Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm Linh chi (Ganoderma lucidum P. Karst.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P.Karst.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P.Karst.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410

Ngƣời hƣớng dẫn :

PGS.TS. Trần Việt Hùng PGS.TS. Đỗ Thị Hà

HÀ NỘI - 2017

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

Ơ

N

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Việt Hùng,

N

H

PGS.TS. Đỗ Thị Hà, những ngƣời thầy đã quan tâm, chỉ bảo tận tình và tạo mọi

U Y

điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.

.Q

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung

TP

ƣơng, Ban giám đốc Viện Dƣợc liệu, Khoa Hóa Thực vật 2, Ban giám hiệu, Phòng

ẠO

Quản lý sau đại học và các thầy cô giáo trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo mọi

Đ

điều kiện thuận lợi, giúp đỡ hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ

G

thực hiện đề tài.

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn các anh chị Khoa Nghiên cứu và Phát triển đã giúp đỡ, san sẻ công việc và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành luận văn này.

TR ẦN

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ thực hiện luận văn này.

Hà Nội, ngày 4 tháng 4 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Ngân

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

N

DANH MỤC CÁC BẢNG

Ơ

DANH MỤC CÁC HÌNH

N

H

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

.Q

U Y

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................2

TP

1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P. Karst.) ............2

ẠO

1.1.1 Vị trí phân loại ...........................................................................................2

Đ

1.1.2 Đặc điểm thực vật ......................................................................................2

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

1.1.3 Phân bố, sinh thái ......................................................................................3

H Ư

1.1.4 Thành phần hóa học ..................................................................................3

TR ẦN

1.1.4.1 Polysaccharid ..........................................................................................4 1.1.4.2. Triterpenoid ...........................................................................................5

10 00

B

1.1.4.3 Peptid, protein ........................................................................................6 1.1.4.4 Khoáng chất ............................................................................................7

Ó

A

1.1.5 Tác dụng của nấm Linh chi .......................................................................7

Í-

H

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi ..................................................................11

-L

1.2 POLYSACCHARID TRONG NẤM LINH CHI............................................11

ÁN

1.2.1 Hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi ........................................11

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

1.2.2 Các phƣơng pháp phân tích polysaccharid (PS) trong nấm Linh chi......12 1.2.1.1 Phƣơng pháp tạo màu đo quang phổ hấp thụ UV – VIS ......................12 1.2.1.2 Phƣơng pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao HPLC ...................................13

1.3 ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI .......................................13 1.3.1 Hàm lƣợng acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi ......................14 1.3.2 Các phƣơng pháp phân tích acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi ...........................................................................................................................14

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.3.2.1 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng .............................................................15 1.3.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ...................................15

H

Ơ

1.4.1 Mô tả ........................................................................................................16

N

1.4 MỘT SỐ CHỈ TIÊU KHÁC TRONG KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI ...16

U Y

N

1.4.2 Bột ...........................................................................................................16

.Q

1.4.3 Định tính ..................................................................................................17

TP

1.4.4 Độ ẩm ......................................................................................................19

ẠO

1.4.5 Tro toàn phần ...........................................................................................19

G

Đ

1.4.6 Tro không tan trong acid .........................................................................19

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

1.4.7 Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu ..............................................................19

TR ẦN

1.4.8 Tạp chất ...................................................................................................19 1.5 MỘT VÀI NÉT VỀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................19

B

1.5.1 Phƣơng pháp HPTLC ..............................................................................19

10 00

1.5.2 Phƣơng pháp HPLC.................................................................................21

A

1.5.3 Phƣơng pháp quang phổ UV – VIS .........................................................23

H

Ó

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................25

Í-

2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................25

-L

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI........................................25

ÁN

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM ...........................................................26

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................27 2.4.1 Định danh thực vật ..................................................................................27 2.4.2 Mô tả dƣợc liệu........................................................................................27 2.4.3 Mô tả đặc điểm bột dƣợc liệu ..................................................................27 2.4.4 Xác định độ ẩm........................................................................................27 2.4.5 Định tính nấm Linh chi bằng phƣơng pháp TLC ....................................28

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.4.6 Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng HPLC .................................................................................29

H

Ơ

2.4.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC.........................30

N

2.4.6.1 Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu.........................................................29

U Y

N

2.4.6.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích .......................................................30

.Q

2.4.7 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng acid ganoderic

TP

A trong các mẫu nấm Linh chi ..........................................................................33

ẠO

2.4.8 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng polysaccharid (PS) trong nấm Linh

Đ

chi bằng phƣơng pháp đo quang .......................................................................33

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

2.4.8.1 Lựa chọn nhiệt độ chiết tối ƣu ..............................................................34

H Ư

2.4.8.2 Khảo sát thời gian chiết ........................................................................34

TR ẦN

2.4.8.3 Khảo sát thời gian và điều kiện phản ứng ............................................34 2.4.8.4 Khảo sát thể tích ethanol 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid ......34

10 00

B

2.4.8.5 Thẩm định phƣơng pháp ......................................................................35 2.4.9 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng polysaccharid

Ó

A

trong các mẫu nấm Linh chi ..............................................................................36

Í-

H

2.4.10 Xử lý số liệu ..........................................................................................36

-L

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................38

ÁN

3.1 ĐỊNH DANH THỰC VẬT .............................................................................38

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

3.2 MÔ TẢ HÌNH THỂ ........................................................................................38 3.3 MÔ TẢ BỘT DƢỢC LIỆU ............................................................................42 3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM .......................................................................................46 3.5 ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC ................48 3.6 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC ...52 3.6.1 Tối ƣu quá trình chiết acid ganoderic A (GAA) .....................................52

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC............................52 3.6.2.1 Lựa chọn thành phần pha động ............................................................52

N

3.6.2.3 Lựa chọn nhiệt độ cột ...........................................................................53

H

Ơ

3.6.3 Quy trình định tính, định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng pháp

U Y

N

HPLC.................................................................................................................53

.Q

3.6.4 Thẩm định phƣơng pháp .........................................................................54

TP

3.6.4.1 Độ đặc hiệu ...........................................................................................54

ẠO

3.6.4.2 Tính thích hợp của hệ thống .................................................................55

G

Đ

3.6.4.3 Độ tuyến tính ........................................................................................56

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

3.6.4.4 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian ...................................................57

TR ẦN

3.6.4.5 Độ đúng ................................................................................................58 3.6.4.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ...................59

B

3.7 ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM

10 00

LINH CHI VIỆT NAM .........................................................................................59 3.8 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID

Ó

A

TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV – VIS .60

Í-

H

3.8.1 Lựa chọn thời gian chiết ..........................................................................60

-L

3.8.2 Lựa chọn thể tích EtOH 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid...........60

ÁN

3.8.3 Lựa chọn thời gian và điều kiện phản ứng ..............................................61

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

3.8.4 Quy trình định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi ........................61

3.8.5 Thẩm định phƣơng pháp .........................................................................62

3.8.5.1 Độ đặc hiệu ...........................................................................................62 3.8.5.2 Tính thích hợp của hệ thống .................................................................62 3.8.5.3 Độ tuyến tính ........................................................................................62 3.8.5.4 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian ...................................................63

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3.8.5.5 Độ đúng ................................................................................................64 3.9 ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM LINH

H

Ơ

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................68

N

CHI VIỆT NAM ...................................................................................................65

N

4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỂ QUẢ, BỘT NẤM LINH CHI .....................................68

U Y

4.2 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG SẮC KÝ LỚP

.Q

MỎNG HIỆU NĂNG CAO HPTLC ....................................................................68

TP

4.3 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A

ẠO

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC ............................................69

Đ

4.3 HÀM LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG CÁC MẪU NẤM LINH

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

CHI NGHIÊN CỨU ..............................................................................................69

H Ư

4.4 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID BẰNG

TR ẦN

PHƢƠNG PHÁP ĐO QUANG ............................................................................70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................72

B

KẾT LUẬN ...........................................................................................................72

10 00

KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................73

A

TÀI LIỆU THAM KHẢO

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

PHỤ LỤC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Ganoderma lucidum

EtOH

Ethanol

LOD

Limit of detection (giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantitation (giới hạn định lƣợng)

TLC

Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng)

HPTLC

High performance thin layer chromatography (sắc ký lớp

ẠO

mỏng hiệu năng cao)

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

G.lucidum

HPLC

High-performance liquid chromatography (sắc ký lỏng

G

Đ

hiệu năng cao)

N

Ultraviolet – visible

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

UV – VIS PS

Polysaccharid

Acid ganoderic A

TR ẦN

GAA

Low-density lipoprotein - cholesterol

HDL – C

High-density lipoprotein - cholesterol

10 00

B

LDL – C

ALT

A

MeOH

H

Methanol American Herbal Pharmacopoeia

Relative standard deviation (độ lệch chuẩn tƣơng đối) Rentention time (thời gian lƣu)

V

Thể tích

T, T’

Nhiệt độ

t

Thời gian

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

RT

Í-

RSD

Ó

AHP

Alanin Amino Transferase

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. 1: Phân tích TLC trong bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam và dƣợc

Ơ H

18

N

Bảng 1. 2: Phân tích TLC trong Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) và Dƣợc

U Y

điển Mỹ

TP

.Q

Bảng 2.1: Các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu

Bảng 3. 2: Độ ẩm của 12 mẫu nấm Linh chi

N

Bảng 3. 5: Kết quả khảo sát độ tuyến tính

H Ư

Bảng 3. 4: Cách pha dãy các dung dịch chuẩn

G

Đ

Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống

ẠO

Bảng 3. 1: Mô tả hình thể

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

17

N

điển Trung Quốc

25 38 47 55 56 56 57

Bảng 3. 7: Kết quả độ thu hồi

58

TR ẦN

Bảng 3. 6: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian

B

Bảng 3. 8: Hàm lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi

59 62

Bảng 3. 10: Kết quả khảo sát độ tuyến tính

63

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian

64

Bảng 3. 12: Kết quả độ thu hồi

65

Í-

H

Ó

A

10 00

Bảng 3. 9: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống

65

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Bảng 3.13: Kết quả định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC HÌNH

5

Hình 1.2:

Cấu trúc hóa học một vài hợp chất triterpenoid trong G.lucidum

6

Hình 1.3:

Acid ganoderic A

Hình 2. 1:

Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu

Hình 3. 1:

Bột nấm Linh chi GLT – 1

Hình 3. 2:

Bột nấm Linh chi GLT – 2

Hình 3. 3:

Bột nấm Linh chi GLT – 3

Hình 3. 4:

Bột nấm Linh chi GLT – 4

Hình 3. 5:

Bột nấm Linh chi GLT – 5

Hình 3. 6:

Bột nấm Linh chi GLT – 6

Hình 3. 7:

Bột nấm Linh chi GLT – 7

Hình 3. 8:

Bột nấm Linh chi GLT – 8

45

Hình 3. 9:

Bột nấm Linh chi GLT – 9

45

Hình 3. 10: Bột nấm Linh chi GLN – 1

45

Hình 3. 11: Bột nấm Linh chi GLN – 2

46

N

Công thức đơn vị polysaccharid -proteoglycan chiết xuất từ G. Lucidum

N

H

Ơ

Hình 1. 1:

U Y

13

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q

26

A

10 00

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Trang

43 43 43 44 44 44

46

H

Ó

Hình 3. 12: Bột nấm Linh chi GLN – 3

42

49

Hình 3. 14: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol ở bƣớc sóng 366 nm

49

TO

ÁN

-L

Í-

Hình 3. 13: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol ở bƣớc sóng 254 nm

50

Hình 3. 16: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 254 nm

50

Hình 3. 17: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 366 nm

51

D

IỄ N

Đ

ÀN

Hình 3. 15: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

51

Hình 3. 19: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid ganoderic A (1), dung dịch thử (2), dung dịch trắng (3) và so sánh phổ UV của pic acid ganoderic A của dung dịch chuẩn – thử

55

H N 57

U Y

Hình 3. 20: Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan nồng độ acid ganoderic A và diện tích pic

Ơ

Hình 3. 18: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) sau khi phun thuốc thử

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

63

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

Hình 3. 21: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan tuyến tính nồng độ D-glucose và độ hấp thụ

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, bên cạnh việc sử dụng các thuốc tân dƣợc thì ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung đang dần dần đi theo hƣớng sử dụng các thảo dƣợc vì tính

Ơ

N

hiệu quả và an toàn thân thiện với cơ thể con ngƣời, có thể sử dụng thƣờng xuyên

N

H

hàng ngày. Việt Nam là một nƣớc có thảm thực vật phong phú và đa dạng sinh học

U Y

với nhiều cây dƣợc liệu quý. Nhân dân ta vốn có kinh nghiệm lâu đời trong việc

.Q

dùng thảo dƣợc. Nhiều cây thuốc đã đƣợc nghiên cứu kỹ càng về thành phần hóa

TP

học, cơ chế tác dụng chữa bệnh và đƣợc tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên, trong thực tế,

ẠO

nhiều cây thuốc dùng để chữa bệnh trong dân gian vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách đầy đủ.

G

Đ

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum P. Karst) là một loại dƣợc liệu quý đƣợc sử

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

dụng lâu đời, đặc biệt trong điều trị suy nhƣợc thần kinh, mất ngủ, các bệnh về tim

H Ư

mạch, ung thƣ, thấp khớp, tiểu đƣờng, viêm gan…[13], [20]. Ở Trung Quốc, nấm

TR ẦN

Linh chi còn đƣợc coi là một “thần dƣợc” giúp kéo dài tuổi thọ, ngăn ngừa lão hóa, tăng sức dẻo dai cho cơ thể [20]. Với những tính năng và công dụng phong phú của nó đối với sức khỏe, nấm Linh chi đƣợc sử dụng phổ biến không những ở các nƣớc

10 00

B

phƣơng Đông mà còn khá đƣợc ƣa chuộng ở các nƣớc phƣơng Tây. Tuy nhiên, chất lƣợng của nấm Linh chi không ổn định, phụ thuộc vào các yếu tố về giống, điều

A

kiện nuôi trồng, nguồn gốc địa lý, điều kiện khí hậu, môi trƣờng, thời gian thu

H

Ó

hoạch... [20], [40]. Hiện nay, trên thị trƣờng Việt Nam có rất nhiều sản phẩm linh

Í-

chi có nguồn gốc khác nhau, là loại nuôi trồng hay thu hái tự nhiên, với các mức

-L

chất lƣợng khác nhau. Vì vậy cần thiết phải có một phƣơng pháp kiểm tra đánh giá

ÁN

chất lƣợng chúng.

TO

Vì vậy, việc xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm Linh chi nhằm đánh giá

chất lƣợng nấm Linh chi là một vấn đề có ý nghĩa không chỉ về mặt khoa học mà

D

IỄ N

Đ

ÀN

còn đáp ứng nhu cầu cấp thiết hiện nay của xã hội. Xuất phát từ nhu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm

Linh chi (Ganoderma lucidum P. Karst.)” với mục tiêu sau: 1. Xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm nấm Linh chi (Ganoderma lucidum P. Karst.).

2. Ứng dụng phƣơng pháp đã xây dựng để đánh giá chất lƣợng một số mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum P. Karst.) trên thị trƣờng.

1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P. Karst.)

N

Chi Ganoderma trên thế giới có trên 250 loài. Trong đó, loài đƣợc sử dụng

H

Ơ

nhiểu nhất cho đến thời điểm hiện tại để chăm sóc sức khỏe là nấm Linh chi

N

Ganoderma lucidum P. Karst. [3].

U Y

Nấm linh chi gọi theo tiếng Trung Quốc là Lingzhi, theo tiếng Nhật là Reishi, ở

.Q

Việt Nam là nấm Lim, nấm Tiên Thảo hay nấm Trƣờng Thọ [13], [14]. Trong số rất

TP

nhiều tên gọi khác nhau nhƣ Chi Linh, Mộc Chi Linh, Linh chi…thì tên Linh chi

ẠO

(đƣợc dùng làm tên gọi chung cho các loài nấm thuộc họ Ganodermataceae) là tiêu

G

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

2000 năm, tên này đã chính thức đƣợc sử dụng [14].

Đ

biểu và mang tính lịch sử. Trong sách “Thần nông bản thảo” ra đời cách đây hơn

H Ư

1.1.1 Vị trí phân loại

TR ẦN

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum P. Karst. [14].

Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) nấm Linh chi thuộc: Giới nấm (Fungi)

10 00

B

Ngành nấm đảm (Basidiomycota) Lớp nấm đảm (Agaricomycetes)

Ó

A

Bộ nấm đa tầng (Polyporales)

H

Họ nấm Linh chi (Ganodermataceae)

-L

Í-

Chi Ganoderma P. Karst. [12], [14].

1.1.2 Đặc điểm thực vật

ÁN

Nấm hóa gỗ, sống một năm hay lâu năm [13]. Quả thể có cuống dài, ngắn hay

TO

hầu nhƣ không cuống và mũ đính lệch hay đính bên màu nâu đỏ, bóng nhoáng. Mũ

D

IỄ N

Đ

ÀN

nấm mới sinh có dạng cục lồi, tròn; sau phát triển thành dạng thận, dạng bán cầu, dạng quạt, có khi hầu nhƣ tròn. Mặt trên mũ nấm có những vân vòng đồng tâm,

lƣợn sóng nhiều hay ít; hơi có vân răn dạng phóng xạ [12]. Mặt dƣới nâu nhạt mang các ống rất nhỏ chứa bào tử [13]. Mép nấm mỏng hoặc hơi tù, lƣợn sóng; hơi chia thùy ở những mũ nấm có kích thƣớc lớn [12].

2

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Mũ mới sinh có màu trắng có sắc thái vàng lƣu huỳnh; sau chuyển sang màu vàng, vàng rỉ sắc, nâu, nâu đỏ, nâu hồng tím…tạo nên một lớp vỏ bóng nhoáng nhƣ quét sơn hoặc nhƣ đánh vecni. Kích thƣớc mũ 2 – 2,5 x 3 – 30 cm; dày 0,5 –

Ơ

N

1,5 cm [12].

N

H

Cuống nấm thƣờng đính ở trên phần lõm vào của mũ nấm. Cuống mới hình

U Y

thành màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, màu nâu…và phủ vỏ bóng, có màu sắc

.Q

và cấu trúc tƣơng tự mũ nấm. Cuống hình trụ, gần nhƣ tròn hoặc hơi dẹp, kích

TP

thƣớc (1)3-20 x 0,5-2(4) cm [12].

ẠO

Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và

Đ

nhiều gai nhọn. Toàn cây nấm màu nâu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen [13].

G N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

1.1.3 Phân bố, sinh thái

H Ư

Nấm Linh chi là loài phân bố khắp nơi trên thế giới. Nấm mọc trên gốc, rễ cây

TR ẦN

sống và cây đã chết, trên rất nhiều cây gỗ mọc trong rừng và công viên, nhƣ cây ăn quả, đặc biệt là các cây thuộc bộ Đậu nhƣ lim xanh, lim vàng, phƣợng vĩ…. [12].

Có thể tìm thấy nấm linh chi ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai (Sa Pa) đến

10 00

B

Lâm Đồng (Lang Biang). Ở các vùng rừng trƣớc kia có nhiều cây lim đã bị khai thác, trên gốc hoặc phần thân cành còn lại (chủ yếu ở phần giác) đều có thể thấy

A

nấm này mọc vào mùa mƣa ẩm, nhƣ vùng rừng thuộc lâm trƣờng Hƣơng Sơn, tỉnh

H

Ó

Hà Tĩnh; vùng rừng thuộc Vƣờn Quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa và Tam Đảo

-L

Í-

(Vĩnh Phúc)…[13].

ÁN

Nấm Linh chi sinh sản chủ yếu bằng bào tử nằm ở mặt dƣới của thể quả. Phần

TO

có chức năng sinh dƣỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất. Ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam ngƣời ta đã chủ động nghiên cứu trồng đƣợc

D

IỄ N

Đ

ÀN

Nấm Linh chi trên giá thể nhân tạo để dùng làm thuốc [13].

