BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG MSV: 1201629
ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2017
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG MSV: 1201629
ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Văn Hân 2. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp Nơi thực hiện: Viện Dược liệu
HÀ NỘI – 2017
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
LỜI CẢM ƠN! Lời đầu tiên em xin tỏ lòng biết ơn chân thành đối với thầy giáo TS.
H
N
điều kiện, giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Ơ
N
Nguyễn Văn Hân, người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã tạo
.Q
thành tới TS. Nguyễn Tuấn Hiệp đã định hướng, giúp đỡ và dạy dỗ em trong
TP
suốt thời gian làm nghiên cứu.
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh Đỗ Quang Thái cũng như
G
Đ
các anh chị khoa công nghệ chiết xuất- Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng
N
dẫn, chỉ bảo em tận tình và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận.
H Ư
Tiếp theo em xin phép gửi lòng biết ơn tới Viện Dược liệu đã tạo điều
TR ẦN
kiện thuận lợi và nhiều động lực để em có cơ hội được học hỏi nhiều hơn. Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học
10 00
B
Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những tháng năm học tập tại trường.
A
Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn
Í-
-L
gian qua.
H
Ó
tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận
TO
ÁN
không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè.
D
IỄ N
Đ
ÀN
Em xin chân thành cảm ơn!
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân
Hà Nội, tháng 04 năm 2017 Sinh viên Hoàng Thị Huyền Trang
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
MỤC LỤC
N
LỜI CẢM ƠN! .................................................................................................. 3
H
Ơ
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... 8
U Y
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ............................................................... 10
.Q
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
ẠO
TP
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 2
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
1.1. Tổng quan về Achyranthes bidentata Blume.......................................... 2
G
Đ
1.1.1. Về thực vật ........................................................................................ 2
H Ư
N
1.1.1.1. Vị trí phân loại của Ngưu tất ...................................................... 2 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật ...................................................................... 2
TR ẦN
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái........................................................................ 3 1.1.1.4. Bộ phận dùng .............................................................................. 4
10 00
B
1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 4 1.1.2.1. Saponin ....................................................................................... 4
Ó
A
1.1.2.2. Phytoecdysteroid......................................................................... 6
H
1.1.2.3. Polysacharid ................................................................................ 6
-L
Í-
1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................. 7
ÁN
1.2. Tổng quan về phương pháp tinh chế....................................................... 8
TO
1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) ..................................................... 8
D
IỄ N
Đ
ÀN
1.2.1.1 Khái niệm.................................................................................... 8 1.2.1.2 Nguyên tắc và cơ chế của SPE .................................................... 8
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ 9
1.2.1.3. Ứng dụng .................................................................................... 9 1.2.2. Tổng quan về hạt nhựa macroporous.............................................. 10 1.2.2.1. Định nghĩa và phân loại ............................................................ 10 1.2.2.2. Đặc điểm hạt nhựa macroporous .............................................. 11 1.2.2.3. Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101 ............................. 11
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.2.2.3.1. Thông số vật lý ................................................................... 11
Ơ
1.2.2.3.3. Ứng dụng trong tách chiết saponin .................................... 12
N
1.2.2.3.2. Cơ chế hấp phụ saponin của hạt nhựa D101 ...................... 12
H
1.2.2.4.4. Ứng dụng hạt nhựa trong nghiên cứu Ngưu tất.................. 13
.Q
2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ...................... 15
TP
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................... 15
ẠO
2.1.2. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ .............................................................. 16
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
2.1.2.1. Hoá chất .................................................................................... 16
N
G
2.1.2.2. Dụng cụ ..................................................................................... 16
H Ư
2.1.2.3. Thiết bị ...................................................................................... 16
TR ẦN
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 17 2.2.1. Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu........................................ 17
B
2.2.2. Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa
10 00
macroporous D101 .................................................................................... 17
A
2.2.3. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa
H
Ó
macroporous D101 .................................................................................... 17
Í-
2.2.4. Đề xuất và ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt
-L
nhựa macroporous D101 ........................................................................... 17
ÁN
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 17
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng ................................................. 17 2.3.1.1. Phương pháp thuỷ phân ............................................................ 17
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 15
2.3.1.2. Phương pháp định tính.............................................................. 18 2.3.1.3. Phương pháp định lượng .......................................................... 18 2.3.2. Phương pháp chiết .......................................................................... 19 2.3.3. Phương pháp xử lý dịch chiết ......................................................... 19 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu .......................... 19
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết
H
2.3.5.2. Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên
Ơ
2.3.5.1. Phương pháp khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột ............ 21
N
lên hạt nhựa macroporous D101 ............................................................... 21
.Q
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa
TP
macroporous D101 .................................................................................... 23
ẠO
2.3.6.1. Khảo sát dung môi giải hấp phụ ............................................... 23
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
2.3.6.2. Khảo sát thể tích rửa giải .......................................................... 24
N
G
2.3.7. Đề xuất và ổn định quy trình làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất ứng
H Ư
dụng hạt nhựa macroporous D101 ............................................................ 24
TR ẦN
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 27 3.1. Nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu ...................................................... 27
B
3.2. Khảo sát quá trình hấp phụ saponin lên hạt nhựa macroporous D101 ở
10 00
điều kiện động .............................................................................................. 28
A
3.2.1. Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột........................................ 28
H
Ó
3.2.2. Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều kiện động ... 29
Í-
3.3. Khảo sát quá trình giải hấp phụ saponin trên hạt nhựa macroporous
-L
D101 ............................................................................................................. 30
ÁN
3.3.1. Lựa chọn dung môi giải hấp phụ saponin ....................................... 30
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
3.3.2. Khảo sát thể tích rửa giải ................................................................ 31 3.3.2.1. Quá trình rửa tạp chất ............................................................... 31
