipemidictrong thuốc viên nén, thuốc viên nang và trong dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu) với cơ chế dịch chuyển điện tử trong phản ứng quang hóa tạo phức của các FQs trên với tác chất là 7,7,8,8-tetracyanoquinodimetan (TCNQ).

Cường độ huỳnh quang của các phức chất mới được tạo thành tăng từ 15–90 lần so với cường độ của chính bản thân các FQs. Đề tài này có tính mới hơn đó là có thể định lượng được các FQs này trong dịch sinh học vàtrong cùng một điều kiện đã khảo sát với nền mẫu là dược phẩm.

3-Phương pháp tạo phức làm tăng và ổn định cường độ huỳnh quang là phương pháp đơn giản, hiệu quả. Tuy nhiên, còn có thể làm tăng huỳnh quang hơn nữa đó là tạo mixen tăng huỳnh quang, bằng cách thêm vào hỗn hợp gồm thuốc thử, FQs và một chất hoạt động bề mặt, nó có chức năng tạo mixen, do đó làm cường độ huỳnh quang tăng lên rất nhiều lần, giúp cho việc định lượng FQs một cách chính xác và dễ dàng hơn. Hai nghiên cứu sau đây là một ví dụ điển hình, đó là định lượng levofloxacin (LEV) và Moxifloxacin (MOX) trong thuốc viên và dịch sinh học (huyết thanh và nước tiêu).

Bảng 3.4. Điều kiện tối ưu và kết quả định lượng FQs trong thuốc viên Tác chất, điều kiện, kết quả Thuốc thử tạo phức

LEV Axit acetic 0,1M-đệm ntriacetat (pH 4)

MOX Europium(III), 1,7.10-5 M

Sodium dodecyl sulfat (SDS)

Sodium dodecyl benzene

pH 5, 8 mM, pH 4.5–6.0

sulfonate (SDBS), pH 9.2

λex/λem (nm)

494/292

373/614

Phổ huỳnh quang

Hình vẽ 3-13

Hinh vẽ 3-14

Nhiệt độ phản ứng

25.0 ± 0.1°C

-

LOD/LOQ (ng.ml-1)

30/100

2.8.10-3/-

Chất tạo mixen

31

Khoảng tuyến

20–3000

1.8.10-2 – 7.3

Độ thu hồi (%), (n=

101.4 (VN), 104.7 (NT), 105

100,7 (VN), 99.7 (NT),

5)

(HT)

99.2(HT)

RSD (%)

0,56 (VN), 0,8 (NT), 1,9 (HT)

TLTK

[18]

-1

tính(ng.ml )

1.35 (VN), 1.35 (NT),1.5(HT) [19]

VN: viên nén, NT: nước tiểu, HT: huyết thanh

Hình 3- 13.Phổ kích thích và phát xạ của LEV (1µg/ml) (A) trong dung dịch chưa tạo mixen (B) trong dung dịch tạo mixen với SDS 8mM

32

Hình 3- 14.Phổ phát xạ (a), phổ kích thích (b) của Eu3+–MOX–SDBS. (1)Eu3+; (2)MOX; (3)Eu3+–MOX; (4)Eu3+–MOX–SDBS, pH 9.2 Bên cạnh phương pháp đo huỳnh quang trong phản ứng quang hóa, phương pháp hóa phát quang cũng có nhiều ứng dụng trong phân tích FQs trong dược phẩm và dịch sinh học. Một số nghiên cứu tiêu biểu: định lượng một số FQs trong dược phẩm và dịch sinh học sử dụng hệ thuôc thử [Ru(bipy) 32 + ]–Ce(IV) với khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện thấp và độ thu hồi cao [20], sử dụng thuốc thử tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(II) cho phản ứng phát quang hóa học, để định lượng ofloxacin trong dược phẩm [21]. Ngoài ra còn rất nhiều nghiên cứu khác, thành công với phương pháp hóa phát quang để định lượng FQs trong các đối tượng khác như sữa, thức ăn chăn nuôi, thực phẩm, nước…vv.

IV. KẾT LUẬN Phản ứng quang hóa của FQs là một trong số những thành tựu và ứng dụng điển hình cho phản ứng quang hóa hữu cơ.Dựa vào cơ chế phản ứng quang hóa, cơ chế phát huỳnh quang ở trạng thái dừng và phân giải theo thời gian hay cơ chế tắt huỳnh quang trong phản ứng hóa phát quang là những cơ sở cho định lượng FQs trong dược phẩm và dịch sinh học. Dựa trên nền tảng lý thuyết căn bản và các nghiên cứu đã được công nhận chúng tôi đã có những định hướng kế thừa cho việc triển khai phần thực nghiệm của đề tài, phân tích đánh giá một số chất kháng sinh thuộc họ FQs thế hệ 2, 3, 4, đối tượng dự kiến là norfloxacin, ciprofloxacin, fleroxacin, levofloxacin và moxifloxacin. Dựa trên việc khảo sát hai phương pháp phát quang là phản ứng quang hóa và phản ứng hóa phát quang để đưa ra phương pháp phù hợp và hiệu quả nhất, tiếp theo là khảo sát thuốc thử,pH môi trường, dung môi…Nếu thành công thìhoàn toàn có thể áp dụng phương pháp vào thực tế tại các phòng kiểm nghiệm thuốc ở Việt Nam thay thế các phương pháp cũ hoặc phương pháp phức tạp, tốn kém hơn.