1.1.4 Thành phần hóa học Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra nấm Linh chi có chứa các hoạt chất quý nhƣ triterpenoid, polysaccharid, peptid, steroid, acid amin, khoáng chất [3], acid béo no và không no [9], protein, alkaloid, nucleosid [38], ergosterol [20] và các vitamin [33], [57]. Hầu hết, nấm Linh chi tƣơi chứa khoảng 90% nƣớc theo trọng 3

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

lƣợng, 10% còn lại bao gồm protein 10-40%, 2-8% chất béo, 3-28% carbohydrat, 332% chất xơ, 8-10% tro, và một số vitamin và khoáng chất chính nhƣ: kali, canxi,

Ơ

Trong số các thành phần hóa học của nấm Linh chi thì polysaccharid và

N

phốt pho, magie, selen, sắt, kẽm, đồng, …[40].

N

H

triterpenoid đƣợc chú ý hơn cả vì những tác dụng sinh học đáng kể của chúng [22],

U Y

[39], [40], [63]. Tuy nhiên, số lƣợng và tỷ lệ phần trăm của từng thành phần có thể

.Q

rất đa dạng trong các sản phẩm tự nhiên và thƣơng mại, đã đƣợc minh chứng bằng

TP

số liệu trong nhiều nghiên cứu [40], [42].

ẠO

1.1.4.1 Polysaccharid

G

Đ

Các polysaccharid đƣợc phân lập từ bào tử, quả thể và sợi nấm của nấm Linh

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

chi hoặc tách từ dung dịch môi trƣờng nuôi cấy nấm [39].

Polysaccharid là một trong những thành phần có hàm lƣợng cao (có thể tới

TR ẦN

45%) của G.lucidum [3] gồm các polysaccharid trung tính (β-1→3, β-1→6 homo D-glucan); glucan có tính acid và polyglycan; heteroglucan liên kết protein;

10 00

B

arabinoxyoglucan (một heteroglucan phân nhánh cao); heteroglycan với liên kết β1→4 và peptidoglycan (ganoderan A, B, và C) [17]. Dây nối (1,3)- β-D-glucan làm

A

cho mạch polysaccharid có dạng xoắn tƣơng tự nhƣ tinh bột. (1,3)- β-D-glucan tan

H

Ó

trong nƣớc nóng và tan một phần trong nƣớc lạnh. Dung dịch nƣớc của các (1,3)- β-

-L

Í-

D-glucan ở nồng độ cao có độ nhớt cao [3].

Các β – glucan trong thể quả của Linh chi có thể có cùng khối lƣợng phân tử

ÁN

nhƣng khác nhau về mức độ phân nhánh. Khối lƣợng phân tử của các chất này vào

TO

khoảng 1.050.000 đvc. Dây nhánh trong các β – glucan của Linh chi thƣờng là 1→6

chi cấu tạo bởi các đƣờng D – glucose, D-galactose, D-mannose, L-(hay D-)arabinose, D-xylose hay L-fucose [3], [40].

D

IỄ N

Đ

ÀN

[20]. Tỉ lệ phân nhánh thay đổi từ 1/3 – 1/23. Các heteropolysaccharid trong Linh

4

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

TP

Hình 1. 1: Công thức đơn vị polysaccharid -proteoglycan chiết xuất từ G. Lucidum

ẠO

1.1.4.2. Triterpenoid

Đ

Terpen là hợp chất tự nhiên mà bộ khung cacbon của nó bao gồm một hoặc

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

nhiều đơn vị isopren C5. Triterpen là một phân lớp của nhóm terpen, có cấu trúc

H Ư

khung C30 [40]. Cấu trúc hóa học của các triterpenoid trong nấm Linh chi dựa trên

TR ẦN

lanostan, là một chất chuyển hóa của lanosterol [33], [40]. Các triterpenoid của nấm Linh chi đã nhận đƣợc những chú ý đáng kể do những tác dụng dƣợc lý nổi bật của

B

chúng [23], [25].

10 00

Trong phần không phân cực của thể quả có các triterpenoid tự do với hàm lƣợng có thể tới 3-5%. Các chất chính là các acid ganoderic A, B, C, D, F, H, I, J,

Ó

A

K, L, M, R, S, T, V, X, Y, Z, W; lucidenic A, B, C, D, I; ganoderan A, B, C và

H

lucidenol A, B, C. Các triterpen khác bao gồm ganoderol A và B, epoxyganoderiol

-L

Í-

A-C, acid ganoderenic A-D, acid ganodermic, ganoderiol A-I, ganodermanontriol, ganodermatriol, acid ganolucidic A-E, lucidon A-C, acid lucidenic A-M, lucidadiol

ÁN

và lucidal. Một số triterpenoid nhƣ acid ganoderic A, C, I, J; acid lucidenic A, D, I

TO

và lucidon A và C làm cho Linh chi có vị đắng, khác với các loại nấm khác [3]. Các

D

IỄ N

Đ

ÀN

triterpen lanostanoid oxy hóa khác nhau trong nấm Linh chi bao gồm nhiều cặp C-3 lập thể và C-3/ C-5 đồng phân vị trí [20].

Acid ganoderic A và acid ganoderic B là hai chất thuộc nhóm triterpen đƣợc phân lập lần đầu từ Linh chi vào năm 1982 [49].

Cho đến nay, ngƣời ta đã xác định có hơn 150 triterpenoid khác nhau đƣợc xác định trong quả thể, bào tử và hệ sợi [23] và đƣợc phân thành năm nhóm cấu trúc

5

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

chính [55]. Các acid ganoderic A, B, H chỉ đƣợc phát hiện trong thể quả, trong khi acid ganoderic R, S, T là những triterpenoid chính trong sợi nấm [45].

Hàm lƣợng triterpenoid là khác nhau ở các bộ phận khác nhau và ở các giai

Ơ

N

đoạn phát triển của nấm. Sự khác nhau của các triterpenoid trong G. lucidum có thể

N

H

đƣợc sử dụng để phân biệt nấm dƣợc liệu này với các loài khác gần tƣơng tự và sử

U Y

dụng nhƣ một tiêu chuẩn để đánh giá chất lƣợng của các mẫu nấm Linh chi khác

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

nhau [20], [40].

Acid ganoderic B

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

Lanosterol

Lucidaciol

-L

Lucidenic A

ÁN

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học một vài hợp chất triterpenoid trong G.lucidum

TO

1.1.4.3 Peptid, protein

ÀN

Năm 1989, các tác giả ngƣời Nhật đã phân lập từ sợi nấm Linh chi một

D

IỄ N

Đ

polypeptid (Lingzhi – 8 có 110 amino acid dựa trên sắc ký lọc gel (cột Sephadex G

– 75) và sắc ký trao đổi ion (cột DEAE Sephadex – 25) [64].

Protein trong nấm Linh chi có chứa tất cả các acid amin thiết yếu, rất giàu lysin và leucin. Tổng hàm lƣợng chất béo thấp và tỷ lệ cao các đa acid béo không bão hòa tƣơng đối so với tổng số acid béo của nấm đƣợc coi là đóng góp đáng kể cho giá trị sức khỏe của nấm [39].

6

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Tuy nhiên theo Robert T. GoW thì hàm lƣợng protein trong chi Ganoderma thấp hơn so với các loại nấm khác (chỉ khoảng 7-8%) [32].

Ơ

Thành phần khoáng chính trong nấm Linh chi là phosphor, silica, sulfur, kali,

N

1.1.4.4 Khoáng chất

N

H

calci, và magnesi. Ngoài ra, các nguyên tố nhƣ sắt, natri, kẽm, đồng, mangan,

U Y

stronti cũng đƣợc phát hiện ở nồng độ thấp, cũng nhƣ các kim loại nặng khác nhƣ

.Q

chì, thuỷ ngân, cadmi. Nấm G. lucidum cũng có thể chứa hàm lƣợng selen lên đến

TP

72 µg / g nấm khô [30].

ẠO

Trong thể quả của G.lucidum, ngoài các khoáng chất thông thƣờng còn có một

Đ

hàm lƣợng cao của germani. Hàm lƣợng germani trong Linh chi châu Á có thể tới

G N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

800 – 2000 ppm [3].

H Ư

1.1.5 Tác dụng của nấm Linh chi

TR ẦN

- Tác dụng chống khối u

Nhiều tác giả cũng đã cho thấy hiệu quả tiêu diệt một số tế bào ung thƣ của polysaccharid nhƣ tế bào ung thƣ bạch cầu chuột (L1210) [65], tế bào ung thƣ bạch

10 00

B

cầu ngƣời HL-60 [47], tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC-3 [44] Acid ganoderic T (GA-T) phân lập từ nấm Linh chi có hiệu quả ức chế tế bào

A

ung thƣ xâm thực và di căn trong cơ thể [24].

H

Ó

Theo nghiên cứu của Jiang J. và cộng sự, nấm Linh chi ức chế sự phát triển của

Í-

tế bào ung thƣ vú thông qua ức chế tín hiệu Akt/NF-kappaB và có thể sử dụng để

-L

điều trị ung thƣ vú [42].

ÁN

Các bác sĩ Trung Quốc hiện đại sử dụng nấm Linh Chi để hỗ trợ sức đề kháng ở

TO

bệnh nhân trải qua hóa trị liệu thông thƣờng và / hoặc xạ trị cho các hình thức ung

D

IỄ N

Đ

ÀN

thƣ khác nhau [20].

- Tác dụng hạ đường huyết Các glycan A, B và C phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng hạ đƣờng máu rõ rệt ở chuột nhắt trắng bình thƣờng và chuột nhắt trắng gây đái tháo đƣờng bằng aloxan [13].

Jia và cộng sự [42] nghiên cứu trên những con chuột bị gây tiểu đƣờng bằng streptozotocin. Sau điều trị bằng dịch chiết giàu polysaccharid, nồng độ insulin

7 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

huyết thanh tăng (so với chứng) và nồng độ glucose giảm một cách phụ thuộc vào liều. Nghiên cứu này cũng cho thấy, ngoài việc điều chế đƣờng huyết, điều trị bằng G. lucidum giúp giảm các tác nhân oxy hóa [42].

Ơ

N

- Tác dụng hạ huyết áp

N

H

Các thử nghiệm có kiểm chứng trên ngƣời cho thấy cao chiết Linh chi (55 mg x

U Y

3 lần/ngày) sử dụng trong 1 tháng có tác dụng hạ huyết áp rõ rệt so với giá trị cơ

.Q

bản trên những bệnh nhân cao huyết áp trung bình không đáp ứng với nifedipin hay

TP

với nimodipin, so với placebo. Một số acid ganoderic nhƣ acid ganoderic B, D, F, H

ẠO

phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống tăng huyết áp, trong đó acid ganoderic

Đ

F có tác dụng mạnh nhất [3].

G

- Tác dụng hạ lipid máu

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Nguyễn Thị Mai Anh và cộng sự đã nghiên cứu trên chuột cống trắng tăng cholestron máu thực nghiệm, thu đƣợc kết quả cao nƣớc nấm Linh chi (2ml cao

TR ẦN

lỏng chứa 1 g nấm) có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL – C, đồng thời làm tăng HDL – C trong huyết tƣơng [1].

10 00

B

Ganoderol A và B, ganoderal A và acid ganoderic phân lập từ nấm Linh chi, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol thông qua ức chế enzym lanosterol- 14α-

Ó

H

cholesterol) [36].

A

desmetilase (xúc tác cho phản ứng chuyển 24,25 – dihydrolanosterol thành

Í-

- Tác dụng bảo vệ gan và chống loét dạ dày

-L

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hà cùng các cộng sự (2013) [34] cho thấy, cao chiết

ÁN

methanol và các phân đoạn n – hexan, dicloromethan, nƣớc của dịch chiết

TO

methanol, cùng các hợp chất phân lập đƣợc từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol

ÀN

peroxid và ganodermanontriol) có tác dụng bảo vệ gan in vivo và in vitro liên quan

D

IỄ N

Đ

đến sự kích hoạt enzyme HO – 1 và hợp chất ganodermanontriol thể hiện tác dụng kích hoạt protein HO – 1 thông qua sự kích hoạt yếu tố chuyển vị trong nhân tế bào

NRF – 2, trong các con đƣờng tín hiệu PI3K/Akt và p38, làm tăng cƣờng mức độ bảo vệ các tế bào gan chống lại t- BHP gây ra các stress oxy hóa [34].

Theo nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi và cộng sự, cao triterpenoid trong nấm Linh chi với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột có tác dụng bảo vệ tế bào gan. Ở

8 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

liều này, cao nấm Linh chi có khả năng ức chế 39,86 % sự tăng hoạt độ men ALT trong huyết thanh chuột gây ra bởi paracetamol [16].

Các polysaccharid trong nấm Linh chi đƣợc xem là có tác dụng bảo vệ gan.

Ơ

N

Acid ganoderic R và S trong hệ sợi; acid ganoderic A trong bào tử nấm Linh chi có

N

H

tác dụng bảo vệ gan gây ra bởi galactosamin [3].

U Y

Ngoài ra, tác dụng của nấm linh chi trên những tổn thƣơng dạ dày cũng đã đƣợc

.Q

nghiên cứu. Nhóm nghiên cứu Gao, Tang và cộng sự [31] đã gây loét dạ dày chuột

TP

bằng acid acetic đã gây và điều trị bằng GL-PS, một polysaccharide chiết xuất từ G.

ẠO

lucidum, với liều 0,5 và 1,0 g / kg trong 14 ngày. Kết quả, GL-PS làm gia tăng đáng

Đ

kể việc chữa lành vết loét (40% và 56%, tƣơng ứng với liều điều trị). Điều trị với

G

liều 1,0 g / kg còn cho thấy sự phục hồi đáng kể chất nhầy và nồng độ prostaglandin

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

so với nhóm chứng [31].

- Tác dụng tăng cường miễn dịch

TR ẦN

Năm 2007, Xu Z. và cộng sự [68] đã báo cáo một polysaccharid của G.lucidum giúp đẩy nhanh quá trình phục hồi các tế bào tủy xƣơng, hồng cầu, bạch cầu, các tế

10 00

B

bào tiêu diệt tự nhiên và các tế bào T trên chuột bị gây ức chế miễn dịch bằng cyclophosphamid.

A

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hƣơng và Trịnh Văn Tấn (2011), cao

H

Ó

nƣớc, cao cồn và polysaccharid thô chiết từ nấm Linh chi đỏ trồng tại Việt Nam đều

Í-

có tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch trong thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch

-L

bằng cyclophosphamid [11].

ÁN

Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của nấm Linh chi có liên quan đến sự hỗ

TO

trợ điều hoà miễn dịch thông qua sự cảm ứng của các cytokin và tăng cƣờng lại cơ

ÀN

quan miễn dịch phản ứng lại kích thích. Các thành phần khác nhau từ G. lucidum

D

IỄ N

Đ

làm tăng cƣờng sự phát triển và trƣởng thành của các lympho T và B, các tế bào

đơn nhân lách, các tế bào NK và các tế bào đuôi gai trong nuôi cấy in vitro và trong các nghiên cứu động vật in vivo [21], [73].

- Tác dụng chống oxy hóa Năm 2002, You và Lin [69] đã báo cáo phức hợp polysaccharid – peptid gồm16 loại amino acid có tác dụng chống oxy hóa.

9 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Năm 2005, Nguyễn Thƣợng Dong và cộng sự tiến hành trên chuột nhắt trắng, nhận thấy cao nƣớc và cao ethanol 80 % chiết xuất từ nấm Linh chi có hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl4 [7].

Ơ

N

Nấm Linh chi đỏ thể hiện hoạt tính khử gốc superoxid in vitro điển hình ở các

N

H

cao cồn, cao MeOH, phân đoạn n – butanol và phân đoạn diethy ether. Theo nhóm

U Y

nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng chiết xuất từ nấm Linh chi

.Q

có tác dụng chống oxy hóa (ức chế 19,94 % sự tăng hàm lƣợng MDA so với chứng

TP

bệnh lý với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột) [16].

ẠO

Cao cồn và cao nƣớc nấm Linh chi điều chỉnh về mức bình thƣờng hoạt tính

Đ

GSH-Px trong gan chuột bị gây tổn thƣơng oxy hóa bằng cyclophosphamid [5].

G

Năm 2015, Yurkiv B và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tác dụng chống oxy

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

hóa trên chuột đƣợc gây đái tháo đƣờng bằng streptozotocin, nhận thấy nấm làm tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa. Từ đó giúp ngăn ngừa stress oxy hóa

TR ẦN

phát triển trong tế bào ở bệnh nhân tiểu đƣờng [71].

- Tác dụng kháng HIV

10 00

B

Các tác giả Hàn Quốc đã đánh giá tác dụng ức chế sự phát triển HIV-1 ở các tế bào lympho T ở ngƣời của cao nƣớc nấm Linh chi. Kết quả cho thấy, cao nƣớc nấm

A

Linh chi có tác dụng ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này [45].

H

Ó

Các chất nhƣ ganoderiol A, B và F, ganodermanontriol, acid ganoderic α, B, C1

Í-

và H, 3β-5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-dien đƣợc phân lập từ nấm có khả

-L

năng ức chế enzym protease của virus HIV in vitro [29].

ÁN

- Tác dụng khác

TO

Cao nấm Linh chi toàn phần có tác dụng dự phòng và điều trị phục hồi một

D

IỄ N

Đ

ÀN

phần độc tính gây suy giảm bạch cầu của paclitaxel và carboplatin [8].

Adenosin trong nấm có tác dụng giảm kết tập tiểu cầu, phân giải thrombin và

ngăn ngừa huyết khối [3], [32], [44].

Ngoài ra, hàm lƣợng cao germani của nấm Linh chi giúp gia tăng khả năng hấp thu oxy của hồng cầu lên tới 1,5 lần; có thể tăng cƣờng chuyển hóa và ngăn ngừa thoái hóa mô [3].

10 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Nghiên cứu của Nguyễn Thƣợng Dong và cộng sự (2006) cho thấy cao EtOH nấm Linh chi ở cả hai liều thử tƣơng đƣơng 10 và 20 g dƣợc liệu/kg chuột có tác dụng cải thiện sự suy giảm khả năng nhận thức và suy giảm khả năng ghi nhớ gây

N

ra bởi scopolamin [6].

H

Ơ

Nấm Linh chi còn có tác dụng chống viêm trong bệnh Crohn liên quan đến

N

việc ức chế tín hiệu NF-κB của tuyến yên [51]. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc tác

U Y

dụng giảm đau đến 37,9 % trên chuột thực nghiệm của các acid ganoderic A, B,

.Q

C và H [39].

ẠO

lại sự phá hủy của tia phóng xạ trên in vitro và in vivo [59].

TP

Polysaccharid phân lập từ G.lucidum đã đƣợc chứng minh là có tác dụng chống

Đ

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Linh chi đƣợc sử dụng từ lâu và đƣợc coi nhƣ là một trong các vị thuốc đầu vị tăng cƣờng trí nhớ, kéo dài tuổi thọ… [3]

H Ư

của y học cổ truyền phƣơng Đông. Trong y học cổ truyền, Linh chi đƣợc dùng để

TR ẦN

Theo kinh nghiệm dân gian, Nấm Linh chi đƣợc dùng để điều trị suy nhƣợc thần kinh, chóng mặt, mất ngủ; viêm khí quản mạn tính, bệnh bụi silic phổi lao;

B

tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, bệnh động mạch vành tim; viêm gan, đau dạ

10 00

dày, chán ăn, thấp khớp, thống phong. Liều dùng mỗi ngày 3 – 10 g dạng thuốc sắc,

A

hoặc 2 – 5 g tán bột uống. Dùng ngoài, xông trị viêm mũi [13].

Ó

1.2 POLYSACCHARID TRONG NẤM LINH CHI

Í-

H

1.2.1 Hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi

-L

Dƣợc điển Trung Quốc yêu cầu hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi

ÁN

không đƣợc thấp hơn 0,5% dƣợc liệu khô [58].