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
điều kiện động........................................................................................ 22
3.3.2.2. Quá trình giải hấp phụ bằng ethanol 50%, 70%, 96% ............. 33
3.4 Đề xuất quy trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 ............................................................................................................. 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 37 4.1. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu .................................................. 37
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
4.1.1. Phương pháp chiết và xử lý dịch chiết............................................ 37
Ơ
4.2. Bàn luận về kết quả ............................................................................... 39
N
4.1.2. Bàn luận về phương pháp tinh chế saponin trong rễ Ngưu tất ....... 37
N
H
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................ 41
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
PHỤ LỤC .......................................................................................................... 7
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên β-D-glucopyranosyl
Abp
Achyranthes bidentata polysacharid
AbpS
Achyranthes bidentata polysacharid sulfat
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
SKLM
Sắc ký lớp mỏng
Đ
Dung lượng hấp phụ
Qe
Ethanol
TR ẦN
EtOH
N
G
Chiết pha rắn
H Ư
SPE
ẠO
HPLC
Thể tích: thể tích
kl:v
Khối lượng/ thể tích
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10 00
B
v:v
D
IỄ N
Đ
ÀN
TP
Bed volume
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
.Q
U Y
N
H
Ơ
Glc
BV
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
N
Ký hiệu
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
DANH MỤC CÁC BẢNG Trang
N
Tên bảng Trình bày một số saponin oleanolic phân lập từ rễ Ngưu tất
1.2
Đặc tính vật lý một số loại hạt nhựa macroporous
1.3
Thông số vật lý của hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất
2.1
Tên hoá chất và nguồn gốc
3.1
Ảnh hưởng của các tác nhân đến dung lượng hấp phụ của hạt nhựa
3.2
Ảnh hưởng của tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột lên dung lượng hấp phụ
3.3
Kết quả dung lượng hấp phụ của hạt nhựa
3.4
Khối lượng cắn loại được sau rửa tạp với nước và ethanol
33
3.5
Kết quả phân lập saponin Ngưu tất trên quy mô 170 g (n=3)
36
N
H
5
Ơ
1.1
ẠO
TP
.Q
11 16 27
G
N
H Ư
TR ẦN
B 10 00 A Ó H Í-L ÁN TO
39
D
IỄ N
Đ
ÀN
38
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
10
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Bảng
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Trang
1.1
Achyranthes bidentata
1.2
Axit oleanolic
1.3
Cấu trúc hóa học của β-ecdysterone (I), inokosterone (II), rubrosterone (III)
2.1
Hình ảnh dược liệu Ngưu tất
2.2
Hình ảnh hạt nhựa macroporous D101
3.1
Ảnh hưởng của các tác nhân đến dung lượng hấp phụ của hạt nhựa
3.2
Ảnh hưởng của tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột lên hiệu suất giải hấp phụ
38
3.3
Hình ảnh sắc ký của dịch ra theo mỗi BV
39
3.4
So sánh khả năng rửa giải của các dung môi lựa chọn
30
3.5
Sắc ký đồ của dịch ra theo thứ tự dung môi rửa tạp là nước, ethanol 10% và 20%
32
3.6
Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải với nước
32
3.7
Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải với ethanol 20%
33
N
H
2
Ơ
N
Tên hình
6
15 15
G
N
H Ư
TR ẦN
B
10 00
-L
Í-
H
Ó
A
27
34
Đường cong giải hấp phụ bằng ethanol 50%
35
ÁN
(a) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 50% theo thứ tự ở BV thứ 6 và 7 từ trái qua phải, (b) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 70% theo thứ tự ở BV thứ 1, 2 và 3 từ trái qua phải, (c) Hình ảnh sắc ký của dịch rửa giải ethanol 96%
3.9
3.10 Hình (a), (b) thứ tự là hình ảnh cao trước và sau tinh chế
36
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
3.8
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
ẠO
TP
.Q
U Y
4
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Hình
Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
ĐẶT VẤN ĐỀ
N
Ngưu tất là một trong những dược liệu có vai trò quan trọng trong y
Ơ
học cổ truyền Trung Quốc [20], di thực vào nước ta từ năm 1960. Nhiều
U Y
sinh học đáng quý như: chống viêm [7] [22], hạ cholesterol máu [4] [7] [25],
TP
.Q
hạ huyết áp [2] [7], kháng khuẩn [10], tăng cường miễn dịch, hạ đường huyết [36], đã và đang được ứng dụng rộng rãi tạo ra nhiều sản phẩm đáp ứng nhu
ẠO
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
cầu trong nước.
G
Đ
Sử dụng dung môi hữu cơ n-buthanol [44] để tinh chế saponin trong
H Ư
N
cao Ngưu tất là phương pháp đang được áp dụng nhưng đồng thời đó cũng là vấn đề độc hại đối với sức khoẻ con người và môi trường. Hiện nay có rất
TR ẦN
nhiều công nghệ khác được ứng dụng trong lĩnh vực chiết phân lập và tinh chế sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Trong đó sử dụng hạt nhựa
10 00
B
macroporous đã thu hút nhiều sự quan tâm vì tính chất hấp phụ và các ưu điểm bao gồm: loại bỏ được lượng lớn tạp chất, chi phí vận hành thấp, tiêu
H
thấp [16].
Ó
A
thụ dung môi ít hơn và lượng dư hóa chất không mong muốn trong sản phẩm
-L
Í-
Với những ưu điểm trên, nhóm tiến hành đề tài “Ứng dụng nhựa
ÁN
macroporous trong làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất (Achyranthes bidebtata
TO
Blume)” với mục tiêu:
ÀN
- Khảo sát một số điều kiện hấp phụ và giải hấp phụ saponin lên hạt - Xây dựng quy trình ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 để thu
được cao có hàm lượng saponin cao.
D
IỄ N
Đ
nhựa macroporous D101.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
H
nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm saponin trong Ngưu tất có nhiều tác dụng
1 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
N
1.1. Tổng quan về Achyranthes bidentata Blume
H
Ơ
1.1.1. Về thực vật
U Y
Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan công bố năm 2009
TP
.Q
thì Ngưu tất có tên khoa học là Achyranthes bidentata Blume có vị trí phân loại
ẠO
như sau [29]:
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
G
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsid)
H Ư
N
Phân lớp Cẩm chướng (Caryophyllidae)
TR ẦN
Bộ Cẩm chướng (Caryophyllules) Họ Rau dền (Amaranthacaceae) Chi (Achyranthes)
10 00
B
Loài Bidentata
A
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
H
Ó
Cây thảo, sống nhiều năm, cao
Í-
60- 80 cm hoặc hơn. Rễ củ hình trụ
-L
dài, có nhiều rễ phụ to. Thân mảnh, có
ÁN
cạnh, phình lên ở những đốt, màu lục
TO
hoặc nâu tím và cành thường mọc
D
IỄ N
Đ
ÀN
hướng lên gần như thẳng đứng. Lá
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
1.1.1.1. Vị trí phân loại của Ngưu tất
mọc đối, hình bầu dục hoặc hình móc, dài 5- 10 cm, rộng 1- 4 cm, gốc thuôn
hẹp, đầu rất nhọn, hai mặt nhẵn, mép nguyên đôi khi uốn lượn, gân lá mặt Hình 1.1 Achyranthes bidentata [2] trên màu nâu tía, gân phụ 5- 7 cặp,
2 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
cuống lá dài 1- 3 cm có lông [3] [4] [6] [20]. Cụm hoa mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành thành bông, dài 2- 5 cm,
Ơ
N
hoa thường gập xuống, sát vào cụm hoa lá bắc hình trứng dài 3 mm [20], lá
H
bắc con có gai dài 0,25- 0,3 cm [20] lá đài 5, gần bằng nhau, nhị 5, chỉ nhị
.Q
mặt chim, bầu hình trứng [2] [3] [7].
TP
Quả nang hình bầu dục, có 1 hạt [3] [4] [6].
ẠO
Mùa hoa quả: tháng 5- 7 [6].
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Cây dùng thay thế: ở Việt Nam, các thầy thuốc y học cổ truyền và nhân
TR ẦN
1.1.1.3. Phân bố, sinh thái
H Ư
Ngưu tất với tên gọi là Ngưu tất nam [2].
N
G
dân ở nhiều nơi đã dùng rễ cây Cỏ xước (Achyranthes aspera L.) để thay thế
Ngưu tất có nguồn gốc ở vùng Đông Bắc Trung Quốc hoặc Nhật Bản.
10 00
B
Ngưu tất được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam năm 1960. Ban đầu cây được trồng để thuần hóa ở Sa Pa, sau đó chuyển sang Sìn Hồ (Lai Châu) rồi
Ó
A
về trại thuốc Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Văn Điền (Hà Nội). Cách đây khoảng
H
30 năm, cây đã được trồng dưới dạng sản xuất dược liệu ở vùng ngoại thành
-L
Í-
Hà Nội và các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ [7].
ÁN
Có thể coi Ngưu tất là một ví dụ điển hình về một cây thuốc có nguồn
TO
gốc ôn đới, qua quá trình nghiên cứu di thực đã có thể trồng thành công ở cả vùng đồng bằng có khí hậu nhiệt đới gió mùa. Điều đó cho thấy Ngưu tất là
D
IỄ N
Đ
ÀN
cây có biên độ sinh thái tương đối rộng. Mặc dù thời vụ trồng chủ yếu vẫn ở
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
dính với nhau và dính với cả nhị lép, nhị lép có răng rất nhỏ, bao phấn hình
thời kì có nhiệt độ thấp trong năm [7]. Ngưu tất là cây ưa sáng và ẩm. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên hạt [7].
