TÌM HIỂU CÁC LOẠI DETECTOR SỬ DỤNG TRONG SẮC KÝ KHÍ & SẮC KÝ LỎNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU CÁC LOẠI DETECTOR SỬ DỤNG TRONG SẮC KÝ KHÍ

GVGD: TRẦN NGUYỄN AN SA SVTH: NGUYỄN LINH TÂM 10043861 NGUYỄN TẤN ĐẠT

10226241

MỤC LỤC I. SƠ LƯỢC VỀ CÁC LOẠI DETECTOR.

II. CÁC LOẠI DETECTOR THÔNG DỤNG HIỆN NAY & NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG.

I. SƠ LƯỢC VỀ DETECTOR DETECTOR: là một trong những bộ phận quan trọng sử dụng trong máy phân tích sắc ký, có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lượng không điện thành đại lượng điện và có chức năng phát hiện, đo độ lớn của các cấu tử khi ra khỏi cột sắc ký.

Nguyên tắc hoạt động của các detector: là dựa vào tính chất vật lí của các cấu tử như: tính chất hấp thụ và phát xạ ánh sáng, tính phân cực, tính khúc xạ, tính dẫn điện, dẫn nhiệt, khối lượng riêng…

I. SƠ LƯỢC VỀ DECTECTOR Có thể phân loại các detector thành 2 nhóm chính như sau: Detector vạn năng: đáp ứng với tất cả các chất tan Detector chọn lọc: đáp ứng với đăc tính riêng nào đó của chất tan Hiện nay đã có nhiều detector được nghiên cứu và chế nhưng chỉ có 4 loại được sử dụng phổ biến: Dẫn nhiệt TCD ( Thermal Conductivity Detector ) Ion hóa ngọn lửa FID ( Flame Ionisation Detector ) Nito phosphor NPD ( Nitrogen-phosphorus Detector ) Cộng kết điện tử ECD ( Electron Capture Detector )

II. CÁC LOẠI DETECTOR THÔNG DỤNG HIỆN NAY & NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA CHÚNG. 1. Detector dẫn nhiệt TCD ( Thermal Conductivity Detector ) 2. Detector Ion hóa ngọn lửa FID ( Flame Ionisation Detector ) 3. Detector Nito phosphor NPD ( Nitrogen-phosphorus Detector )

4. Detector Cộng kết điện tử ECD ( Electron Capture Detector )

1. Detector dẫn nhiệt TCD ( Thermal Conductivity Detector ) Detector TCD có thể thiết kế theo một số kiểu khác nhau. Trong đó có ba kiểu thường gặp là: tế bào dòng chảy, tế bào bán khuếch tán và tế bào khuếch tán.

A-kiểu tế bào dòng chảy.B-kiểu tế bào bán khuếch tán.C-kiểu tế bào khuếch tán

1. Detector dẫn nhiệt TCD ( Thermal Conductivity Detector ) Detector có 2 tế bào giống nhau, trong mỗi tê bào có sợi platin, điện trở của chúng phụ thuộc vào nhiệt độ, vì vậy cũng phụ thuộc vào tốc độ tỏa nhiệt. Tốc độ này liên quan đến độ dẫn nhiệt của khí bao quanh sợi platin Nguyên lý hoạt động: Dựa trên nguyên tắc cầu Wheatstone Khi khí mang đi qua cả 2 tế bào, điện trở của 2 sợi là như nhau, cầu cân bằng, cho ta đường nền ổn định Khi khí mang qua một tế bào, còn khí rửa giải đi qua tế bào thứ 2( có chất phân tích) đi qua tế bào thứ 2. Ở đây có mặt chất phân tích nên điện trở thay đổi làm cầu lệch vi trí cân bằng. Dựa trên sự thay đổi điện trở của cầu, gây sự mất cân bằng trong mạch, tạo một tín hiệu dưới dạng mũi sắc ký. Khi mẫu ra khỏi cột tín hiệu biến mất.

2. Detector Ion hóa ngọn lửa FID ( Flame Ionisation Detector ) Đây là detector sử dụng tín hiệu liên quan đến sự ion hóa các chất được rửa giải

2. Detector Ion hóa ngọn lửa FID ( Flame Ionisation Detector ) Sơ đồ nguyên lý hoạt động của detector ion hóa ngọn lửa (FID)

Đây là detector vạn năng, rất nhạy và đáp ứng với tất cả chất hữu cơ, có khoảng tuyến tính rộn nhất. Nhược điểm là không đáp ứng với chất vô cơ vì chúng không cháy được

3. Detector Nito phosphor NPD ( Nitrogen-phosphorus Detector )

Hydro

3. Detector Nito phosphor NPD ( Nitrogen-phosphorus Detector ) Nguyên tắc làm việc: Đây cũng là một detector ion hóa ngọn lửa như FID, nhưng chỉ khác ở một điểm : có chuỗi hạt gốm tẩm muối Rb hoặc Cs đốt nóng tới 8000C đặt ngay trên ngọn lửa giữa cực góp và đầu đốt. Sự thay đổi này làm tăng đáp ứng của detector với hợp chất có nito lên 50 lần, với photpho lên 500 lần Sự tăng bí ẩn như trên tạo ra ưu thế về độ nhạy và độ chọn lọc cho phân tích định lượng các hợp chất chứa nito và photpho Đây là detector chọn lọc, khoảng tuyến tính nằm trung gian giữa TCD và FID

4. Detector Cộng kết điện tử ECD ( Electron Capture Detector )

4. Detector Cộng kết điện tử ECD ( Electron Capture Detector ) Nguyên tắc làm việc: gồm 3 quá trình * Quá trình ion hóa: một nguồn tia phóng xạ được lắp sẵn trong detector, phát ra một chùm tia β- với tốc độ 108-109 hạt/s. Các hạt βnày sẽ ion hóa phân tử khí mang (M) tạo ra các ion dương của phân tử khí mang và điện tử tự do sơ cấp (e-). So với các điện tử của chùm tia β- các điện tử tự do này chậm hơn hẳn. Chúng được gia tốc nhờ một điện trường và được chuyển dịch về phía anôt. Tại đây chúng bị lấymất điện tích và qua đó cho dòng điện nền của detector.

4. Detector Cộng kết điện tử ECD ( Electron Capture Detector ) * Quá trinh công kết điện tử các nguyên tử hoặc là phân tử của các chất (EC), sau khi rời bỏ cột tách, được đưa thẳng vào buồng ion cùng với khí mang. Tùy theo ái lực điện tử của các phân tử này, các điện tử tự do sơ cấp nói trên sẽ bị các phân tử đó bắt giữ và do vậy tạo ra các ion âm. * Quá trình tái kết hợp: các ion âm được tạo ra như vậy sẽ kết hợp với các ion dương của phân tử khí mang để tạo thành các phân tử trung hòa.

Như vậy do khả năng cộng kết điện tử của chất cần phân tích, điện tử bị lấy mất khỏi hệ và dòng điện nền bị giảm đi so với lúc chỉ có khí mang tinh khiết đi qua detector. Mức độ suy giảm của dòng điện nền trong thời điểm có chất đi qua được thể hiện bằng pic sắc ký của chất đó.

TÓM TẮT DETECTOR DẪN NHIỆT TCD

Giới hạn phát hiện: 2,5.10-6 Khoảng tuyến tính: 1:105 Độ nhạy A.s/g: 2000-9000 Đặc điểm: vạn năng, không phá hủy mẫu, khoảng tuyến tính hẹp, không nhạy với các chất vô cơ.

TÓM TẮT DETECTOR ION HÓA NGỌN LỬA FID

Giới hạn phát hiện: 5.10-12 Khoảng tuyến tính: 1:107 Độ nhạy A.s/g: 2.10-2 đối với cacbon Đặc điểm: rất nhạy, khoảng tuyến tính rộng, dùng rộng rãi nhất trong phân tích sắc ký khí

TÓM TẮT DETECTOR NITO PHOSPHOR NPD

Giới hạn phát hiện: 10-14 (N), 10-15 (P) Khoảng tuyến tính: Độ nhạy A.s/g: Đặc điểm: tương tự FID, chọn lọc với N và P, khoảng tuyến tính hẹp hơn FID

TÓM TẮT DETECTOR CỘNG KẾT ĐIỆN TỬ ECD

Giới hạn phát hiện: 2.10-14 Khoảng tuyến tính: 1:103 Độ nhạy A.s/g: 40 đối với lindan Đặc điểm: rất nhạy với các chất ái electron, dễ bị nhiễm bẩn, khoảng tuyến tính hẹp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]. Hóa phân tích, tập 2 Phân tích dụng cụ, tác giả PGS.TS. Trần Tử An, Nhà xuất bản y học, năm 2007.

[2]. Bài giảng NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA MỘT SỐ DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG VÀ KHÍ, Ths.

Lê Nhất Tâm, Khoa công nghệ

hóa, trường ĐHCN TP Hồ Chí Minh, 10/2006.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

TIỂU LUẬN MÔN

PHÂN TÍCH SẮC KÝ

Đề Tài:

TÌM HIỂU VỀ CÁC LOẠI

DETECTOR TRONG SẮC KÝ LỎNG GVGD: Th.S Trần Nguyễn An Sa Nhóm SV thực hiện: Đỗ Duy Tân – 10231391 Nguyễn Chí Thanh – 10230641

1. Giới Thiệu về Detector trong sắc ký lỏng 1.1 Tổng quan Detector được trang bị với flow-cell là một bước đột phá lớn trong sự phát triển của sắc ký lỏng hiện đại.

Phát hiện này lần đầu tiên được áp dụng bởi nhóm Tiselius, tại Thụy Điển vào năm 1940, bằng cách liên tục đo chỉ số khúc xạ của cột nước thải.

Hiện tại, Detector LC có phạm vi hoạt động rộng cho phép phân tích và quy mô chuẩn bị chạy trên cùng một công cụ. Chúng có độ nhạy cao, thường cho phép phát hiện lượng vết của các chất.

Hình 1.1: Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-1971)

Trong thập kỷ qua, có một tiến bộ đáng kể trong sự phát triển của detector trong HPLC trong đó HPLC ghép đầu dò MS được cho là có độ nhạy và độ chọn lọc cao nhất.

Nhiệm vụ của đầu dò (detector) là nhận biết các thành phần mẫu khi chúng giải hấp ra khỏi cột sắc ký. Đầu dò có khả năng phân tích cả định tính và định lượng. Để đầu dò phù hợp với mục đích sử dụng, cần thỏa mãn các yêu cầu về độ nhạy, tính chọn lọc, độ ổn định, dải tuyến tính, thể tích đầu dò và thời gian đáp ứng.

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC

* Tính chất chung của detector :  Tính chọn lọc cao.  Độ nhạy cao.  Trơ với mẫu và điều kiện môi trường, ổn định khi phân tích mẫu, thể tích nhỏ gọn, dễ sử dụng và dễ vận hành…

Trong sắc ký lỏng người ta thường dùng các quang phổ kế đo quang có độ nhạy cao, nhờ đó có thể nhận dạng các hợp chất đến nồng độ cực nhỏ 10-10 M trong miền ánh sáng nhìn thấy. Để dò tìm các chất không màu người ta thường dùng các máy đo chiết suất vi sai.

Khi phân tích các chất có khả năng oxy hóa – khử người ta dùng các bộ dò tìm điện hóa (đo điện thế, cực phổ). Người ta cũng dùng các bộ dò tìm huỳnh quang, đo độ dẫn điện.

1.2. Các thông số quan trọng của detector * Độ nhạy ( S > 2N) * Thời gian đáp ứng (response) * Khoảng tuyến tính * Độ chính xác, độ đúng Thời gian đáp ứng: là thời gian cần thiết để cho tín hiệu điện tương ứng với nồng độ nhất định trong pha khí được thiết lập.

Khoảng tuyến tính: đây là thông số quan trọng nhất để đánh giá chất lượng của bất kì một loại detector nào.

Nó bao gồm phạm vi kể từ nồng độ lớn cho tới nồng độ nhỏ nhất vẫn còn phân biệt rõ ràng so với can nhiễu của đường nền.

Hình 1.2 Khoảng tuyến tính của đồ thị

Khoảng tuyến tính của một detector được coi là lớn, nếu như: - Can nhiễu đường nền nhỏ và do vậy khả năng phát hiện của detector này lớn.

- Các lượng chất nhỏ nhất cũng như các lượng chất lớn nhất được phát hiện với khả năng đáp ứng như nhau.