33

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]

A. Albini, S. Monti, and V. P. Gobetti, “Photophysics and photochemistry of fluoroquinolones,” pp. 238–250, 2003.

[2]

A. V. Polishchuk, E. T. Karaseva, T. B. Emelina, and V. E. Karasev, “Spectroscopic and photophysical properties of protonated forms of some fluoroquinolones in solutions,”J. Fluoresc., vol. 22, no. 1, pp. 373–379, 2012.

[3]

Peter Atkins & Julio de Paula, Physical Chemistry. Oxford, 2006.

[4]

. K. K. Rohatgi-Mukherjee, Fundamentals of Photochemistry. 1978.

[5]

Phan Thị Như Quỳnh, “Phương pháp phân tích bằng quang phổ huỳnh quang.” tr. 45–60, 2002.

[6]

Trần Tứ Hiếu, Giới thiệu phương pháp phát quang (huỳnh quang). 2003.

[7]

Trần Văn Nhân, Hóa lý - Tập 3. NXB Giáo dục.

[8]

J. R. Lakowicz, “Introduction to fluorescence,” Princ. Fluoresc. Spectrosc., pp. 1–27, 2006.

[9]

Joseph R. Lakowicz, “Principle of Fluorescence Spectroscopy,” no. Springer, 3rd Edition, 2006.

[10] J. A. Ocaña, M. Callejón, and F. J. Barragán, “Determination of trovafloxacin in human serum by time resolved terbium-sensitised luminescence,” Eur. J. Pharm. Sci., vol. 13, no. 3, pp. 297–301, 2001.

[11] R. C. Rodríguez‐Díaz, M. P. Aguilar‐Caballos, and A. Gómez‐Hens, “Sensitive Determination of Fluoroquinolone Antibiotics in Milk Samples Using Time‐Resolved Methodology,” Anal. Lett., vol. 37, no. 6, pp. 1163– 1175, 2004.

[12] N. Seedher and P. Agarwal, “Complexation of fluoroquinolone antibiotics with human serum albumin: A fluorescence quenching study,” J. Lumin., vol.

130, no. 10, pp. 1841–1848, 2010.

34

[13] T. H. Fereja, A. Hymete, and T. Gunasekaran, “A Recent Review on Chemiluminescence Reaction, Principle and Application on Pharmaceutical Analysis,” ISRN Spectrosc., vol. 2013, pp. 1–12, 2013.

[14] A. Albini, S. Monti, and V. P. Gobetti, “Photophysics and photochemistry of fluoroquinolones.,” Chem. Soc. Rev., vol. 32, no. 4, pp. 238–250, 2003.

[15] G. Viola et al., “Photophysical and phototoxic properties of the antibacterial fluoroquinolones levofloxacin and moxifloxacin,” Chem. Biodivers., vol. 1, no. 5, pp. 782–801, 2004.

[16] D. Liming, X. Qingqin, and Y. Jianmei, “Fluorescence spectroscopy determination of fluoroquinolones by charge-transfer reaction,” J. Pharm.

Biomed. Anal., vol. 33, no. 4, pp. 693–698, 2003.

[17] L. M. Du, Y. Q. Yang, and Q. M. Wang, “Spectrofluorometric determination of certain quinolone through charge transfer complex formation,” Anal.

Chim. Acta, vol. 516, no. 1–2, pp. 237–243, 2004.

[18] J. A. O. Gonzlez, M. Callejn Mochn, and F. J. B. De La Rosa, “Spectrofluorimetric determination of levofloxacin in tablets, human urine and serum,” Talanta, vol. 52, no. 6, pp. 1149–1156, 2000.

[19] M. Kamruzzaman et al., “Spectrofluorimetric study of the interaction between europium(III) and moxifloxacin in micellar solution and its analytical application,” Spectrochim. Acta - Part A Mol. Biomol. Spectrosc., vol. 86, pp.

375–380, 2012.

[20] F. A. Aly, S. A. Al-Tamimi, and A. A. Alwarthan, “Chemiluminescence determination of some fluoroquinolone derivatives in pharmaceutical formulations and biological fluids using [Ru(bipy)3/2+] - Ce(IV) system,” Talanta, vol. 53, no. 4, pp. 885–893, 2001.

[21] P. S. Francis and J. L. Adcock, “Chemiluminescence methods for the determination of ofloxacin,” Anal. Chim. Acta, vol. 541, no. 1–2, pp. 3–12.

35

36