TO

Dƣợc điển Mỹ yêu cầu hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi không

D

IỄ N

Đ

ÀN

đƣợc thấp hơn 0,7% dƣợc liệu khô [67].

Năm 2013, Poh-Guat Cheng và cộng sự [26] đã nghiên cứu trên mẫu nấm

G.lucidum thu hái ở Malaysia, thu đƣợc dịch chiết nƣớc chứa tổng lƣợng polysaccharid là 25,1%.

Theo Juan Lu và cộng sự (2012) [54] nghiên cứu các mẫu nấm G.lucidum đƣợc

thu hái từ núi Dabie, quận Longquan, Nantong, núi Changbai, Wuyi, thành phố Liaocheng (Trung Quốc), có hàm lƣợng polysaccharid lần lƣợt là 1,85%; 5,88%; 3,30%; 6,03%; 7,38%; 9,08%.

11 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Trần Thị Văn Thi cùng cộng sự [15] cũng đã xác định hàm lƣợng của phân đoạn polysaccharid từ nấm Linh chi nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế. Hàm lƣợng polysaccharid trong cao toàn phần polysaccharid là 86,00 ± 0,53 (P = 0,95, n = 6).

Ơ

N

1.2.2 Các phƣơng pháp phân tích polysaccharid (PS) trong nấm Linh chi

N

H

Dung môi chiết xuất polysaccharid thƣờng là nƣớc nóng [23], [33], [39] hoặc là

.Q

1.2.1.1 Phương pháp tạo màu đo quang phổ hấp thụ UV – VIS

U Y

dung dịch kiềm [38] sau đó kết tủa bởi rƣợu [23], [33], [39].

TP

* Phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử anthron

ẠO

Nguyên tắc:

- Dùng dung dịch HCl loãng để thuỷ phân polysaccharid thành monosaccharid.

G

Đ

- Trong môi trƣờng acid nóng, glucose bị dehydrat hóa tạo thành hydroxymethyl

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

furfural. Hợp chất này kết hợp với anthron tạo thành sản phẩm có màu xanh lục hấp

H Ư

thụ cực đại tại 630 nm [37].

TR ẦN

Phƣơng pháp này đƣợc dƣợc điển Trung Quốc sử dụng để định lƣợng tổng lƣợng polysaccharid trong G.lucidum và G.sinensis [58].

B

* Phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử phenol-acid sulfuric

10 00

Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng thuỷ phân polysaccharid thành monosaccharid. Trong môi

A

trƣờng acid nóng, glucose bị dehydrat hóa tạo thành hydroxymethyl furfural. Hợp

H

Ó

chất này tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bƣớc

Í-

sóng λ = 490 nm [37].

-L

Theo Krystyna Skalicka-Woźniak [63], sau khi chiết PS bằng nƣớc nóng

ÁN

(85°C) trong 5 giờ, và kết tủa bằng EtOH, tổng lƣợng PS tinh khiết đƣợc định lƣợng

TO

bằng cách tạo màu với thuốc thử phenol – acid sulfuric theo quy trình: lắc đều 30

ÀN

phút hỗn hợp 1 ml dung dịch thử, 1 ml dung dịch phenol 5% và 5 ml H2SO4 đặc, đo

D

IỄ N

Đ

quang ở bƣớc sóng 490 nm. Phƣơng pháp có độ lặp lại cao, tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,055-0,475 mg/ml [63].

Theo Masuko T. và cộng sự (2005) [56] thứ tự mẫu thử - acid sulfuric – phenol cho độ hấp thụ tối đa. Tuy nhiên phƣơng pháp thêm dung dịch đƣờng, phenol vào bình nón, lắc đều rồi thêm H2SO4 đặc cũng đƣợc nhiều nghiên cứu chứng minh là cho độ hấp thụ tối đa [62], [70].

12 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.2.1.2 Phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao HPLC Dƣợc điển Mỹ [67] đã sử dụng phƣơng pháp HPLC để định lƣợng polysaccharid toàn phần trong nấm Linh chi. Các điều kiện sắc ký nhƣ sau:

Ơ

N

Detector: UV 250 nm

N

H

Cột: L1, 4,6 mm x 25 cm, 5 µm

U Y

Nhiệt độ cột: 35 ± 1°C

.Q

Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

TP

Thể tích tiêm: 10 µl

ẠO

Pha động: đệm phosphat 0,05 M (dung dịch A) : acetonitril (dung dịch B)

84

30

82,5

55 60

Dung dịch B (%) 16

H Ư

17,5

81

19

81

19

84

16

10 00

B

61

Đ

0

G

Dung dịch A (%)

N

Thời gian (phút)

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Chƣơng trình gradient:

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

1.3 ACID GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI

Tên

khoa

Hình 1.3: Acid ganoderic A học:

(2R,6R)-6-[(5R,7S,10S,13R,14R,15S,17R)-7,15-dihydroxy-

4,4,10,13,14-pentamethyl-3,11-dioxo-2,5,6,7,12,15,16,17-octahydro-1Hcyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methyl-4-oxoheptanoic

acid,

(7β,15α,25R)-

7,15-dihydroxy-3,11,23-trioxo-lanost-8-en-26-oic acid Công thức phân tử: C30H44O7

13 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Khối lượng phân tử: 516,67 g/mol Acid ganoderic A là một trong những triterpen chính của nấm G.lucidum [59], đƣợc phát hiện trong G.lucidum mà không đƣợc phát hiện trong một số loài nấm cùng

Ơ

N

chi Ganoderma nhƣ Ganoderma applanatum, Ganoderma lipsiense, Ganoderma

N

H

carnosum, Ganoderma sugae, Ganoderma mastoporum, Ganoderma neo-japonicum,

U Y

Ganoderma amboinense, Ganoderma austral [55]. Acid ganoderic A có nhiều trong

.Q

thể quả và có tác dụng bảo vệ gan trên chuột bị tổn thƣơng gan gây ra bởi CCl4 bằng

TP

cách ức chế β-glucuronidase, trong khi các triterpen khác chỉ làm giảm không đáng

ẠO

kể các enzym gan [20], [66]. Ngoài ra còn có tác dụng chống khối u [47].

Đ

1.3.1 Hàm lƣợng acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi

G

Hàm lƣợng acid ganoderic A và B chiếm hơn một nửa toàn lƣợng nấm Linh chi,

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

do đó việc xác định hàm lƣợng của axit ganoderic A và B có thể đƣợc sử dụng để đánh giá chất lƣợng của nấm G.lucidum [49].

TR ẦN

Trong nghiên cứu của Poh-Guat Cheng [26], mẫu nấm Linh chi đƣợc tiêu chuẩn hóa chứa hàm lƣợng GAA là 0,45 %.

10 00

B

Hàm lƣợng GAA trong các mẫu nấm thu hái từ núi Dabie, quận Longquan, Nantong, núi Changbai, Wuyi, thành phố Liaocheng (Trung Quốc) lần lƣợt là 7,254

A

m/g; 6,658 mg/g; 3,563 mg/g; 2,628 mg/g; 2,154 mg/g và 1,959 mg/g [54].

H

Ó

Hàm lƣợng GAA trong bào tử và thể quả của G.lucidum cho kết quả lần lƣợt từ

Í-

15,1- 278,6 µg/g và 57,7 – 987,2 µg/g [63].

-L

Acid ganoderic A đƣợc sử dụng là một trong các chất đối chiếu để định lƣợng

ÁN

thành phần triterpenoid của nấm Linh chi trong dƣợc điển Mỹ, với yêu cầu tổng

TO

lƣợng triterpenoid không đƣợc ít hơn 0,3 %, tính theo tổng hàm lƣợng của 10

ÀN

triterpenoid bao gồm: acid ganoderic A, acid ganoderenic C, acid ganoderic C2, acid

D

IỄ N

Đ

ganoderic G, acid ganoderenic B, acid ganoderic B, acid ganoderic H, acid ganoderic D, acid ganoderenic D và acid ganoderic F so với dƣợc liệu khô [67].

1.3.2 Các phƣơng pháp phân tích acid ganoderic A (GAA) trong nấm Linh chi Dung môi để chiết xuất các hợp chất triterpenpid trong chi Ganoderma là diclomethan [25], methanol [29], [28], [57], ethanol [68], chloroform [68], [23]

hoặc dung dịch kiềm [18].

14 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng Dƣợc điển Mỹ sử dụng acid ganoderic A làm một trong các chất đối chiếu trong định tính nấm Linh chi bằng HPTLC, với hệ dung môi toluen – ethyl format – acid

Ơ

N

formic (5 : 5 : 0,2) [66].

N

H

Các tác giả PGS. TS. Nguyễn Ngọc Vinh, Ths. Nguyễn Thị Kim Danh [19]

U Y

cũng chọn GAA để làm chất đối chiếu, và sử dụng hệ dung môi: chloroform –

.Q

methanol – nƣớc (30 : 4 : 1), lấy lớp dƣới.

TP

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

ẠO

Dƣợc điển Mỹ [67] định lƣợng thành phần GAA trong nấm Linh chi bằng

Đ

phƣơng pháp HPLC, sử dụng cột L1 (2,1 mm x 15 cm, 1,8 µm); detector UV 257

- Dung dịch B: acetonitril

10 00

B

Dung dịch A (%) 80 73,5 73,5 61,5 0 0 80

Dung dịch B (%) 20 26,5 26,5 38,5 100 100 20

-L

Í-

H

Ó

A

Thời gian (phút) 0 3 34 52 54 55 55,5

TR ẦN

Chƣơng trình gradient:

N

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

- Dung dịch A: acid phosphoric/nƣớc 0,075%

G

nm; nhiệt độ cột 25 ± 1°; tốc độ dòng 0,4 ml/phút với pha động nhƣ sau:

ÁN

Theo Jie Liu và cộng sự [52] sử dụng HPLC rửa giải gradient, pha động acid

TO

acetic 2%/nƣớc (v/v, dung dịch A) và acetonitril (dung dịch B) đã định lƣợng đƣợc

D

IỄ N

Đ

ÀN

5 triterpenoid, trong đó có acid ganoderic A. Theo Jing Zhao và cộng sự [72] đã định lƣợng đồng thời 8 triterpen (gồm GAA

và acid ganoderic Y, acid ganoderic DM, ganoderol A, ganoderol B, ganoderal A, methyl ganoderat D, ganoderate G) và sterol bằng HPLC rửa giải gradient, sử dụng cột Zorbax ODS C18, thành phần pha động gồm nƣớc (dung dịch A) và methanol (dung dịch B).

Phƣơng pháp HPLC rửa giải đẳng dòng cũng đƣợc sử dụng để phân tích GAA.

Với các điều kiện sắc ký: Alltima C18 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), pha động

15 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

acetonitril- acid formic 0,04%, bƣớc sóng phát hiện 254 nm, nhiệt độ cột 15°C, Li B. M. [48] đã định lƣợng đồng thời GAA cùng acid ganoderic C2, acid ganoderic G, acid ganoderenic B, acid ganoderic B, acid ganoderenic A, acid ganoderic A,

N

acid lucideric A, acid ganoderenic D và acid ganoderic C1.

H

Ơ

Để so sánh hàm lƣợng triterpenoid trong thể quả và bào tử của G.lucidum, một

N

chƣơng trình HPLC đƣợc xây dựng với pha động ethanol 2% –acetonitril (4:6),

U Y

phân tách đƣợc 7 acid ganoderic là acid ganoderic A, B, C1, H, α, β và acid

.Q

ganolucidic A [50].

TP

GAA trong nấm Linh chi cũng đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC –

ẠO

PAD pha đảo rửa giải isocratic với các điều kiện sắc ký gồm: cột RP 18 (100 x 4,6

Đ

mm; 4 µm); pha động acetonitril – acid acetic 1% (30 : 70), bƣớc sóng phát hiện

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

254 nm, nhiệt độ cột 30°C, tốc độ dòng 1,5 ml/phút [18].

H Ư

Chƣơng trình HPLC đẳng dòng pha động gồm acetonitril, nƣớc và acid formic (42:58:0.5, v/v/v), cột Agilent Zorbax XDB C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm) cho

TR ẦN

giới hạn phát hiện GAA là 3,0 ng/ml và giới hạn định lƣợng là 20,0 ng/ml [53].

Theo Da J. và cộng sự [28], đã chọn GAA là chuẩn đối chiếu để phân tích các

B

thành phần triterpen khác trong G.lucidum do có hàm lƣợng cao trong G.lucidum,

10 00

phân tách dễ, và tƣơng đối ổn định.

A

Ngoài ra GAA còn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp miễn dịch học sắc ký [61].

H

1.4.1 Mô tả

Ó

1.4 MỘT SỐ CHỈ TIÊU KHÁC TRONG KIỂM NGHIỆM NẤM LINH CHI

-L

Í-

Thể quả hình thận, hình tròn hay hình quạt, hóa gỗ, cứng, đƣờng kính 5 cm đến

ÁN

18 cm, dày 1 cm đến 2 cm. Mặt trên màu nâu vàng đến nâu đỏ, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép mỏng, nhẵn, hơi lƣợn

TO

sóng, Mặt dƣới màu vàng nâu đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Phần trong xốp, màu

D

IỄ N

Đ

ÀN

trắng đến nâu nhạt. Cuống hình trụ, đính lệch, có khi phân nhánh dài 6 cm đến 10 cm,

đƣờng kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen. Màu thơm nhẹ, vị đắng [2].

1.4.2 Bột Bột màu vàng nâu. Soi bột dƣới kính hiển vi thấy: Sợi nấm rải rác hoặc tụ thành

đám, không màu hoặc nâu nhạt, mảnh, hơi cong, phân nhánh, đƣờng kính 2,5 µm đến 6 µm. Bào tử hình trứng, màu nâu, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, dài 8 µm

16 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

đến 12 µm, rộng 5 µm đến 8 µm, đỉnh trơn nhẵn, lớp vỏ ngoài không màu, lớp vỏ trong có nhiều chỗ lồi ra [2].

1.4.3 Định tính

Ơ

N

A. Lấy 2 g bột dƣợc liệu, thêm 20 ml EtOH 96 %, đun sôi hồi lƣu 1 giờ, lọc. Nhỏ vài

N

0,9 % và dung dịch kali fericyanid 0,6 % theo tỷ lệ 1:1, sẽ có màu xanh lơ [2].

H

giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, sấy nhẹ cho khô, phun hỗn hợp dung dịch sắt (III) clorid

U Y

B. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

.Q

Bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam, Dƣợc điển Trung Quốc, Dƣợc điển dƣợc

TP

liệu Mỹ (AHP) và Dƣợc điển Mỹ đều sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng để

ẠO

định tính nấm Linh chi [2], [58], [20], [67].

TR ẦN

G

Silica gel G

10 00

B

Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C)- ether ethylic – acid đến 90°C) – ethyl format – acid formic (15 : 5 : 1) formic (15 : 5 : 1); Lấy 2g bột dƣợc liệu, thêm 30ml Lấy 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 methanol, đun hồi lƣu trong 30 ml methanol, đun hồi lƣu trong 30 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc tới phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa tan cắn trong 2ml cắn. Hòa cắn trong 2 ml methanol methanol

H

Ó

Dung dịch thử

Silicagel G

A

Bản mỏng Dung môi khai triển

Dƣợc điển Trung Quốc [58]

H Ư

Bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam [2]

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Đ

Bảng 1.1: Phân tích TLC trong bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam và dƣợc điển Trung Quốc

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

Dung Lấy 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) dịch đối tiến hành chiết nhƣ mẫu thử chiếu Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký đến Tiến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến hành 12 cm, lấy bản mỏng để khô trong không khí, quan sát dƣới đèn tử ngoại, bƣớc sóng 366 nm Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết giống với các vết của Yêu cầu dung dịch đối chiếu về màu sắc và vị trí (có ít nhất 4 vết phát quang màu vàng ánh xanh)

Lấy 2g bột nấm Linh chi (mẫu chuẩn), tiến hành chiết nhƣ mẫu thử.

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 4 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng , quan sát dƣới tia UV bƣớc sóng 365 nm.

Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị Rf, với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

17 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 1. 2: Phân tích TLC trong Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) và Dƣợc điển Mỹ Dƣợc điển dƣợc liệu Mỹ (AHP) [20]

N

Dƣợc điển Mỹ [67]

H .Q

TP

Đ

ẠO

Siêu âm khoảng 1,0 g bột mịn nấm Linh chi trong 50 ml EtOH trong 15 phút, ly tâm, phần dịch đƣợc bốc hơi đến cắn. Hòa cắn trong 2ml EtOH.

G

Siêu âm 250 mg bột thuốc trong 5 ml methanol trong Dung dịch 5 phút, lọc. Bốc hơi dịch thử lọc đến cắn. Hòa cắn trong 3 ml methanol

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

N U Y

– Toluen – ethyl format – acid formic (5 : 5 : 0,2).

Dichloromethan methanol (9:1)

N

Dung môi khai triển

Ơ

Bản mỏng HPTLC 10 x 10 Bản mỏng cm hoặc 20 x 10 cm, silica Bản mỏng HPTLC gel 60

TR ẦN

-Dung dịch chuẩn A: 1,0 mg acid ganoderic A/EtOH - Dung dịch chuẩn B: 0,3 mg/ml ergosterol/ EtOH - Dung dịch chuẩn C: 50 mg/ml nấm G.lucidum trong EtOH

10 00

B

Dung dịch Không có đối chiếu

H2SO4 10%/ EtOH

A

Thuốc thử H2SO4 10%/ MeOH

-L

Í-

H

Ó

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch Tiến hành thử. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 7 cm

ÀN

TO

ÁN

Khi quan sát ở bƣớc sóng 366 nm, sắc ký đồ của dung dịch thử có 6 vết giống với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C về màu sắc và Rf. Ở ánh sáng thƣờng, mẫu thử có vết màu xanh tím trùng với Rf của acid ganoderic A; 2 vết tím đỏ, 1 vết xanh tím ở giữa sắc ký đồ, 2 vết màu tím, trong đó có 1 vết trùng với Rf của ergosterol

Yêu cầu

D

IỄ N

Đ

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 2 µl dung dịch A và B, 4 µl dung dịch C và dung dịch thử. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 7 cm

18 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1.4.4 Độ ẩm Yêu cầu không quá 17,0% [1], [58] 1.4.5 Tro toàn phần

Ơ

N

Yêu cầu không quá 3,0 % [1], không quá 3,2 % [58]

N

H

1.4.6 Tro không tan trong acid

U Y

Yêu cầu không quá 0,5 % [1], [58]

.Q

1.4.7 Chất chiết đƣợc trong dƣợc liệu

TP

Yêu cầu: Không ít hơn 3,0 % tính theo dƣợc liệu khô kiệt [1], [58].

ẠO

1.4.8 Tạp chất

Đ

Yêu cầu:

G

- Arsen: không vƣợt quá 3,0 µg/g

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

- Cadmium: không vƣợt quá 0,5 µg/g - Chì: không vƣợt quá 5,0 µg/g

TR ẦN

- Thủy ngân: không vƣợt quá 0,2 µg/g

- Vi sinh vật: tổng lƣợng vi khuẩn hiếu khí không vƣợt quá 105 cfu/g; tổng số lƣợng

10 00

B

nấm mốc và nấm men không vƣợt quá 103 cfu/g; vi khuẩn Gram âm không vƣợt quá 103 cfu/g và không có vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli. [58]

A

1.5 MỘT VÀI NÉT VỀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

H

Ó

1.5.1 Phƣơng pháp HPTLC

Í-

Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đƣợc dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi

-L

để bán định lƣợng hoặc định lƣợng hoạt chất thuốc [10].

ÁN

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động

TO

di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất

ÀN

hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, đƣợc trải thành lớp mỏng

D

IỄ N

Đ

đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu đƣợc là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng

19 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động [10]. Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di

Ơ

N

chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng

N U Y

a b

TP

.Q

Rf 

H

dịch chuyển của dung môi [10]:

ẠO

Trong đó: a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;

G

Đ

b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu.

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.

H Ư

Ngoài ra, khi sắc ký liên tục không xác định đƣợc tuyến dung môi, vị trí vết chất

TR ẦN

thử trên sắc đồ có thể xác định bằng hệ số dịch chuyển tƣơng đối Rr. Hệ số dịch chuyển tƣơng đối Rr đƣợc xác định bằng tỷ số giữa khoảng cách dịch chuyển của

B

vết chất thử và khoảng cách dịch chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu đƣợc sắc ký

10 00

trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với mẫu thử [10]: a c

H

Trong đó:

Ó

A

Rr 

-L

Í-

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử; c là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết chất chuẩn.

ÁN

Giá trị Rr có thể lớn hay nhỏ hơn 1.

TO

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức nâng cao của

D

IỄ N

Đ

ÀN

TLC. HPTLC đƣợc điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đƣa ra. Trong đó, các thông số của

quá trình phân tích đƣợc ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao.

Các bƣớc của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết đƣợc tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun mẫu đƣợc tiến hành tự động hoặc bán

20 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxi hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong quá trình

Ơ

lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các

N

khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm đƣợc kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ

N

H

phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống

U Y

phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lƣợng.

.Q

Hiện nay để tăng cƣờng độ tin cậy của kết quả phân tích, ngƣời ta sử dụng

TP

bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates). Bản này đƣợc tráng lớp pha

ẠO

tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thƣớc hạt 5µm độ

Đ

đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giải đƣợc tăng

G

cƣờng vì vết sắc kí nhỏ, thời gian sắc kí ngắn hơn và lƣợng dung môi ít hơn so

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

với TLC. 1.5.2 Phƣơng pháp HPLC

TR ẦN

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid ChromatographyHPLC) là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha

10 00

B

tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi

A

bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Các chất phân tích di chuyển qua

H

Ó

cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân

Í-

bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của chất này với

-L

pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất này ra khỏi cột phụ thuộc vào

ÁN

các yếu tố trên [4], [10].

TO

Kết quả của quá trình tách các chất đƣợc detector phát hiện, phóng đại và

ÀN

ghi thành sắc ký đồ. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành

D

IỄ N

Đ

phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt đƣợc tách ra trên sắc đồ. Tùy thuộc vào cơ

chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký pha liên kết, sắc ký gel. Trong đó sắc ký phân bố đƣợc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay[4], [10].

21 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Máy HPLC gồm các bộ phận sau: hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc

ký (bộ phận điều khiển nhiệt độ có thể đƣợc sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị). Pha

Ơ

N

động đƣợc cung cấp từ một hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thƣờng

.Q

Thời gian lưu tR (phút)

U Y

Sau đây là một số thông số đặc trƣng của kỹ thuật HPLC:

N

H

với tốc độ không đổi và sau đó chạy qua detector [4], [10].

Đ

Hệ số dung lượng k ’

ẠO

Thời gian lƣu là đại lƣợng để phát hiện định tính các chất.

TP

Thời gian lƣu t R là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic.

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha

H Ư

và đƣợc tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh

TR ẦN

và lƣợng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng. Độ chọn lọc α

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có kA’ và

10 00

B

kB’ khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc α (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ƣu). Nếu α quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.

A

Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)

H

Ó

Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định.

Í-

Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký nhƣ là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp

-L

này có tính chất động học, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân

ÁN

bằng nhiệt động học đƣợc thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha

TO

tĩnh và trong pha động.

D

IỄ N

Đ

ÀN

Độ phân giải R

Độ phân giải biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì để 2 pic có độ lớn bằng nhau đƣợc coi là tách ra khỏi nhau hoàn toàn thì độ phân giải tối thiểu phải là 1,5.

Hệ số bất đối xứng T

22 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hệ số bất đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ thu đƣợc.

T đƣợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nửa pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao pic.

Trong phép định lƣợng yêu cầu 0,8 ≤ T ≤ 2,0.

Ơ

N

1.5.3 Phƣơng pháp quang phổ UV – VIS

N

H

Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn đƣợc gọi là phƣơng

U Y

pháp quang phổ hấp thụ điện tử, là một trong các phƣơng pháp phân tích dựa trên

.Q

sự hấp thụ bức xạ điện từ [10].

TP

Xác định độ hấp thụ

ẠO

Độ hấp thụ A của một dung dịch là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền

A = Log10  = Log10  Trong đó:

I

TR ẦN

T

N

I0

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

1

G

Đ

quang T khi cho ánh sáng đơn sắc đi qua. Nó đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình:

B

I là cƣờng độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dung dịch;

10 00

Io là cƣờng độ ánh sáng đơn sắc tới; T là độ truyền quang.

Ó

A

Ngoại trừ sự có mặt của các yếu tố lý - hóa học khác, độ hấp thụ A tỷ lệ với độ

H

dài quang trình d của ánh sáng truyền qua dung dịch (bề dày lớp dung dịch) và nồng

TO

ÁN

[10].:

-L

Í-

độ c của dung dịch chất khảo sát. Sự phụ thuộc này đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình

A=cd

D

IỄ N

Đ

ÀN

Trong đó  là độ hấp thụ mol, d đƣợc biểu thị bằng cm và c biểu thị bằng mol/lít. Độ hấp thụ của dung dịch chất tan ở nồng độ 1% (kl/tt) hay 10 g/l trong một cốc

đo có chiều dày 1 cm và đo ở một bƣớc sóng xác định là độ hấp thụ riêng của chất tan và đƣợc ký hiệu là A (1 %, 1 cm). Độ hấp thụ riêng của chất tan đƣợc tính bằng công thức [10]: 10  

23 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

A (1%, 1 cm) = M

N

M là khối lƣợng phân tử của chất thử.

Ơ

Độ hấp thụ riêng của một chất trong một dung môi xác định và đo ở một bƣớc sóng xác

N

H

định là một đặc tính của chất đó.

U Y

Thiết bị

.Q

Máy quang phổ thích hợp dùng cho việc đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến bao

TP

gồm một hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ

ẠO

200 nm đến 800 nm và một thiết bị phù hợp để đo độ hấp thụ. Hai cóng đo dùng

Đ

cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu cần phải có đặc tính quang học nhƣ nhau.

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Khi đo trên máy tự ghi hai chùm tia, cốc đựng dung dịch đối chiếu đƣợc đặt ở bên

H Ư

có chùm tia đối chiếu đi qua [10].

TR ẦN

Từ những kết quả tham khảo các tài liệu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm nấm Linh chi của các Dƣợc điển trên thế giới và của Việt Nam (bản bổ sung) cùng những tổng quan về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của nấm Linh chi, nhóm nghiên

10 00

B

cứu đề xuất một số chỉ tiêu phục vụ kiểm nghiệm nấm Linh chi nhƣ sau: 1. Chỉ tiêu mô tả đặc điểm dƣợc liệu, đặc điểm bột dƣợc liệu

A

2. Chỉ tiêu định tính: sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

H

Ó

3. Chỉ tiêu định lƣợng:

UV-VIS

-L

Í-

+ Định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp đo quang phổ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

+ Định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

24 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

N

Nấm Linh chi trồng và thu hái tự nhiên tại các tỉnh Quảng Nam, Tây Nguyên,

Ơ

Thanh Hóa, Bình Định, Đồng Nai. Tên khoa học của cây đƣợc xác định là

N

H

Ganoderma lucidum. Ngoài ra, thu thập mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc để nghiên cứu

Nam.

TP

Bảng2..1: Các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu

.Q

U Y

định tính. Các mẫu nấm đƣợc xay thành bột thô theo quy định của dƣợc điển Việt

Thời điểm thu mẫu

Nguồn gốc

ẠO

Ký hiệu

Đ Đại Lộc, Quảng Nam

GLT – 2

Đại Lộc, Quảng Nam

GLT – 3

Đại Lộc, Quảng Nam

10/2016

GLT – 4

Đại Lộc, Quảng Nam

10/2016

GLT – 5

Quảng Nam

10/2016

GLT – 6

Tây Nguyên

11/2016

Tây Nguyên

11/2016

Thanh hoá

10/2016

Bình Định

01/2017

Tiên Phƣớc, Quảng Nam

10/2016

Quảng Ninh

10/2016

Cát Tiên, Đồng Nai

07/2016

B

TR ẦN

H Ư

N

G

GLT – 1

10 00

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Nấm trồng

GLT – 7

Ó

A

GLT – 8

10/2016

Í-

H

GLT – 9

10/2016

-L

Nấm tự nhiên

ÁN

GLN – 1

TO

GLN – 2

ÀN

GLN – 3

D

IỄ N

Đ

Mẫu nấm Hàn Quốc 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI -

Chất chuẩn đối chiếu: Acid ganoderic A (số lô Gan01/0-8/14) do Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh cung cấp, hàm lƣợng 98,92%; D-glucose hàm lƣợng 99,5% của Sigma-Aldrich.

25 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

-

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Các hóa chất thuốc thử đạt tinh khiết phân tích (PA) hoặc HPLC: Ether dầu hỏa, diethyl ether, acid formic, dichloromethan, acid acetic 1% (tt/tt), acetonitril (loại HPLC), methanol (loại HPLC), NaHCO3 5%, chloroform,

Ơ H

Giấy chỉ thị pH, giấy lọc

N

-

N

acid hydrochloric 1N, ethanol, phenol, H2SO4 đặc, nƣớc cất…

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Water với đầu dò PAD, cột sắc

.Q

-

U Y

2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM

TP

ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), máy quang phổ Shimadzu UV – VIS

ẠO

2450, hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag, máy ly

Đ

tâm lạnh Eppendorf 5804R, máy xay dƣợc liệu, cân phân tích Mettler

Dụng cụ thủy tinh các loại: Phễu chiết 100 ml và 250 ml, bình cầu dung tích

H Ư

-

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Toledo, bể siêu âm Elmasonic, tủ sấy, nồi cách thủy, tủ lạnh…..

1000 ml, bình định mức, cốc các loại, bình tam giác các loại, pipet, lam kính,

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

chày cối sứ….

thuốc Trung ƣơng

Cân phân tích Mettler Toledo XPE 26, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Máy HPLC Water, Viện Kiểm nghiệm

26 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5804R,

2450, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng

TP

.Q

Máy quang phổ UV – VIS Shimadzu

ẠO

ƣơng

Đ

Hình 2.1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu

G N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

H Ư

2.4.1 Định danh thực vật

TR ẦN

Các mẫu Nấm Linh chi sau khi thu hái đƣợc gửi chuyên gia về nấm để định danh thực vật.

B

Nấm đƣợc sấy khô bằng tủ sấy ở 100°C, bảo quản trong túi nilon kín, tránh ánh 2.4.2 Mô tả dƣợc liệu

10 00

sáng và ở điều kiện phòng thí nghiệm.

H

chất của dƣợc liệu.

Ó

A

Quan sát mẫu ở ánh sáng thƣờng. Mô tả hình dạng, kích thƣớc, màu sắc và thể

-L

Í-

2.4.3 Mô tả đặc điểm bột dƣợc liệu

ÁN

Sấy khô dƣợc liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 100°C sau đó dùng máy xay và

TO

thuyền tán nghiền nhỏ. Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác dàn đều cho bột thấm nƣớc, đặt lam kính lên, đi nhẹ lam kính và quan sát dƣới kính hiển vi vật kính x40

D

IỄ N

Đ

ÀN

để xác định đặc điểm bột.

2.4.4 Xác định độ ẩm * Nguyên tắc: Việc xác định độ ẩm đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp khối lƣợng. Cân khối lƣợng nguyên liệu trƣớc và sau khi sấy, khối lƣợng mất sau khi sấy đi đƣợc xem là khối lƣợng nƣớc tự do có trong mẫu, từ đó tính độ ẩm của mẫu.

27 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

* Tiến hành: Sấy bì đựng mẫu thử trong tủ sấy ở áp suất thƣờng trong thời gian 30 phút. Cân xác định khối lƣợng bì là m0 (g).

Cân khoảng 1 g bột dƣợc liệu, dàn mỏng, sấy ở nhiệt độ 100°C đến khối lƣợng

Ơ

N

không đổi. Sau khi sấy làm nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel

N

H

rồi cân ngay. Xác định khối lƣợng cốc và mẫu sau khi sấy là m’ (g). Xác định thời

U Y

gian làm khô và giới hạn độ ẩm của nấm Linh chi. Xác định độ ẩm tƣơng đối của

100%

m – m0

TP

m – m’

ẠO

Độ ẩm (%) =

.Q

nguyên liệu theo công thức sau:

Đ

Trong đó:

G

m0: khối lƣợng cốc cân đã sấy khô đến khối lƣợng không đổi

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

m: khối lƣợng cốc và bột nấm Linh chi trƣớc khi sấy

m’: khối lƣợng cốc và bột nấm Linh chi sau khi sấy đến khối lƣợng không đổi

TR ẦN

2.4.5 Định tính nấm Linh chi bằng phƣơng pháp TLC Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký lớp mỏng nhƣ sau:

10 00

B

1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254

2. Pha động: Khảo sát 3 hệ dung môi khai triển nhƣ sau:

A

+ Hệ A: Dichloromethan – methanol (9:1)

H

Ó

+ Hệ B: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic

Í-

(15:5:1)

ÁN

(5:5:1)

-L

+ Hệ C: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic

TO

3. Chuẩn bị mẫu:

ÀN

- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi

D

IỄ N

Đ

lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml methanol.

- Dung dịch đối chiếu: + Dung dịch 1: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu nấm đối chiếu) tiến hành chiết nhƣ mẫu thử + Dung dịch 2: Dung dịch acid ganoderic A chuẩn nồng độ khoảng 0,1 mg/ml

28 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

4. Thuốc thử: chọn thuốc thử H2SO4 10 %/EtOH 5. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch

Ơ

mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm, 366 nm

N

đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản

N

H

và sau khi phun thuốc thử hiện màu.

U Y

- Yêu cầu: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết có cùng màu sắc và giá trị

.Q

Rf, với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

TP

2.4.6 Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid ganoderic A trong

ẠO

nấm Linh chi bằng HPLC

Đ

2.4.6.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

G

Khảo sát các quy trình xử lý mẫu sau:

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

* Quy trình 1: - Dung môi chiết: NaHCO3 5% - Thời gian chiết: 3h, 3h30, 4h

TR ẦN

- Phƣơng pháp chiết: siêu âm, ngâm chiết

10 00

B

- Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2g bột nấm linh chi cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml, thêm 40 ml dung dich NaHCO3 5% siêu âm, sau đó chiết lấy

A

dịch kiềm. Tiếp tục thêm 40 ml dung dịch NaHCO3 5% vào cắn siêu âm và chiết

H

Ó

dịch kiềm. Tiếp tục siêu âm cắn với 20 ml dung dịch NaHCO3 5%. Tâp trung dịch

Í-

chiết kiềm, acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 1N đến pH < 3. Dịch sau khi

-L

acid hóa đƣợc chiết bằng chloroform 3 lần (40 x 30 x 30 ml). Tập trung dịch

ÁN

chloroform và bay hơi đến cắn. Hòa cắn trong 20 ml methanol. Lọc qua giấy lọc

TO

Millipore 0,45 µm.

ÀN

* Quy trình 2:

D

IỄ N

Đ

- Dung môi chiết: chloroform - Phƣơng pháp chiết: siêu âm - Thời gian chiết: 3h, 3h30, 4h - Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2g bột nấm linh chi cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml, thêm 40 ml dung dich chloroform siêu âm, sau đó chiết lấy dịch.

Tiếp tục thêm 40 ml dung dịch chloroform vào cắn siêu âm và chiết dịch kiềm. Tiếp

29 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

tục siêu âm cắn với 20 ml dung dịch chloroform. Tâp trung dịch chiết chloroform, chiết bằng NaHCO3 5% 3 lần (40 x 30 x 30). Tập trung dịch chiết kiềm, acid hóa bằng dung dịch acid hydrochloric 1N đến pH < 3. Dịch sau khi acid hóa đƣợc chiết

H N

cắn. Hòa cắn trong 20 ml methanol. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 µm.

Ơ

N

bằng chloroform 3 lần (40 x 30 x 30 ml). Tập trung dịch chloroform và bay hơi đến

U Y

2.4.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC

ẠO

2.4.6.3 Thẩm định phương pháp phân tích

TP

sóng phát hiện, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu….

.Q

Xác định các điều kiện cho phân tích HPLC nhƣ: cột sắc ký, pha động, bƣớc

Đ

Sau khi lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký, thẩm định quy trình định lƣợng với các

G

nội dung sau:

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

* Độ đặc hiệu: Tiến hành: ký theo điều kiện đã chọn.

TR ẦN

 Tiêm lần lƣợt dung dịch mẫu trắng, chuẩn và thử vào hệ thống, tiến hành sắc

10 00

B

 Ghi lại các sắc ký đồ và thời gian lƣu (RT) của acid ganoderic A trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn, dung dịch mẫu thử và trên sắc ký đồ của dung

A

dịch mẫu trắng (nếu có).

H

Ó

Yêu cầu:

Í-

 Sắc ký đồ các dung dịch thử cho pic có thời gian lƣu khác nhau không có ý

-L

nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên

ÁN

sắc ký đồ dung dịch thử nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) không phải

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

pic của hoạt chất cần phân tích, thì pic của hoạt chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phƣơng pháp

sắc ký lỏng đƣợc quy định trong dƣợc điển.  Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pic phải ≤ 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn.  Phổ hấp thụ tử ngoại của pic tƣơng ứng với acid ganoderic A trong mẫu thử và mẫu chuẩn phải tƣơng ứng nhau

30 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

* Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành:  Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch acid ganoderic A chuẩn có nồng độ thích hợp,

Ơ

N

và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.

N

H

 Ghi SKĐ và xác định thời gian lƣu, diện tích pic, hệ số bất đối của pic acid

U Y

ganoderic A và số đĩa lý thuyết của cột tính theo pic acid ganoderic A. Tính

TP

Yêu cầu: Giá trị RSDthời gian lƣu ≤ 1,0%, RSDdiện tích pic ≤ 2,0%

.Q

RSD (%) của diện tích pic và thời gian lƣu.

ẠO

* Độ tuyến tính: Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn, có nồng độ 50%; 80%; 100%, 120%

Đ

và 150% so với nồng độ định lƣợng ở phần độ lặp lại.

G

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn, ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

ứng của pic. Xác định phƣơng trình hồi quy, hệ số tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu đƣợc trên các sắc ký đồ bằng

TR ẦN

phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu.

Yêu cầu: Hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,998.

10 00

B

* Độ lặp lại: Tiến hành:

A

 Tiến hành định lƣợng 06 mẫu thử độc lập.

H

Ó

 Xác định hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu thử

Í-

 Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định

-L

lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu.

ÁN

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu

TO

≤ 2,0%.

D

IỄ N

Đ

ÀN

* Độ chính xác trung gian Tiến hành:  Tiến hành nhƣ độ lặp lại nhƣng khác ngày  Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu trong mỗi ngày  Xác định mức độ sai khác kết quả định lƣợng giữa 2 ngày.

31 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Yêu cầu:  Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng của mỗi ngày (n=6) ≤ 2,0% và của cả hai ngày (n=12) phải ≤ 3,0%.

Ơ

N

* Độ đúng

N

H

Tiến hành:

U Y

 Xác định độ đúng của phƣơng pháp bằng cách thêm chính xác một lƣợng

.Q

chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu thử.

TP

 Chuẩn bị 03 loại mẫu bằng cách thêm chính xác một lƣợng chất chuẩn chất

ẠO

cần phân tích vào các mẫu thử. Lƣợng chất chuẩn thêm vào tƣơng ứng với 3

Đ

mức nồng độ 110%, 120% và 130% so với mức hàm lƣợng định lƣợng tại độ

G

lặp lại. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập.

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

 Phân tích mẫu theo qui trình phân tích. Xác định hoạt chất thu hồi theo dung

TR ẦN

dịch chuẩn C100 hoặc phƣơng trình hồi quy tuyến tính ở phần độ tuyến tính.  Xác định độ đúng của phƣơng pháp theo công thức: Lƣợng hoạt chất tìm lại

Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) =

x 100 %

10 00

B

Lƣợng hoạt chất thêm vào

Yêu cầu:

A

 Tỷ lệ thu hồi trong khoảng 98 – 102% ở mỗi mức nồng độ.

H

Ó

 RSD tỷ lệ thu hồi (≤ 2,0%) ở mỗi mức nồng độ.

-L

Í-

* Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Pha loãng dần mẫu chuẩn bằng dung môi pha mẫu. Tiến hành phân tích các

ÁN

dung dịch pha loãng trên. Trên sắc ký đồ thu đƣợc, xác định đáp ứng pic (chiều cao)

TO

tƣơng ứng với mỗi mức nồng độ. Xác định giá trị LOD của phƣơng pháp dựa và tỷ ganoderic A gấp khoảng 3 lần nhiễu đƣờng nền.

Sau khi xác định giá trị LOD, tính giá trị LOQ thông qua công thức:

D

IỄ N

Đ

ÀN

lệ đáp ứng so với nhiễu. Trong đó LOD là giá trị nồng độ ở đó có đáp ứng pic acid

LOQ= 10/3 LOD (kl/tt)

32 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.4.7 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng acid ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi Ứng dụng quy trình định lƣợng đã xây dựng để đánh giá hàm lƣợng acid

Ơ

N

ganoderic A trong 12 mẫu Nấm Linh chi nghiên cứu.

N

H

Hàm lƣợng acid ganoderic A trong Nấm Linh chi đƣợc tính theo đƣờng chuẩn và

(

)

p

100

Trong đó:

ẠO

X: Hàm lƣợng của acid ganoderic A có trong dƣợc liệu (%)

Đ

Sc: Diện tích đỉnh của mẫu chuẩn

N

G

St: Diện tích đỉnh của mẫu thử

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

.Q

Cc

TP

X=

U Y

theo công thức:

H Ư

Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml)

TR ẦN

k: Độ pha loãng của mẫu đo m: Khối lƣợng cân dƣợc liệu (mg)

B

h: Độ ẩm của dƣợc liệu

10 00

p: Độ tinh khiết của chất chuẩn (%) 2.4.8 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng polysaccharid (PS) trong nấm Linh

Ó

A

chi bằng phƣơng pháp đo quang

H

* Nguyên tắc chiết PS:

Chiết PS trong Ganoderma lucidum bằng nƣớc nóng

-

Kết tủa PS bằng EtOH 96°

V ml H2O, T°C, t giờ Dịch nƣớc

IỄ N D

Bột dƣợc liệu

Bã dƣợc liệu

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

-

EtOH 96°, T’°C, để qua đêm

Dịch EtOH

PS thô

33 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.4.8.1 Lựa chọn nhiệt độ chiết tối ưu Theo tài liệu tham khảo [15], [65], lựa chọn nhiệt độ đun hồi lƣu là 100°C. 2.4.8.2 Khảo sát thời gian chiết

Ơ

N

Tiến hành chiết đến khi thu đƣợc dịch chiết không màu. Cô cách thủy dịch chiết

N

H

đến còn 50 ml, thêm 200 ml ethanol 96% vào và khuấy đều. Để lạnh ở 2°C trong 24

U Y

giờ. Dịch chiết đƣợc coi là không chứa PS nếu không thu đƣợc kết tủa.

.Q

2.4.8.3 Khảo sát thời gian và điều kiện phản ứng

TP

Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2 ml dung dịch

ẠO

B, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc. Làm nguội hỗn hợp phản

Đ

ứng. Khảo sát điều kiện phản ứng:

G

- Lắc đều

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

- Đun cách thủy nhiệt độ 30°, 40°, 50°, 60°, 70°, 80°, 90°C trong thời gian 10 – 15 – 20 phút. Lựa chọn điều kiện phản ứng cho độ hấp thụ cao nhất.

TR ẦN

2.4.8.4 Khảo sát thể tích ethanol 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid Lần lƣợt cho thêm 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml ethanol 96% vào 50 ml dịch

10 00

B

chiết. Để lạnh ở 2°C trong 24 giờ. Ly tâm 3500 vòng/phút, trong 10 phút. Xác định tủa PS thô. Xác định PS tinh khiết theo phƣơng pháp sau:

A

* Chuẩn bị mẫu định lƣợng :

H

Ó

- Mẫu trắng : Hút 2 ml phenol 5% trong ethanol, cho vào bình nón nút mài 50

Í-

ml, thêm 10 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc vào, lắc đều, đun cách thủy.

-L

- Mẫu chuẩn : Cân chính xác và hòa tan khoảng 25 mg D-glucose trong vừa đủ

ÁN

250 ml nƣớc cất (dung dịch A có nồng độ 0,1 mg/ml). Pha loãng dung dịch A thành

TO

các dung dịch A1, A2, A3, A4, A5 có nồng độ lần lƣợt : 0,01 mg/ml (A1); 0,02 mg/ml

ÀN

(A2); 0,03 mg/ml (A3); 0,04 mg/ml (A4); 0,06 mg/ml (A5). Hút 2,0 ml mỗi dung

D

IỄ N

Đ

dịch A, A1, A2, A3, A4, A5 cho vào 6 bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5%

và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, lắc đều, đun cách thủy.

- Mẫu thử : Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2,0 ml dung dịch B vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, làm nguội, lắc đều, đun cách thủy.

34 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Quét phổ từ 200 nm đến 800 nm tìm bƣớc sóng hấp thụ cực đại. Hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi đƣợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy của dãy tuyến tính.

Ơ

N

2.4.8.5 Thẩm định phương pháp

N

H

* Độ đặc hiệu

U Y

Tiến hành: Đo phổ hấp thụ UV – VIS của các mẫu sau:

.Q

 Mẫu trắng: phenol 5%/ EtOH + H2SO4 đậm đặc

TP

 Mẫu chuẩn: chứa đƣờng D-glucose chuẩn

ẠO

 Mẫu thử

Đ

Yêu cầu: phổ của dung dịch thử phải trùng với phổ dung dịch chuẩn hoặc các cực

G

đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch thử phải tƣơng đƣơng với các cực đại hấp thụ thu

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

đƣợc từ dung dịch chuẩn.

TR ẦN

* Độ tuyến tính Tiến hành:

 Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần từ một dung dịch

10 00

B

chuẩn gốc

 Đo độ hấp thụ theo quy trình đã nêu

A

Yêu cầu: Hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,995.

H

Ó

* Độ đúng

Í-

Tiến hành

-L

 Thêm một lƣợng D-glucose chuẩn (đã biết hàm lƣợng) vào mẫu thử bằng

ÁN

cách cân một lƣợng D-glucose chuẩn vào mẫu thử (110 %, 120 %, 130 %

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

nồng độ mẫu thử). Tại mỗi mức nồng độ thực hiện 3 mẫu thử.

 Đo độ hấp thụ của các dung dịch trên. Mỗi dung dịch đo 3 lần. Tính kết quả dựa vào đƣờng chuẩn

 Xác định độ đúng theo công thức: Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) =

Lƣợng hoạt chất tìm lại Lƣợng hoạt chất thêm vào

x 100 %

35 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Yêu cầu:  Tỷ lệ thu hồi trong khoảng 98 – 102% ở mỗi mức nồng độ.  RSD tỷ lệ thu hồi (≤ 2,0%) ở mỗi mức nồng độ.

Ơ

N

* Độ lặp lại:

N

H

Tiến hành:

U Y

 Tiến hành định lƣợng 06 mẫu thử độc lập.

.Q

 Xác định hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu thử

TP

 Độ lặp lại của phƣơng pháp đƣợc xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định

ẠO

lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu.

Đ

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng hàm lƣợng hoạt chất có trong các mẫu

G N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

≤ 2,0%.

H Ư

* Độ chính xác trung gian

TR ẦN

Tiến hành:

 Tiến hành nhƣ độ lặp lại nhƣng khác ngày

10 00

các mẫu trong mỗi ngày

B

 Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lƣợng hoạt chất có trong  Xác định mức độ sai khác kết quả định lƣợng giữa 2 ngày.

Ó

A

Yêu cầu:

H

 Giá trị RSD (%) kết quả định lƣợng của mỗi ngày (n=6) ≤ 2,0% và của cả hai

-L

Í-

ngày (n=12) phải ≤ 3,0%.

ÁN

2.4.9 Ứng dụng quy trình đã xây dựng định lƣợng hàm lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm Linh chi

TO

Ứng dụng quy trình định lƣợng đã xây dựng để đánh giá hàm lƣợng

D

IỄ N

Đ

ÀN

polysaccharid trong 12 mẫu Nấm Linh chi nghiên cứu. Hàm lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm đƣợc tính theo đƣờng chuẩn.

2.4.10 Xử lý số liệu - Các kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu đƣợc xử lý bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC, quang phổ UV – VIS.

36 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

- Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toàn học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán: phƣơng trình hồi qui tuyến tính bậc nhất, kết quả trung bình, độ lệch, độ

Ơ

N

lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tƣơng đối, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực

N

H

nghiệm và đánh giá thẩm định phƣơng pháp.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

- Sử dụng quy tắc làm tròn số.

37 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊNH DANH THỰC VẬT

N

Toàn bộ mẫu nấm Linh chi nghiên cứu đƣợc định danh bởi bởi TS. Nguyễn

Ơ

Phƣơng Đại Nguyên – trƣờng Đại học Tây Nguyên. Các mẫu nấm Linh chi đều

N

H

đƣợc xác định là loài Ganoderma lucidum.

U Y

3.2 MÔ TẢ HÌNH THỂ

.Q

Hình thể các mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đƣợc mô tả trong bảng

Quả thể

G

Hình ảnh

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

mẫu

ẠO

Tên

Đ

Bảng 3. 1: Mô tả hình thể

TP

sau:

Mũ nấm hình hạt đậu. Mặt trên màu nâu đỏ, đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ

B

GLT –

TR ẦN

bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng

1

10 00

nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 12 – 15

A

cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đỏ bóng.

H

Ó

Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

-L

Í-

Mũ nấm hình hạt đậu. Mặt trên màu nâu đỏ sẫm

ÁN

đến nâu đen, bóng loáng nhƣ đánh vecni, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép

TO

GLT – nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu nâu nhạt với

D

IỄ N

Đ

ÀN

2

các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 12 – 15 cm, đƣờng kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

38 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, nhạt dần từ cuống nấm đến rìa, có những vòng

3

Ơ

N

đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều.

Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti.

H

GLT –

U Y

N

Cuống hình trụ, đính lệch, dài 7 – 10 cm, đƣờng

.Q

kính 1,5 – 2,5 cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân

ẠO

TP

nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

Đ

Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đen, bóng,

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

nhạt dần từ cuống nấm đến rìa, có những vòng lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ

TR ẦN

4

đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi

H Ư

GLT –

nhỏ li ti. Cuống hình trụ, đính lệch, dài 8 – 9 cm,

B

đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen bóng. Toàn

10 00

thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

Ó

A

Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ, màu

H

không đều nhau, có những vết trắng, không

-L

Í-

bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

5

ÁN

GLT – ra; mép nhẵn, hơi lƣợn sóng và có màu vàng nâu. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti.

Cuống hình trụ, đính lệch, dài 11 – 13 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm, màu nâu đen. Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

Mũ nấm hình thận, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu GLT – nhạt, không bóng, có những vòng đồng tâm và 6

nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu vàng nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi

39 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H

Ơ

N

thơm nhẹ, vị đắng.

U Y .Q

7

nhạt, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều. Mặt dƣới màu

ẠO

vàng nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi

TP

GLT –

N

Mũ nấm hình thận, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

thơm nhẹ, vị đắng.

đỏ, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt

8

10 00

B

GLT –

TR ẦN

Mũ nấm hình quạt, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu

dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Không

Í-

H

Ó

A

cuống.

-L

Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu, nhiều bột, không bóng, có những vòng đồng tâm và nếp

ÁN

TO

GLT –

nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng, màu vàng nâu. Mặt dƣới màu vàng với các lỗ nhỏ li ti.

Cuống ngắn. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

D

IỄ N

Đ

ÀN

9

40 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ẠO

nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới

màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình

Đ

GLN –

TP

nâu đỏ bóng, có những vòng đồng tâm và nếp

.Q

Mũ nấm hình thận đến hình quạt. Mặt trên màu

1

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

trụ, đính lệch, dài 8 – 9 cm, đƣờng kính 1 – 2

H Ư

cm, màu nâu đen bóng. Toàn thân nấm hóa gỗ.

B

TR ẦN

Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

10 00

Mũ nấm hình quạt. Mặt trên màu nâu đỏ bóng, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra,

Ó

A

GLN – mép nhẵn, đều, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Cuống hình trụ,

H

2

-L

Í-

đính lệch, dài 4 – 5 cm, đƣờng kính 1 – 2 cm.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Toàn thân nấm hóa gỗ. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

GLN – 3

Mũ nấm hình quạt, hóa gỗ. Mặt trên màu nâu đỏ, có những vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, đều, hơi lƣợn sóng và màu vàng. Mặt dƣới màu vàng nâu với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.

41 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

N

Từ những đặc điểm hình thái của 12 mẫu nấm Linh chi trên cùng mô tả trong

U Y

bản bổ sung dƣợc điển Việt Nam, có thể đƣa ra đặc điểm hình thể nấm Linh chi nhƣ

TP

.Q

sau: Thể quả dạng hình thận, hình hạt đậu hay hình quạt, hóa gỗ, cứng. Mặt trên màu nâu nhạt, nâu vàng, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng hoặc không bóng, có những

ẠO

vòng đồng tâm và nếp nhăn tỏa ra, mép nhẵn, hơi lƣợn sóng. Mặt dƣới màu vàng

G

Đ

nhạt đến nâu nhạt với các lỗ nhỏ li ti. Không cuống hoặc cuống hình trụ, đính lệch,

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

dài 4 cm đến 15 cm, đƣờng kính 1 cm đến 3,5 cm, màu nâu đỏ đến nâu đen. Mùi

TR ẦN

3.3 MÔ TẢ BỘT DƢỢC LIỆU

H Ư

thơm nhẹ, vị đắng.

Các bột nấm Linh chi đều có những đặc điểm chung nhƣ sau: Bột màu nâu

B

vàng. Soi dƣới kính hiển vi thấy: Sợi nấm rải rác hoặc tụ thành đám, không màu

10 00

hoặc nâu nhạt, mảnh, hơi cong, phân nhánh hoặc không phân nhánh, đƣờng kính 2,5 µm đến 6 µm. Bào tử hình trứng, màu nâu, đứng riêng lẻ hay tụ thành đám, dài 8

Ó

A

µm đến 12 µm, rộng 5 µm đến 8 µm, đỉnh trơn nhẵn, lớp vỏ ngoài không màu, lớp

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

vỏ trong có nhiều chỗ lồi ra.

Hình 3.1: Bột nấm Linh chi GLT – 1

42 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

Hình 3.2: Bột nấm Linh chi GLT – 2

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 3.4: Bột nấm Linh chi GLT – 4

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Hình 3.3 Bột nấm Linh chi GLT – 3

43 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TP

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

Hình 3.5: Bột nấm Linh chi GLT – 5

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 3.7: Bột nấm Linh chi GLT – 7

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

Hình 3.6: Bột nấm Linh chi GLT – 6

44 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

Hình 3.8: Bột nấm Linh chi GLT – 8

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

Hình 3.9: Bột nấm Linh chi GLT – 9

Hình 3.10: Bột nấm Linh chi GLN – 1

45 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

Hình 3.11: Bột nấm Linh chi GLN – 2

10 00

B

Hình 3.12: Bột nấm Linh chi GLN – 3 3.4 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

Độ ẩm của 12 mẫu nấm Linh chi đƣợc trình bày ở bảng sau:

46 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.2: Độ ẩm của 12 mẫu nấm Linh chi

50,8186 49,2965 49,3808

50,6566 49,1168 49,22669

48,8211 49,1028 47,4791

49,8297 50,1082 48,4829

49,6983 49,9769 48,3519

48,9091 48,2650 48,8815

49,9113 49,2678 49,8846

49,8153 48,3782 49,1028 48,2650 47,4791 48,8815

49,2704 48,4839 49,8845

49,1409 48,3545 49,7552

48,9091 49,1028 48,3782

49,9111 50,1057 49,3807

49,7874 49,9813 49,2569

49,8153 48,2574 48,8815

50,8178 49,2606 49,8853

50,6863 49,1294 49,7538

48,2650 47,4791 48,9091

49,2695 48,4839 49,9141

49,1171 48,3307 49,7615

49,1028

50,1066

49,9475

A

Ó

H Í-

-L

Trung bình

TO

ÁN

GLT – 7

D

IỄ N

Đ

ÀN

Trung bình GLT – 8

Trung bình GLT – 9 Trung bình GLN – 1

U Y TP

ẠO

G N

50,6863 49,2486 49,9741

Trung bình GLT – 6

49,7968 49,1529 49,7696

50,8188 49,3821 50,1078

10 00

GLT – 5

TR ẦN

Trung bình

B

GLT – 4

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Trung bình

Đ

Trung bình GLT – 3

.Q

Trung bình GLT – 2

16,15 16,14 16,16 16,15 15,20 15,20 15,35 15,25 13,04 13,06 13,05 13,05 11,43 11,46 11,46 11,45 13,20 13,30 13,30 13,20 12,88 12,93 12,89 12,90 12,35 12,40 12,30 12,35 13,12 13,08 13,10 13,10 15,17 15,25 15,18 15,20 15,85

N

49,7502 49,0987 49,7233

Độ ẩm (%)

N

49,8153 48,2650 48,3782

Khối lƣợng cốc và bột nấm sau khi sấy (g)

Ơ

GLT – 1

48,9091 48,2574 48,8815

Khối lƣợng cốc và bột nấm trƣớc khi sấy (g) 49,9122 49,2607 49,8855

H

Tên mẫu

Khối lƣợng cốc (g)

47 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

49,8896 49,8261

49,7293 49,6658

48,2574 47,4791 48,2650

49,2586 47,4809 49,2671

49,1625 47,3817 49,1679

49,1028 48,9091 48,8815

50,1056 49,9126 49,8855

49,9612 49,7674 49,7401

Trung bình GLN – 2

U Y TP

Trung bình

.Q

GLN – 3

N

Trung bình

15,90 15,95 15,90 9,6 9,9 9,9 9,8 14,40 14,47 14,48 14,45

Ơ

48,8815 48,8211

N

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ẠO

Nhƣ vây, tất cả các mẫu nấm Linh chi đều có độ ẩm không vƣợt quá 17,0%,

Đ

đạt chỉ tiêu độ ẩm theo nhƣ Dƣợc điển Trung Quốc và Dƣợc điển Việt Nam IV bản

G

bổ sung. Do đó, chỉ tiêu về độ ẩm của nấm Linh chi có thể để giới hạn là 17,0%.

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

3.5 ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC Hệ dung môi: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid

TR ẦN

formic (15:5:1) cho Rf các vết quá thấp, do đó tỷ lệ đƣợc điều chỉnh thành ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1).

B

Trong 3 hệ dung môi lựa chọn khảo sát, hệ dung môi: Dichloromethan –

10 00

methanol (9:1) tách đƣợc nhiều vết và rõ ràng nhất. Chất đối chiếu acid ganoderic A

A

sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH có màu xanh da trời. Đối chiếu màu sắc

H

Ó

và Rf = 0,32 của chất chuẩn acid ganoderic A với các mẫu thử, phát hiện acid

-L

- 5, GLN - 1.

Í-

ganoderic A trong các mẫu nấm Linh chi GLT - 1, GLT - 2, GLT - 3, GLT - 4, GLT

ÁN

Các sắc ký đồ với hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1) (hình 3.13,

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

hình 3.14, hình 3.15):

48 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Đ

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

ở bƣớc sóng 254 nm

ẠO

Hình 3.13: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol

ở bƣớc sóng 366 nm

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Hình 3.14: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol

49 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ẠO

Hình 3.15: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi dichloromethan – methanol

G

Đ

sau khi phun thuốc thử H2SO4 10 %/ EtOH

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Chú thích:

(1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT –

TR ẦN

6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12): GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu

B

acid ganoderic A

10 00

Các sắc ký đồ với hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) –

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

ether ethylic – acid formic (5:5:1) (hình 3.16, hình 3.17, hình 3.18).

Hình 3.16: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 254 nm

50 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ẠO

Hình 3.17: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) ở bƣớc sóng 366 nm

-L

Hình 3.18: Sắc ký đồ HPTLC hệ dung môi ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến

TO

ÁN

90°C) – ether ethylic – acid formic (5:5:1) sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH

D

IỄ N

Đ

ÀN

Chú thích: (1): GLT – 1; (2): GLT – 2; (3): GLT – 3; (4): GLT – 4; (5): GLT – 5; (6) GLT –

6; (7): GLT – 7; (8): GLT – 8; (9): GLT – 9; (10): GLN – 1; (11): GLN – 2; (12): GLN – 3; (13) Nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu); (14): chất đối chiếu acid ganoderic A Qua những khảo sát trên, lựa chọn quy trình định tính nấm Linh chi bằng sắc ký lớp mỏng nhƣ sau:

51 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1. Pha tĩnh: Bản mỏng Silicagel GF254 2. Pha động: Dichloromethan – methanol (9:1) 3. Chuẩn bị mẫu:

Ơ

N

- Dung dịch thử: Cân khoảng 2 g bột thô dƣợc liệu, thêm 30 ml methanol, đun hồi

N

H

lƣu 30 phút, lọc. Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 2 ml

U Y

methanol.

TP

nhƣ mẫu thử (hoặc dung dịch acid ganoderic A chuẩn 0,1 mg/ml)

.Q

- Dung dịch đối chiếu: Cân khoảng 2 g bột thô Linh chi (mẫu chuẩn) tiến hành chiết

ẠO

4. Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch

Đ

đối chiếu. Triển khai sắc ký đến khi dung môi đi đƣợc 10 cm đến 12 cm, lấy bản

N

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

khi phun thuốc thử hiện màu H2SO4 10%/ EtOH.

G

mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát bản mỏng ở bƣớc sóng 254 nm và sau - Yêu cầu: Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết giống với các vết của dung

TR ẦN

dịch đối chiếu (hoặc chất đối chiếu) về màu sắc và vị trí.

3.6 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID

10 00

B

GANODERIC A TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC 3.6.1 Tối ƣu quá trình chiết acid ganoderic A (GAA)

A

- Thời gian siêu âm: Siêu âm với thời gian 3h30, 4h cho kết quả tƣơng đƣơng

H

Ó

với thời gian 3h, do đó lựa chọn thời gian chiết là 3h.

Í-

- Dung môi chiết: Siêu âm với dung môi chloroform cho kết quả định lƣợng

-L

thấp hơn so với khi siêu âm với dung dịch NaHCO3 5% với cùng thời gian siêu âm,

ÁN

do đó lựa chọn dung môi chiết là dung dịch NaHCO3 5%.

TO

- Phƣơng pháp chiết: Kết quả thu đƣợc cho thấy phƣơng pháp siêu âm chiết

ÀN

đƣợc hàm lƣợng cao hơn phƣơng pháp ngâm chiết trong cùng thời gian. Do đó lựa

D

IỄ N

Đ

chọn phƣơng pháp siêu âm.

3.6.2 Khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC 3.6.2.1 Lựa chọn thành phần pha động Theo tài liệu tham khảo [16] chúng tôi lựa chọn pha động là acetonitril : acid acetic 1%, sau đó tiến hành các thay đổi tỷ lệ acetonitril và acid acetic 1% (20:80);

52 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

(30:70); (40:60). Kết quả tỷ lệ acetonitril : acid acetic (30: 70) cho thời gian lƣu của chất phân tích hợp lý và các pic tách nhau hoàn toàn.

3.6.2.3 Lựa chọn nhiệt độ cột

Ơ

N

Trong nhiều trƣờng hợp, nhiệt độ cũng là một yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả

N

H

tách sắc ký. Nói chung khi tăng nhiệt độ trong một phạm vi nhất định thƣờng cho

U Y

kết quả tách sắc ký tốt hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến sự tồn tại và

.Q

độ bền của chất phân tích cũng nhƣ của pha tĩnh và pha động. Tiến hành các phân

TP

tích thử nghiệm thay đổi nhiệt độ buồng cột (30°C, 40°C và nhiệt độ phòng) với các

ẠO

Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút

-

Thể tích tiêm: 20 µl

-

Thời gian phân tích: 40 phút

-

Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (30:70)

N

G

Đ

-

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

điều kiện chạy cố định:

TR ẦN

Kết quả lựa chọn nhiệt độ buồng cột sắc ký là 30°C. 3.6.3 Quy trình định tính, định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng pháp

10 00

B

HPLC

Định tính acid ganoderic A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dựa vào so

A

sánh thời gian lƣu tR, phổ PDA của mẫu (dung dịch) thử và mẫu (dung dịch) đối

H

Ó

chiếu.

Í-

Sau khi khảo sát các điều kiện phân tích trên hệ thống HPLC và các điều kiện

-L

xử lý mẫu, quy trình phân tích acid ganoderic A đƣợc tiến hành nhƣ sau:

ÁN

* Điều kiện HPLC:

TO

- Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

D

IỄ N

Đ

ÀN

- Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm

- Nhiệt độ cột: 30°C - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Thời gian phân tích: 40 phút - Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (30:70)

53 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

* Chuẩn bị mẫu + Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 2 g bột nấm linh chi cho vào bình nón nút

N

mài dung tích 250 ml, thêm 40 ml dung dich NaHCO3 5% siêu âm trong khoảng 2

Ơ

giờ, sau đó chiết lấy dịch kiềm. Tiếp tục thêm 40 ml dung dịch NaHCO3 5% vào

N

H

cắn siêu âm trong khoảng 30 phút và chiết dịch kiềm. Tiếp tục siêu âm cắn với 20

U Y

ml dung dịch NaHCO3 5% trong 30 phút. Tâp trung dịch chiết kiềm, acid hóa bằng

.Q

dung dịch acid hydrochloric 6N đến pH < 3. Dịch sau khi acid hóa đƣợc chiết bằng

TP

chloroform 3 lần (40 x 30 x 30 ml). Tập trung dịch chloroform và bay hơi đến cắn.

ẠO

Hòa cắn trong 20 ml methanol. Lọc qua giấy lọc Millipore 0,45 µm.

G

Đ

+ Mẫu trắng: MeOH 100%

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

+ Dung dịch đối chiếu: cân chính xác khoảng 10mg acid ganoderic A cho vào bình định mức 20ml, hòa tan trong khoảng 15 ml methanol, sau đó thêm methanol

3.6.4 Thẩm định phƣơng pháp

10 00

B

3.6.4.1 Độ đặc hiệu

TR ẦN

vừa đủ thể tích , lắc đều (dung dịch có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml).

Tiến hành phân tích theo các điều kiện sắc ký ở trên với mẫu trắng, mẫu chuẩn

Ó

A

và mẫu thử có nồng độ tƣơng ứng. Kết quả cho thấy trên sắc đồ của mẫu chuẩn, chỉ

H

xuất hiện một pic rõ ràng của acid ganoderic A. Đối với mẫu trắng, trên sắc ký đồ

-L

Í-

không có pic nào tƣơng ứng với thời gian lƣu của pic acid ganoderic A. Sắc ký đồ

ÁN

mẫu thử có pic có thời gian lƣu trùng với thời gian lƣu của pic acid ganoderic A

TO

trong mẫu đối chiếu. Phổ tử ngoại của pic acid ganoderic A trong mẫu thử giống phổ tử ngoại của mẫu đối chiếu acid ganoderic A. Vậy phƣơng pháp có tính đặc

D

IỄ N

Đ

ÀN

hiệu. Sắc ký đồ đƣợc ghi trong hình 3.19:

54 Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

N

(3)

(1)

G

(4)

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

(2)

H Ư

Hình 3.19: Sắc ký đồ dung dịch acid ganoderic A chuẩn (1), dung dịch thử (2),

TR ẦN

dung dịch trắng (3) và so sánh phổ UV của pic acid ganoderic A của dung dịch

B

chuẩn – thử

10 00

3.6.4.2 Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn acid ganoderic A nồng độ 0,244

Ó

A

mg/ml.

Í-

H

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Diện tích pic

Thời gian lƣu

1

3246643

22,239

2

3249151

22,254

3

3168966

22,325

4

3195474

22,281

5

3209117

22,296

6

3128404

22,267

TB

3199626

22,277

RSD

1.45

0,14

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Số lần tiêm

55

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Kết quả thống kê cho thấy, sau 6 lần tiêm diện tích pic và thời gian lƣu có RSD < 2%. Vậy phƣơng pháp đạt độ thích hợp hệ thống.

3.6.4.3 Độ tuyến tính

Ơ

N

Cân 9,88 mg acid ganoderic A cho vào bình định mức 20 ml, hòa tan trong

N

H

khoảng 15 ml methanol, sau đó thêm methanol vừa đủ thể tích, lắc đều thu đƣợc

U Y

dung dịch gốc có nồng độ 489 µg/ml. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc (C0) trong

.Q

dung môi pha mẫu để đƣợc các dung dịch đối chiếu có nồng độ acid ganoderic A

TP

khoảng từ 61 µg/ml đến 400 µg/ml. Cách pha dãy dung dịch chuẩn đƣợc thể hiện

ẠO

trong bảng bảng 3.4

Đ

Bảng 3.4: Cách pha dãy các dung dịch chuẩn C2

C0

C0

C3

C4

C5

C6

C0

C0

C0

C0

2,5

2,0

2,5

3,0

4,0

G

C1

2,5

V bình định mức (ml)

20,0

10,0

5,0

5,0

5,0

5,0

61

122

195

244

293

390

10 00

Số ml chuẩn trung gian

B

gian

TR ẦN

Dung dịch chuẩn trung

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Dung dịch chuẩn

A

Nồng độ thu đƣợc (µg/ml)

H

Ó

Kết quả khảo sát mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ (µg/ml) acid

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

ganoderic A đƣợc trình bày ở bảng dƣới đây: Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ tuyến tính

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích pic

61

826448

122

1612916

195

2576008

244

3195474

293

3774255

390

5123743

Phƣơng trình hồi quy: y= 12953x + 29526; Hệ số tƣơng quan r = 0,999

56

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

6000000 y = 12953x + 29526 R² = 0,9997

Ơ

N

5000000

H

4000000

U Y

N

3000000

.Q

2000000

TP

1000000

100

200

300

400

500

Đ

0

ẠO

0

N

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

và diện tích pic

G

Hình 3.20: Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan nồng độ acid ganoderic A

TR ẦN

Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic. Đƣờng hồi quy là đƣờng thẳng (y=

B

12953x + 29526) với hệ số tƣơng quan R = 0,9998 (>0,997) (hình 3.20).

10 00

3.6.4.4 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian Chuẩn bị 6 mẫu thử nhƣ trên vào hai ngày khác nhau. Kết quả thu đƣợc nhƣ

Ó

A

sau:

Í-

H

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian

TO

1 2 3 4 5 6 Trung bình RSD (%) (n=6) RSD (%) (n=12)

ÀN Đ IỄ N D

Lƣợng cân mẫu thử (g) 2,0005 2,0004 2,0034 2,0035 2,0010 2,0026

-L

ÁN

STT

Ngày 1 Diện tích pic 2863536 2799371 2813658 2823009 2864703 2813850

Hàm lƣợng (%) 0,260 0,254 0,255 0,256 0,260 0,255 0,257 1,01

Lƣợng cân mẫu thử (g) 2,0017 2,0001 2,0095 2,0090 2,0024 2,0044

Ngày 2 Diện tích pic 2862494 2887068 2945047 2855047 2859775 2835393

Hàm lƣợng (%) 0,256 0,259 0,263 0,255 0,256 0,254 0,257 1,28

1,33 57

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Kết quả phân tích cho thấy phƣơng pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại trong ngày và trong hai ngày đều < 2%.

3.6.4.5 Độ đúng

Ơ

N

Sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn, thêm chính xác một lƣợng acid ganoderic A

N

H

chuẩn đã biết vào mẫu thử.

U Y

* Chuẩn bị mẫu 110%:

.Q

Cân chính xác khoảng 2 g bột nấm Linh chi cho vào bình nón nút mài 250 ml.

TP

Cân chính xác khoảng 4,44 mg acid ganoderic A cho vào bình định mức 5 ml. Hút

ẠO

1,0 ml cho vào mẫu thử. Tiến hành nhƣ phần độ lặp lại. * Chuẩn bị mẫu 120%:

Đ

Cân chính xác khoảng 2 g bột nấm Linh chi cho vào bình nón nút mài 250 ml.

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Cân chính xác khoảng 4,5 mg acid ganoderic A cho vào bình định mức 5 ml. Hút

TR ẦN

* Chuẩn bị mẫu 130%:

Cân chính xác khoảng 2 g bột nấm Linh chi cho vào bình nón nút mài 250 ml.

Cân chính xác khoảng 6,56 mg acid ganoderic A cho vào bình định mức 5 ml. Hút

10 00

B

1,0 ml cho vào mẫu thử. Tiến hành nhƣ phần độ lặp lại.

Kết quả độ thu hồi nhƣ sau:

Ó

A

Bảng 3.7: Kết quả độ thu hồi

Í-

H

Lƣợng acid ganoderic A thêm vào (mg) 0,440 0,441 0,440 0,858 0,856 0,856 1,297 1,297 1,297

ÁN

-L

Tỷ lệ thêm vào (%)

120%

IỄ N

Đ

ÀN

TO

110%

D

H Ư

1,0 ml cho vào mẫu thử. Tiến hành nhƣ phần độ lặp lại.

130%

Lƣợng cân bột dƣợc liệu (mg) 2,0015 2,0028 2,0042 2,0064 2,007 2,0052 2,0010 2,0035 2,0047 Trung bình

Lƣợng acid ganoderic A tìm lại (mg) 0,438 0,441 0,448 0,904 0,884 0,873 1,289 1,321 1,333

Tỷ lệ thu hồi (%) 99,62 99,89 101,86 101,39 99,28 98,13 99,41 100,70 101,57

Trung bình (%) 100,46

99,60

100,56 100,21

58

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Kết quả khảo sát cho thấy phƣơng pháp có tỷ lệ thu hồi cao, độ đúng tốt (100,21%) 3.6.4.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện đƣợc xác định bằng phƣơng pháp pha loãng dần dung dịch

Ơ

N

chuẩn C0 đến khi dung dịch chuẩn không có đáp ứng. Sau khi khảo sát ở điều kiện

N

H

sắc ký đã chọn, ở nồng độ 2,5 µg/ml có tỷ số nhiễu đƣờng nền s/n = 3,03. Pha loãng

U Y

hơn nồng độ dƣới 2,5 µg/ml thì thấy không còn đáp ứng nên đây đƣợc coi là giới

thống là:

ẠO

LOQ= 10/3 x 2,44 = 8,13 µg/ml

TP

.Q

hạn phát hiện (LOD) của hệ thống. Nhƣ vậy giới hạn định lƣợng (LOQ) của hệ

Đ

3.7 ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM

G

LINH CHI VIỆT NAM

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Kết quả định lƣợng acid ganoderic A trong 12 mẫu nấm Linh chi nhƣ sau: Bảng 3.8: Hàm lƣợng acid ganoderic A trong 12 mẫu nấm Linh chi

A Ó H

ÁN

-L

Í-

Trung bình RSD (%) GLT – 2

TR ẦN

GLT – 1

2,0005 2,0095 2,0133

Hàm ẩm Diện tích pic (%) Nấm Linh chi trồng 1789411 16,15 1762377 1752093

B

Khối lƣợng cân (g)

10 00

Tên mẫu

2,0064 2,0084 2,0080

15,25

1631674 1659948 1665245

13,05

3287628 3274910 3225648

11,45

3693434 3809942 3814161

GLT – 3

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Trung bình RSD (%) 2,0068 2,0068 2,0042

Trung bình RSD (%) GLT – 4

2,0091 2,0097 2,0099

Hàm lƣợng (%) 0,161 0,158 0,157 0,159 1,42 0,145 0,148 0,148 0,147 1,04 0,288 0,287 0,283 0,286 0,93 0,317 0,327 0,327

59

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

2,0053 2,0032 2,0055

GLT – 5

Đ

G

10 00

B

Trung bình RSD (%) GLN – 2 GLN – 3

N

GLN – 1

H Ư

2,0005 2,0004 2,0034 2,0035 2,0010 2,0026

9,8 14,45

-L

Í-

Trung bình RSD (%)

H

Ó

A

2,0075 2,0044 2,0076

.Q TP

12,90 12,35 13,10 15,20 Nấm Linh chi tự nhiên 2863536 2799371 2813658 15,90 2823009 2864703 2813850

ẠO

-

U Y

N

13,20

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Trung bình RSD (%) GLT – 6 GLT – 7 GLT – 8 GLT – 9

3429766 3388128 3449094

0,324 1,80 0,300 0,298 0,303 0,300 0,85 -

Ơ

Trung bình RSD (%)

N

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

914334 913122 915717

0,260 0,254 0,255 0,256 0,260 0,255 0,257 1,01 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08

ÁN

3.8 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID

TO

TRONG NẤM LINH CHI BẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV – VIS

D

IỄ N

Đ

ÀN

3.8.1 Lựa chọn thời gian chiết Sau khi chiết 7h thu đƣợc dịch chiết không màu, và khi cho thêm ethanol, để tủ

lạnh 2°C trong 24h, không thấy tủa. Do đó, lựa chọn đun hồi lƣu ở 100°C trong vòng 7h.

3.8.2 Lựa chọn thể tích EtOH 96% thêm vào để kết tủa polysaccharid Khi cho thêm 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml EtOH 96% vào 50 ml dịch chiết, để lạnh 2°C trong 24h, thu đƣợc tủa thô lần lƣợt là 90,1 mg; 99,1 mg; 99,2 mg và

60

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

99,4 mg. Tỷ lệ phần trăm polysacharid xác định đƣợc bằng phƣơng pháp đo quang lần lƣợt là 18,98 %; 24,50 %; 24,44 % và 24,45 % . Do đó chúng tôi chọn thể tích EtOH thêm vào là 200 ml.

N

H

Qua khảo sát, khi đun cách thủy ở 70°C trong 10 phút cho độ hấp thụ tối đa.

Ơ

N

3.8.3 Lựa chọn thời gian và điều kiện phản ứng

U Y

3.8.4 Quy trình định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi

.Q

Từ những khảo sát trên và các tài liệu tham khảo, phƣơng pháp định lƣợng

TP

polysaccharid trong nấm Linh chi nhƣ sau:

ẠO

Cân chính xác khoảng 5 g bột nấm Linh chi, cho vào bình cầu 250 ml, thêm 100

Đ

ml nƣớc, đun hồi lƣu ở 100°C trong vòng 4h. Lọc nóng, tiếp tục thêm 100 ml nƣớc

G

vào đun hồi lƣu trong khoảng 1,5 giờ và lọc ngay. Tiếp tục đun hồi lƣu với 100 ml

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

trong 1,5 giờ. Gộp dịch chiết, cô cách thủy còn 50 ml. Thêm 200 ml EtOH vào, khuấy đều. Để lạnh 2°C trong 24h. Ly tâm 3500 vòng/phút, trong 10 phút, thu tủa

10 00

* Chuẩn bị mẫu định lƣợng:

B

định hàm lƣợng PS tinh khiết.

TR ẦN

polysaccharid (PS) thô. Cân xác định khối lƣợng PS thô. Tiến hành đo quang để xác

- Mẫu trắng : Hút 2 ml phenol 5% trong ethanol, cho vào bình nón nút mài 50 ml,

A

thêm 10 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc vào, lắc đều. Đun cách thủy ở 70°C

H

Ó

trong 10 phút.

Í-

- Mẫu chuẩn : Cân chính xác và hòa tan khoảng 25 mg D-glucose trong vừa đủ 250

-L

ml nƣớc cất (dung dịch A có nồng độ 0,1 mg/ml). Pha loãng dung dịch A thành các

ÁN

dung dịch A1, A2, A3, A4, A5 có nồng độ lần lƣợt : 0,01 mg/ml (A1); 0,02 mg/ml

TO

(A2); 0,03 mg/ml (A3); 0,04 mg/ml (A4); 0,06 mg/ml (A5). Hút 2 ml mỗi dung dịch

ÀN

A, A1, A2, A3, A4, A5 cho vào 6 bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10

D

IỄ N

Đ

ml acid sulfuric đậm đặc, lắc đều. Đun cách thủy ở 70°C trong 10 phút.

- Mẫu thử : Hòa tan 10 mg PS thô trong 100 ml nƣớc cất (dung dịch B). Hút 2 ml dung dịch B vào bình nón nút mài 50 ml, thêm 2 ml phenol 5% và 10 ml acid sulfuric đậm đặc, lắc đều. Đun cách thủy ở 70°C trong 10 phút.

61

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Quét phổ từ 200 nm đến 800 nm tìm bƣớc sóng hấp thụ cực đại. Hàm lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi đƣợc tính dựa vào phƣơng trình hồi quy của dãy tuyến tính.

Ơ

N

3.8.5 Thẩm định phƣơng pháp

N

H

3.8.5.1 Độ đặc hiệu

U Y

Ta thấy các cực đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch thử tƣơng đƣơng với các cực

.Q

đại hấp thụ thu đƣợc từ dung dịch chuẩn, do đó phƣơng pháp có độ đặc hiệu.

TP

3.8.5.2 Tính thích hợp của hệ thống

ẠO

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn D-glucose nồng độ 0,01 mg/ml, ta

Đ

có kết quả sau (bảng 3.9):

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Độ hấp thụ

0,2173

5

0,2175

6

0,2177

Trung bình

0,2172

RSD (%)

0,17

H

Ó

A

4

Í-L

0,2169

TO

ÁN

0,2139

0,2167

10 00

3

TR ẦN

2

B

1

H Ư

Số lần tiêm

ÀN

Kết quả thống kê cho thấy, sau 6 lần đo độ hấp thụ có RSD < 2%. Vậy phƣơng

D

IỄ N

Đ

pháp đạt độ thích hợp hệ thống.

3.8.5.3 Độ tuyến tính Kết quả độ hấp thụ của các dung dịch D-glucose chuẩn 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08 và 0,1 mg/ml nhƣ sau:

62

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ tuyến tính Độ hấp thụ

0,01

0,2413

0,02

0,4310

0,03

0,5896

0,04

0,7611

0,06

1,0087

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

Nồng độ (mg/ml)

ẠO

TP

Phƣơng trình hồi quy: y= 16,833x + 0,0837, R= 0,999

N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

1

G

y = 16,833x + 0,0837 R² = 0,9994

Đ

1,2

TR ẦN

0,8 0,6

10 00

B

0,4 0,2

A

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

H

Ó

0

-L

Í-

Hình 3.21: Đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan tuyến tính nồng độ D-glucose và độ hấp thụ

ÁN

Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tƣơng quan tuyến tính

TO

giữa nồng độ chất phân tích và độ hấp thụ. Đƣờng hồi quy là đƣờng thẳng (16,833x

ÀN

+ 0,0837) với hệ số tƣơng quan, R= 0,999 (>0,997) (hình 3.21).

Chuẩn bị 6 mẫu thử nhƣ trên vào hai ngày khác nhau. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

D

IỄ N

Đ

3.8.5.4 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian

63

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian Ngày 1

Ngày 2

thụ

thử (g)

Lƣợng

so với

cân mẫu

dƣợc liệu

thử (g)

so với

thụ

dƣợc liệu khô (%)

5,0050

0,5622

0,611

5,0026

0,5347

0,603

2

5,0055

0,5678

0,611

5,0028

0,5416

0,613

3

5,0061

0,5712

0,609

5,0035

0,5398

0,597

4

5,0038

0,5528

0,599

5,0021

0,5475

0,600

5

5,0043

0,5498

0,595

5,0046

0,5504

0,617

6

5,0031

0,5514

0,597

5,0050

0,5523

0,619

TR ẦN

H Ư

G

Đ

ẠO

TP

1

N

.Q

khô (%)

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

lƣợng PS

Độ hấp

H

cân mẫu

lƣợng PS

N

Độ hấp

U Y

Lƣợng

Tổng

Trung bình

0,604

0,608

1,22

1,53

B

RSD (%) (n=6)

0,01

10 00

RSD (%) (n=12)

N

Tổng

Ơ

STT

Kết quả phân tích cho thấy phƣơng pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại trong

Ó

A

ngày và trong hai ngày đều < 2%.

-L

Í-

H

3.8.5.5 Độ đúng * Chuẩn bị dung dịch 110%: Cân chính xác khoảng 5 g bột nấm Linh chi bình nón

ÁN

250 ml, thêm chính xác khoảng 3 mg D-glucose chuẩn. Tiến hành các bƣớc nhƣ ở

TO

phần độ lặp lại. * Chuẩn bị dung dịch 120%: Cân chính xác khoảng 5 g bột nấm Linh chi bình nón

D

IỄ N

Đ

ÀN

250 ml, thêm chính xác khoảng 6 mg D-glucose chuẩn. Tiến hành các bƣớc nhƣ ở phần độ lặp lại. * Chuẩn bị dung dịch 130%: Cân chính xác khoảng 5 g bột nấm Linh chi vào bình nón 250 ml, thêm chính xác khoảng 9 mg D-glucose chuẩn. Tiến hành các bƣớc nhƣ ở phần độ lặp lại.

64

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Ơ

H N U Y

ẠO

TP

.Q

100,37

100,21

100,50 100,36

Kết quả khảo sát cho thấy phƣơng pháp có tỷ lệ thu hồi cao, độ đúng tốt (100,36%).

B

3.9 ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM LINH

10 00

CHI VIỆT NAM

Kết quả định lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu nấm Linh chi nhƣ sau:

H

Ó

A

Bảng 3.13: Kết quả định lượng polysaccharid trong nấm Linh chi Khối lƣợng cân (g)

Í-

-L

Tên mẫu

TO

ÁN

Mẫu nấm Linh chi trồng 5,0015 GLT – 1 5,0025 5,0048 Trung bình RSD (%) 5,0018 GLT – 2 5,0023 5,0036 Trung bình RSD (%) GLT – 3 5,0012

ÀN Đ IỄ N D

100,98 99,70 100,43 101,14 100,43 99,06 100,19 99,76 101,54

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

130%

Trung bình

Đ

120%

Tỷ lệ thu hồi (%)

G

110%

Lƣợng Dglucose tìm lại (mg) 33,20 33,17 33,18 36,24 36,21 36,14 39,20 39,18 39,33

N

5,0015 5,0013 5,0018 5,0023 5,0028 5,0023 5,0034 5,0028 5,0032

Lƣợng Dglucose thêm vào (mg) 3,01 3,02 3,01 6,03 6,02 6,01 9,01 9,03 9,02 Trung bình

H Ư

Tỷ lệ thêm vào

Lƣợng cân mẫu thử (mg)

N

Bảng 3.12: Kết quả độ thu hồi

Khối lƣợng polysaccharid thô

Độ hấp thụ

94,6 94,9 95,0

0,6383 0,6401 0,6339

93,8 93,9 94,0

0,6303 0,6289 0,6178

99,1

0,7753

Tổng lƣợng PS so với dƣợc liệu khô (%) 0,710 0,728 0,712 0,717 1,35 0,685 0,684 0,670 0,680 1,21 0,768

65

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

0,7849 0,7728

5,0024 5,0062 5,0048

100,2 100,3 100,3

0,7661 0,7713 0,7818

5,0017 5,0058 5,0029

99,4 99,5 99,4

0,7123 0,7237 0,7258

5,0022 5,0036 5,0017

80,7 80,8 80,6

0,3265 0,3325 0,3318

5,0020 5,0021 5,0092

Trung bình RSD (%)

N

GLT – 4

Đ

G N H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

GLT – 6 Trung bình RSD (%) GLT – 7

81,3 81,3 81,9

0,3231 0,3259 0,3301

100,1 100,1 100,1

0,7354 0,7312 0,7279

99,9 99,9 99,9

0,7176 0,7309 0,7354

100,0 100,0 100,0

0,6867 0,6908 0,7089

99,7 99,9 99,9

0,6912 0,7045 0,7079

10 00

B

Trung bình RSD (%)

5,0091 5,0099 5,0083

-L

Í-

H

Ó

A

GLT – 8

ÁN

GLT – 9

5,0029 5,0037 5,0018

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Trung bình RSD (%) Mẫu nấm Linh chi tự nhiên 5,0039 GLN – 1 5,0040 5,0049 Trung bình RSD (%) 5,0013 GLN – 2 5,0020 5,0022

.Q

ẠO

Trung bình RSD (%)

TP

GLT – 5

U Y

Trung bình RSD (%)

Trung bình RSD (%)

0,771 0,756 0,765 0,99 0,855 0,861 0,874 0,863 1,09 0,790 0,803 0,806 0,799 1,06 0,269 0,276 0,275 0,273 1,51 0,275 0,275 0,279 0,276 0,74 0,824 0,798 0,815 0,812 1,62 0,823 0,840 0,837 0,833 1,04

Ơ

99,2 99,1

H

5,0060 5,0028

N

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TR ẦN

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

0,817 0,822 0,836 0,825 1,24 0,759 0,775 0,779

66

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

0,5622 0,5678 0,5712 0,5528 0,5498 0,5514

TP

.Q

Trung bình RSD (%)

N

GLN – 3

93,8 93,8 93,9 93,7 93,8 93,7

U Y

5,0050 5,0055 5,0061 5,0038 5,0043 5,0031

0,771 1,35 0,611 0,611 0,609 0,599 0,595 0,597 0,604 1,22

Ơ

Trung bình RSD (%)

N

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ẠO

Tổng lƣợng polysaccharid trong các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu từ 0,2 –

Đ

0,8% so với dƣợc liệu khô. Theo dƣợc điển Trung Quốc, hàm lƣợng polysaccharid

G

trong nấm Linh chi không đƣợc thấp hơn 0,5% so với dƣợc liệu khô. Trong các mẫu

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

khảo sát có hai mẫu nấm GLT – 6 và GLT – 7 có hàm lƣợng polysaccharid thấp hơn 0,5%, còn lại các mẫu nấm khác đều chứa polysaccharid với hàm lƣợng từ

TR ẦN

0,5% trở lên (so với dƣợc liệu khô). Do đó có thể xây dựng chỉ tiêu định lƣợng tổng lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi theo phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử

B

phenol – acid sulfuric, yêu cầu tổng lƣợng polysaccharid quy về glucose (tính theo

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

dƣợc liệu khô) không đƣợc thấp hơn 0,5%.

67

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 VỀ ĐẶC ĐIỂM THỂ QUẢ, BỘT NẤM LINH CHI

N

Nghiên cứu bổ sung thêm một số đặc điểm thể quả nấm Linh chi so với dƣợc

H

Ơ

điển Việt Nam IV về màu sắc của thể quả, thể quả có thể bóng hoặc không bóng, có

N

cuống hoặc không có cuống.

U Y

Bột nấm Linh chi có hai đặc điểm đặc trƣng nhất là sợi nấm và bào tử. Đặc

.Q

điểm bào tử của nấm Linh chi có thể dùng để phân biệt với các loài khác trong chi

TP

Ganoderma.

ẠO

4.2 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH NẤM LINH CHI BẰNG SẮC KÝ LỚP

Đ

MỎNG HIỆU NĂNG CAO HPTLC

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Dung môi khai triển là dichloromethan – methanol (9:1) là hệ dung môi 2 cấu

H Ư

tử đơn giản hơn hệ dung môi 3 cấu tử: Ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) –

TR ẦN

ether ethylic – acid formic (15:5:1) (Dƣợc điển Việt Nam IV bản bổ sung); ether dầu hỏa (khoảng sôi 60°C đến 90°C) – ethyl format – acid formic (15:5:1) (Dƣợc

B

điển Trung Quốc); toluen – ethyl format – acid formic (5:5:0,2) (Dƣợc điển Mỹ)

10 00

cho hiệu quả tách tốt các thành phần của nấm Linh chi. Hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1) cũng gồm các thành phần dung môi phổ biến, dễ

Ó

A

tìm và ít gây độc hại đến kiểm nghiệm viên.

H

Các mẫu nấm Linh chi Việt Nam có các vết ở vị trí và có màu sắc tƣơng đối

-L

Í-

giống nhau khi quan sát ở bƣớc sóng 254 nm, 366 nm và sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH. Các thành phần giữa mẫu nấm Linh chi Việt Nam và Hàn Quốc

ÁN

cũng có một vài sự khác biệt.

TO

Chất đối chiếu là acid ganoderic A sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ EtOH

D

IỄ N

Đ

ÀN

có màu xanh da trời, và Rf = 0,32 đối với hệ dung môi dichloromethan – methanol (9:1). Chất này có trong mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc (dƣợc liệu đối chiếu) và các mẫu nấm GLT – 1, GLT – 2, GLT – 3, GLT – 4, GLT – 5, GLN – 1, tƣơng đồng với kết quả định tính bằng phƣơng pháp HPLC. Mẫu nấm GLN – 3 có hàm lƣợng acid ganoderic A thấp thì phƣơng pháp này không phát hiện đƣợc acid ganoderic A có trong mẫu nấm.

68

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

4.3 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG ACID GANODERIC A BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Phƣơng pháp chiết có dƣới sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm có tần số và cƣờng độ

Ơ

N

cao để truyền qua chất lỏng hay chất khí giúp phá vỡ thành tế bào sinh học, tạo

N

H

thuận lợi cho việc giải phóng dịch cần chiết. Do đó, phƣơng pháp cho hiệu quả cao

U Y

và tiết kiệm thời gian hơn so với phƣơng pháp ngâm thông thƣờng.

.Q

Phƣơng pháp định lƣợng acid ganoderic A trong nấm Linh chi bằng HPLC –

TP

DAD với cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) và pha động gồm hỗn hợp

ẠO

acid acetic 1% và acetonitril có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao. Loại cột

Đ

đƣợc sử dụng là cột có kích cỡ hạt 5 µm là loại cột đƣợc sử dụng phổ biến trong

G

điều kiện phòng thí nghiệm hơn loại cột có kích cỡ hạt 4 µm, cho thời gian phân

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

tích hợp lý (40 phút), rút ngắn so với rửa giải gradient trong các công trình đã công bố và các pic tách nhau rõ ràng.

TR ẦN

Nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp siêu âm mà không dùng phƣơng pháp ngâm nhƣ trong tài liệu tham khảo số 16. Phƣơng pháp siêu âm cho hàm lƣợng acid

10 00

B

ganoderic A cao hơn rõ rệt so với phƣơng pháp ngâm.

4.3 HÀM LƢỢNG ACID GANODERIC A TRONG CÁC MẪU NẤM LINH

A

CHI NGHIÊN CỨU

H

Ó

Hàm lƣợng acid ganoderic A không đồng đều trong các mẫu nấm thu hái tại các

Í-

tỉnh khác nhau hoặc trong cùng một tỉnh. Các mẫu nấm Linh chi nghiên cứu có hàm

-L

lƣợng acid ganoderic A từ 0,08 – 0,3 % so với dƣợc liệu khô. Một số mẫu Nấm

ÁN

Linh chi trồng và mẫu Nấm Linh chi tự nhiên không phát hiện chứa acid ganoderic

TO

A. Năm mẫu nấm Linh chi GLT – 1, GLT – 2, GLT – 3, GLT – 4 và GLT – 5 đều

ÀN

thu hái tại Quảng Nam nhƣng có hàm lƣợng acid ganoderic A khác nhau, lần lƣợt là

D

IỄ N

Đ

0,16 %, 0,15 %, 0,29 %, 0,32 % và 0,30 %. Nhƣ vậy, chất lƣợng nấm Linh chi không chỉ phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng.

Các mẫu Nấm Linh chi trồng cho hàm lƣợng acid ganoderic A cao hơn mẫu

nấm tự nhiên. Mẫu nấm GLT – 4 cho hàm lƣợng acid ganoderic A là cao nhất. Nhƣ vậy cần khảo sát thêm hàm lƣợng và sự có mặt của các triterpenoid khác trong nấm

69

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Linh chi để xây dựng đƣợc chỉ tiêu định lƣợng thành phần triterpenoid trong nấm Linh chi.

Ơ

N

4.4 VỀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG POLYSACCHARID BẰNG

N

H

PHƢƠNG PHÁP ĐO QUANG

U Y

Nghiên cứu sử dụng dung môi là nƣớc để chiết polysaccharid trong nấm Linh

.Q

chi. Một số tài liệu tham khảo sử dụng dung môi kiềm, tuy nhiên một số tài liệu

TP

tham khảo cũng đã chứng minh khi chiết bằng dung dịch kiềm thì lƣợng

ẠO

polysaccharid thô thu đƣợc có lẫn nhiều tạp hơn. Mặt khác, do tính chất của

Đ

polysaccharid tan tốt trong nƣớc, do đó lựa chọn dung môi chiết là nƣớc, vừa an

G

toản, rẻ tiền và hiệu quả.

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Polysaccharid cho một màu vàng cam khi đƣợc phản ứng với phenol và acid sulfuric đậm đặc. Phản ứng này rất nhạy và màu sắc ổn định trong nhiều giờ, đƣợc

TR ẦN

xác định ở bƣớc sóng 490 nm. Phản ứng này đƣợc sử dụng để xác định tổng lƣợng polysaccharid thu đƣợc từ Ganoderma lucidum P.Karst tính theo D-glucose.

10 00

B

Phƣơng pháp có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao có thể sử dụng bổ sung cho phƣơng pháp sử dụng thuốc thử anthron nêu trong dƣợc điển Trung Quốc.

A

Tuy nhiên phƣơng pháp tạo màu với thuốc thử phenol – acid sulfuric cũng có

H

Ó

nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng tạo màu nhƣ: thứ tự cho phenol, acid sulfuric

Í-

và mẫu thử; thể tích phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc cũng nhƣ thời gian ủ hỗn

-L

hợp phản ứng. Theo nhiều tài liệu tham khảo thì thứ tự mẫu thử - phenol – acid

ÁN

sulfuric cho độ hấp thụ tối đa, đƣợc giải thích là do sự có mặt sẵn phenol trong dung

TO

dịch thì khi đƣờng furfural đƣợc tạo thành thì phản ứng tạo màu giữa phenol và

ÀN

đƣờng furfural sẽ xảy ra nhanh chóng trƣớc bất cứ sự cạnh tranh nào hoặc trƣớc khi

D

IỄ N

Đ

đƣờng furfural phân hủy. Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến phản ứng tạo màu này. Khi chỉ lắc hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng thì cho độ hấp thụ không ổn định. Tuy

nhiên, khi sau khi lắc, đun hỗn hợp phản ứng trong bể cách thủy ở 70°C trong 10 phút thì độ hấp thụ thu đƣợc ổn định hơn và đạt tối đa.

70

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS là phƣơng pháp phân tích hiện đại đƣợc áp dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm. Phƣơng pháp cho kết quả phân

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

tích nhanh với độ chính xác cao.

71

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Đã nghiên cứu đƣợc đặc điểm quả thế, đặc điểm bột nấm Linh chi, giới hạn độ

Ơ

N

ẩm của nấm Linh chi

N

H

2. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính nấm Linh chi bằng sắc ký

U Y

lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC.

.Q

3. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng acid ganoderic

TP

A trong nấm Linh chi bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC:

Khảo sát và lựa chọn đƣợc phƣơng pháp chiết acid ganoderic A

-

Khảo sát và lựa chọn đƣợc các thông số tối ƣu cho quá trình sắc ký:

Đ

ẠO

-

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Bƣớc sóng phát hiện: 254 nm

G

Cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) Nhiệt độ cột: 30°C

TR ẦN

Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút Thể tích tiêm: 20 µl

10 00

B

Thời gian phân tích: 40 phút Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (30:70)

Ó

Phƣơng pháp đã đƣợc thầm định trên điều kiện thiết bị hiện có cho kết quả

H

-

A

Chế độ chạy đẳng dòng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

đáng tin cậy với những thông số sau: Khoảng tuyến tính: 120 µg/ml đến 400 µg/ml Giới hạn phát hiện: 2,5 µg/ml Giới hạn định lƣợng: 8,13 µg/ml Độ chính xác (RSD %): < 2% Độ đúng (%): 98% - 102%

4. Đã định lƣợng đƣợc hàm lƣợng acid ganoderic A trong 12 mẫu nấm Linh chi Việt Nam, kết quả cho thấy có 5/12 mẫu không có acid ganoderic A và có 7/12 mẫu có acid ganoderic A với hàm lƣợng từ 0,02 – 0,32%

72

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

5. Đã nghiên cứu xây dựng đƣợc phƣơng pháp định lƣợng polysaccharid trong nấm Linh chi bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV – VIS và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng polysaccharid trong 12 mẫu nấm Linh chi Việt Nam.

Ơ

N

KIẾN NGHỊ

N

H

Khảo sát thêm hàm lƣợng của các thành phần triterpenoid khác trong nấm Linh

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

chi Việt Nam để có cơ sở xây dựng hàm lƣợng triterpenoid phù hợp.

73

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), "Nghiên cứu

Ơ

N

tác dụng của nấm Linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) qua một số chỉ số

N

H

lipid máu ở chuột cống", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 38(5).

U Y

2. Bản bổ sung Dƣợc điển Việt Nam IV (2015)

.Q

3. Bộ Y tế (2013), Dược liệu học, Tập 1, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr. 135 - 139.

TP

4. Bộ Y tế (2013), Hóa phân tích, Tập 2, Nhà xuất bản Y học Hà Nội,

ẠO

5. Mai Thành Chung, Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2012), "Khảo sát hoạt tính khử gốc

Đ

tự do superoxid và tác dụng trên glutathion peroxidase trong gan của nấm Linh

G

chi đỏ và nấm Linh chi Vàng", Tạp chí Dược liệu, 17(5), tr. 275 – 281.

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

6. Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trần Mỹ Tiên, Lƣơng Kim Bích, Nguyễn Kim Phƣợng, Đỗ Thị Phƣơng, Nguyễn Thị Phƣơng,

TR ẦN

Đinh Thị Mai Hƣơng (2006),”Nghiên cứu tác dụng trên trí nhớ của 3 loài nấm

10 00

liệu, 11(1), tr. 35-40.

B

linh chi trên mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng scopotamin”, Tạp chí Dược 7. Nguyễn Thƣợng Dong, Bùi Thị Bằng, Nguyễn Kim Phƣợng, Đỗ Thị Phƣơng,

A

Nguyễn Thị Phƣơng, Đinh Thị Mai Hƣơng (2005), "Nghiên cứu tác dụng

H

Ó

chống oxy hóa của 3 loài nấm Linh chi trên mô hình gây viêm gan cấp bằng

Í-

tetraclorur carbon (CCL4)", Tạp chí Dược liệu, 10(6), tr. 192 - 196.

-L

8. Trần Đình Duy, Hà Đức Cƣờng, Nguyễn Đăng Thoại, Trần Mạnh Hùng (2013),

ÁN

"Nghiên cứu tác dụng dự phòng và điều trị suy giảm bạch cầu của cao Linh chi

TO

(Ganoderma lucidum) và chế phẩm Linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu

ÀN

bằng pactitaxel và carboplatin", Tạp chí Dược học, 53(450), tr.15 - 19.

D

IỄ N

Đ

9. Nguyễn Anh Dũng (1995), "Góp phần vào nghiên cứu các thành tố hóa học của Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.", Tạp chí Dược học, 229, tr. 14 – 16.

10. Dƣợc điển Việt Nam IV 11. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Trịnh Văn Tấn (2011), "Nghiên cứu tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của nấm Linh chi đỏ trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid", Tạp chí Dược liệu, 16(1+2), tr. 69 - 74.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

12. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam, Tập 1 (Tái bản lần thứ 2), NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 41, 135 - 157.

13. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,

Ơ

N

Hà Nội.

N

H

14. Nguyễn Phƣơng Đại Nguyên (2013), Nấm Linh chi ở Tây Nguyên, Nhà xuất

U Y

bản giáo dục Việt Nam.

.Q

15. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài, Lê Trung Hiếu (2012), “Chiết xuất, xác định

TP

hàm lƣợng và khảo sát tác dụng dƣợc lý của phân đoạn polysaccharid từ nấm linh

ẠO

chi nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Dƣợc học, 52 (433), 18-22.

Đ

16. Trần Thị Văn Thi, Nguyễn Thị Hoài, Nguyễn Thị Phƣợng, Lê Trung Hiếu, Lê

G

Lâm Sơn (2012), "Khảo sát một số tác dụng dƣợc lý của phân đoạn

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

triterpenoid từ nấm Linh chi trồng tại Thừa Thiên Huế", Tạp chí Dược liệu, 17(3), tr. 154 - 158.

TR ẦN

17. Phạm Bảo Trƣơng và Nguyễn Minh Thủy (2015), “Tối ƣu hóa quá trình trích ly polysaccharide và tannin trong nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)”, Tạp

10 00

B

chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 36 (2015): 21-28.

18. Nguyễn Ngọc Vinh, Lê Thị Thu Cúc, Phan Nhƣ Trúc, Trần Việt Hùng (2016)

A

"Xây dựng quy trình định tính, định lƣợng acid ganoderic A bằng phƣơng

H

Ó

pháp HPLC trong nấm Linh chi - Ganoderma lucidum (Leyss ex. Fr.) Karst".

Í-

Tạp chí Dược học, 56, 48-51.

-L

19. Kiểm nghiệm 116 dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (2016), Nhà

ÁN

xuất bản y học, 224-226.

TO

Tài liệu tiếng Anh

ÀN

20. American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium

D

IỄ N

Đ

21. Bao X., Liu C., Fang J., Li X. (2001), "Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.”, Carbohydrat Research, 332, 67-74.

22. Bao X., Fang J., Li X. (2001), “Structural characterization and immunomodulating activity of a complex glucan from spores of Ganoderma lucidum”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (11), pp. 2384-2391.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

23. Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L. (2007), “Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds”, Biotechnology Annual Review, 13, pp.

Ơ

24. Chen N. H., Liu J.W., Zhong J.J. (2010), “Ganoderic acid T inhibits tumor

N

265-301.

N

H

invasion in vitro and in vivo through inhibition of MMP expression”,

U Y

Pharmacological Reports, 62(1), pp.150-63.

.Q

25. Cheng C. R., Yue Q. X., Wu Z. Y., Song X. Y., Tao S. J., Wu X. H., Xu P.

TP

P., Liu X., Guan S. H., Guo D. A. (2010), “Cytotoxic triterpenoids from

ẠO

Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 71, pp. 1579–1585.

Đ

26. Cheng P., Chia-Wei Phan, Vikineswary Sabaratnam, Noorlidah Abdullah,

G

Mahmood Ameen Abdulla, Umah Rani Kuppusamy (2013), “Polysaccharides

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

rich extract of Ganoderma lucidum (M.A. Curtis:Fr.) P. Karst accelerates wound healing in streptozotocin-induced diabetic rats”, Evidence-Based

TR ẦN

Complementary and Alternative Medicine, 2013, pp.9.

27. Chen Y., Yan Y., Xie M.Y., Nie S.P., Liu W., Gong X.F., Wang Y.X. (2008),

10 00

B

“Development of a chromatographic fingerprint for the chloroform extracts of Ganoderma lucidum by HPLC and LC-MS.”, Journal of Pharmaceutical and

A

Biomedical Analysis, 47(3), pp. 469-77.

H

Ó

28. Da J. (2015), “A reproducible analytical system based on the multi-component

Í-

analysis of triterpene acids in Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 114, pp.

-L

146-54.

ÁN

29. el-Mekkawy S. , Meselhy R. Meselhy, Norio Nakamura, Yasuhiro Tezuka,

TO

Masao Hattori, Nobuko Kakiuchi, Kunitada Shimotohno, Takuya Kawahata,

D

IỄ N

Đ

ÀN

Toru otake (1998), “Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma lucidum”, Phytochemistry, 49(6), pp.1651-7.

30. Falandysz J. (2008) "Selenium in edible mushrooms.". J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev., 26 (3), 256-299.

31. Gao Y., Tang W., Gao H., Chan E., Lan J., Zhou S. (2004), "Ganoderma lucidum polysaccharide fractions accelerate healing of acetic acid-induced ulcers in rats.". Journal of Medicinal Food, 7 (4), 417-421.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

32. Gau J. P., et al. (1990), “The lack of antiplatelet effect of crude extracts from Ganoderma lucidum on HIV-positive hemophiliacs”, The American Journal of

Ơ

33. GoW T. Robert, Dan Li, George W. Sypert, Randall S. Alberte, (2008),

N

Chinese Medicine, 18, pp. 175 – 179.

N

H

“Extracts and methods comprising Ganoderma species”, United States, Patent

U Y

Application Publication, Pub. No.: US 2008/0112966 A1.

.Q

34. Ha Do T., Oh J., Khoi N. M., Dao T. T., Dung le V., Do T. N., Lee S. M., Jang

TP

T. S., Jeong G. S., Na M. (2013), “In vitro and in vivo hepatoprotective effect

ẠO

of ganodermanontriol against t-BHP-induced oxidative stress”, Journal of

Đ

Ethnopharmacology, 150(3), pp. 875-855.

G

35. Ha D. T., Loan L.T., Hung T.M., Han L.V.N, Nguyen Minh Khoi, Dung L.V.,

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Byung Sun Min, Nguyen N.P.D. (2015), “An improved HPLC-DAD method for quantitative comparisons of triterpenes in Ganoderma lucidum and its five

TR ẦN

related species originating from Vietnam”, Molecules, 1059-1077.

36. Hajjaj H., et al. (2005), “Effect of 26-oxygenosterols from Ganoderma lucidum

10 00

B

and their activity as cholesterol synthesis inhibitors”, Applied and Environmental Microbiology, 71(7), pp. 3653-3658.

A

37. Hedge, J.E. and Hofreiter, B.T. (1962). In: Carbohydrate Chemistry, 17 (Eds.

H

Ó

Whistler R.L. and Be Miller, J.N.), Academic Press, New York.

Í-

38. Huang S. Q. (2010), “Optimization of Alkaline Extraction of Polysaccharides

-L

from Ganoderma lucidum and Their Effect on Immune Function in Mice”,

ÁN

Molecules, 15, pp. 3694-3708.

TO

39. Huie C. W., Di X. (2004), “Chromatographic and electrophoretic methods for

D

IỄ N

Đ

ÀN

Lingzhi pharmacologically active components”, Journal of Chromatography

B, 812, pp. 241-257.

40. Iris F. F. Benzie and Sissi Wachtel-Galor (2011), Herbal Medicine: Biomolecular and Clinical Aspects. 2nd edition.

41. Jia J, Zhang X, Hu Y. S, et al. (2009), "Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum polysaccharides in STZ-diabetic rats". Food Chemistry, 115, 32-36.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

42. Jiang J.,

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Slivova V., Harvey K., Valachovicova T., Sliva D. (2004),

“Ganoderma lucidum suppresses growth of breast cancer cells through the inhibition of Akt/NF-kappaB signaling”, Nutrition and Cancer, 49(2), pp.

Ơ

N

209-216.

N

H

43. Jiang J., Slivova V., Valachovicova T., Harvey K., Sliva D. (2004),

U Y

"Ganoderma lucidum inhibits proliferation and induces apoptosis in human

.Q

prostate cancer cells PC-3". International Journal of Oncology, 24 (5), 1093-

TP

1099. 50T

ẠO

44. Jong S.C, Birmingham J. M. (1992), “Medicinal benefits of the mushroom

Đ

Ganoderma”, Advances in Applied Microbiology, 37, pp. 101-34

G

45. Kim H. W. (1997), “Inhibition of cytopathic effect of human immunodeficiency

Pharmacal Research, 20, pp. 425-431.

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

virus-1 by water-soluble extract of Ganoderma lucidum”, Archives of

TR ẦN

46. Kim K. C., Kim J. S., Son J. K., Kim I. G. (2007), "Enhanced induction of mitochondrial damage and apoptosis in human leukemia HL-60 cells by the

10 00

B

Ganoderma lucidum and Duchesnea chrysantha extracts". Cancer Lett., 246 (1-2), 210-217.

A

47. Koyama K., Imaizumi T., Akiba M., Kinoshita K., Takahashi K., Suzuki

H

Ó

A., Yano S., Horie S., Watanabe K., Naoi Y. (1997), “Antinociceptive

Í-

components of Ganoderma lucidum”, Planta Medica, 63(3), pp. 224-227.

-L

48. Kubota T. (1982), “Structures of Ganoderic Acid A and B, two new lanostane

ÁN

type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum (FR.) Karst.”, Helvetica

TO

Chimicacta, 65, 2 (1982), 62.

D

IỄ N

Đ

ÀN

49. Li B. M., Gu H. F., Li Y., Liu C., Wang H. Q., Kang J., Wu C. H., Chen R. Y.(2012), “Determination of nine triterpenoid acids from Ganoderma lucidum of different producting areas by HPLC”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 37(23), pp. 3599-3603.

50. Li J. (2014), “Study on variation of main ingredients from spores and fruiting bodies of Ganoderma lucidum”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 39(21), pp.

4246-4251.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

51. Liu C., Dunkin D., Lai J., Song Y., Ceballos C., Benkov K., Li X. M. (2015), “Anti-inflammatory effects of Ganoderma lucidum triterpenoid in human Crohn's disease associated with downregulation of NF-κB signaling”, Inflamm

Ơ

N

Bowel Disease, 21(8), pp. 1918-1925.

N

H

52. Liu J., Kurashiki K., Fukuta A., Kaneko S., Suimi Y., Shimizu K., Kondo

U Y

R.(2012), “Quantitative determination of the representative triterpenoids in the

.Q

extracts of Ganoderma lucidum with different growth stages using high-

ẠO

inhibitory properties”, Food Chemistry, 133(3). (***)

TP

performance liquid chromatography for evaluation of their 5a-reductase

Đ

53. Liu Y. (2011), “Sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass

G

spectrometry method for the determination of five ganoderic acids in

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Ganoderma lucidum and its related species”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54(4), pp. 717–721.

TR ẦN

54. Lu J. (2012), “Quality difference study of six varieties of Ganoderma lucidum with different origins”, Front Pharmacol, 3, pp. 57.

10 00

B

55. Ma B., Wei Ren, Zhou Y., Ma J., Ruan Y., Wen C. N. (2011), “Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum”, North American Journal of

A

Medical Sciences, 11(3).

H

Ó

56. Masuko T., Akio Minamib, Norimasa Iwasakib, Tokifumi Majimab, Shin-Ichiro

Í-

Nishimurac, Yuan C. Leea (2005), “Carbohydrate analysis by a phenol–

-L

sulfuric acid method in microplate format”, Analytical Biochemistry, 339 (1),

ÁN

pp. 69–72.

TO

57. Paterson R. R. M. (2006), “Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory”,

ÀN

Phytochemistry, 67, pp. 1985 – 2001.

D

IỄ N

Đ

58. Pharmacopoeia of the people's republic of China (2005).

59. Pillai T. G., Nair C. K., Janardhanan K. K. (2007), “Polysaccharides isolated from Ganoderma lucidum occurring in Southern parts of India, protects radiation induced damages both in vitro and in vivo”, Environmental Toxicology and Pharmacology, 26 (2008), pp. 80–85.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

60. Radwan F. F., Perez J. M., Haque A., “Apoptotic and immune restoration effects of Ganoderic Acids define a new prospective for complementary treatment of cancer”, Journal of Clinical & Cellular Immunology, 3.

Ơ

N

61. Sakamoto S., Kikkawa N. (2016), “.Immunochromatographic strip assay for

N

H

detection of bioactive Ganoderma triterpenoid, ganoderic acid A in

U Y

Ganoderma lingzhi”, Fitoterapia, 114, pp. 51-55.

.Q

62. Sanat K. Saha, Curtis F. Brewer (1993), “Determination of the concentrations of

TP

oligosaccharides, complex type carbohydrates, and glycoproteins using the

ẠO

phenol-sulfuric acid method”, Carbohydrate Research, 254 (1994), pp. 157-167.

63. Skalicka-Woźniak K., Janusz Szypowski, Renata Łoś, Marek Siwulski,

G

Đ

Krzysztof Sobieralski, Kazimierz Głowniak, Anna Malm (2011), “Evaluation

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

of polysaccharides content in fruit bodies and their antimicrobial activity of four Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) P. Karst. strains cultivated on

TR ẦN

different wood type substrates”, Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 81(1), pp.17-21.

64. Tanaka S., Ko K., Kiko K., Tsuchiya K., Yamashita A., Murasugi A., Sakuma H.

(1989),

“Complete

B

Tsunoo

10 00

S.,

amino

acid

sequence

of

an

immunomodulatory protein, ling zhi-8 (LZ-8). An immunomodulator from a

A

fungus, Ganoderma lucidium, having similarity to immunoglobulin variable

H

Ó

regions”, The Journal of Biological Chemistry, 264, pp. 16372-16377.

Í-

65. Tomasi S., Lohézic-Le Dévéhat F., Sauleau P., Bézivin C., Boustie J. (2004),

-L

"Cytotoxic activity of methanol extracts from Basidiomycete mushrooms on

ÁN

murine cancer cell lines". Pharmazie., 59 (4), 290-293.

TO

66. Trigos A., Medellín J. S. (2011), “Bogically active metabolites of the genus

D

IỄ N

Đ

ÀN

Ganoderma: Three decades of myco-chemistry research”, Revista Mexicana

de Micología, 34, pp. 63 – 83.

67. United States Pharmacopeia Convention 2014.

68. Xu Z., Xiuping Chen, Zhangfeng Zhong, Lidian Cheny and Yitao Wang, Zengtao

X.,

(2011),

“Ganoderma

lucidum

Polysaccharides:

Immunomodulation and Potential Anti-Tumor Activities’, The American Journal of Chinese Medicine, 39(1), pp. 15–27.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

69. Yu-Hong Y., Zhi-Bin L. (2002), “Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species”, Acta Pharmacologica Sinica, 23 (9), pp. 787-791.

Ơ

N

70. Yuanfeng W., et al. (2010), “Determination of tea polysaccharides in Camellia

N

H

sinensis by a modified phenol-sulfuric acid method”, Archives of Biological

U Y

Sciences, 62 (2), 669-676.

.Q

71. Yurkiv B. (2015), “Antioxidant Effects of Medicinal Mushrooms Agaricus

TP

brasiliensis and Ganoderma lucidum (Higher Basidiomycetes): Evidence from

ẠO

Animal Studies”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 17(10), pp.

Đ

943-55.

G

72. Zhao J., Zhang X. Q., Li S. P., Yang F. Q., Wang Y. T., Ye W. C. (2006),

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

“Quality evaluation of Ganoderma through simultaneous determination of nine triterpenes and sterols using pressurized liquid extraction and high

TR ẦN

performance liquid chromatography”, Journal of Separation Science, 29(17), pp. 2609-15.

10 00

B

73. Zhu X. L, Chen A. F, Lin Z. B. (2007), "Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the function of immunological effector cells in immunosuppressed

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

mice", Journal Ethnopharmacol, 111, 219–226.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

PHỤ LỤC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

G

Đ

Mẫu nấm Linh chi Hàn Quốc

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon www.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial