NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG MỸ PHẨM (2019)

LUẬN VĂN SIÊU CẤP CHANNEL

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG MỸ PHẨM (2019) WORD VERSION | 2019 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

(chữ in hoa thẳng, không in đậm cỡ 16)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI (chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

(cỡ 4,0 cm x 4,0 cm)

ĐỚI HẢI LINH (chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC (chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

HÀ NỘI 2019 (chữ in hoa thẳng, in đậm

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

(chữ in hoa thẳng, không in đậm cỡ 16)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI (chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

ĐỚI HẢI LINH (chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG MỸ PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC (chữ in hoa thẳng, in đậm cỡ 16)

CHUYÊN NGÀNH:KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Hường Hoa GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu (chữ in thường thẳng, in thường và đậm cỡ 16)

HÀ NỘI 2019 (chữ in hoa thẳng, cỡ 16)

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Lê Thị Hường Hoa và GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu - những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa kiểm nghiệm Mỹ phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành việc học và làm đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân tích đã cho tôi một môi trường học tập nghiêm túc, giúp tôi bồi đắp kiến thức và hoàn thiện bản thân.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn yêu thương, động viên để tôi có thể hoàn thành cuốn luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2019 Học viên

Đới Hải Linh

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

MỤC LỤC Lời cảm ơn Danh mu ̣c các kí hiêu, ̣ các từ viế t tắ t Danh mu ̣c các bảng Danh mu ̣c các hin ̀ h ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1 ..................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN.................................................................................................................. 3 1.1. ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU........................................... 3 1.1.1. Clindamycin........................................................................................................... 3 1.1.1.1. Tên khoa học, công thức cấu tạo và một số đặc điểm ........................................ 3 1.1.1.2. Dược lí và cơ chế tác dụng ................................................................................. 4 1.1.1.3. Chỉ định .............................................................................................................. 4 1.1.1.4. Độc tính và tác dụng phụ .................................................................................... 5 1.1.1.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Clindamycin ...................................... 5 1.1.2. Lincomycin hydroclorid ........................................................................................ 6 1.1.2.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo .................................................................... 6 1.1.2.2. Dược lý và cơ chế tác dụng ................................................................................ 6 1.1.2.3. Chỉ định .............................................................................................................. 7 1.1.2.4. Độc tính và tác dụng phụ .................................................................................... 7 1.1.2.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Lincomycin ....................................... 7 1.1.3. Tetracyclin hydroclorid ......................................................................................... 8 1.1.3.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo .................................................................... 8 1.1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng ................................................................................ 8 1.1.3.3. Chỉ định .............................................................................................................. 9 1.1.3.4. Độc tính và tác dụng phụ .................................................................................. 10 1.1.3.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Tetracyclin....................................... 10 1.2. PHƯƠNG PHÁP HPLC ......................................................................................... 11 1.2.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 11 1.2.2. Cấu tạo ................................................................................................................. 11

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

1.2.3. Detector và bộ phận ghi tín hiệu.......................................................................... 11 1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí ........................................................ 12 1.2.5. Ứng dụng ............................................................................................................. 13 1.2.6. Kĩ thuật HPLC với detector DAD ....................................................................... 15 CHƯƠNG 2 ................................................................................................................... 16 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 16 2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .................................................................................... 16 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 16 2.2.2. Dung môi và hóa chất .......................................................................................... 17 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 17 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 18 2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ............................................... 21 CHƯƠNG 3 ................................................................................................................... 22 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .................................................................................. 22 3.1. Khảo sát điều kiện xây dựng quy trình ................................................................... 22 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc kí ..................................................................................... 22 3.1.2. Khảo sát điều kiện xử lí mẫu ............................................................................... 25 3.2. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI LINCOMYCIN VÀ TETRACYCLIN .......................................................................... 26 3.2.1. Điều kiện sắc kí ................................................................................................... 26 3.2.2. Điều kiện xử lí mẫu ............................................................................................. 26 3.2.3. Thẩm định phương pháp 1 ................................................................................... 27 3.3. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC DẠNG MUỐI CỦA CLINDAMYCIN ......................................................................... 41 3.3.1. Điều kiện sắc kí ................................................................................................... 41 3.3.2. Điều kiện xử lí mẫu ............................................................................................. 41 3.3.3. Thẩm định phương pháp 2 ................................................................................... 42 3.4. ÁP DỤNG KIỂM TRA MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG ........................................... 54 CHƯƠNG 4 ................................................................................................................... 59 BÀN LUẬN ................................................................................................................... 59

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

4.1. VỀ CÁC KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU .............................................................. 59 4.2. VỀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .................. 59 4.2.1. Về phương pháp xử lí mẫu .................................................................................. 59 4.2.2. Về xây dựng các phương pháp phân tích và thẩm định ...................................... 60 4.3. VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM ............................................................... 61 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 62 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 62 Tài liêụ tham khảo Phu ̣ lu ̣c 1: Một số sắc kí đồ điển hình phân tích đồng thời kháng sinh Lincomycin hydroclorid, Tetracyclin hydroclorid.

Phu ̣ lu ̣c 2: Một số sắc kí đồ điển hình phân tích đồng thời kháng sinh Clindamycin hydroclorid, Clindamycin phosphat.

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt

Tên tiếng Việt (tiếng Anh)

ACN

Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of Official Analytical Chemists)

Linco HCl

Lincomycin hydroclorid

Clinda HCl

Clindamycin hydroclorid

Clinda PO4

Clindamycin phosphat

DMPM

Dung môi pha mẫu

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

Mẫu M1

Kem tẩy trang chiết xuất từ Trà xanh

Mẫu M1’

Mẫu M1 thêm chuẩn

Mẫu M2

Sữa rửa mặt sạch sâu Eveline Skincare 360º

Mẫu M2’

Mẫu M2 thêm chuẩn

MeOH

Methanol

ppm

Phần triệu (parts per million)

r

Hệ số tương quan (Relative coefficient)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SKĐ

Sắc kí đồ

Tetra HCl

Tetracyclin hydroclorid

UV-VIS

Tử ngoại- khả kiến (Ultraviolet-visible)

log P

Hệ số phân tán octanol/nước

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý và hóa học của các dạng muối Clindamycin ............. 4 Bảng 2.1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích.................. 16 Bảng 2.2. Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC ............................... 20 Bảng 3.1. Độ thích hợp của hệ thống sắc kí của Linco HCl và Tetra HCl ................... 27 Bảng 3.2. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Linco HCl và Tetra HCl ................ 32 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Linco HCl và Tetra HCl. .............. 33 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền kem. ................................................................................................................. 35 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt. ..................................................................................................... 35 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền kem ............................................................................................ 37 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt ................................................................................ 37 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền kem .................................................................................................................. 39 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt ...................................................................................................... 40 Bảng 3.10. LOD và LOQ của Linco HCl và Tetra HCl ................................................ 41 Bảng 3.11. Độ thích hợp hệ thống sắc kí của Clinda HCl và Clinda PO4 ..................... 43 Bảng 3.12. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Clinda HCl và Clinda PO4 .......... 46 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Clinda HCl và Clinda PO4. ........ 46 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền kem .......................................................................................................... 48 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt. ............................................................................................. 49 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền kem .......................................................................................... 50 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt .............................................................................. 51

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền kem .................................................................................................................. 53 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt ...................................................................................................... 53 Bảng 3.20. LOD và LOQ của Clinda HCl và Clinda PO4 ............................................ 54 Bảng 3.21. Kết quả phân tích các kháng sinh của các mẫu mỹ phẩm trên thị trường .. 56

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Clinda HCl .................................................................. 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Clinda PO4.................................................................. 3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Linco HCl ................................................................... 6 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Tetra HCl .................................................................... 8 Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC ................................................................... 11 Hình 1.6. Cấu tạo detector mảng diod (DAD)............................................................... 15 Hình 3.1. SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 4 kháng sinh nghiên cứu sử dụng pha động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 40 : 60 (a), tỉ lệ 35 : 65 (b) và tỉ lệ 30 : 70 (c) ............... 22 Hình 3.2. SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 2 kháng sinh Linco HCl và Tetra HCl sử dụng pha động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 27 : 73 ............................................................. 23 Hình 3.3. SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩ n 2 kháng sinh Clinda HCl và Clinda PO4 sử dụng pha động ACN - đệm pH 2,5 với tỉ lệ 23 : 77 ............................................................... 23 Hình 3.4. Phổ hấp thụ UV-VIS của Linco HCl (a), Clinda HCl (b), Clinda PO4 (c) và Tetra HCl (d) ................................................................................................................. 24 Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là Methanol ............. 25 Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là hỗn hợp MeOH : đệm amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30 : 70)....................................................................... 25 Hình 3.7. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Linco HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn................................................................................................................ 29 Hình 3.8. So sánh phổ UV – VIS của Linco HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn. ............................................................................................................................. 30 Hình 3.9. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Tetra HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn ...................................................................................................................... 31 Hình 3.10. So sánh phổ UV - VIS của Tetra HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn. ............................................................................................................................. 31 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Linco HCl................................................................................................................................. 33 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Tetra HCl................................................................................................................................. 34 Hình 3.13. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Clinda HCl và Clinda PO4 trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn ........................................................................................ 44

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Hình 3.14. So sánh phổ UV – VIS của Clinda HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn. ............................................................................................................................. 45 Hình 3.15. So sánh phổ UV - VIS của Clinda PO4 trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn ............................................................................................................................. 45 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Clinda HCl................................................................................................................................. 47 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Clinda PO4.... ............................................................................................................................ 47 Hình 3.18. Khảo sát thời gian lưu của Linco HCl và Tetra HCl trong điều kiện sắc ký của phương pháp 2..... .......................................................................................................... 55 Hình 3.19. So sánh phổ UV – VIS của píc Clinda HCl trên mẫu “Kem mụn Elza” ..... 57

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

ĐẶT VẤN ĐỀ Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao, nhu cầu chăm sóc cho bản thân càng trở nên thiết yếu, do đó mỹ phẩm trở thành sản phẩm tiêu dùng quen thuộc. “Sản phẩm mỹ phẩm” theo định nghĩa của ASEAN là “bất kỳ một chất hoặc một chế phẩm được dùng tiếp xúc với những bộ phận bên ngoài cơ thể con người (biểu bì, hệ thống lông tóc, móng tay/chân, môi và các bộ phận sinh dục ngoài) hoặc tiếp xúc với răng và niêm mạc miệng, với mục đích duy nhất hay chủ yêu là làm sạch, làm thơm, thay đổi diện mạo và/ hoặc cải thiện mùi cơ thể và/hoặc bảo vệ hay duy trì chúng trong điều kiện tốt” [1], [5], [14], [22]. Do đó chất lượng mỹ phẩm là một vấn đề phải được quan tâm bởi vì mỹ phẩm được sử dụng tiếp xúc trực tiếp với những bộ phận bên ngoài của cơ thể, không qui định về thời gian và liều lượng sử dụng, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe và vẻ đẹp của cơ thể.

Theo hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm mà Việt Nam đã tham gia kí kết từ năm 2003, trong bản bổ sung mới nhất vào năm 2018 có qui định danh sách 1383 chất và nhóm chất không được phép có mặt trong các sản phẩm mỹ phẩm (phụ lục II, phần 1) cũng như 323 chất và nhóm chất được phép sử dụng nhưng phải tuân theo các giới hạn và điều kiện qui định (phụ lục III, phần 1) [1], [13]. Kháng sinh thuộc danh sách chất và nhóm chất không được phép có mặt trong các sản phẩm mỹ phẩm [1], [13]. Tuy kháng sinh nằm trong danh mục chất bị cấm có mặt trong mỹ phẩm nhưng các sản phẩm mỹ phẩm trên thị trường vẫn có thể bị trộn trái phép vào để đạt được lợi ích điều trị các bệnh về da và thu lợi về kinh tế.

Các sản phẩm mỹ phẩm trị mụn, tàn nhang, chống nhăn, làm trắng da, làm se lỗ chân lông có hiệu quả tốt trong thời gian ngắn thường dễ bị thêm kháng sinh và các steroids vào mà nhà sản xuất lại không công bố trong thành phần mỹ phẩm, do đó ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người và dễ gây ra tình trạng kháng kháng sinh vì không có qui định về liều lượng và thời gian sử dụng [10], [18], [20], -1Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

[21]. Kháng sinh clindamycin, lincomycin và tetracyclin là những kháng sinh hay được trộn vào các sản phẩm mỹ phẩm như kem, sữa rửa mặt…với mục đích trị mụn trứng cá [4], [21], [24]. Ở Việt nam hiện nay chưa có qui trình phân tích kháng sinh trong mỹ phẩm mà mới chỉ có một số nghiên cứu phân tích các chất cấm thuộc nhóm chất màu, chất bảo quản, corticoid… [3], [11], [14]. Nếu ở nước ngoài đã có các nghiên cứu tương tự thì khi triển khai trên thực tế ở Việt nam cũng cần phải được đánh giá lại bằng thực nghiệm về việc áp dụng trên các mẫu mỹ phẩm đang có mặt tại Việt nam cũng như điều kiện thực tế trang thiết bị của nước ta.

Trên cơ sở đó, nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số kháng sinh trong mỹ phẩm với các mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình phân tích các kháng sinh Lincomycin hydroclorid, Clindamycin hydroclorid, Clindamycin phosphat và Tetracyclin hydroclorid trong nền mẫu kem và sữa rửa mặt trị mụn bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.

2. Áp dụng phương pháp xây dựng được với một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường để kiểm tra khả năng áp dụng của phương pháp và sơ bộ đánh giá sự có mặt các chất này trong mỹ phẩm.

-2Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU 1.1.1. Clindamycin 1.1.1.1. Tên khoa học, công thức cấu tạo và một số đặc điểm ❖ Clindamycin hydroclorid:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Clinda HCl Tên khoa học: (2S,4R)-N-[(1S,2S)-2-chloro-1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-methylsulfanyloxan -2-yl]propyl]-1-methyl-4-propylpyrrolidine-2-carboxamide;hydrochloride

❖ Clindamycin phosphat:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Clinda PO4 Tên khoa học: [(2R,3R,4S,5R,6R)-6-[(1S,2S)-2-chloro-1-[[(2S,4R)-1-methyl-4-propylpyrrolidine2-carbonyl]

amino]propyl]-4,5-dihydroxy-2-methylsulfanyloxan-3-yl]

dihydrogen

phosphate

-3Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý và hóa học của các dạng muối Clindamycin Tên

Clinda HCl

Clinda PO4

C18H34Cl2N2O5S

C18H34ClN2O8PS

Khối lượng mol

461,439

504,96

Thể chất

Tinh thể

Tinh thể

Nhiệt độ nóng chảy (°C)

141-143

114

Độ tan trong nước ở 25°C

30,61 mg/l

∞

log P

2,16

1,25

pKa

7,79

0,96; 6,06

Công thức phân tử

Các muối hydroclorid và phosphat đều tan tốt trong nước, methanol, khó tan trong ethanol; hầu như không tan trong aceton, chloroform, ether [8].

1.1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng - Cơ chế tác dụng: Clindamycin ức chế tổng hợp protein ở vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn với tiểu đơn vị 50S ribosom, tác dụng chính là ức chế sự tạo thành các liên kết peptid. [4], [6].

- Phổ tác dụng: Nhạy cảm: Vi khuẩn Gram dương ưa khí: Streptococci, Staphylococci, Bacillus anthracis và Corynebacterium diphteriae. Vi khuẩn Gram dương kỵ khí: Eubacterium, Propionibacterium, Peptococcus và Peptostreptococcus spp., nhiều chủng Clostridium perfringens và C. tetani. Một số chủng Actinomyces spp. và Nocardia asteroids. [4], [6].

1.1.1.3. Chỉ định Clindamycin được dùng điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt do Bacteroides fragilis. Clindamycin cũng được dùng điều trị các bệnh do nhiễm vi khuẩn Gram dương như Streptococci, Staphylococci (gồm cả chủng đã kháng meticilin) và Pneumococci. Tuy nhiên, do nguy cơ cao gây viêm -4Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

đại tràng giả mạc, clindamycin không phải là thuốc lựa chọn đầu tiên; chỉ nên cho dùng khi không có thuốc thay thế phù hợp.

Clindamycin được dùng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm trong những trường hợp sau: Tai mũi họng do S.pneumoniae kháng penicilin, viêm phế quản phổi, răng hàm mặt, da, trứng cá, sinh dục, xương khớp, nhiễm khuẩn huyết (trừ viêm màng não). Nhiễm khuẩn trong ổ bụng như viêm phúc mạc và áp xe trong ổ bụng.

Dùng tại chỗ chữa trứng cá và trứng cá đỏ [4], [6].

1.1.1.4. Độc tính và tác dụng phụ Dùng clindamycin có thể làm các vi khuẩn không nhạy cảm với thuốc phát triển quá mức.

Clindamycin có nguy cơ cao gây viêm đại tràng giả mạc do độc tố của Clostridium difficile tăng quá mức. Điều này xảy ra khi những vi khuẩn thường có ở đường ruột bị clindamycin phá hủy (đặc biệt ở người cao tuổi và những người có chức năng thận giảm). Ở một số người bệnh viêm đại tràng giả mạc có thể phát triển rất nặng và dẫn đến tử vong.

Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, mày đay, phát ban…[4], [6].

-5Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

1.1.1.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Clindamycin Xác định clindamycin trong “kem cuolingshuang” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, cột C18, pha động: ammonium dihydrogen phosphat pH 3,0 – methanol (1:1), nhiệt độ: 30°C, bước sóng: 214nm [19].

Xác định đồng thời 12 chất ( enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin, clindamycin, clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1,3propanediol, sulfamethoxazol, metronidazole, tindazol và acid salicylic) trong mỹ phẩm trị mụn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD, cột C18 (4,6mm x 250mm, 5µm), pha động: acetonitril – triethylammoniumphosphat 0,025 mol/l, nhiệt độ: 40°C, bước sóng: 210nm và 277nm [16].

1.1.2. Lincomycin hydroclorid 1.1.2.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo

R = CH3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Linco HCl Công thức phân tử: C18H35ClN2O6S Khối lượng mol: 442,996 Tên khoa học: (2S,4R)-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6methylsulfanyloxan-2-yl]propyl]-1-methyl-4-propylpyrrolidine-2-carboxamide; chloride;hydrate

-6Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Lincomycin hydroclorid là tinh thể, nhiệt độ nóng chảy là 156-158°C. Độ tan trong nước ở 25°C: 50 mg/l, log P = 0,56 và pKa = 7,6.

1.1.2.2. Dược lý và cơ chế tác dụng - Cơ chế tác dụng Lincomycin, cũng như các lincosamid khác gắn vào tiểu thể 50S của ribosom vi khuẩn giống các macrolid như erythromycin và cản trở giai đoạn đầu của tổng hợp protein. Tác dụng chủ yếu của lincomycin là kìm khuẩn, tuy vậy ở nồng độ cao có thể diệt khuẩn từ từ đối với các chủng nhạy cảm. [4], [6].

- Phổ tác dụng Thuốc có tác dụng đối với nhiều vi khuẩn ưa khí Gram dương, bao gồm các Staphylococcus,

Streptococcus,

Pneumococcus,

Bacillus

anthracis,

Corynebacterium diphtheriae. Tuy nhiên, không có tác dụng với Enterococcus.

Phần lớn các vi khuẩn ưa khí Gram âm, như Enterobacteriaceae kháng lincomycin; khác với erythromycin, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis và Haemophilus influenzae thường kháng lincomycin. [4], [6].

Lincomycin có phổ tác dụng rộng đối với các vi khuẩn kỵ khí. Các vi khuẩn kỵ khí Gram dương nhạy cảm bao gồm Eubacterium, Propionibacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus và nhiều chủng Clostridium perfringens và Clostridium tetani. Với liều cao, lincomycin có tác dụng đối với các vi khuẩn kỵ khí Gram âm, trong đó có Bacteroides spp.

Thuốc cũng có một vài tác dụng đối với sinh vật đơn bào, nên đã được dùng thử trong điều trị bệnh viêm phổi do Pneumocystis carinii và bệnh nhiễm Toxoplasma.

1.1.2.3. Chỉ định Nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus ở người bệnh có dị ứng với penicilin như áp xe gan; nhiễm khuẩn xương do Staphylococcus; nhiễm khuẩn phụ khoa như nhiễm khuẩn ở âm đạo, viêm màng trong tử cung, viêm vùng chậu; viêm màng bụng thứ phát; áp -7Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

xe phổi; nhiễm khuẩn huyết; mụn nhọt biến chứng và loét do nhiễm khuẩn kỵ khí…[4], [6].

1.1.2.4. Độc tính và tác dụng phụ Phải thận trọng khi dùng cho người có bệnh đường tiêu hóa, đặc biệt người có tiền sử viêm đại tràng. Người bệnh cao tuổi và nữ có thể dễ bị tiêu chảy nặng hoặc viêm đại tràng có màng giả.

Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, mày đay, phát ban…[4], [6].

1.1.2.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Lincomycin SINXác định đồng thời 12 chất ( enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin, clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1,3-propanediol, sulfamethoxazol, metronidazole, tindazol và acid salicylic) trong mỹ phẩm trị mụn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD, cột C18 (4,6mm x 250mm, 5µm), pha động: acetonitril – triethylammoniumphosphat 0,025 mol/l, nhiệt độ: 40°C, bước sóng: 210nm và 277nm [16].

1.1.3. Tetracyclin hydroclorid 1.1.3.1. Tên khoa học và công thức cấu tạo

Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Tetra HCl Công thức phân tử: C22H25ClN2O8 Khối lượng mol: 480,898 Tên khoa học: (4S,4aS,5aS,6S,12aR)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride -8Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Tetracyclin hydroclorid là tinh thể, nhiệt độ nóng chảy là 170-173°C. Độ tan trong nước ở 25°C: 231 mg/l, log P = -1,37 và pKa = 3,3.

1.1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng - Cơ chế tác dụng Tetracyclin là một kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn do ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Cơ chế tác dụng của tetracyclin là do khả năng gắn vào và ức chế chức năng ribosom của vi khuẩn. Khi vào trong tế bào vi khuẩn, tetracyclin gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom, ngăn cản sự gắn kết aminoacyl tRNA làm ức chế quá trình tổng hợp protein. Khi vi khuẩn kháng tetracyclin, vị trí gắn tetracyclin trên ribosom bị thay đổi. Do vậy, tetracyclin không gắn được vào ribosom của vi khuẩn và mất tác dụng. [4], [6].

- Phổ tác dụng Tetracyclin cơ bản có tác dụng trên nhiều vi khuẩn gây bệnh cả Gram âm và Gram dương, cả hiếu khí và kỵ khí; thuốc cũng có tác dụng trên Chlamydia, Mycoplasma, Rickettsia, Spirochaete. Các loại nấm, nấm men, virus không nhạy cảm với tetracyclin.

Gần đây, sử dụng tetracyclin trong điều trị phụ trợ cho các trường hợp trứng cá viêm (trứng cá bọc, trứng cá đỏ) có hiệu quả khả quan. Quá trình điều trị cần được thầy thuốc theo dõi chuyển biến lâm sàng và điều chỉnh kịp thời. Thời gian điều trị thường phải bắt đầu một vài tuần, sau đó điều chỉnh hoặc duy trì cho đến khi các tình trạng bệnh được cải thiện rõ ràng. [4], [6].

1.1.3.3. Chỉ định Do mức độ kháng thuốc của vi khuẩn nghiêm trọng và hiện nay có nhiều loại thuốc kháng khuẩn khác nên hạn chế việc sử dụng tetracyclin trong điều trị. Tuy nhiên, thuốc vẫn còn được chỉ định trong một số nhiễm khuẩn khi xác định vi khuẩn còn nhạy cảm như: nhiễm khuẩn do Chlamydia, trứng cá bọc, trứng cá đỏ, bệnh giang mai, bệnh dịch hạch, bệnh than…

-9Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Phối hợp trong một số phác đồ điều trị H. pylori trong bệnh loét dạ dày tá tràng. Phối hợp với thuốc chống sốt rét như quinin để điều trị sốt rét do Plasmodium falciparum kháng thuốc.

Sợi tetracyclin được dùng trong điều trị phụ trợ bệnh nha chu để giảm chảy máu và làm sâu thêm các hốc quanh chân răng khi lấy cao răng và làm sạch chân răng.

Chỉ nên dùng tetracyclin khi đã chứng minh được vi khuẩn gây bệnh còn nhạy cảm [4], [6].

1.1.3.4. Độc tính và tác dụng phụ Không dùng tetracyclin cho phụ nữ mang thai và trẻ em dưới 8 tuổi, do việc sử dụng các thuốc nhóm tetracyclin trong quá trình phát triển của răng (nửa cuối thai kỳ và trẻ dưới 8 tuổi) có thể gây biến màu răng vĩnh viễn (vàng, xám, nâu) và thuốc có thể gắn vào và ảnh hưởng tới sự phát triển của xương.

Một vài trường hợp dùng tetracyclin thấy có phản ứng nhạy cảm với ánh sáng biểu hiện bằng bỏng nắng khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. Những người bệnh dùng tetracyclin nếu phải tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời hay tia tử ngoại cần được cảnh báo về nguy cơ này và cần ngừng thuốc ngay khi có những triệu chứng đầu tiên của ban đỏ.

Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, bội nhiễm nấm ở miệng, thực quản; mày đay, ban đỏ, viêm gan, tổn thương ống thận, sai lệch công thức máu do các sản phẩm chuyển hóa của thuốc gây ra…[4], [6].

1.1.3.5. Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Tetracyclin Xác định đồng thời 7 kháng sinh nhóm tetracyclin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao, pha đảo, cột Diamonsil C18 (250mm x 4,6mm, 5µm), pha động: methanol - acetonitril - acid oxalic 0,01 mol/l (pH 2,0) (11:22:67), bước sóng 267nm [23].

Xác định đồng thời 6 kháng sinh tetracyclin (minocycline hydroclorid, oxytetracyclin, tetracyclin hydroclorid, clotetracyclin hydroclorid, doxycyclin - 10 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

hydroclorid, chloramphenicol) trong sản phẩm mỹ phẩm trị mụn bằng phương pháp HPLC cột C18 (4,6mm x150mm, 5µm), pha động: acetonitril - methanol - acid trifluoroacetic 10mmol/l, tốc độ: 1,0ml/phút, nhiệt độ cột: 30°C, bước sóng 268nm [15], [17].

1.2. PHƯƠNG PHÁP HPLC 1.2.1. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di duyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuốc và các yếu tố đó.

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [2], [3], [7], [9].

1.2.2. Cấu tạo Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Hệ thống cấp pha động, bơm sắc kí lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột và pha tĩnh, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu.

Hệ thống cấp . dung môi

Bộ phận tiêm mẫu

Bơm

Hệ thu nhận xử lý dữ liệu Detector

Cột sắc ký

Thải

Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC. - 11 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

1.2.3. Detector và bộ phận ghi tín hiệu Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp.

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS).

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang.

- Detector điện hóa: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation, anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

- Detector chỉ số khúc xạ: sử dụng với hầu hết chất phân tích nhưng độ nhạy kém hơn detector hấp thụ UV. - Detector tán xạ bay hơi: thường được dùng để phân tích các chất kém bay hơi hơn so với pha động của sắc kí lỏng.

Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính. Để phân tích các kháng sinh có các phương pháp phổ biến như: phương pháp sắc kí lỏng (sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV-VIS; sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS; sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết hợp đầu dò khối phổ UPLCMS/MS. Phương pháp HPLC là một phương pháp đơn giản, với độ lặp lại tốt là một kỹ thuật phù hợp để phân tích các kháng sinh. Tuy nhiên phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS có một nhược điểm là có thể có sự chồng lấp các píc khi phân tích kháng sinh trong nền mẫu phức tạp. Những hạn chế này có thể được khắc phục khi kết hợp sắc kí lỏng với đầu dò khối phổ. Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao hơn đáng kể và thiết bị vẫn chưa có ở nhiều phòng thí nghiệm. Dựa vào tham khảo tài liệu, kết hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC kết hợp với detector DAD để phân tích kháng sinh. Đây là thiết bị khá phổ biến ở các phòng phân tích, kiểm nghiệm.

- 12 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Detector DAD là công cụ hữu hiệu để giúp loại trù các trường hợp dương tính giả do xuất hiện các pic trùng thời gian lưu với các chất cần phân tích.

1.2.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí 1.2.4.1. Thời gian lưu Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi píc đến detector được gọi là thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian tM của chất không lưu gọi là thời gian chết.

1.2.4.2. Độ phân giải Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký: Rs = trong đó:

RS : độ phân giải (tR)1, (tR)2: thời gian lưu chất 1, 2 W1, W2 : lần lượt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic RS ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn.

1.2.4.3. Tính đối xứng của píc sắc kí - Hệ số bất đối:

b AF = a

b: nửa chiều rộng phía sau píc. a: nửa chiều rộng phía trước píc a+b - Hệ số kéo đuôi: As = 2a 1.2.4.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết Cột sắc kí được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết.

- 13 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng píc nhỏ.

1.2.5. Ứng dụng Sắc kí nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: định tính, định lượng và điều chế.

1.2.5.1. Định tính Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau: - So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắcký.

- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm chuẩn đối chiếu.

- So sánh phổ UV-VIS (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối chiếu bằng DAD thông qua hệ số Match.

- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).

1.2.5.2. Phân tích định lượng Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc : nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký: ➢ Phương pháp chuẩn ngoại ➢ Phương pháp chuẩn nội ➢ Phuơng pháp thêm chuẩn ➢ Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong luận văn này phương pháp chuẩn ngoại được chọn sử dụng. Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với

- 14 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.

1.2.6. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách ra thành các bước sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử. Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc.

Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký. Phổ DAD của các pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic.

Hình 1.6. Cấu tạo detector mảng diod (DAD).

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian. Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích, có khả năng vẽ phổ UV – VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match.

Khi hệ số match xấp xỉ 1 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn. Hệ số match trên 0,90 thì chỉ ra hai phổ tương tự. Hệ số match càng gần 1 thì sự tương tự của hai phổ càng cao. Hệ số match dưới 0,90 chỉ ra hai phổ khác nhau [2], [3],[7], [9].

- 15 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 4 kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh nằm trong trong danh mục các chất không được dùng trong mỹ phẩm bao gồm: Clinda HCl, Clinda PO4, Linco HCl và Tetra HCl. Quy trình phân tích được khảo sát trên 2 nền mẫu là kem và sữa rửa mặt không chứa các kháng sinh nghiên cứu như ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích.

STT 1

2

Nơi sản xuất

Tên mẫu Kem tẩy trang chiết

Nature Republic, Hàn

xuất từ Trà xanh

Quốc

Sữa rửa mặt sạch sâu

Eveline Cosmetics, Ba

Thành phần Không có chứa các kháng sinh nghiên cứu

Eveline Skincare 360º Lan

Không có chứa các kháng sinh nghiên cứu

2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.2.1. Thiết bị và dụngcụ Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2018 đến tháng 2/2019 tại Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương với các thiết bị được định kỳ hiệu chuẩn đạt yêu cầu ISO/IEC 17025.

- Máy sắc kí lỏng Shimadzu LC - 2030C 3D (L21455502327) gồm module điều khiển, bơm gradient 4 kênh, bộ tiêm mẫu tự động, detector UV - UV 2600, buồng điều nhiệt, tích hợp đuổi khí.

- Cân phân tích chính xác tới 0,1 mg.

- Máy lắc siêu âm.

- Máy đo pH. - Máy li tâm lạnh.

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, pipet...

- 16 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

2.2.2. Dung môi và hóa chất - Chuẩn Clindamycin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: 0515098.03, hàm lượng: 92,90 %.

- Chuẩn Clindamycin phosphat: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: WS.0213205.03, hàm lượng: 95,29 %.

- Chuẩn Lincomycin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: 0417013.03, hàm lượng: 91,17 %.

- Chuẩn Tetracyclin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: 0411002.02, hàm lượng: 97,63 %.

- Methanol HPLC (Merck).

- Acetonitril HPLC (Merck).

- Amoni dihydrophosphat (Merck).

- Nước tinh khiết (DĐVN IV).

2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU • Xây dựng phương pháp phát hiện 4 kháng sinh: Clinda HCl, Clinda PO4, Linco HCl và Tetra HCl có mặt trái phép trong mỹ phẩm với hai quy trình: - Quy trình phân tích, phát hiện 2 kháng sinh: Linco HCl và Tetra HCl bằng HPLC. - Quy trình phân tích, phát hiện 2 kháng sinh: Clinda HCl và Clinda PO4 bằng HPLC; • Đánh giá phương pháp đã xây dựng: - Tính đặc hiệu; - Độ chính xác của phương pháp (gồm độ lặp lại và độ chính xác trung gian); - Độ đúng; - Khoảng tuyến tính; - Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện.

- 17 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

• Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện 4 kháng sinh: Clinda HCl, Clinda PO4, Linco HCl và Tetra HCl trong một số chế phẩm mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường.

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sử dụng là 2 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm: kem và sữa rửa mặt để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích với HPLC. Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc kí thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê. ❖ Xây dựng quy trình xử lý mẫu: Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu dựa vào 3 yếu tố chính: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu, phương pháp phân tích. ❖ Lựa chọn điều kiện sắc kí phù hợp: Tiến hành khảo sát chọn cột sắc kí, nhiệt độ cột, thành phần pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector DAD, thể tích tiêm mẫu. Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết píc và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đồng của píc nghi ngờ thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn. Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao píc thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn.

Cách tiến hành:Tiêm riêng biệt dung dịch thử, dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc kí lỏng sử dụng các điều kiện ở trên. Tiến hành sắc kí khoảng 30 - 45 phút. Ghi lại sắc kí đồ.

Cách đánh giá kết quả: - Dựa vào thời gian lưu: thời gian lưu của píc thu được từ dung dịch thử phải tương đương với thời gian lưu của píc thu được từ dung dịch chuẩn.

- So sánh phổ UV-VIS của píc thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu tương ứng với píc thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các píc này phải đạt từ 0,99 trở lên.

- 18 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

❖ Độ đặc hiệu: Tiến hành sắc kí các loại mẫu: mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích đã được thêm chuẩn chất cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình.

Yêu cầu: Trên sắc kí đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các píc khác (nếu có trong nền mẫu) và có thời gian lưu tương ứng với píc của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn. Sắc kí đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Píc của chất cần phân tích trong sắc kí đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ số tương đồng phổ UV-VIS của píc chất cần phân tích thu được trong sắc kí đồ của dung dịch tự tạo (hoặc mẫu thử, nếu có) với píc tương ứng trong sắc kí đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ 0,99 trở lên. ❖ Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn (5 dung dịch). Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng píc thu được trên các sắc kí đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải đạt r ≥ 0,995. Trường hợp r < 0,995 phải có sự giải thích phù hợp. ❖ Độ chính xác: Độ lặp lại: có thể được đánh giá trên kết quả của tối thiểu 6 lần định lượng ở 100% nồng độ thử (đối với chất cấm, dạng vết thì đánh giá ở nồng độ LOQ dự kiến). Độ chính xác trung gian: diễn tả mức giao động của kết quả, được thực hiện như độ lặp lại ở các ngày khác nhau.

Yêu cầu: như bảng 2.2.

- 19 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Bảng 2.2. Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC [12]. Đơn vị 100% 10% 1% 0,1% 100 ppm 10 ppm 1 ppm 100 ppb 10 ppb 1 ppb

RSD (%) 1,3 1,9 2,7 3,7 5,3 7,3 11 15 21 30

Độ thu hồi (%) 98-102 98-102 97-103 95-105 90-107 80-110 80-110 80-110 60-115 40-120

❖ Độ đúng: Xác định trên các mẫu tự tạo. Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích. Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập. Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính. Tính tỷ lệ thu hồi theo công thức: Lượng chất phân tích tìm lại Tỉ lệ thu hồi (%) =

Lượng chất chuẩn thêm vào

x100

Yêu cầu: như bảng 2.2. ❖ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Có thể dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu. Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích đã biết với đáp ứng của mẫu trắng và từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện (LOD) hoặc định lượng (LOQ) được.

Giới hạn phát hiện: Tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu nằm giữa 3 hoặc 2:1 có thể được chấp nhận để thiết lập giới hạn phát hiện.

- 20 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com

Giới hạn định lượng: Tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu thông thường là 10:1.

2.5. XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Các kết quả thực nghiệm được tính toán và xử lý thống kê trên Microsoft Excel với các hàm thống kê thông dụng như: - Hàm tính trung bình cộng AVERAGE. - Hàm tính độ lệch chuẩn STDEV.

- 21 Đóng góp PDF bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đăng ký Word doc qua Zalo 0905779594 Email thanhtuqn88@gmail.com