3 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.1.1.4. Bộ phận dùng Bộ phận dùng là rễ (Radix Achyranthes bidentatae) [3] [4].
Ơ
N
Rễ thu hái khi phần trên mặt đất tàn lụi vào tháng 1- 2 ở vùng núi hoặc tháng
H
3- 4 ở đồng bằng. Loại bỏ rễ con, rửa sạch rồi phơi hay sấy khô. Rễ to, dài,
ẠO
1.1.2. Thành phần hóa học
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Các nghiên cứu chỉ ra rằng saponin, phytoecdysteroid và polysacharid
G
Đ
là 3 nhóm thành phần hóa học chính được phân lập từ rễ Ngưu tất [20].
H Ư
N
1.1.2.1. Saponin
Saponin là một nhóm các glycosid có phần genin có cấu trúc triperten
TR ẦN
hay steroid 27 carbon. Với saponin triterpenoid cấu trúc phần genin có 30 carbon cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen nối với nhau theo quy tắc đầu đuôi [4].
10 00
B
Saponin là thành phần quan trọng trong rễ Ngưu tất, có khoảng 38 saponin đã được phân lập và saponin triterpenoid là hoạt chất chính. Trong
Ó
A
đó, saponin toàn phần tính theo hàm axit oleanolic là 0,78%-1,42% [17] (hình
H
1.2). Hiện nay các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc một số
Hình 1.2 Axit oleanolic
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
saponin được trình bày chi tiết ở bảng dưới.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
TP
.Q
rượu hoặc muối tùy theo trường hợp rồi phơi hay sấy khô [4].
U Y
N
dẻo là loại tốt. Có thể dùng ở dạng sống (thường dùng cách này), hoặc tẩm
4 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Bảng 1.1 Trình bày một số saponin oleanolic phân lập từ rễ Ngưu tất [20] R1
R2
α-L-rhamnopyranosyl(1→3)-β-Dglucironopyranosyl
Achhybidensaponins II
β-D-glucopyranosyl
Glc
Bidentatoside I
3’-glycolyl-2,3-dioxopropionyl-β-Dglucopyranosyl
Glc
Bidentatoside II
2’-(2”-O-glycolyl)-glyoxylyl
Glc
Chikusetsusaponin V methyl ester
Glc-(1→2)-6-Me-β-Dglucironopyranosyl
Glc
Glc-(1→ 2)-β-D-glucironopyranosyl
Glc
H
Glc
2’-O-Glc-3’-O-(2’-OH-1”carboxyethoxycarboxypropyl)-β-Dglucironopyranosyl
Glc
Glc-3’-O-(2”-OH-1’carboxyethoxycarboxypropyl)-β-Dglucopyranosyl
Glc
Aachyranthoside C
3-[2-Carboxy-1-(carboxymethoxy)-2hydroxyethyl]-β-D-glucopyranosyl
Glc
Aachyranthoside E
3-[1-Carboxy-1-(carboxymethoxy) methyl]-β-D-glucopyranosyl
Glc
TO ÀN Đ IỄ N
G
N
H Ư
TR ẦN
Ó H Í-
ÁN
-L
Aachyranthoside I
Aachyranthoside II
D
B
A
Ginsenoside Ro PJS- 1
Đ
Achhybidensaponins I
10 00
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
Khung cấu trúc chung của một số saponin trong rễ Ngưu tất. Glc
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
TP
.Q
U Y
N
H
Ơ
N
Saponins
5 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.1.2.2. Phytoecdysteroid Là những steroid tự nhiên với bộ khung là cholestane [17]. Hàm lượng
Ơ
N
phytoecdysteroid trong rễ dược liệu là 0,037% [7]. Ba phytoecdysteroid được
N
H
phân lập chủ yếu là β-ecdysterone, inokosterone và rubrosterone (hình 1.4)
20,22-O-(R-3-methoxycarbonyl)
.Q
O-(R-ethylidene)-20-hydroxyecdysone;
(25S)-inokosterone;
(25R)-inokosterone-20,22-acetonide;
ẠO
monoacetonide,
20-hydroxyecdysone-20,22-
TP
propylidene-20-hydroxyecdysone;
B
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
niuxixinsterone A- C; sefurosterone A [7] [4] [24] [26] [31].
10 00
(I)
(II)
(III)
A
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của β-ecdysterone (I), inokosterone (II),
H
Ó
rubrosterone (III) lần lượt từ trái sang phải
-L
Í-
1.1.2.3. Polysacharid
ÁN
Nhóm Polysaccharid chế từ rễ Ngưu tất được công nhận trên nhiều
TO
nghiên cứu là có hoạt tính tăng cường miễn dịch [18] [19] [36]. Trong một nghiên cứu, polysacharid trong rễ Ngưu tất được phân tích cấu tạo bao gồm polysacharid tan trong nước bao gồm 6 glucose và 3 mannose [20]. Hàm lượng polysacharid là 5,68 mg/ 1 gam dược liệu [20].
D
IỄ N
Đ
ÀN
fructose và glucose với tỷ lệ mol là 8:1 [9]. Một số tác giả tìm ra được một
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
ngoài ra có polypodine B; (25S)-20,22-O-(R-ethylidene) inokosterone; 20,22-
6 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.1.3. Tác dụng sinh học Cho đến nay Ngưu tất vẫn luôn được xem là cây thuốc quý, được chú
Ơ
N
trong nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong chữa bệnh:
H
- Tác dụng chống viêm [7] [22]: trong mô hình viêm cấp, dịch chiết
TP
- Tác dụng hạ cholesterol máu [4] [25]: năm 2014 Sang Deog Oh
ẠO
cùng với cộng sự đã nghiên cứu được ảnh hưởng của dịch chiết nước Ngưu
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
tất ức chế tế bào mỡ 3T3-L1 làm giảm trọng lượng cơ thể và triglycerid đáng
N
G
kể so với nhóm chứng [25].
H Ư
- Tác dụng hạ huyết áp [2] [7] [41]: saponin trong Ngưu tất không chỉ
TR ẦN
ngăn cản co mà còn có tác dụng giãn trực tiếp cơ trơn mạch máu dẫn đến hạ huyết áp [41].
B
- Tác dụng kháng khuẩn: các loại dịch chiết đều nhạy cảm với
10 00
Proteus, Escherichia coli, Bacillus subtilin, Samonella typhy; nhạy cảm trung
A
bình và kém với Staphylococcus aureus và Pseudomonas [10].
H
Ó
- Tác dụng trên xương [13] [39]: nghiên cứu về tác động của dịch
Í-
chiết Ngưu tất trên bệnh loãng xương sau mãn kinh cho thấy sau 16 tuần điều
-L
trị ngăn ngừa mất khối lượng xương do thay đổi tỷ lệ tái tạo xương [39].
ÁN
- Tác dụng nuôi dưỡng thần kinh [11] [42]: tác dụng của dịch chiết
TO
nước Ngưu tất về phục hồi dây thần kinh bị nghiền nát ở thỏ cho thấy dịch
D
IỄ N
Đ
ÀN
chiết đẩy nhanh sự tái tạo dây thần kinh ngoại vi phụ thuộc liều [11].
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
.Q
và 500 mg/kg đối với nhóm thử (p< 0.001) so với đối chứng [30].