Can nhiễu đường nền Nd= v1.A = v1/S

v1 ( mV): Đo trên thang ghi A : Hệ số khuyếch đại S : Độ suy giảm hệ số

Hình 1.3 so sánh độ nhiễu của dường nền

Detector noise

Sensitivity Nguyên nhân: Detector, máy ghi.

Khắc phục: sử dụng bộ lọc nhiễu.

Short Term noise

Long Term noise

Drift

Total noise

Nguyên nhân: sự không ổn định detector làm thay đổi môi trường xung quanh.

(VD: RID detector độ nhạy phụ thuộc nhiệt độ và áp suất) Nguyên nhân: - Mất cân bằng trong detector do nguồn điện cung cấp cho detector dẫn đến đầu ra thay đổi chậm.

- Thay đổi nhiệt độ xung quanh

1.3. Phân loại Detector I. Detector phát hiện sự thay đổi các đặc tính của dung dịch rửa giải - Detector điện hóa:(electrochemical detector ) đo dòng, cực phổ, độ dẫn .

- Detector chỉ số khúc xạ (chiết suất vi sai) (reflective index,RI) - Detector tán xạ bay hơi (evaporative light scattering detector ,ELSD) - Detector UV-VIS đơn bước sóng . (UV detector ) để phát hiện các chất hấp thụ quang. Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất.

- Detector huỳnh quang (fluorescence detector ) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.

Hình 1.4: một số UV Detector

II.Các detector quang phổ - Detector dãy diod quang (photodiode array , PDA ) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.

- Detector khối phổ (MS) • Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT) • Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS).

• Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) • Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole) Hình 1.5 Detector bẫy ion

Bảng 1.1: Bảng so sánh độ nhạy của một số detector trong LC

Bảng 1.2 Các thông số cơ bản của một số detector.

2. Nguyên lý hoạt động của một số detector trong sắc ký lỏng 2.1 Detector điện hóa Detector điện hóa thực chất là một máy phân tích điện hóa được dùng như một detector có độ nhạy cao và dựa vào sự thay đổi cường độ dòng điện, điện thế hay sự thay đổi độ dẫn, điện lượng,...

Nguyên tắc: Tín hiệu đo theo tính chất điện hóa tuân theo mối quan hệ sau:

A = k.C

A : tín hiệu đo K : hằng số thực nghiệm của phép đo ( phụ thuộc vào điều kiện thực nghiệm chọn trước & cấu tạo flowcell của detector...

I.Cấu tạo detector điện hóa

Phản điện cực

Gồm 2 bộ phận: - Buồng đo (flowcell) và điện cực.

- Hệ đo để nhận, khuếch đại tín hiệu nhận được,ghi nhận cũng như điều khiển quá trình đo.

RE-3V điện cực tham chiếu

Vòng đệm Điện cực hoạt động

Cấu tạo flowcell

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo chi tiết của flow-cell trong detector điện hóa

II. Hệ điện cực Hệ điện cực của detector điện hóa thường gồm 3 loại điện cực

Một vài loại điện cực thường dùng

Hình 2.2 Một số điện cực thường dùng

III.Một số detector điện hóa dùng trong HPLC Detector điện hóa có nhiều loại khác nhau.

Dựa vào nguyên tắc và cấu tạo người ta phân ra thành các loại sau : - Detector Amor - Detector cực phổ - Detector : + cực phổ dòng một chiều + cực phổ sóng thường + cực phổ sóng vuông + cực phổ xung vi phân + cực phổ hỗn hống...

- Detector đo thế với điện cực chọn lọc ion - Detector đo độ dẫn - Detector đo điện dung - Detector đo điện lượng

IV. Ứng dụng của detector điện hóa Trong kĩ thuật phân tích HPLC thì các detector điện hóa là một công cụ quan trọng để phát hiện và định lượng các chất vô cơ cũng như hữu cơ có tính chất điện hóa học. Dù bằng phương pháp trực tiếp hay gián tiếp.

Trong lĩnh vực phân tích hữu cơ, hầu hết các ứng dụng của detector điện hóa là để phát hiện các hợp chất có trong các loại mẫu y học, sinh học, thực phẩm, môi trường ECD

rất

nhạy

,

có Bảng 2.1 Vài ví dụ về detector điện hóa trong phân tích vô cơ

khoảng tuyến tính cao và có khả năng

phân tích

các mẫu sinh học, môi trường

như:

catecholamines, acetylcholine,

glutamate,

glycine, GABA,… .

Bảng 2.2 Các nhóm chất được phát hiện bởi các detector khác nhau

2.2. UV detector I. Giới thiệu UV detector là đầu dò phổ biến rộng rãi nhất trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Thiết bị này là đơn giản và dễ dàng phân tích được nhiều chất phân tích phù hợp cho HPLC hấp thụ tia UV. - Khoảng tuyến tính rộng.

- Thể tích chết tương đối nhỏ nên UV detector kết hợp hiệu quả với HPLC. Nếu cần thiết, phạm vi bước sóng có thể dễ dàng mở rộng sang vùng ánh sáng nhìn thấy (VIS) để phát hiện các chất phân tích có màu. Đây là lý do tại sao nó là rấtphổ biến và được sử dụng từ lâu kể từ những ngày khi các nhà hóa học xây dựng nên phương pháp phân tích sắc ký lỏng, nó được dùng phổ biến từ năm 1958.

II. Nguyên tắc và Cấu tạo Nguyên tắc đo: dựa vào định luật Lambert – Beer:

A=log(I0/I)= ε. L.C

Mối liên hệ giữa cường độ ánh sáng UV truyền qua cell đo và nồng độ chất tan

IT = Io.e-kLC Cấu tạo flowcell trong UV detector

Ln.IT = Ln.Io.e-kLC

Io: cường độ ánh sáng tới cell.

IT : cường độ ánh sáng truyền qua.

L: chiều dài của cell đo.

C: nồng độ chất tan. k: hệ số dập tắt phân tử (chất tan, bước sóng).

Hình 2.3 cấu tạo flow-cell trong UV detector

Đầu dò này đo sự tập trung của mẫu dưới một dãy bước sóng trong giới hạn nhất định khi chúng rời khỏi cột và đi xuyên qua detector của dòng pin.

Khi không có bước sóng đi xuyên qua detector tín hiệu là một giá trị không đổi.

Khi mẫu có bước sóng đi qua detector, detector sẽ phản ứng lại tín hiệu được hiển thị trên màn hình.

Dưới hình thức đơn giản nhất đầu dò UV bao gồm: Nguồn sáng, dòng Pin, dòng cảm biến.

Hình 2.4 sơ đồ hệ thống đo trong HPLC

Nguyên tắc hoạt động : Khi không có mẫu qua detector ánh sáng đi qua dòng pin và phát ra tín hiệu lớn nhất tại

VIDEO NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA UV DETECTOR

dòng cảm biến nếu một mẫu có bước sóng đi qua detector, mẫu này làm giảm lượng ánh sáng ở dòng cảm biến và là nguyên nhân làm thay đổi tín hiệu ở detector.

Tín hiệu này chuyển một dòng electron và xuất hiện sắc phổ trên giấy. Tín hiệu hiển thị tăng lên tập trung tại mẫu của dòng pin.

Hình 2.5 quan hệ giữa độ nhạy và bước sóng

III.Detector UV_VIS đơn bước sóng Đầu dò UV có bước sóng thay đổi sử dụng ánh sáng đơn sắc ( cho ánh sáng đi qua khe và tấm cách ) Để chọn 1 bước sóng ánh sáng đi qua mẫu.

Hình 2.6 sơ đồ hoạt động của UV-VIS đơn bước sóng

Sơ đồ cấu tạo của UV-VIS detector – Đơn bước sóng

Hình 2.7 Sơ đồ cấu tạo của UV-VIS detector – Đơn bước sóng

Mô tả một UV detector đơn bước sóng - Kích thước Cell đo (L=1-10 mm, bk = 1mm) - Đèn : Đèn hơi thủy ngân (253.7 nm) -> đầu dò nhạy với nhiều chất tan.

- Đèn hơi kẽm (212.9 nm và 307.6 nm) - Đèn hơi Cd (228.8, 326.1, 340.3, 346.6 nm)- Độ nhạy cao (5x10-5mg/ml), độ chọn lọc cao - Khoảng tuyến tính (5x10-5 - 5x10-1mg/ml) - Response Index (0.98 – 1.02)

Hình 2.8 mô tả nguyên lý của UV-VIS detector

IV. Đầu dò photodiode array (PAD) - Đầu có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.

Hình 2.9 Sơ đồ của quang phổ dãy điốt quang

Sơ đồ cấu tạo của PAD – Đa bước sóng

Hình 2.10 Sơ đồ cấu tạo của PAD – Đa bước sóng

Ghi lại thời gian của một peak đặc trưng, phổ đồ của chất tan. Phổ ghi nhận được dưới dạng 3D

Ưu điểm : độ nhạy cao (10-4 mg/ml), độ chọn lọc cao Khoảng tuyến tính (5x10-4 - 5x10-1 mg/ml) Response Index (0.97 – 1.03)

Hình 2.11 phổ đồ độ hấp thu quang của PAD

Phổ đồ của PAD

V. Ảnh hưởng của nhiệt đến Cell đo Nói chung, hình dạng phổ đồ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi trường

absorbance ở nhiệt độ thấp absorbance ở nhiệt độ cao Sự khác biệt giữa độ hấp thu do chênh lệch nhiệt độ

VI. Không khí hòa tan trong pha động ảnh hưởng peak trong UV detector Detection: UV-210nm

Pha động được khử không khí

Pha Pha động động được chưa khử không khí được khử không khí

2.3 Detector tán xạ bay hơi (evaporating light scattering detector ,ELSD) Evaporating Light Scattering Detector (ELSD), hay còn gọi là Detector tán xạ bay hơi, thích hợp cho việc phát hiện các thành phần mẫu không bay hơi trong một dung môi dễ bay hơi.

ELSD sử dụng ánh sáng phản xạ và tán xạ và một biến quang có độ nhạy cao để đo nồng độ chất phân tích.

Các ứng dụng của một ELSD rất rộng vì thế nó là một trong các detector phổ biến nhất sử dụng cho HPLC. Không giống như chỉ số khúc xạ (RI), ELSD một có thể được sử dụng với Gradient rửa giải, nhưng một máy dò RI có thể được sử dụng với các muối đệm hòa tan trong dung môi, trong khi ELSD có thể không dùng được.

Nguyên tắc hoạt động Các dòng dung môi đi qua một nebuliser vào một buồng bốc hơi, dung môi được bốc hơi để lại một màn sương của các hạt mẫu nhỏ.

Những phân tán chùm tia sáng, và mức độ của sự tán xạ ánh sáng là tỷ lệ thuận với số lượng hiện tại mẫu.

Hình 2.12 sơ đồ cấu tạo của ELSD

Quá trình thực hiện: Gồm 3 giai đoạn

Ống phun

Bay hơi

1. Ống phun Cột mẫu đi vào thông qua một lổ nhỏ như lỗ kim và pha trộn với khí nitơ để hình thành một hệ phân tán với các hạt nhỏ.

ELSD đòi hỏi cung cấp một nguồn khí sạch (tốt nhất là khí trơ) khô.

Không khí nén đôi khi được sử dụng, nhưng cần loại bỏ các dấu vết của dầu hoặc nước, vì chúng sẽ cho ra một đường nền rất nhiễu.

Khí phải được cung cấp ở áp suất khoảng 30 psi (2Bar), và có lưu lượng khí trong ống là 0,5 - 5 lít mỗi phút. Bởi vì hơi dung môi đi ra , nó phải được sử dụng trong tủ bay hơi, hoặc hơi ra một tủ bay hơi thông qua một ống nhỏ có đường kính khoảng 8cm.

2. Bay hơi Các hạt nhỏ đi qua nguồn nhiệt “drift tube” nơi mà pha động bốc hơi, để lại một màn sương của mẫu khô là các hạt theo hơi dung môi

3. Detection

Photomultiplier Các hạt mẫu vượt qua thông qua một

cell và ánh sáng tán xạ từ một chùm tia laser.

Các ánh sáng tán xạ được phát hiện,tạo ra tín hiệu.

Nguồn sáng

Phổ đồ của ELSD trong phân tích lipit

2.4.Detector chỉ số khúc xạ RI (Refractive Index) Nguyên tắc phát hiện liên quan đến việc đo lường sự thay đổi trong chỉ số khúc xạ của các dung dịch tách được từ cột sắc kí lỏng.

Sự khác biệt lớn về chỉ số chiết suất giữa mẫu và pha động càng lớn thì càng tạo ra một sự mất cân bằng lớn.

Nên tính nhạy của đầu dò sẽ cao hơn nếu có sự cách biệt về chỉ số chiết suất giữa pha động và pha tĩnh.

( RI ) = K RI c ( dn / dc ) C: là nồng độ chất tan mg/ml dn/dc: là độ tăng chỉ số khúc xạ của chất tan KRI: là hằng số

Hình 2.13 Hiện tượng thay đổi góc khúc xạ

I. Cấu tạo detector RI Đầu dò chiết suất RI là một

Tungsten lamp Condenser lens Light-recerving element Zero” glass Heat exchange Collimator lens Flow cells Mirrow

dụng cụ đòi hỏi có độ chính xác cao, bất cứ sự thay đổi nào trong thành phần của các cấu tử cần tách cũng đòi hỏi sự tái lặp cân bằng của đầu dò.

Nguyên lý hoạt động Biểu đồ thể hiện cách hoạt động của detector chiết suất RI được thể hiện theo hình sau: Hình 2.14 cấu tạo RID

Nguồn sáng

Bộ phận tiếp nhận ánh sáng

Phía bên mẫu

Phía bên Tham chiếu

2.5.Detector huỳnh quang (fluorescence detector) I. Giới thiệu Detector huỳnh quang là detector nhạy cảm nhất trong số các detector hiện đại hiện có HPLC. Có thể để phát hiện sự hiện diện của một phân tử chất phân tích duy nhất trong flow-cell.

Thông thường, độ nhạy huỳnh quang cao hơn 10 -1000 lần so với detector UV- VIS. Detector huỳnh quang chính xác và có tính chọn lọc hơn trong số các detector quang học khác.

Khoảng 15% các hợp chất có huỳnh quang trong tự nhiên. Sự hiện diện của liên hợp pi-electron, đặc biệt là trong các thành phần thơm cho cường độ huỳnh quang cao nhất. Ngoài ra, hợp chất béo và alicyclic với các nhóm cacbonyl và các hợp chất có liên kết đôi liên hợp đều phát huỳnh quang.

Là ứng dụng của quang phổ huỳnh quang.

Nó liên quan đến việc sử dụng một chùm sáng

khe

(thường là ánh sáng cực tím) kích thích các Mẫu

electron trong phân tử nhất định trong mẫu phân tích phát ra ánh sáng, thường là các ánh

khe

sáng nhìn thấy.

Khi một hợp chất có một nhóm chất đặc biệt được kích thích bởi bước sóng có năng lượng

Nguồn sáng

Lưới nhiễu xạ

thấp, bức xạ cao được gọi là Huỳnh Quang.

Detector

Thông thừơng sự phát xạ này đều đặn ở một góc 90o khi có sự kích thích.

Hình 2.15 Phương pháp quang phổ huỳnh quang

II. Cấu tạo - Ánh sáng huỳnh quang phát ra theo mọi hướng.

Một số ánh sáng huỳnh quang này đi qua một

sự kích thích

Flow cell

Nguồn sáng

bộ lọc đơn sắc thứ hai và đi đến một detector, thường được đặt ở góc 90 ° so với chùm tia ánh sáng tới để giảm thiểu nguy cơ

thay đổi sự kích thích và bước sóng phát xạ

của ánh sáng truyền tới hoặc phản chiếu đến các detector .

Bộ phận nhận quang

Hình 2.16 Nguyên tắc hoạt động của Fluorescence Detector

Sự phát xạ

3. Detector khối phổ trong LC (LC/MS) 3.1 Giới thiệu LC/MS là phương pháp được dùng trong phân tích vết (ppb, ppm) các hợp chất cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nhất định ngoài thời gian lưu đặc trưng, các chất còn được nhận danh bằng khối phổ của nó

3.2. Nguyên lý chung Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.

Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp.

Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-).

Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: • Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI).

• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI).

• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI).

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả.

Ph

3.3.Nguồn ion hóa trong đầu dò khối phổ I. Ion hóa tia điện (ESI) ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn.

Thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol.

Trong ESI, các ion được hình thành như sau: Khí phun vào

Ion dương Khí nitơ khô nóng

Phun dung môi rửa giải Các ion đi vào ống mao dẫn Hình 3.1 Sự hình thành ion trong ESI

II. Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) - APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.

- Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích hòa tan trong pha động sau khi ra khỏi cột sắc ký được cho đi ngang qua ống mao quản đốt nóng.

- Hợp chất đi theo luồng khí nóng ra khỏi ống để đến một vùng có áp suất khí quyển, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, tại đây có sự trao đổi proton để biến thành ion dương (M + H)+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm (M – H)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối.

III. Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI) Kết hợp ưu điểm của giữa dòng khí phun thẳng góc với dòng ion, đèn krypton trong nguồn sẽ phát ra các photon có năng lượng cao đủ để ion hóa nhiều hợp chất hóa học khác nhau. Đầu vào HPLC Khí phun vào

Ống phun Nhiệt

Đèn UV

Khí khô

ống mao dẫn

Hình 3.2 Sự hình thành ion trong APPI

3.4. Các loại đầu dò khối phổ Hiện nay, có bốn kiểu đầu dò khối phổ chính đang được sử dụng bao gồm: - Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT) - Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS).

- Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) - Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole)

3.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực Đầu dò tứ cực có độ nhạy cao được sử dụng trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS, thích hợp cho phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc.

I.Nguyên tắc hoạt động - Mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Sau đó bị ion hóa trong buồng API với kiểu ESI, APCI hoặc APPI. - Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối.

- Tại bộ phân tích khối, tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion.

II. Cấu tạo đầu dò khối phổ ba tứ cực Đầu dò khối phổ ba tứ cực bao gồm 4 bộ phận chính sau: - Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển: nguồn ion gồm ESI, APCI, APPI và MMI - Hệ quang học ion là một bát cực có tác dụng như bộ lọc khối để đưa ion vào tứ cực thứ nhất Q1.

- Bộ phân tích khối gồm một buồng va chạm, được xem là tứ cực thứ hai Q2 đặt ở giữa Q1 và Q3.

- Đầu dò phát hiện ion gồm có 2 dynode đặt vuông góc với dòng các ion và phân tử trung tính đi ra khỏi bộ phân tích khối.

Video clip giới thiệu máy Agilent 6410 Triplequad LC/MS/MS Hình 3.3 Cấu tạo đầu dò khối phổ Triple Quad Agilent

3.4.2 Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò Ion Trap I. Nguyên tắc hoạt động đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion trap) - Ban đầu mẫu bị ion hóa trong buồng API với kiểu APCI hoặc ESI. Ion sinh ra được đưa vào bộ phân tích khối.

- Ở đó, ion sẽ bị bẫy trong những quĩ đạo được ổn định bởi một điện trường thay đổi theo thời gian .

- Tùy theo hiệu điện thế âm hay dương áp vào những thấu kính mà các ion dương hoặc âm sẽ được dẫn tới bộ phân tích khối.

- Ion cần phân tích sẽ có một tỉ lệ m/z xác định, và bị tách chọn lọc ra khỏi bộ phân tích khối và tạo một tín hiệu đặc trưng tại hệ thống phát hiện ion

II. Cấu tạo đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion trap) Đầu dò bẫy ion gồm có bốn bộ phận chính như sau: • Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển (API). Đầu dò LCQ MS có hai nguồn ion hóa là ESI và APCI • Hệ quang học ion (ion optics).

• Bộ phân tích khối (mass analyzer).

• Hệ thống phát hiện ion (ion detection system).

Video clip giới thiệu máy AB SCIEX QTRAP® 5500 LC_MS_MS System iontrap

Hình 3.4 Sơ đồ đầu dò MS bẫy ion

Tài liệu tham khảo

1. Ths.Lê Nhất Tâm - Nguyên lý hoạt động của một số detector trong sắc ký lỏng và khí, Trường Đại Học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2006.

2. Nguyễn Thị Thu Vân - Phân tích định lượng, Trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, 2010, trang 512.

3. Dr. Shulamit Levin, Medtechnica- www.forumsci.co.il/HPLC.