SẮC KÝ LỌC GEL GVHD TRẦN THANH TUẤN

SẮC KÝ LỌC GEL GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TRẦN THANH TUẤN

GIỚI THIỆU

Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử.

Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution).

Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt.

Quá trình phân tách bằng phương pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed). Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ.

Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt.

Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài được xem là pha động.

LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL

Đặc điểm của quá trình Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đổ giải li hay phổ đồ sắc kí cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thụ tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử.

Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng, Ve (elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí.

Có 3 cách để xác định Ve:

Biểu đồ thể hiện V0 và Vt

Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị Kav ứng với log Mr của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc.

Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu. Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị Vt (Kav = 1) + Nếu Kav > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (Ve > Vt). + Nếu Kav < 0, có thể trong cột đã xuất hiện những kênh, rãnh mà các phân tử có thể chảy tắt qua cột (Ve < Vo).

Độ giải li

Các thông số để xác định độ giải li

Độ giải li là hàm của độ chọn lọc của phương pháp và hiệu quả của phương pháp tạo ra những mũi hẹp.

Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá trình giải li và được xác định dựa trên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N): N = 5.54(Ve/W1/2)2 . 1000/L Trong đó: + Ve: thể tích mũi giải li. + W1/2: chiều rộng mũi tại một nửa chiều cao mũi. + L: chiều cao đệm.

Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình khuếch tán xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng thể tích mẫu tối đa trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có vùng giản rộng thì thể tích tối đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách: VSep = VeB - VeA

PHÂN LOẠI GEL

Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố: + Mục tiêu của thí nghiệm (phân tích độ phân giải cao hay tách thành từng nhóm hợp chất) + Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và chất bẩn Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex,Sephacryl, Superose và Sphadex và Sphadex LH-20

Superdex Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp Superdex là loại gel được lựa chọn đầu tiên cho độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt.

Superdex được sản xuất với hai loại kích thước hạt với 4 độ chọn lọc khác nhau (Superdex Peptide , superdex 30, Superdex 75, Superdex 200).

Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 13 của Superdex Peptide Superdex 30, Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ.

Sử dụng cột nhồi sẵn hạt kích thước 34 của Superdex perep grade cho qui mô công nghiệp.

Khi không biết khối lượng của protein quan tâm thì nên bắt đầu với Superdex 200. Superdex 200 hay Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc phân tách kháng thể đơn dòng từ dimerr và từ chất bẩn có khối lượng phân tử thấp.

Sephacryl Sephacryl là lựa chọn cho phân tách nhanh, độ thu hồi cao tại phòng thí nghiệm và qui mô công nghiệp.

Sephacryl Superdex High Resolution (HR) thay thế cho superdex prep grade trong những ướng dụng đòi hỏi khoảng tuông đối rộng ,độ bền hóa học và chịu được tốc độ dòng cao là cho Sephacryl phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp.

Superose Superose có thể dùng trong khoảng khối lượng phân tử rộng nhưng không phù hợp cho phân tách qui mô công nghiệp Superose là loại gel bền vật lí và hóa học cao, hình thành dựa trên liên kết ngang cùng phân tử lỗ xốp agarose. Một vài tương tác kị nước với gel làm cho những phân tử kị nước nhỏ, aromatic peptides, membrane proteins và lipoproteins có thể được giải li chậm hơn dự đoán. Tuy nhiên, trong 1 vài ứng dụng , những tương tác này có thể giúp làm tăng độ giải li của quá trình phân tách.

Sephadex Sephadex được dùng để tách nhanh những nhóm có khối lượng phân tử nhỏ , khử muối, đổi dạng dung môi và làm sạch mẫu.

Sephadex được tạo thành bởi liên kết ngang giữa dextran với epichlorohydrin.

Những loại khác nhau của Sephadex là do mức độ khác nhau của liên kết ngang và vì vậy nó có những mức độ trương nở và độ chọn lọc khác nhau cho những kích thước phân tử đăc trưng.

Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 được sản xuất dành riêng cho việc phân tách và tinh chế các hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi sự có mặt của dung môi hữu cơ để duy trì độ bền cả chúng.

Nó được sư dụng trong phân tích và trong qui mô công nghiệp để phân tách những nhóm chất có tính chất tương tự nhau.

Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh khiết cao bằng sắc kí tao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang (diastereoisomers).

ỨNG DỤNG

Khử muối – đổi dung môi – làm tang nồng độ protein

Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6

Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu

Sắc kí gel trong chiến lược tinh chế. Để tinh chế ở mức độ cao hay khi không tìm được phối tử phù hợp cho phương pháp tinh chế một giai đoạn bằng cột ái lực, một phương pháp nhiều giai đoạn hiệu quả được phát triển để sử dụng cho quá trình tinh chế, phương pháp này gọi tắc là CIPP. CIPP được sử dụng cho công nghệ dược và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để đảm bảo phát triển một phương pháp nhanh, hiệu quả và chất lượng cao.

Xác định khối lượng phân tử và phân tích sự phân bố khối lượng phân tử.

Không giống như kỹ thuật điện di, sắc kí gel cung cấp phương pháp để xác định khối lượng phân tử hay kích thước của protein tự nhiên hay protein biến tính dưới những điều kiện khác nhau về pH,nhiệt độ, ái lực các ion.

Việc xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp sắc kí gel có thể thực hiện bằng cách so sánh thông số thể tích giải li (Vc) hay Kav của chất quan tâm với giá trị thu được từ chất chuẩn đã biết trước.

Đường cong chuẩn được xây dựng bằng cách đo thế tích giải li của một vài chất chuẩn, tính giá trị Kav tương ứng và vẽ giá trị Kav tương ứng với logarit khối lương phân tử của chúng.

Khối lượng phân tử của một chất chưa biết có thể xác định từ đường cong chuẩn khi đo giá trị Vc và tính giá trị Kav của chúng.

Thông số giải li khác như V0, Vc/Vo, Kd cũng có thể được sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn nhưng giá trị Kav thường được sử dụng vì nó ít bị ảnh hưởng bởi sai số do sự khác nhau về thông số và sự chuẩn bị cột; ngoài ra không đòi hỏi xác định chính xác giá trị Vi như đối với Kd.

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE THE END