U Y
N
ethanol Ngưu tất ức chế phù khoảng 63.52% và 79.73% sau 3 giờ với liều 375
- Tác dụng điều hòa miễn dịch [8] [18] [38]: nghiên cứu năm 2009
[8] tiến hành tìm hiểu ảnh hưởng polysaccharide Ngưu tất tới hoạt động của các tế bào miễn dịch. Kết quả cho thấy các tế bào lympho hoạt động mạnh hơn ở lợn con bổ sung polysacharide, cũng như nồng độ huyết thanh IgG, IgA, IgM, C 3, C 4, IL (interleukin)-2 và IFN (interferon)–γ.
7 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
- Tác dụng hạ đường huyết: nghiên cứu năm 2009 cho thấy, AbpS có tác dụng chống oxy hóa và giảm đường huyết của chuột bị tiểu đường rõ ràng
Ơ
N
hơn Abp, có thể là do tác dụng chống oxy hóa của nó [36].
U Y
1.2.1. Phương pháp chiết pha rắn (SPE)
TP
.Q
1.2.1.1 Khái niệm
SPE là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn. Trong
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để
N
G
Đ
hấp phụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn [5].
H Ư
1.2.1.2 Nguyên tắc và cơ chế của SPE
TR ẦN
Dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật sắc ký: lựa chọn pha rắn thích hợp phụ thuộc vào tương tác giữa pha rắn và pha lỏng [43].
B
Pha rắn là hạt nhỏ và xốp được nhồi vào cột sắc ký. Khi đổ pha lỏng
10 00
lên pha rắn trong cột sắc ký, pha tĩnh (pha rắn) sẽ tương tác với các chất và giữ lại một số nhóm chất trên cột, còn các nhóm khác sẽ đi ra khỏi cột. Sau
Ó
A
đó dùng dung môi thích hợp để rửa giải và thu sản phẩm [5].
Í-
H
Pha rắn: thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm,
-L
silica gel trung tính đã được ankyl hóa nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon
ÁN
mạch thẳng –C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
loại nhựa hoặc than hoạt tính… Pha lỏng là pha chứa hợp chất nghiên cứu [5]. Các tương tác giữa pha tĩnh và pha động như sau:
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
H
1.2. Tổng quan về phương pháp tinh chế
- Pha đảo bao gồm pha động phân cực hoặc phân cực trung bình và pha
tĩnh không phân cực. Lực giữ các hợp chất hữu cơ từ pha lỏng phân cực (ví dụ như nước) lên pha tĩnh chủ yếu là do lực liên kết giữa cacbon- hydro của hợp chất đó và các nhóm chức năng của pha tĩnh. Lực liên kết giữa 2 chất không phân cực này thường được gọi là lực Van der Waals hoặc lực phân tán.
8 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Dung môi phân cực trung bình không phân cực có thể phá vỡ liên kết giữa pha tĩnh và chất hoặc nhóm chất được hấp phụ lên. Pha tĩnh thường sử dụng
Ơ
N
là silica liên kết với alkyl hoặc aryl.
H
- Pha thường gồm pha động phân cực, hoặc phân cực trung bình đến không
.Q
do lực tương tác giữa các nhóm chất phân cực trên chất đó và nhóm chức trên
TP
pha tĩnh: gồm liên kết hydro, tương tác л- л ... Dung môi phá vỡ lực này
ẠO
thường là một dung môi có độ phân cực cao. Pha tĩnh thường là silica đính
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
các chuỗi alkyl ngắn với các nhóm chức phân cực được liên kết trên bề mặt
N
G
được sử dụng hấp phụ hợp chất từ phân cực đến không phân cực [43].
H Ư
- SPE trao đổi ion sử dụng cho các hợp chất anion có thể được phân lập
TR ẦN
trên bề mặt silica gắn nhóm amin bậc bốn. Các hợp chất cation được phân lập bằng cách sử dụng silica gắn các nhóm axit sulfonic. Cơ chế chính giữ hợp
B
chất lên bề mặt chủ yếu dựa vào sự thu hút tĩnh điện của hai nhóm chức tích
A
Ó
1.2.1.3. Ứng dụng
10 00
điện [43].
H
Phân tích hợp chất hữu cơ: SPE được ứng dụng cho phân tích hợp chất
-L
Í-
hữu cơ: tách và làm giàu dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hoạt động bề mặt,
ÁN
các hydrocacbon thơm mạch vòng khó phân hủy… trong các mẫu nước [5].
TO
Phân tích các chất vô cơ: ngày nay, SPE được phát triển và ứng dụng
rộng rãi để làm giàu và tách các ion kim loại trong môi trường bằng phương
D
IỄ N
Đ
ÀN
pháp trao đổi ion, chiết các hợp phức kim loại với thuốc thử hữu cơ, ứng dụng
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
phân cực (ví dụ aceton, hexan) và một pha tĩnh phân cực. Lực giữ một chất là
các loại nhựa vòng càng [5]. Ngày nay, SPE được sử dụng rộng rãi như là một kỹ thuật chuẩn bị để phân tích mẫu trong các lĩnh vực y học, khoa học và công nghệ thực phẩm… Đây là kỹ thuật đang có tiềm năng rất lớn trong việc phân tích và phân lập các sản phẩm tự nhiên [33].
9 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.2.2. Tổng quan về hạt nhựa macroporous 1.2.2.1. Định nghĩa và phân loại
Ơ
N
Hạt macroporous là hạt polymer hình cầu, màu trắng, cấu trúc xốp với
H
các lỗ xốp tương đối rộng (đường kính lỗ xốp >50 Å) [16] có thể cho phân tử
X-5
Độ ẩm (%) 55- 60
500- 600
50- 55
540- 580
60- 65
>0,25
600
65- 70
0,3- 1,0
500- 650
55- 75
0,3- 1,2
500- 550
65- 75
TP
Kích thước Diện tích bề (mm) mặt (m2/g) ≥ 550
ẠO
Không phân cực
Cấu trúc
Đ
Loại hạt nhựaa D1400
Styren
0,3- 1,2
G
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Độ phân cực
.Q
Bảng 1.2: Đặc tính vật lý một số loại hạt nhựa macroporous [33]
H Ư
N
D4020 HP- 20 HP-20
Polystyren
TR ẦN
Phân cực yếu
DM130
Polystyren
10 00
Phân cực trung bình
B
D302 HPD-600
H
Ó
A
XDA-8
ADS-11 DA201
55- 65
300
50- 55
≥ 1050
65- 75
100- 200
55- 70
190- 220
60- 70
≥ 150
60- 65
0,3- 1,2
0,3- 1,0 0,3- 1,2
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
Phân cực
ÁN
-L
Í-
FL-1
Styren divinylbenzen Polystyren Nhóm sulfonic Styren
550- 600
Theo IUPAC, hạt nhựa macroporous có các lỗ xốp trong khoảng 50 nm
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
lớn đi qua, hấp phụ nhờ lực liên kết tĩnh điện, liên kết hydro hoặc tạo phức.
đến 1 μm. Tuy nhiên gần đây, do nhận được nhiều sự chú ý nên các vật liệu có kích thước lỗ xốp từ 1 μm dến 100 μm và lớn hơn nữa cũng đã được sản xuất. Có thể gọi đó là các polyme supermacroporous [23].
10 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.2.2.2. Đặc điểm hạt nhựa macroporous Ba đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của các hạt
Ơ
N
nhựa là: tổng diện tích bề mặt (trong và ngoài), đường kính lỗ xốp và độ phân
H
cực bề mặt. Diện tích bề mặt thường trong khoảng 100 đến 1000 m2/g, đường
.Q
cực, phân cực yếu, trung bình và mạnh tùy theo monomer sử dụng trong hoặc
TP
xử lý sau quá trình polymer hóa [15] [16] [27].
ẠO
Đường kính lỗ xốp và diện tích bề mặt được quyết định bởi cấu trúc
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
của hạt nhựa, cấu trúc được kiểm soát dựa vào thành phần các chất hóa học sử
N
G
dụng trong hỗn hợp đem đi polymer hóa (ngoài các monomer thì để tạo ra các
H Ư
lỗ xốp còn thêm các chất gọi là porogen trộn lẫn với hỗn hợp monomer,
TR ẦN
không hòa tan được polymer, có khả năng bay hơi ở nhiệt độ nhất định sau khi kết thúc polymer hóa để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polymer) [16].
10 00
B
1.2.2.3. Tổng quan về hạt nhựa macroporous D101 1.2.2.3.1. Thông số vật lý
H
Ó
A
Bảng 1.3: Thông số vật lý của hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất
Í-
Không phân cực
Độ ẩm
65- 75%
Trọng lượng riêng bão hòa
1,00- 1,07 g/ml
Trọng lượng biểu kiến bão hòa
0,67- 0,73 g/ml
Diện tích bề mặt
500- 550 m2/g
Đường kính lỗ xốp trung bình
9- 10 nm
Khoảng đường kính hạt nhựa
0,3- 1,25 mm
Thể tích lỗ xốp
1.18- 1.24 ml/g
Độ xốp
50- 60%
-L
Độ phân cực
ÁN TO ÀN Đ IỄ N D
Hạt hình cầu, màu trắng đục
Hình dạng
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 Å, độ phân cực thì rải đều từ không phân
11 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
1.2.2.3.2. Cơ chế hấp phụ saponin của hạt nhựa D101 Hạt nhựa D101 bản chất là polymer styren divinylbenzen không phân
Ơ
N
cực, tạo liên kết Van der Waals với saponin có phần sapogenin không phân
U Y
saponin [16].
.Q
Hơn nữa, các lỗ xốp trong hạt nhựa làm tăng diện tích tiếp xúc dẫn đến
TP
tăng hiệu quả hấp phụ của hạt nhựa, tỷ lệ giữa đường kính lỗ xốp của hạt
ẠO
nhựa macroporous với đường kính phân tử hấp phụ là trong khoảng 2 đến 6.
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Nếu đường kính quá nhỏ thì chất hấp phụ đi vào trong lỗ xốp rất khó, còn quá
N
G
lớn thì chất hấp phụ dễ dàng đi qua lỗ và làm giảm diện tích bề mặt hấp phụ.
H Ư
Đường kính của glycosid ước tính ít nhất là 1 nm, tùy thuộc vào loại và nhiều
TR ẦN
nhóm chức được gắn vào khung của chúng. Trong thực tế các phân tử thường lớn hơn đáng kể, đối với glycosid một số nhóm đường thường được gắn vào
B
phân tử, đường kính phân tử có thể được ước tính khoảng 2,0 nm [16]. D101
10 00
đường kính lỗ xốp trung bình 9-10 nm, gấp khoảng 5 lần so với đường kính
Ó
A
glycosid nên thích hợp cho việc sử dụng để tinh chế các glycosid.
H
1.2.2.3.3. Ứng dụng trong tách chiết saponin
-L
Í-
Trong những thập kỉ gần đây, hạt nhựa D101 được phát triển và ứng
ÁN
dụng rất rộng rãi trong chiết xuất, phân lập và tinh chế các chất có nguồn gốc
TO
tự nhiên flavonoid, saponin, tách kim loại,… [28]. Trong đó saponin là nhóm chất có nhiều nghiên cứu (khoảng 30 bài báo) sử dụng hạt nhựa D101 với
D
IỄ N
Đ
ÀN
mục đích tinh chế, phân lập.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
H
cực trong dịch chiết của Ngưu tất đã qua xử lý nên có khả năng hấp phụ
Năm 2013, Liu Z và cộng sự đã tinh chế saponin steroid từ thân rễ của Paris Polyphylla var. yunnanensis để chọn loại hạt nhựa phù hợp nhất nhằm thiết lập một phương pháp đơn giản, bảy loại hạt nhựa macroporous đã được lựa chọn để khảo sát hấp phụ và giải hấp phụ. Kết quả hạt nhựa D101 được chứng minh là hấp phụ và giải hấp phụ tốt nhất cho saponin
12 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
steroid. Saponin steroid toàn phần trong sản phẩm tăng 4,83 lần với hàm lượng thu hồi lên tới 85.47% [21].
Ơ
N
Hấp phụ và giải hấp phụ flavonoid và saponin toàn phần của
H
Astragalus trên các hạt nhựa macroporous khác nhau bao gồm D101, AB-8,
.Q
sánh. Theo kết quả, XDA-5, D101 và AB-8 khả năng hấp phụ, giải hấp phụ
TP
và tốc độ hấp phụ cao hơn flavonoid và saponin các loại hạt nhựa khác [34].
ẠO
Một nghiên cứu khác sử dụng hạt nhựa macroporous D101 để làm sạch
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
gypenosid từ dịch chiết thô Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino.
N
G
Theo điều kiện tối ưu được xác định như sau: nồng độ mẫu 6 mg/mL và giải
H Ư
hấp phụ với dung dịch ethanol 50% , kết quả hàm lượng saponin thu được đạt
TR ẦN
92,76% [14].
Tinh chế saponin toàn phần từ Gynostemma bằng cách chiết nước nóng
B
và sau đó tinh chế bằng hấp phụ lên hạt nhựa D101. Sau tinh chế bằng hạt
10 00
nhựa D101 kết quả cho thấy hàm lượng saponin toàn phần tăng từ 26,2% lên
A
83% [12].
H
Ó
Năm 2006, Xu Xianxiang, Xia Lunzhu thiết lập một phương pháp tách
Í-
và tinh chế saponin toàn phần từ Radix clematidis: chiết xuất với 70% ethanol
-L
và sau đó được tinh sạch bằng hạt nhựa D101. Sau khi rửa với nước cất và
ÁN
ethanol các nồng độ 30%, 50% và 70% thì so sánh bằng các chỉ số: tốc độ rửa
TO
giải và tỷ lệ rửa giải. Kết quả saponin toàn phần được giải hấp phụ với ethanol
D
IỄ N
Đ
ÀN
50%. Tỷ lệ rửa giải là 71,26% và khả năng hấp phụ là 53,36 mg/g [35].
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
XAD-1, HP-20, SP8-25, LSA-40, LX-18, XDA-5 và ADS-7 được so
1.2.2.4.4. Ứng dụng hạt nhựa trong nghiên cứu Ngưu tất Cho đến nay, ứng dụng hạt nhựa macroporous trong nghiên cứu Ngưu tất đã được chú ý rất nhiều, trong đó nhựa macropopous D101 đã được sử dụng trong một số nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của một số chất trong Ngưu tất khi kết hợp với những phương pháp khác.
13 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Năm 2007, với mục tiêu phân lập các thành phần từ Ngưu tất và làm sáng tỏ cấu trúc của chúng Zhao Wan-ting và cộng sử đã sử dụng hạt nhựa macroporous D101, sắc ký cột silica gel và HPLC, UV, 1H-NMR và
13
Ơ
N
C-
H
NMR để xác định cấu trúc. Kết quả cho 5 hợp chất đã được xác định là:
.Q
inokosteron [40].
TP
Qiu-Hong Wang và cộng sự đã xác định được cấu trúc 3 hợp chất định
là
(20R,22R,24S)-20-O,22-O-(5′-hydroxymethyl)-furfuryliden-
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
xác
ẠO
phytoecdysteroid mới, có tên niuxixinsteron A, B và C. Các cấu trúc đã được
(20R,22R)-20-O,22-O-(5′-
N
G
2β,3β,14α,25-tetrahydroxy-5β-ergost-7-en-6-one,
H Ư
hydroxymethyl)-furfuryliden-2β,3β,25-trihydroxy-14β-methyl-18-nor-5β-
TR ẦN
cholesta-7,12-dien-6-one và (20R,22R,25R)-20-O,22-O-(5′-hydroxymethyl)furfuryliden-2β,3β,5β,14α,26-pentahydroxycholest-7-en-6-one) bằng chứng
B
quang phổ. Dịch chiết ban đầu được xử lý và phân lập bằng hạt nhựa
10 00
macroporous D101 và sắc ký cột silica gel [32].
A
Tiếp theo đó công bố năm 2012 đã thu được 2 glycosid tyramin
H
Ó
feruloyl và 7 saponin triterpenoid đã thu được, chúng xác định là N-transN-trans-feruloyl-3-
Í-
feruloyl-3-methoxytyramin-4′-O-β-D-glucopyranosid,
-L
methoxytyra min-4-O-β-D-glucopyranosid, PJS-1, chikusetsusaponin IVa,
ÁN
oleanolic acid 3-O-[β-D-glucuronopy ranosid-6-O-methyl ester]-28-O-β-D-
TO
glucopyranosid (5), oleanolic acid 3-O-[β-D-glucuronopyran-osid-6-O-
D
IỄ N
Đ
ÀN
ethylester]-28-O-β-D-glucopyranosid,
oleanolic
acid
3-O-[β-D-
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
stachysteron A, podecdyson C, β-ecdysteron, 25-(R)-inokosteron, 25-(S)–
glucuronopyranosid-6-O-butyl ester]-28-O-β-D-glucopyranosid, ginsenosid Ro và hederagenin-28-O-β-D-glucopyranosyl ester. Các thành phần hóa học trên được phân lập và tinh chế bằng hạt nhựa D101, silica gel và sắc ký điều chế HPLC sử dụng cột ODS. Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ trên cơ sở phân tích 1D và 2D- NMR [37].
14 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu
Ơ
N
2.1.1. Nguyên vật liệu
N
H
Rễ Ngưu tất đã được xông sinh nguồn gốc ở Thái Bình đạt tiêu chuẩn
10 00
B
Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Ngưu tất
A
Hạt nhựa D101 nguồn gốc từ Trung Quốc được mua của công ty Anhui
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
sanxing resin technology.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
TR ẦN
H Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
TP
.Q
U Y
hàm lượng saponin trong dược liệu khô >1% theo Dược điển Hong Kong.
Hình 2.2 Hình ảnh hạt nhựa macroporous D101
15 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
2.1.2. Hoá chất, thiết bị, dụng cụ 2.1.2.1. Hoá chất
Ethanol 96%
Việt Nam
3
HCl
Trung Quốc
4
NaOH
Trung Quốc
5
Natri laurylsulfat
Trung Quốc
6
Methanol
Trung Quốc
7
Cloroform
8
Vanillin
Trung Quốc
9
H2SO4 đặc
Trung Quốc
10
Aceton
H
Ó
- Cột thuỷ tinh (đường kính trong: 1,5 cm; 2 cm; 2,5 cm; 4 cm )
Í-
- Pipet pasteur; pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml.
-L
- Phễu thuỷ tinh.
ÁN
- Cốc thuỷ tinh.
TO
- Ống đong 100 ml, 250 ml, 1000 ml, 2000 ml.
IỄ N
Đ
ÀN
- Giấy lọc.
D
.Q
Trung Quốc
A
2.1.2.2. Dụng cụ
TP
ẠO
Đ
G
N
H Ư
B
TR ẦN
Trung Quốc
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
1
H
Tiêu chuẩn, nguồn gốc
N
Tên hóa chất
U Y
TT
10 00
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Ơ
N
Bảng 2.1 Tên hoá chất và nguồn gốc
- Bình định mức 10 ml. 2.1.2.3. Thiết bị - Máy cất quay Daihan scientific (Hàn Quốc). - Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ).
- Máy đo hàm ẩm Ohaus (Thuỵ Sĩ).
16 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
- Cân phân tích Wisd (Đức). - Máy đo quang Shimadzu.
Ơ
N
- Tủ sấy Memmert (Đức).
U Y
- Máy siêu âm Daihan scientific (Hàn Quốc).
TP
.Q
- Bể điều nhiệt. 2.2. Nội dung nghiên cứu
ẠO Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
2.2.1. Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu
G
2.2.2. Nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa
H Ư
N
macroporous D101 - Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột.
TR ẦN
- Xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa. 2.2.3. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa
10 00
B
macroporous D101 - Khảo sát dung môi rửa giải.
Ó
A
- Khảo sát thể tích rửa giải.
H
2.2.4. Đề xuất và ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt
-L
Í-
nhựa macroporous D101
ÁN
2.3. Phương pháp nghiên cứu
TO
2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng
D
IỄ N
Đ
ÀN
2.3.1.1. Phương pháp thuỷ phân
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
H
- Hệ thống lọc hút Buchner.
- Dịch được thuỷ phân trong môi trường axit HCl 10% với tỷ lệ dịch thuỷ phân: axit là 2:1 (v:v). - Điều kiện: nhiệt độ 85o và trong thời gian 2,5 giờ.
17 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
2.3.1.2. Phương pháp định tính Phương pháp: sắc ký lớp mỏng với các điều kiện như sau:
Ơ
N
- Lựa chọn điều kiện pha động: cloroform: methanol (20:1) (v:v).
H
- Pha tĩnh: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck).
.Q
1ml ethanol tuyêt đối.
TP
- Chất đối chiếu: axit oleanolic.
ẠO
- Thuốc thử hiện màu: bản mỏng được nhúng thuốc thử vanlin/ axit sulphuric
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
(pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 100˚C và quan sát dưới ánh sáng thường.
H Ư
N
G
Saponin cho vết màu tím trên bản mỏng. 2.3.1.3. Phương pháp định lượng
TR ẦN
Định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 550 nm theo quy
10 00
- Chuẩn bị mẫu trắng:
B
trình sau:
+ Lấy chính xác 1ml methanol cho vào ống nghiệm và cô đến cắn rồi
Ó
A
thêm 0,3 ml vanillin trong axit acetic và 1 ml HClO4 đem ủ ở 75o trong 15
H
phút sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic.
-L
Í-
- Chuẩn bị mẫu cần định lượng:
ÁN
+ Hút chính xác vào ống nghiệm 2 ml dịch cần định lượng đem pha
TO
loãng với 2 ml nước cất rồi tiến hành thuỷ phân như đã nêu ở mục 2.3.1.1. Sau thuỷ phân, lọc lấy tủa hoà tan bằng methanol rồi định mức 10 ml bằng
D
IỄ N
Đ
ÀN
methanol và lắc đều.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
- Mẫu thử: dịch được thuỷ phân như mục 2.3.1.1 và lấy phần tủa đem hoà với
+ Lấy chính xác 1 ml dịch này cho vào ống nghiệm cô thành cắn rồi hoà tan bằng 0,3 ml vanilin trong axit acetic và 1ml HClO4 đem ủ ở 75o trong 15 phút. Sau đó định mức 10 ml bằng axit acetic. Lắc đều và đem đi đo quang.
18 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Nồng độ saponin trong mẫu được tính toán như sau: Từ phương trình tuyến tính giữa giá trị mật độ quang đo được và nồng độ
Ơ
N
axit oleanolic có dạng: A= aC+ b
H
A- b
U Y
N
1000. a
.Q
Trong đó:
TP
C%: nồng độ saponin trong mẫu (mg/ml).
ẠO
A: mật độ quang đo được của mẫu.
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
a, b: các hệ số của phương trình đường chuẩn.
N
2.3.2. Phương pháp chiết
H Ư
Dược liệu sau khi được rửa sạch và cắt nhỏ đem chiết hồi lưu với
TR ẦN
ethanol 50% với tỷ lệ dược liệu: dung môi (kl:v) là 1: 8. Chiết ở điều kiện nhiệt độ 90o trong 3 lần thứ tự 4 giờ, 3 giờ và 2 giờ.
10 00
B
Lọc dịch chiết, bỏ phần bã. Gộp dịch chiết ethanol 50% của 3 lần. 2.3.3. Phương pháp xử lý dịch chiết
Ó
A
- Dịch chiết ethanol 50% thu được đem cô quay dưới áp suất giảm đến cao
Í-
H
đặc.
-L
- Hoà cao vào nước (tỷ lệ nước: dịch chiết ethanol là 1:1).
ÁN
- Lọc dịch nước bằng phễu lọc Buchner được dịch trong đem chạy cột.
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu Dung lượng hấp phụ (Qe) là khả năng hấp phụ chất hoặc nhóm chất của
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
Nồng độ saponin (mg/ml): C (mg/ml)
1 g hạt nhựa có thể hấp phụ được. Cách xử lý ban đầu ảnh hưởng rất lớn đến thông số dung lượng hấp phụ của hạt. Tham khảo từ các tài liệu và thông tin từ nhà sản xuất, xử lý hạt nhựa ban đầu có thể dùng các dung dịch a cid, ba zơ và chủ yếu bằng ethanol tuyệt đối. Mục tiêu: xác định quá trình xử lý ban đầu để loại hết tạp bám trên hạt nhựa trong quá trình sản xuất và hạt sau xử lý cho
19 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
kết quả dung lượng hấp phụ cao nhất đồng thời khảo sát sự ảnh hưởng của các dung môi lên khả năng hấp phụ của hạt nhựa.
Ơ
N
Tiến hành:
H
- Chuẩn bị dịch chạy cột như mục 2.3.2 và 2.3.3.
.Q
trong hạt nhựa và làm hạt trương nở rồi rửa sạch ethanol bằng nước cất. Sau
TP
đó cân 3 phần mỗi phần khoảng 1g cho vào bình nón đem xử lý tiếp như sau:
ẠO
+ Mẫu 1: không xử lý gì thêm.
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
+ Mẫu 2: ngâm trong dung dịch axit HCl 4% trong 4 giờ.
N
G
+ Mẫu 3: ngâm trong dung dịch NaOH 4% trong 4 giờ.
H Ư
- Rửa sạch mẫu 2 và 3 bằng nước cất đến pH trung tính.
TR ẦN
- Hút chính xác 40 ml dịch chiết cho vào các bình nón, ngâm trong 24 giờ thi thoảng lắc đều.
B
- Sau 24 giờ, lấy chính xác mỗi mẫu 6 ml cho vào ống nghiệm đem thuỷ phân
10 00
ở điều kiện như mục 2.3.1.1. Sau đó định lượng mẫu bằng phương pháp đo
A
quang.
H
Ó
Đánh giá kết quả: chọn phương pháp xử lý cho hạt nhựa có dung lượng
Í-
hấp phụ cao nhất.
Qe (mg/g)
TO
ÁN
-L
Dung lượng hấp phụ của hạt nhựa được tính theo công thức sau: (Co Cs ) V m
D
IỄ N
Đ
ÀN
Trong đó: Qe: dung lượng hấp phụ của hạt nhựa (mg/g).
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
- Chuẩn bị hạt nhựa: ngâm 24 giờ trong ethanol 96% để loại hết tạp còn sót lại
Co: nồng độ dịch chiết ban đầu (mg/ml). Cs: nồng độ dịch chiết sau hấp phụ (mg/ml). m: khối lượng hạt nhựa đem hấp phụ (g). V: thể tích dich hấp phụ (ml).
20 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
- Sau khi có kết quả trong điều kiện tĩnh lựa chọn tác nhân thích hợp để
N
chuyển sang xác định Qe ở điều kiện động như mục 2.3.5.2.
H
Ơ
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu quá trình hấp phụ saponin từ dịch chiết
U Y
2.3.5.1. Phương pháp khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột
.Q
Với mục tiêu xác định cột có tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột phù hợp.
TP
Nghiên cứu đánh giá dựa trên dung lượng hấp phụ, hiệu suất giải hấp phụ và
ẠO
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
hàm lượng saponin của cao tương ứng với mỗi cột sau tinh chế.
G
Đ
Tiến hành:
H Ư
N
- Chuẩn bị dịch chạy cột như mục 2.3.2 và 2.3.3.
- Chuẩn bị hạt nhựa: xử lý hạt nhựa theo quy trình được kết luận ở mục 2.3.4.
TR ẦN
- Chuẩn bị cột: 25 g hạt nhựa được đưa lên mỗi cột có đường kính thứ tự 1,5 cm (tỷ lệ 10), 2 cm (tỷ lệ 6) và 2,5 cm (tỷ lệ 4).
10 00
B
- Tiến hành hấp phụ 1000 ml dịch qua mỗi cột với vận tốc 2 BV/h sau đó rửa giải với 300 ml ethanol 70% vận tốc 1,5 BV/h.
Ó
H
Dung lượng hấp phụ: Qe (mg/g)
Cv Vv Cr Vr m
ÁN
-L
Í-
A
Tính toán:
TO
Trong đó:
D
IỄ N
Đ
ÀN
Cv: nồng độ saponin dịch nước được hấp phụ (mg/ml). Vv: thể tích dịch nước được hấp phụ (ml).
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
lên hạt nhựa macroporous D101
Cr: nồng độ saponin của dịch rửa giải (mg/ml). Vr: thể tích dịch rửa giải (ml). m: khối lượng hạt nhựa lên cột (g).
21 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
Hiệu suất giải hấp phụ: Cr Vr 100 Qe m
Ơ
Hghp ( )
N N
H
Trong đó:
U Y
Cr: nồng độ saponin của dịch rửa giải (mg/ml).
.Q
Vr: thể tích dịch rửa giải (ml).
TP
m: khối lượng hạt nhựa lên cột (g).
ẠO Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Qe: dung lượng hấp phụ (mg/g).
G
2.3.5.2. Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ của hạt nhựa trên điều
H Ư
N
kiện động
TR ẦN
Có thể tính toán thông số Qe ở điều kiện động và điều kiện tĩnh. Do quá trình hấp phụ thực hiện trên cột nên trong nghiên cứu tiến hành xác định Qe ở
B
điều kiện động. Từ đó làm cơ sở để ước tính lượng dịch chiết đưa hấp phụ
10 00
qua cột. Tiến hành:
Ó
A
- Chuẩn bị dịch chạy cột như mục 2.3.2 và 2.3.3.
Í-
H
- Chuẩn bị hạt nhựa: xử lý hạt nhựa dựa vào kết quả đạt được sau khi tiến
-L
hành quy trình ở mục 2.3.4.
ÁN
- Cột thuỷ tinh (đường kính 4 cm) được nạp 180 g hạt nhựa (tỷ lệ chiều cao/
TO
đường kính cột là 6, thể tích cột (BV) là 240 ml). Dịch được cho chảy qua cột
ÀN
với vận tốc 2 BV/h.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
D
IỄ N
Đ
- Dịch sau hấp phụ mỗi BV lấy 2 ml vào ống nghiệm đem đi định tính saponin bằng SKLM. Khi sắc ký đồ dịch ra hiện vết saponin thì dừng lại. Dung lượng hấp phụ của hạt nhựa được tính toán theo công thức sau. Qe (mg/g)
Co Vv m
22 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Trong đó: Co: nồng độ dịch chạy cột (mg/ml).
Ơ
N
Vv: thể tích dịch ra (ml).
U Y
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu quá trình giải hấp phụ saponin từ hạt
TP
.Q
nhựa macroporous D101 2.3.6.1. Khảo sát dung môi giải hấp phụ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
ẠO
Mục tiêu: khảo sát khả năng rửa giải của các dung môi từ đó tìm kiếm
G
Đ
dung môi thích hợp có sức rửa giải tốt để tiết kiệm thời gian và đạt được hiệu
H Ư
N
suất cao. Tham khảo tài liệu [14] [23] [35] dung môi thường được sử dụng để rửa giải là ethanol hoặc aceton vì vậy nhóm tiến hành nghiên cứu với các loại
TR ẦN
dung môi này. Tiến hành:
10 00
B
- Chuẩn bị dịch chạy cột như mục 2.3.2 và 2.3.3. - Giai đoạn hấp phụ: ngâm 10 g hạt nhựa đã xử lý trong 400 ml dịch trên
H
mỗi bình nón.
Ó
A
trong 24 giờ thỉnh thoảng lắc đều. Hạt nhựa sau hấp phụ lọc và cân 1g vào
-L
Í-
- Giai đoạn rửa giải: thêm vào mỗi bình nón 6 ml ethanol nồng độ 10%, 20%,
ÁN
30%, 40%, 50%, 70%, 80%, 96% và aceton ngâm trong 4 giờ, thỉnh thoảng
TO
lắc đều. Sau đó lấy 2 ml mỗi mẫu đi thuỷ phân trong điều kiện 2.3.1.1 để xác Đánh giá: nồng độ saponin thông qua nồng độ axit oleanolic trong dịch
sau rửa giải để lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp. Nồng độ càng cao càng chứng tỏ dung môi có sức rửa giải saponin tốt.
D
IỄ N
Đ
ÀN
định nồng độ saponin trong dịch giải hấp phụ bằng phương pháp đo quang.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
H
m: khối lượng hạt nhựa lên cột (g).
23 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
2.3.6.2. Khảo sát thể tích rửa giải Mục tiêu: ước tính được thể tích dung môi cần dùng cho cả quá trình
Ơ
N
rửa giải bao gồm giai đoạn loại tạp và giải hấp phụ.
H
Tiến hành:.
.Q
- Chuẩn bị hạt nhựa: cân 180 g hạt nhựa xử lý theo quy trình được kết luận ở
TP
mục 2.3.4.
ẠO
- Giai đoạn hấp phụ: hạt nhựa sau xử lý được nhồi lên cột (đường kính 4 cm,
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột là 6) và cho dịch chạy qua cột với vận tốc 2
N
G
BV/h.
H Ư
- Giai đoạn rửa giải:
TR ẦN
+ Rửa loại tạp chất với vận tốc 4 BV/h:
Khảo sát với nước: hứng mỗi BV dịch rửa ra quan sát màu sắc dịch ra
B
và đồng thời kiểm tra bằng SKLM sau khi thuỷ phân.
10 00
Khảo sát với ethanol: từ kết quả của khảo sát dung môi rửa giải chọn ra
A
nồng độ ethanol thích hợp để khảo sát thể tích rửa giải và quan sát sắc ký đồ
H
Ó
để kết luận khả năng rửa loại tạp chất của nó.
Í-
+ Giải hấp phụ với vận tốc 1,5 BV/h: lựa chọn nồng độ ethanol thích hợp
-L
từ kết quả khảo sát để ước tính thể tích rửa giải. Mỗi BV dịch rửa giải, lấy 2
ÁN
ml đem thuỷ phân để chấm sắc ký. Theo dõi lượng saponin ra bằng SKLM và
TO
định lượng bằng phương pháp đo quang. Dừng quá trình rửa giải khi vết
D
IỄ N
Đ
ÀN
saponin trên sắc ký đồ mờ hẳn.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
U Y
N
- Chuẩn bị dịch chạy cột như mục 2.3.2 và 2.3.3.
2.3.7. Đề xuất và ổn định quy trình làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 Chuẩn bị dịch chiết như mục 2.3.2 và 2.3.3 được dịch nước Ngưu tất để đưa lên cột.
24 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
Lượng dịch đưa lên cột:
Ơ
N
Qe m Cv
H
Vv (ml)
U Y
m: khối lượng hạt nhựa lên cột (g).
TP
.Q
Qe: dung lượng hấp phụ của hạt nhựa (mg/g).
ẠO
Cv: Nồng độ dịch nước Ngưu tất được hấp phụ (mg/ml).
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Chuẩn bị hạt nhựa: xử lý bằng ethanol trong 24 giờ, sau đó rửa sạch
G
ethanol và ngâm trong NaOH 4% trong 4 giờ và rửa bằng nước cất đến trung
H Ư
N
tính, rồi đưa lên cột 180 g hạt nhựa (đường kính 4 cm, 1 BV= 240 ml).
TR ẦN
Tiến hành tinh chế saponin từ rễ Ngưu tất bằng hạt nhựa macroporous D101 theo những thông số đã lựa chọn:
- Giai đoạn hấp phụ: dịch được đưa qua cột hấp phụ với tốc độ 2 BV/h
10 00
B
chạy đến Vv ml dịch thì dừng lại. - Giai đoạn rửa tạp: tiếp theo rửa cột với nước cất với vận tốc 4 BV/h.
H
BV/h.
Ó
A
Sau đó đưa lên ethanol để tiếp tục loại tạp chất cũng với vận tốc 4
-L
Í-
- Giai đoạn giải hấp phụ bằng ethanol: hứng dịch rửa giải với vận tốc 1,5
ÁN
BV/h.
TO
Lặp lại quy trình trên 3 lần.
D
IỄ N
Đ
ÀN
Đánh giá hàm lượng cao, hiệu suất giải hấp phụ, hiệu suất toàn bộ quá trình và độ lặp lại của quy trình.
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
N
Trong đó:
Tính toán: Hiệu suất giải hấp phụ được tính toán như công thức mục 2.3.5.1.
25 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
Hàm lượng saponin trong cao: Cr Vr 100 mcao
Ơ
HL ( )
N N
H
Trong đó:
U Y
Cr: nồng độ saponin của dịch rửa giải (mg/ml).
.Q
Vr: thể tích dịch rửa giải (ml).
TP
mcao: khối lượng cao thu được (mg).
ẠO
Đ
Cr Vr 1000 dl h (100 W)
H Ư
N
( )
G
www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com
Hiệu suất toàn bộ quy trình:
Trong đó:
TR ẦN
mdl: khối lượng dược liệu đem chiết (g). h: hàm lượng saponin trong dược liệu khô (%).
10 00
B
W: độ ẩm của dược liệu (%).
Cr: nồng độ saponin của dịch rửa giải (mg/ml).
D
IỄ N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
Vr: thể tích dịch rửa giải (ml).
DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST> : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN
www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com
26 Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial