Nghiên cứu tổng hợp muối canxihydroxycitrat từ axit hidroxycytric của vỏ quả bứa ở Quảng Ngãi

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CANXIHYDROXYCITRAT

vectorstock.com/22606229

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection DẠY KÈM QUY NHƠN EBOOK PHÁT TRIỂN NỘI DUNG

Nghiên cứu tổng hợp muối canxihydroxycitrat từ axit hidroxycytric của vỏ quả bứa ở Quảng Ngãi WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

1

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Theo Tổ chức Y tế thế giới, hiện nay dư cân và béo phì là đề tài mà ngành y đang quan tâm nhất là đối với các nước phát triển và đang phát triển.

Hội nghị quốc tế lần thứ VIII về béo phì họp tại Paris ngày 01/09/1998 nhận định rằng Bệnh béo phì đã trở thành đại dịch toàn cầu, là vấn đề lớn đang đe dọa sức khoẻ cộng đồng. Số liệu thống kê gần đây của Tổ chức Y tế thế giới cho thấy số người béo phì đang gia tăng một cách đáng báo động với hơn 1,5 tỉ người toàn cầu.

Bệnh béo phì không chỉ ảnh hưởng đến lao động, sinh hoạt, thẫm mỹ mà còn nguy hại nhất định đến sức khoẻ. Người trung niên và lớn tuổi bị béo phì sẽ dễ mắc các bệnh như: huyết áp cao, bệnh mạch vành, tiểu đường, bệnh Gout, tai biến mạch não, sỏi túi mật vv… Cũng theo tài liệu điều tra của Trung Quốc, trong số 153 bệnh nhân động mạch vành thì có 120 ca cân nặng quá tiêu chuẩn 10% chiếm tỉ lệ 78,4% và 77 ca mắc bệnh béo phì chiếm tỉ lệ 50,3%. Béo phì là bệnh do mỡ tích luỹ quá nhiều trong cơ thể làm thay đổi chức năng sinh lý, sinh hoá của cơ thể.

Cây bứa, bứa lá tròn dài – tên khoa học là Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth, thuộc họ bứa và chi bứa. Được Antonie Laurent de Jusieu đưa ra năm 1789, là một loại thực vật có hoa bao gồm khoảng 50 chi và 1.200 loài các cây thân gỗ hay cây bụi. Cây mọc hoang trong rừng thứ sinh của các tỉnh từ Hà Tuyên, Vĩnh Phú, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Tây Nguyên đến Nam Bộ.

Trên thế giới việc nghiên cứu cây bứa đã có từ rất lâu, tính đến nay đã có hàng trăm công trình nghiên cứu cây bứa bao gồm: chiết tách, xác định

2

thành phần hoá học các hợp chất hữu cơ, ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, công nghệ dược phẩm, đặc biệt là chế phẩm giảm béo.

HCA được chiết từ vỏ quả bứa có tác dụng ngăn chặn quá trình tích lũy mỡ, cải thiện bilance trong máu, kìm hãm quá trình chuyển hóa lượng đường thừa trong cơ thể thành mỡ, giúp ngăn chặn quá trình béo phì. Ngoài ra, HCA còn cải thiện giảm các loại mỡ xấu như: tryglixerit, CDL cholesterol, cholesterol toàn phần và tăng HDL cholesterol là loại mỡ có tác dụng bảo vệ tim mạch. Bên cạnh đó, HCA làm tăng nồng độ serotonin có vai trò kiểm soát sự thèm ăn, làm tăng quá trình tổ hợp glycogen và tăng độ oxi hóa, đốt cháy mỡ thừa…Dạng lỏng tự do của HCA có xu hướng không ổn định, dễ bị lacton hóa nên việc tổng hợp muối đi từ HCA đã được nghiên cứu nhằm làm tăng sự ổn định và hoạt tính sinh học của HCA. Lowenstein đã mô tả các muối của HCA dựa trên các kim loại kiềm, kiềm thổ như: kali, natri, canxi…

Muối canxi (-)-hydroxycitrat có hoạt tính sinh học của HCA. Canxi là loại khoáng chất quan trọng cần thiết cho sự phát triển vững chắc của răng và xương giúp làm giảm nguy cơ loãng xương. Canxi giữ vai trò là chất truyền dẫn thông tin và nó tham gia vào hầu hết các hoạt động của cơ thể và tế bào.

Như vậy, ngoài hiệu quả giảm cân thì muối canxi (-)-hydroxycitrat còn giúp bổ sung lượng canxi cần thiết cho sự phát triển của cơ thể. Ở Mỹ, Hydrotrim là sản phẩm độc quyền được điều chế từ muối canxi của HCA, có hiệu quả cao trong việc điều trị giảm cân hiện nay được người tiêu dùng rất ưa chuộng.

Với những lý do trên mà tôi chọn đề tài: “ Nghiên cứu tổng hợp muối canxihydroxycitrat từ axit hidroxycytric của vỏ quả bứa ở Quảng Ngãi ”.

2. Mục đích nghiên cứu - Khảo sát quá trình chiết tách axit hidroxycytric từ vỏ quả bứa.

- Xây dựng quy trình tổng hợp muối canxihydroxycitrat.

3

- Đóng góp thêm những thông tin, tư liệu khoa học về cây bứa, tạo cơ sở khoa học ban đầu cho các nghiên cứu sâu về ứng dụng của axit hidroxycytric .

3. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu: Vỏ quả của cây bứa (Garcinia oblongifolia Champ. Ex Benth.) tại xã Bình Hải và Bình Hoà, huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi.

3.2. Phạm vi nghiên cứu: - Chiết tách axit hidroxycytric bằng phương pháp chưng ninh. Kiểm tra sản phẩm chiết bằng phương pháp chuẩn độ axit-bazơ, phổ hồng ngoại (IR) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Tổng hợp muối canxihydroxycitrat và khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: pH, thể tích và thời gian tới hiệu suất quá trình tổng hợp muối.

- Tinh chế muối và kiểm tra sản phẩm muối đã tinh chế bằng phương pháp đo phổ IR, HPLC và xác định hàm lượng canxi trong muối.

4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Nghiên cứu lý thuyết: Phương pháp nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của một số loài thực vật thuộc họ bứa Clusiaceae.

4.2. Phương pháp thực nghiệm: Phương pháp chiết tách: Phương pháp chiết chưng ninh sử dụng dung môi là nước cất.

Phương pháp phân tích công cụ: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

4

cao (HPLC), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR).

5. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài Từ các nghiên cứu trên, đề tài đã thu được một số kết quả với ý nghĩa như sau: - Xây dựng quy trình chiết tách axit hidroxycytric từ vỏ quả bứa khô.

- Xây dựng quy trình tổng hợp muối canxihydroxycitrat từ axit hidroxycytric được chiết trong vỏ quả bứa.

- Cung cấp các thông tin khoa học về thành phần và cấu tạo của muối canxihydroxycitrat .

- Làm cơ sở dữ liệu để ứng dụng muối canxihydroxycitrat trong thực tế.

6. Cấu trúc của luận văn Luận văn gồm phần mở đầu, kết luận, kiến nghị, tài liệu tham khảo.

Nội dung của luận văn chia làm ba chương như sau: Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận.

5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. CÂY BỨA [3], [4], [5], [7] 1.1.1. Bộ chè Là bộ lớn, bao gồm chủ yếu các cây thân gỗ có quan hệ gần gũi với bộ sổ và sớm đi ra từ bộ này.

Bộ chè gồm 19 họ, ở nước ta có 8 họ trong đó có 2 họ quan trọng nhất là họ Chè và họ Măng cụt, phân biệt với nhau chủ yếu như sau: - Cây không có nhựa mủ, lá mọc cách thường thuộc Họ Chè.

- Cây có nhựa mủ màu vàng , lá mọc đối thường thuộc Họ Măng cụt.

Họ Măng cụt gồm 14 chi và hơn 350 loài phân bố trong giới hạn các nước nhiệt đới ẩm; trong đó Việt Nam có 5 chi: Calophyllum, Garcinia, Kayea, Mesua, Ochrocarpus và khoảng 45 loài.

1.1.1.1. Họ Chè (Theaceae) Cây gỗ hay cây bụi, lá mọc cách, đơn nguyên và không có lá kèm, trong lá thường có tế bào đã phân nhánh. Hoa lưỡng tính, thường mọc đơn độc. Ðài gồm 5 lá đài không bằng nhau, tồn tại trên quả. Tràng gồm 5- 9 cánh rời. Nhị nhiều. Nhụy do 3- 5 lá noãn hợp thành bầu trên, số ô tương ứng với số lá noãn, trong mỗi ô có 2 hay nhiều noãn, đính noãn trụ giữa. Quả có một hay nhiều hạt, không có nội nhũ, phôi lớn.

Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài, phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới của cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á. Ở Việt Nam có 11 chi với trên 100 loài.

1.1.1.2. Họ Măng cụt (Clusiaceae) Cây gỗ hay cây bụi, thường xanh, có cành mọc ngang. Trong nhiều bộ phận của cây có ống tiết nhựa mủ màu vàng hay vàng lục. Lá mọc đối, không

6

có lá kèm. Hoa thường lưỡng tính, đôi khi đơn tính hay đa tính. Ðài gồm 5- 6 mảnh, tồn tại trên quả. Tràng gồm 2- 6 cánh hoa (có khi nhiều hơn).

Nhị nhiều, tập hợp thành bó. Nhụy gồm 3- 5 ( có khi tới 15) lá noãn.

Quả mở vách hay quả mọng. Hạt thường nhiều, không có nội nhũ, có khi có áo hạt bao ngoài.

Họ măng cụt gồm 14 chi và hơn 350 loài phân bố trong giới hạn các nước nhiệt đới ẩm. Ở Việt Nam có 5 chi, 45 loài.

1.1.2. Bứa

Hình 1.1. Quả, lá, hoa và cây bứa ở Quảng Ngãi Tên khoa học: Garcinia oblongifolia Champ.ex Benth.

Thuộc họ măng cụt Clusiaceae.

Mô tả: Cây thân gỗ cao 10- 15m. Cành và nhánh dài và mảnh mọc xoè ngang. Vỏ cây màu xám tro. Lá mọc đối, mép nguyên nhẵn bóng, có nhiều điểm mờ. Hoa màu vàng có cả hoa đực và hoa lưỡng tính. Hoa đực có 4 lá

7

đài, 5 cánh hoa. Hoa lưỡng tính có 4 lá đài, 4 cánh hoa, rất nhiều nhị. Bầu 610 ô. Quả nang hình cầu có nhiều rãnh dọc. Vỏ quả màu vàng ở ngoài, phía trong hơi đỏ, vị chua, 6- 10 hạt, có nhiều múi mọng nước ăn được (hình 1.1).

Thành phần hoá học: Trong quả chứa nhiều axit hữu cơ, vitamin C (100g có 61mg vitamin C), flavonozit.

Bộ phận dùng: Vỏ Cortex Garciniae.

Nơi sống và thu hái: Cây mọc hoang trong rừng thứ sinh của các tỉnh từ Hà Tuyên, Vĩnh Phú đến Quảng Nam, Quảng Ngãi . Thường được trồng lấy lá tươi và quả nấu canh chua.

Tính vị, công dụng: Vỏ có tính săn da và hơi đắng, mát, hơi độc, có tác dụng tiêu viêm, hạ nhiệt, làm săn da, lành vết thương. Lá có vị chua, thường được dùng nấu canh chua. Hạt có áo hạt chua, ăn được, cũng dùng nấu canh chua.

Vỏ thường dùng trị: Loét dạ dày, loét tá tràng, viêm dạ dày ruột, kém tiêu hoá, viêm miệng, bệnh cặn răng, ho ra máu. Dùng ngoài trị bỏng, mụn nhọt, eczema, dị ứng, mẩn ngứa, rút các vết đạn đâm vào thịt. Liều dùng 2030g dạng thuốc sắc; dùng ngoài giã vỏ tươi đắp. Nhựa bứa dùng trị bỏng. Đơn thuốc: -Viêm dạ dày ruột, kém tiêu hoá: Vỏ cây Bứa sắc đặc cô đặc lấy 50%; hàng ngày uống 30ml.

-Bỏng: Nhựa bứa pha dầu làm thành cao lỏng, bôi ngày 1- 2 lần.

1.1.3. Phân loại bứa 1.1.3.1. Bứa mọi Bứa mọi-Garcinia harmandii Pierre, thuộc họ bứa-Clusiaceae.

Mô tả: Cây gỗ cao 6- 10m, phân nhánh nhiều từ gốc, có vỏ vàng. Lá thuôn, hình trứng ngược hay hình ngọn giáo ngắn, có góc ở gốc, có mũi nhọn

8

ở đầu, dài 4-10cm, rộng 15- 30mm, cuống ngắn (hình 1.2). Hoa vàng, hầu như không cuống; hoa đực xếp thành nhóm 3- 6, hoa cái đơn độc. Quả có đường kính 10- 20mm, màu tía, hơi dẹp giữa các hạt. Ra hoa tháng 2- 3, kết quả vào tháng 3.

Bộ phận dùng: Vỏ Cortex Garciniae.

Nơi sống và thu hái: Sống phổ biến ở miền Nam Việt Nam, Campuchia và Nam Lào. Ở nước ta cây mọc hoang trong rừng ở độ cao thấp từ Khánh Hoà tới Đồng Nai, Tây Ninh.

Công dụng: Quả có nạc ngon, mùi thơm, vị ngọt, dùng ăn được. Vỏ chát, được nhân dân Campuchia dùng ăn với trầu. Người ta còn phối hợp với nhiều vị thuốc khác để trị ỉa chảy.

Hình 1.2. Cây bứa mọi ở Quảng Ngãi

9

1.1.3.2. Bứa mủ vàng

Hình 1.3. Hoa, lá, quả của cây bứa mủ vàng Bứa mủ vàng-Garcinia xanthochymus Hook.f.ex J.Anderson, thuộc họ bứa- Clusiaceae.

Mô tả: Cây gỗ lớn; nhánh non vuông, vàng hay nâu. Lá có phiến thuôn, to, dài đến 30cm, rộng 6- 8cm, dày bóng; gân phụ nhiều, cách nhau khoảng 1cm; cuống ngắn. Hoa ở nách lá già, rộng cỡ 1cm, cuống 2cm; hoa đực có 5 lá đài, 5 cánh hoa trắng, cao 8mm; 5 bó nhị mà mỗi bó có 3- 5 bao phấn,có nhụy lép; hoa cái có bao hoa như hoa đực, nhị lép, bầu 5 ô. Quả tròn, to 9cm (hình 1.3).

Bộ phận dùng: Lá, thân, nhựa, mủ và quả.

Nơi sống và thu hái: Loài phân bố ở Ấn Độ, Nêpan, Trung Quốc và Việt Nam. Ở nước ta, cây mọc ở rừng miền Nam. Tính vị, tác dụng: Lá, thân, mủ có vị đắng, chua, tính mát; có tác dụng sát trùng. Quả giải nhiệt, lợi mật.

10

Công dụng: Ở Ấn Độ, quả được dùng như quả loài Garcinia indica Chois làm thuốc chống bệnh thiếu vitamin C. Ở Trung Quốc, để trị đỉa vào mũi, người ta lấy mủ tươi với liều lượng thích hợp nhỏ vào xoang mũi, đỉa sẽ bò ra.

1.1.3.3. Bứa nhà

Hình 1.4. Cây bứa nhà ở Quảng Ngãi Bứa nhà- Garcinia cochinchinensis Choisy, thuộc họ Măng cụtClusiaceae.

Mô tả: Cây cao 10- 15m, vỏ ngoài màu đen, phía trong màu vàng. Cành non vuông, về sau tròn. Lá thuôn nhọn ở gốc, dài 8- 15cm, rộng 3- 4,5cm (hình 1.4). Hoa đực có từ 1 đến 5 hoa, mọc thành chùm ở nách lá, màu vàng, có nhiều nhị; hoa lưỡng tính không cuống, thường mọc đơn độc; nhị xếp

11

thành 4 bó, mỗi bó 7- 12 bao phấn; bầu 6- 10 ô, thường là 8. Quả có đường kính 4cm, hình trứng; vỏ quả nạc, có cơm hơi đỏ bao quanh hạt. Ra hoa vào tháng 4- 5.

Nơi sống và thu hái: Cây mọc chủ yếu ở rừng thưa từ Quảng Trị trở vào . Thu hái vỏ, lá quanh năm.

Công dụng: Lá và vỏ quả thường dùng nấu canh chua. Quả chín dùng để ăn hoặc làm nước giải khát; áo hạt có vị chua ngọt. Vỏ thường dùng trị dị ứng, mẩn ngứa và bệnh ngoài da. Lá giã nát đắp trị sâu. Búp non nhai ăn chữa động thai. Đơn thuốc: Dị ứng, mẩn ngứa, dùng vỏ bứa 20- 30g, nước 500ml, sắc còn 150ml, chia 2- 3 lần uống trong ngày.

1.1.3.4. Garcinia cowa Roxb Tên khoa học là Garcinia pedunculata Roxb, thông thường gọi là tai chua. Cây nhỏ mọc thẳng, thân thường có nhiều u lồi. Cành nhiều và mảnh, thường nằm ngang, đầu hơi rủ xuống. Lá hình trứng ngược, đầu lá tù, đuôi lá hình nêm, dài 7- 17cm, rộng 2,5- 6cm, gân lá rõ ở cả hai mặt, đường gân phụ nối liền với nhau ở mép, cuống lá mảnh dài gần 2cm. Cụm hoa đực có 3- 8 hoa xếp hình tán, hoa có cuống dài 1cm, tràng 4 cánh dày, nhị xếp thành một khối, chỉ nhị ngắn. Hoa lưỡng tính đơn lẻ hay tụ thành 2- 3 lá mọc ở nách lá, gần như không cuống, nhị họp thành 4 bó, mỗi bó 1- 8 thuỳ hình nêm. Quả mập hình cầu dẹt (hình 1.5), trên có những múi nổi rõ . Mọc hoang tại nhiều khu rừng miền Bắc nước ta và ở Quảng ngãi, nhiều nhất ở Phú Thọ, Yên Bái, Lào Cai, Hoà Bình, Tuyên Quang, Hà Giang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn. Một số vùng người ta trồng ven đường làng để lấy quả ăn và dùng trong công nghệ. Mùa hoa vào các tháng 3- 4, mùa quả vào tháng 7- 8.

Thường hái về bỏ hạt, thái thành từng miếng mỏng phơi hay sấy khô, có màu đen nâu nhạt, hơi mềm. Trong nhân dân tai chua chủ yếu được dùng để nấu

12

canh có vị chua. Một số nơi nhân dân sắc uống chữa sốt, khát nước. Ngày uống 6- 10g. Trước đây, khi chưa có axit xitric tổng hợp, người ta xem tai chua là axit xitric thiên nhiên đáng quý. Theo lời phát biểu của một giám đốc nhà máy nhuộm Zurich (Đức) thì cao quả tai chua dùng trong in vải vừa giữ cho màu bền, vừa không hại vải cho nên dù cùng một giá trị với axit xitric hay với giá trị cao hơn một chút thì việc sử dụng tai chua trong nhuộm in trên vải vẫn tốt hơn. Điều này giải thích kinh nghiệm trong dân gian ta dùng tai chua làm chất cắn màu trong nhuộm vải, lụa, nhuộm cói, đan chiếu; và do có tính axit nhẹ nên còn sử dụng trong việc làm bóng các kim loại vàng, bạc.

Hình 1.5. Quả tai chua ở Quảng Ngãi

13

1.1.3.5. Garcinia cambogia Loại cây có kích thước nhỏ hoặc trung bình với các nhánh mọc tròn đối xứng như vương miện, nằm ngang hoặc rủ xuống; lá của nó có màu xanh đậm và bóng, hình elip, dài 5- 12cm và rộng 2- 7cm; quả hình trứng, đường kính 5cm, màu vàng hoặc đỏ khi chín với 6- 8 rãnh, mỗi quả có từ 6 đến 8 hạt được bao quanh bởi áo hạt mọng nước. Cây bứa thường tìm thấy tại các cánh rừng thường xanh phía tây Ghats, phía Nam của Konkan đến Travancore- Ấn Độ và trong rừng Shola của Nilgiris với độ cao 1828m so với mực nước biển. Nó ra hoa vào suốt mùa nắng và trái chín kéo dài trong mùa mưa. Hạt của Garcinia cambogia chứa 31% dầu béo, có thể ăn được. Quả của Garcinia cambogia có nhiều axit, có thể ăn sống. Nước sắc của vỏ quả có thể chữa bệnh thấp khớp và bệnh đau đường ruột. Nó cũng được sử dụng làm thuốc thú y để rửa các bệnh ở mồm gia súc. Tại Ceylon- Ấn Độ, vỏ quả khô của G. cambogia được sử dụng với muối trong muối cá. Vỏ quả khô rất có giá trị, nó được sử dụng như là gia vị tạo mùi trong cari để thay thế me hoặc chanh.

Hình 1.6. Lá, quả Garcinia cambogia

14

1.1.3.6. Garcinia indica Là cây thường xanh, mảnh khảnh với các cành rủ xuống; lá hình trứng hoặc hình thuôn ngọn giáo, dài từ 6- 9cm và rộng 2,5- 4cm, màu xanh đậm ở mặt trên và màu xanh nhạt ở phía dưới. Quả có hình cầu, đường kính từ 2,54cm, có màu tím đậm khi chín và được bao quanh từ 5- 8 hạt lớn (hình 1.7).

Cây này tìm thấy tại rừng nhiệt đới ở miền Tây Ghats, từ phía nam Konkan đến Mysore, Coorg, và Wynaad- Ấn Độ. Nó ra hoa từ tháng 11- 12, quả chín vào tháng 4- 5. Rễ chắc chắn. Hạt có dầu ăn được, trong thương mại nó được biết đến như là bơ Kokam. Quả Garcinia indica mùi hương dễ chịu và có vị chua ngọt. Nó được sử dụng làm hương vị chua trong nấu carri cũng như được dùng làm sirô trong mùa nóng. Quả của nó cũng có thể chữa giun sán, bệnh trĩ, bệnh lỵ, khối u, vết thương, bệnh đau tim. Sirô từ nước bứa là thức uống rất được ưa thích. Vỏ quả khô có giá trị, nó được sử dụng như là gia vị tạo mùi trong ca ri để thay thế me hoặc chanh.

Hình 1.7. Cây, quả Garcinia Indica và Kokam

15

1.1.3.7. Garcinia atro Viridis Cây có kích thước trung bình, cao 9- 15m, tìm thấy ở phía đông bắc quận Assam-Ấn Độ. Lá dài 15- 23cm và rộng 5- 7,6cm, dày như da, nhẵn, mũi nhọn, và phần đuôi thon nhỏ; hoa ra theo từng quí, nhụy đơn và rộng.

Quả màu vàng cam, gần giống hình cầu, vỏ có các đường rãnh sâu và khá mỏng, cơm màu trắng đục với các hạt bao quanh (hình 1.8). Vỏ quả của Garcinia atroViridis cũng chứa nhiều axit và có thể ăn sống, nhưng vị của nó rất hấp dẫn khi ninh nhừ với đường. Tại Malay- Ấn Độ, vỏ quả gần chín được phơi khô để bán làm gia vị nấu cari thay cho me hay làm gia vị kho cá. Quả này cũng được sử dụng làm thuốc nhuộm với nhôm trong nhuộm tơ lụa. Nước sắc từ quả và rễ được sử dụng để chữa bệnh đau tai.

Hình 1.8. Hoa, lá, quả và cây Garcinia atro Viridis

16

1.1.3.8. Garcinia dulcis Một loại cây thường xanh, cao 30-40 feet, mọc nhiều ở Malaysia. Nó được đưa tới Ấn Độ và được trồng ở các khu vườn bách thảo. Quả chứa axit xitric và thích hợp để làm mứt hoặc đóng hộp (hình 1.9). Hạt dùng làm thuốc chữa bệnh ngoài da. Vỏ cây được dùng ở Java để nhuộm thảm, chiếu,…

Hình 1.9. Quả Garcinia dulcis 1.1.3.9. Garcinia hombroniana

Cây nhỏ giống như Garcinia mangostana, quả màu đỏ (hình 1.10), đường kính 1-2 inch, tìm thấy ở đảo Nicobar và viễn đông Malaysia, chủ yếu ở những vùng ven biển đầy cát và đá. Thịt quả bao quanh hạt có thể ăn được.

Nó có vị chua và mùi hương hấp dẫn. Ở Malaysia, người ta dùng rễ và lá để trị mẩn ngứa. Thân cây dùng làm gỗ xây nhà và làm mái chèo.

Hình 1.10. Quả Garcinia hombroniana

17

1.1.3.10. Garcinia echinocarpa

Cây sum sê, cao 4-50 feet, quả có màu đỏ sẫm, chứa 1-3 hạt và vị chua (hình 1.11), tìm thấy ở rừng nhiệt đới ẩm miền Nam Travancore và Tinnevelly ở độ cao 3000-5000 feet so với mặt nước biển và ở Ceylon. Hạt của Garcinia echinocarpa thu được chất dầu đặc, nhớt (chiếm 64,4% khối lượng nhân và 49,6% khối lượng hạt), được làm đông đặc chậm trong khoảng 260C thành chất béo có màu nâu nhạt.

Hình 1.11. Lá, hoa của Garcinia echinocarpa 1.1.4. Dẫn xuất của HCA 1.1.4.1. Hoá học của (-)-HCA [8], [9], [12], [14]

Lewis và Neelakantan đã chiết axit chủ yếu trong vỏ quả G.cambogia và xác định (-)-HCA là chất chính và được nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ. Sự xác định và tách axit hidroxycytric (HCA) bằng giấy Whatman No.1 được thực hiện bằng cách sử dụng n-butanol/axit axetic/nước (4:1:5) và

18

n-propanol/axit focmic/nước (4:1:5). Các vạch được xác định bằng phun metavanadate 5% . Kiềm hoá axit bằng cách trộn với lượng kiềm dư và cho đi qua cột nhựa trao đổi ion (Zeocarb 215). Kết quả rửa cho thấy chỉ có vạch (Rf = 0,34) có giá trị thấp tương ứng với (-)-HCA tự do. Trong nồng độ nước rửa cũng còn có vạch cao hơn (Rf = 0,46) đó chính là lacton. Nước chiết từ quả cho thấy có 2 vạch axit nổi trội trong sắc ký với 2 hệ dung môi khác nhau.

Trong trường hợp chuẩn độ dịch chiết này bằng kiềm, sử dụng phenolphtalein làm chất chỉ thị, thu được 2 điểm tới hạn khác nhau, trong môi trường lạnh và sau đó đun nóng, điều này cho thấy đó là đặc điểm của lacton. Hai vạch sắc ký đã được xem như là axit hydroxycitric và lacton của nó (hình 1.12 và 1.13). Điều này cũng chứng tỏ rằng 2 vạch trong sắc ký cũng là của axit γhydroxy và lacton của nó chứ không phải là của axit tactaric và axit citric.

Hoá học lập thể: Axit hidroxycytric (axit 1,2- dihydroxy propan- 1,2,3- tricacboxylic) có 2 trung tâm bất đối; vì vậy, có thể tồn tại 2 cặp đồng phân lập thể hoặc 4 đồng phân khác nhau (Hình 1.12). Martius và Maue đã tổng hợp thành công 4 đồng phân lập thể của hidroxycytric . Một trong các đồng phân này được tìm thấy trong Garcinia và một đồng phân nữa được tìm thấy trong loài cây dâm bụt (Hibiscus). Cấu hình chính xác của lacton axit hidroxycytric , axit hibiscus và axit garcinia, đã được xác định lần lượt là axit (2S, 3R)- và (2S, 3S)-2hydroxycitric-2,5- lacton (Hình 1.13). Cấu hình chính xác được xác định bằng qui luật Hudson, chiều quay quang học của ánh sáng phân cực, vòng tròn của ánh sáng lưỡng sắc, và tính toán góc quay của phân tử. Glusker và những cộng sự đã báo cáo cấu trúc và cấu hình chính xác của muối canxi hydroxycitrat và (-)-HCA lacton bằng chụp X-quang tinh thể.

19

COOH

COOH HO

C

H

HO

C

COOH

H

C

COOH

H HOOC H

Axit (-)-hy®roxy xitric (I)

H

C

OH

C

COOH

Axit (+)-hy®roxy xitric (II) COOH

COOH

HOOC

OH

H

H

HO

C

C

H

C

OH

C

COOH

H

C

OH

HO

C

COOH

H

C

COOH

H

H

Axit (+)-allo-hy®roxy xitric (III)

Axit (-)-allo-hy®roxy xitric (IV)

Hình 1.12. Cấu trúc đồng phân của axit hidroxycytric

O

COOH

COOH

C

H

C

H

HO

C

COOH

C

OH

H

C

C=O

C

C=O

H

Axit (-)-hy®roxy xitric lacton

HOOC O

H

H

Axit (+)-allo-hy®roxy xitric lacton

Hình 1.13. Cấu trúc của axit hidroxycytric lacton

20

Các đặc điểm của HCA được mô tả ở bảng 1.1 như sau: Bảng 1.1. Mô tả các đặc điểm của HCA Nguồn thực vật

Garcinia cambogia

Họ thực vật

Họ bứa (họ măng cụt), Guttiferae Axit (-)-hidroxycytric ; axit 1,2-dihydroxy-

Các tên gọi khác nhau

1,2,3-propan tricacboxylic; axit Garcinia; axit 1,2- di hydroxy propan-1,2,3- tricacboxylic

CAS No.

27750-10-3 [(-)-HCA]

Công thức phân tử

C6H8O8 [(-)-HCA]

Khối lượng phân tử

208 [(-)-HCA]

Trạng thái vật lý

bột

Màu

Kem, trắng

Mùi

Không mùi

Vị

Vị chua axit

Lưu giữ

Trong lọ chịu được hơi ẩm, không khí, ánh sáng.

Gần đây, Jayaprakasha và Sakariah đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định axit hữu cơ trong quả của G.cambogia, mẫu chiết thương mại của G.cambogia và lá, vỏ quả của G.indica. Trong phương pháp HPLC này, dịch chiết pha loãng có thể xác định định lượng mà không cần cô đặc, sấy. Đây là điểm thuận lợi để có thể định lượng (-)-HCA và lacton của nó một cách riêng biệt.

Tác dụng của HCA: 1. HCA có tác dụng ngăn chặn quá trình tích mỡ và cải thiện bilance mỡ máu. HCA kiềm hãm quá trình chuyển hóa lượng đường thừa trong cơ thể

21

thành mỡ, giúp ngăn chặn quá trình béo phì, đặc biệt đạt hiệu quả cao đối với những người dư cân có chế độ ăn quá nhiều bột đường. Không những giúp giảm cân, HCA còn làm giảm các loại mỡ xấu cho sức khỏe như tryglycerid, LDL cholesterol, cholesterol toàn phần và tăng HDL cholesterol là loại mỡ có tác dụng bảo vệ thành mạch.

2. HCA làm gia tăng nồng độ Serotonin, một chất dẫn truyền thần kinh chính yếu có vai trò kiểm soát sự thèm ăn và cảm xúc. HCA kiềm hãm cảm giác thèm ăn, đồng thời cải thiện tâm lý phiền muộn ở người dư cân, béo phì.

3. HCA làm gia tăng quá trình tổng hợp glycogen và tăng độ oxy hóa, đốt cháy mỡ thừa. Ở người dùng HCA, lượng đường thừa trong cơ thể sẽ không chuyển sang dạng mỡ dự trữ mà sẽ được tổng hợp thành glycogen dự trữ tại gan và cơ. Khi mức glycogen bão hòa, dưới tác dụng của HCA, lượng đường thừa này sẽ kích hoạt quá trình chuyển axit béo vào ty lạp thể để đốt cháy tạo năng lượng cho tế bào, làm giảm lượng mỡ thừa dự trữ trong cơ thể.

Trong suốt những năm 1970, các nhà khoa học tại trường đại học Brandeis và ở Hoffman LaRoche đã chứng minh rằng HCA tổng hợp khi trộn lẫn với khẩu phần ăn, đã có hiệu quả kiềm hãm sự tăng cân rõ rệt ở chuột. Các nhà nghiên cứu lưu ý rằng chuột được điều trị với HCA có khuynh hướng ăn ít; mức tiêu thụ được kìm hãm bởi lượng HCA đưa vào tối ưu là 10% hoặc hơn, đó là khi HCA tạo thành 1% hoặc hơn trong khẩu phần ăn kiêng.

Cơ chế mà HCA có ảnh hưởng đến tăng cân trước đây không được biết đến một cách rõ ràng, các nhà khoa học suy đoán rằng hiệu quả ngăn cản sự thèm ăn của HCA được áp dụng không xuyên suốt hoạt động của hệ thống hệ thần kinh trung tâm (CNS), nhưng cũng ảnh hưởng khá trực tiếp đến các quá trình chuyển hóa của cơ thể.

22

Một trong cơ quan họat động chuyển hóa nhiều nhất trong cơ thể là gan. Một chức năng quan trọng của gan là bảo đảm rằng nồng độ glucozơ trong máu bảo quản đủ để cung cấp nhu cầu năng lượng của cơ thể. Gan có thể bảo quản đường trong chế độ ăn dưới dạng glycogen polisaccarit, và giải phóng glucoz khi mức độ đường trong máu thấp. Gan cũng có thể tổng hợp glucoza với một quy trình phức tạp được biết đến là sự tạo thành glucoza, từ amino axit hay axit lactic như là vật chất khởi đầu. Lượng glucoza mới tổng hợp này có thể được giải phóng vào dòng máu để đáp ứng nhu cầu năng lượng của các mô trong cơ thể hoặc có thể được bảo quản như là glucogen cho sau này dùng đến.

Mối liên hệ trực tiếp giữa gan và CNS là theo dõi mức độ glucoza và glucogen trong gan. Mức độ glucogen cao, cũng như kết quả của nguồn cung cấp lượng lớn glucozơ, được chuyển dịch bởi CNS thành trạng thái của cảm giác no nê, mà kết quả là giảm sự thèm ăn.

Do glycogen được gia tăng trong gan giúp tạo cảm giác no, hiệu quả của HCA đối với quá trình tạo thành glucoza ở gan chuột đã được nghiên cứu.

Người ta đã tìm ra rằng, tốc độ sự tạo thành glucoza từ lactat hoặc amino axitalanin khoảng chừng gấp đôi đối với những con chuột được điều trị với HCA. Kết quả này đã cung cấp bằng chứng để chứng minh ý kiến cho rằng HCA gây nên sự ngăn cản quá trình thèm ăn, được theo dõi qua con đường thay đổi tốc độ tạo thành glucoza.

Tuy nhiên, điều đó dường như không chắc chắn rằng việc giảm lượng thức ăn đưa vào có thể chi trả hoàn toàn cho sự giảm cân đáng kể được tìm thấy trong những con chuột được điều trị với HCA. Ví dụ, trong một nghiên cứu, sự giảm mức tiêu thụ thực phẩm thu đươc trong suốt chu kì 80 ngày nghiên cứu chỉ khoảng 4% và tuy nhiên những con chuột giảm 78% cân nặng

23

hơn sự điều kiển trong suốt chu kỳ này. Những nghiên cứu khác, cung cấp những kết quả gây chấn động ít hơn, đề nghị rằng sự giảm cân được so sánh mở rộng là không cân xứng với sự giảm mức tiêu thụ thức phẩm.

Bởi vì không có sự thống nhất giữa việc giảm cân đáng kể và việc ngăn cản sự thèm ăn ít ỏi, nó được mặc nhiên công nhận là HCA áp dụng cơ chế mà tăng việc đốt chất béo, có thể làm trọng lượng cơ thể giảm, trong điều kiện ảnh hưởng quá trình tạo glucoza.

Quá trình đốt cháy chất béo hoặc oxi hóa thúc đẩy một vai trò nổi bật trong quá trình chuyển hóa của gan. Gan chuyển hóa thành cách hoạt động khoảng trên 3/4 tổng lượng O2 tiêu thụ của cơ thể đối với một đối tượng lúc đứng yên, không hoạt động. Những nhu cầu năng lượng cần thiết của gan là sự oxi hóa chất béo. Lượng chất béo trong chế độ ăn được hấp thụ bởi những tế bào gan, mà oxi hóa hay đốt cháy nó cho năng lượng . Những chất béo được vận chuyển từ tế bào chất đến gan bằng cách liên kết chúng lại thành sự vận chuyển đặc biệt phân tử L- crnitine (C7H15NO3). Phản ứng này xảy ra dễ dàng nhờ ezim carnitine acyltransferase.

Carnitine acyltransferase bị ức chế bởi malonyl coenzim A (CoA), có thể chứa đựng từ việc chuyển đổi của axetyl CoA. Malonyl CoA, không những ức chế tiến trình đốt cháy mỡ mà còn gia tăng sự tổng hợp chất béo trong cơ thể, do nó là chất đầu trực tiếp tổng hợp chất béo và cholesterol.

Acetyl CoA được vận chuyển đến tế bào chất để sử dụng trong hoạt động sinh hóa của nó. Tuy nhiên nó không thể được vận chuyển đến tế bào chất trước khi nó được chuyển đổi thành axit citric. Theo cách đó, axit citric là dạng có thể vận chuyển được của axetyl CoA. Axit xitric một khi trong tế bào chất, được chuyển đổi thành axetyl CoA dưới sự giúp đỡ của enzim citrat liaza.

24

HCA được tìm thấy là một chất ức chế có khả năng cạnh tranh cực kỳ hiệu nghiệm với citrat liaza. Ái lực của enzim đối với HCA lớn hơn 1000 lần ái lực của enzim đối với axit citric. Hoạt tính này chỉ có ở HCA dạng axit tinh khiết, chứ không phải dạng lacton.

Tầm quan trọng của việc ức chế citrat lyaza bởi HCA là không có mặt citrat lyaza hoạt động, lượng axetyl CoA vẫn có thể tiến tới tế bào chất. Điều này lần lượt sẽ giới hạn sự có mặt của malonyl CoA và sự tổng hợp chậm chất béo và cholesterol, trong khi quá trình tăng lượng chất béo sụt giảm hoặc quá trình oxi hóa chất béo.

Sự hoạt hóa của quá trình oxi hóa chất béo trong gan cũng có xu hướng kích thích sự tổng hợp glucoza, chủ yếu do bởi sự giảm hoạt động của enzim chủ chốt pynirate carboxylase. Điều này có thể cung cấp thêm nguồn dự trữ glycogen trong gan và gửi một thông điệp an toàn đến trung tâm não bộ.

1.1.4.2. Muối của HCA [10], [11], [13], [15], [16], [17], [18] Vỏ quả của G.cambogia và G.indica chứa 20-30% (-)-HCA. Vì vậy, nó là nguồn chủ yếu chứa (-)-HCA. Bên cạnh đó, (-)-HCA dễ bị lacton hoá trong quá trình hoá hơi và cô đặc, tạo ra nhiều dẫn xuất bền của (-)-HCA, cụ thể là: lacton, este, muối natri, kali, canxi và magie của (-)-HCA. Trong mẫu chiết thương mại của G.cambogia, (-)-HCA tồn tại dưới dạng muối kali bởi vì tính chất bền của nó. (-)-HCA tự do có thể thu được dễ dàng từ mẫu chiết thương mại của G.cambogia, bằng cách cho dung dịch muối kali hoà tan trong nước đi qua cột trao đổi cation. Majeed và những cộng sự đã báo cáo cách tạo muối kalihydroxycitrat từ Garcinia. Nó bao gồm quá trình chiết (-)-HCA từ quả Garcinia bằng cách sử dụng rượu alkyl, dịch chiết trộn lẫn được xử lý bằng KOH và

kết tủa kalihydroxycitrat hình

thành lắng xuống

đáy.

25

Balasubramanyam và những cộng sự tường thuật lại cách tạo thành cặp muối kim loại hoà tan nhóm IA và IIA của (-)- HCA. Nó bao gồm (-)-HCA chiết bằng nước và xử lý dịch chiết với các loại hyđroxit và clorua kim loại khác nhau để được cặp muối kim loại.

Ibnusaud và những cộng sự đã báo cáo cách chiết tách axit Garcinia từ vỏ quả tươi hoặc khô của G.cambogia, G.indica và G.atroViridis. Nó bao gồm 4 đến 5 cách chiết quả Garcinia bằng cách nấu với nước trong vòng 20 giờ. Hỗn hợp dịch chiết được cô đặc, xử lý bằng metanol để loại bỏ pectin và được lọc sạch. Phần nước lọc được xử lý bằng dung dịch NaOH ở 800C nhằm thu được natrihydroxycitrat.

H H

H O

C

C O O C a

H O

C

H

C O O

C

H O

C

H O

C

C O O

C

C O O

M g

C O O

H

H H

C a

H O

C

C O O

H O

C

C O O

C O O

H H

M g

H O

C

C O O

H O

C

C O O

H

C

C a H

C

C O O

M g

H

H

H

H COOK

HO

C

HO

C

COOK

C

COOK

H

C O O

H

HO

C

HO

C

H

C

COONa

COONa

COONa

H

Hình 1.14. Cấu thức thông thường các muối một kim loại Balasubramanyam và những cộng sự đưa ra phương pháp tạo thành cặp

26

muối kim loại hòa tan nhóm IA và IIA của (-)-HCA. Phương pháp này bao gồm (-)-HCA chiết bằng nước và xử lý dịch dịch chiết với các loại hydroxit và clorua kim loại khác nhau để được cặp muối kim loại, sau đó làm kết tủa muối tan hai kim loại bằng cách thêm dung môi phân cực để phân lập muối tan hai kim loại nhóm IA và IIA của (-)-HCA. Dung môi phân cực được sử dụng là dung dịch axeton 80%. Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm IA và IIA được thể hiện ở hình 1.15.

H H

C

COO X

OH

C

COO

HO

C

COO

Y

H

Hình 1.15. Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm IA và IIA Trong đó, X là kim loại nhóm IA như: Li, Na, K, Rb, Cs hay Fr. Y là kim loại nhóm IIA như: Be, Mg, Ca, Sr, Ba hay Ra. Tỷ lệ khối lượng của X chiếm từ 1,5 đến 51,0%. Tỷ lệ khối lượng của Y chiếm từ 2,0 đến 50,9%. Tỷ lệ khối lượng của HCA chiếm từ 31,0 đến 93,0% tùy theo khối lượng phân tử của X và Y. Nếu X là Na+, Y là Ca2+ thì phần trăm khối lượng của natri là 8,58%, của canxi là 14,92% và của (-)-HCA là 76,50%.

Gokaraju và các cộng sự công bố dạng muối hai kim loại của (-)-HCA với các kim loại nhóm II. Quá trình pha chế những muối hai kim loại nhóm II bao gồm việc thêm một hợp chất kim loại nhóm II vào dung dịch (-)-HCA, tiếp theo thêm một dung dịch hợp chất kim loại nhóm II khác. Muối hai kim loại được thu lại bằng cách loại bỏ nước khỏi hỗn hợp phản ứng dưới áp suất

27

thấp hay sấy khô. Sau đó, muối hai kim loại được chia tách khỏi hỗn hợp phản ứng bằng cách thêm những dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn với nước và lọc. Những dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn với nước là ancol, axeton, axetonitrin, dioxan, tetrahidrofuran hay hỗn hợp của chúng. Những muối hai kim loại này có hiệu quả như là những chất bổ sung ăn kiêng và trong thức uống. Chúng có tác dụng giảm béo ở động vật có vú, chữa trị bệnh loãng xương, được sử dụng trong khẩu phần hay thức uống hay những chất bổ sung dinh dưỡng. Công thức của chúng đã được kiểm tra bằng phổ cộng hưởng từ 1

H NMR và 13C NMR. Những muối hai kim loại của (-)-HCA được thể hiện trong công thức

chung như sau:

HO

COO

HO

COO

X HO

HO

COO

COO

X

Y

COO

OCO

Hình 1.16. Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm II Trong đó: X, Y được lựa chọn độc lập từ những kim loại thuộc nhóm II (IIA và IIB) của bảng tuần hoàn. Những kim loại nhóm II và được lựa chọn độc lập từ Be, Mg, Ca, Ba hay Ra (nhóm IIA), Zn, Cd hay Hg (nhóm IIB) trong các hợp chất cacbonat, oxit hay hydroxit của chúng.

Gokaraju và các cộng sự cũng công bố công thức của muối ba kim loại của (-)-HCA. Muối ba kim loại phổ biến là muối ba kim loại của canxi, magie hoặc kẽm và kali. Nghiên cứu này bao gồm quá trình tạo muối ba kim loại

28

bằng việc thêm những lượng xác định các dung dịch hợp chất của các kim loại mong muốn vào dung dịch (-)-HCA. Dịch chiết từ vỏ quả Garcinia được sử dụng như là một vật liệu bắt đầu. Những hợp chất thu được của nghiên cứu này không vị, không mùi và tan tốt trong nước và cũng có chức năng chữa bệnh béo phì. Chúng có thể được sử dụng trong khẩu phần ăn hằng ngày hay thức uống. Công thức của chúng được kiểm tra bằng phổ cộng hưởng từ 1HNMR và C13-NMR. Muối ba kim loại của (-)-HCA có công thức thông thường như sau:

HO

OCO

X

OCO

OH

HO

OCO

Y

OCO

OH

COOZ

COOZ

Hình 1.17. Công thức thông thường muối ba kim loại Trong đó: X và Y được lựa chọn từ Kẽm hay những kim loại nhóm IIA và Z được lựa chọn từ những kim loại nhóm IA. Samuel và các cộng sự đã nghiên cứu các muối phức tạp ba, bốn và năm kim loại của (-)-HCA, thành phần cấu tạo và những phương pháp tổng hợp chúng, với các muối chứa ít nhất 3 kim loại khác nhau được lựa chọn từ kẽm, magie, natri, kali và canxi. Trong thành phần của muối có chứa 2 phân tử của axit hidroxycytric . Thành phần (-)-HCA trong các muối trên chiếm 40 - 75% khối lượng. Trong các muối, có cả lactone của (-)-HCA. Quá trình tổng hợp muối ba hay bốn kim loại của (-)-HCA có chứa ít nhất 3 kim loại khác nhau bao gồm các bước: Chuẩn bị axit hidroxycytric dạng lỏng, cho axit

29

hidroxycytric dạng lỏng phản ứng với hỗn hợp các hợp chất của ít nhất 3 kim loại trong số các kim loại: kẽm, magie, natri, kali và canxi trong một dung dịch, sấy khô dung dịch để thu muối ba, bốn kim loại của axit hidroxycytric .

Nhiệt độ của quá trình sấy khô từ 150 đến 20000C. Các điểm kĩ thuật của kali hydroxycitrat được dùng với tên thương mại là sản phẩm Citrin ® - K : Công thức phân tử: C6H5O8K3.H2O Khối lượng phân tử: 340,41 Sự mô tả: Chất bột có màu biến đổi từ be đến tái Sự hòa tan: Tan trong H2O, axit và dung dịch rượu. Không tan trong các dung môi như: CHCl3, C6H6...

Sự mất mát khi làm khô: 3% ÷ 6% pH của dung dịch 5% trong H2O: 7 ÷ 9 Sự quay đặc biệt: -250C ÷ -180C đối với chất khan.

Lượng kali: ≥ 30% trọng lượng đối với chất khan Lượng HCA: ≥ 50% đối với chất khan Lượng lacton (HPLC): < 2% trọng lượng Thí nghiệm với vi khuẩn: Tổng các bản đếm, E.Coli, Salmonella, những loài nấm men và nấm mốc được xem xét như là mỗi phương pháp độc lập được mô tả trong “Những phương pháp phân tích pháp định- sự kết hợp của các nhà hóa học phân tích pháp định” (xuất bản lần thứ 14, 1990)

30

Giới hạn được cho như sau: Tổng các bản đếm

10000 cfu/g

E.Coli

Vắng mặt

Salmonella

Vắng mặt

Nấm men/nấm mốc

1000 cfu/g

Các điểm kĩ thuật của sản phẩm muối magiehydroxycitrat: Công thức phân tử: C12H10O16Mg3 Sự mô tả: Chất bột có màu biến đổi từ vàng nhạt đến trắng, không có mùi, tan trong nước. pH của dung dịch 5% trong nước: 9-11 Bảo quản: Ở nhiệt độ phòng, nơi khô ráo thoáng mát Shrivastava và các cộng sự mô tả dược tính của muối magie của (-)HCA trong điều trị bệnh. Muối magie của (-)-HCA được chứng minh là hợp chất có dược tính trong phương pháp chữa trị bệnh tim mạch và những chất hỗ trợ tim mạch. Muối magie của (-)-HCA còn được chứng minh là sản phẩm ăn kiêng, sản phẩm dinh dưỡng và là mỹ phẩm. Magiehydroxycitrat được chứng minh là có hiệu quả trong phương pháp chữa trị chứng tăng huyết áp, nhiễm mỡ trong tế bào của mạch cơ trơn, bệnh nhiều cholesterol trong máu.

Các điểm kĩ thuật của sản phẩm muối canxihydroxycitrat: Công thức phân tử: C12H10O16Ca3 Sự mô tả: chất bột có màu trắng hoặc trong, không có mùi, tan trong nước. pH của dung dịch 5% trong nước: 9,5 – 11 Lượng canxi (AAS): 17,22% Lượng HCA (HPLC): 72,5%

31

Lượng H2O: 10% Lượng lacton: < 0,2% Bảo quản: Ở nhiệt độ phòng, nơi khô ráo, thoáng mát.

1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP KĨ THUẬT [3], [7] 1.2.1. Các phương pháp phân huỷ mẫu phân tích Muốn phân tích một chất trong một đối tượng nào đó, trước hết ta phải chuyển chất đó vào dung dịch, đặc biệt với đối tượng phân tích là chất rắn. Có 2 cách chuyển chất rắn thành dung dịch: phương pháp ướt và phương pháp khô.

Phân loại: 1. Phương pháp ướt 2. Phương pháp khô 3. Phương pháp thuỷ nhiệt 4. Phương pháp clo hoá 5. Phương pháp vô cơ hoá các chất hữu cơ. Để xác định các nguyên tố vô cơ trong các hợp chất hữu cơ ở thực vật, động vật, muốn chuyển các hợp chất hữu cơ vào dung dịch, trước hết ta phải chuyển các chất đó thành chất vô cơ. Cách đó gọi là vô cơ hoá.

Vô cơ hoá bằng lối khô: Cách này thường dùng và khá đơn giản. Ta đem nung mẫu ở khoảng 500-6000C trong chén platin hoặc thạch anh, các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi. Cần chú ý rằng trong quá trình nung sẽ mất một số nguyên tố do bay hơi như các halogen, thuỷ ngân, lưu huỳnh...Cũng có thể chỉ cần đốt cháy các chất hữu cơ trong bình kín, dưới áp suất cao hoặc phân huỷ bằng cách nung chảy như đối với chất vô cơ, nhưng phải thêm chất oxi hoá như: KNO3, Na2O2...

Vô cơ hoá bằng lối ướt: Cách này ít được dùng vì không thuận tiện, nó chỉ được dùng khi không dùng lối khô được. Có thể phân huỷ chất hữu cơ

32

bằng H2SO4 đặc, hỗn hợp H2SO4 + HNO3, HClO4...hoặc thêm H2O2, KMnO4 để làm tăng nhanh quá trình phân huỷ.

Vô cơ hoá bằng lối khô ướt kết hợp: Là sự kết hợp của hai phương pháp trên. Phương pháp này được sử dụng nhiều nhất.

1.2.2. Phương pháp trọng lượng 1.2.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc sấy đến khối lượng không đổi.

Cơ sở của phương pháp: Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = mo + w.

Trong đó: m: khối lượng chung của nguyên liệu; mo: khối lượng của chất khô tuyệt đối (không có ẩm); w: khối lượng nước chứa trong nguyên liệu. Độ ẩm tương đối ( ω ) của nguyên liệu ẩm là tỷ số giữa khối lượng nước (w) trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm: ω=

w w .100 = .100 m mo + w

1.2.2.2. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hoá hoàn toàn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 600oC trong khoảng 6 giờ.

Dùng phương pháp trọng lượng để khảo sát xác định một số đại lượng như: độ ẩm, hàm lượng tro trong lá, vỏ quả bứa.

Hàm lượng tro được xác định bằng công thức: H= m1 .100%

m

0

Trong đó: mo: khối lượng vỏ quả khô trước khi tro hóa (g);

33

m1: khối lượng tro (g); H: hàm lượng tro trong vỏ sấy khô ( %).

1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Trong các phương pháp tách và làm sạch chất, phương pháp sắc ký hiện nay có thể xem là hiệu lực hơn cả, nó cho phép tách được những hỗn hợp phức tạp gồm hàng chục, thậm chí hàng trăm cấu tử.

Sắc ký là quá trình tách phụ thuộc vào sự phân bố khác nhau của các cấu tử của hỗn hợp giữa pha động thể tích và pha tĩnh phim mỏng.

- Pha động thường ở trạng thái lỏng, có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là hỗn hợp hợp chất hữu cơ với nước. Các chất này phải thỏa mãn các điều kiện sau: hòa tan được các chất hữu cơ; trơ với pha tĩnh; có độ nhớt càng thấp càng tốt, bền theo thời gian, có độ tinh khiết cao; cân bằng động thiết lập nhanh; phù hợp với detector đem sử dụng…

- Pha tĩnh thường là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên bề mặt của chất mang trơ. Nếu là hạt thì phải có kích thước đồng đều, có thể dưới dạng hình cầu hoặc mảnh. Phải đảm bảo độ xốp nhất định, trơ và bền vững với điều kiện sắc ký. Nếu là dạng lỏng phải là một màng phim mỏng bám đều lên bề mặt của chất mang trơ (chất mang trơ có thể là SiO2, Al2O3…)

Trước đây chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng áp suất thường, tuy thiết bị rẻ nhưng hiệu suất tách thấp, rất tốn dung môi để rửa giải, nên hiện nay sử dụng HPLC. Là kết quả của sự phát triển trong suốt những thập kỉ qua về những cải tiến về thiết bị và sự nhồi cột, HPLC nổi lên như một phương pháp được ưa thích cho kĩ thuật tách và phân tích định lượng của một dải rộng các mẫu.

Phương pháp HPLC hiện đại, nhanh, hiệu quả, có thể dò tìm lượng mẫu nhỏ

đến 200pg. Những trường hợp áp dụng HPLC hầu như không có giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công

34

nghệ. Trong HPLC, hỗn hợp cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp, tiêm một thể tích chính xác vào bộ phận tiêm mẫu và được mang vào cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng dung môi (pha động) trong đó mẫu được hòa tan. Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt xốp có diện tích bề mặt lớn (pha tĩnh). Các cấu tử trong mẫu liên tục tương tác với pha tĩnh. Pha động (còn gọi là chất rửa giải) được bơm qua cột được nhồi chặt các hạt sắc ký. Với việc chọn pha động và vật liệu nhồi cột thích hợp, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển dọc trên cột với những tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lượt thoát ra khỏi cột và đi vào detector thích hợp, ở đây tín hiệu

được ghi lại và chuyển ra ngoài một sắc ký đồ, cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử dưới dạng một pic. Khi đó lượng cấu tử có trong mẫu được tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

1.2.4. Phương pháp chuẩn độ axit- bazơ [8] Nguyên lý: Dùng một dung dịch kiềm chuẩn (NaOH) để trung hoà hết các axit trong mẫu, với phenolphtalein làm chỉ thị màu.

Xác định hàm lượng axit tổng số trong vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88. Nhỏ NaOH 0,1N từ buret xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững.

1.2.5. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [7], [12] Trong điều kiện bình thường, nguyên tử không hấp thụ hay phát ra năng lượng dưới dạng các bức xạ. Lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản. Đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử.

Nhưng khi ở trạng thái hơi nguyên tử tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó, thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ. Lúc đó

35

nguyên tử đã nhận năng lượng dưới dạng các tia bức xạ và nó chuyển lên trạng thái kích thích có năng lượng cao hơn trạng thái cơ bản. Quá trình đó

được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử. Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.

Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử, đám hơi nguyên tử mẫu trong ngọn lửa hay trong cuvet graphit là môi trường hấp thụ bức xạ. Phần tử hấp thụ năng lượng muốn có phổ hấp thụ nguyên tử trước hết phải tạo ra được

đám hơi nguyên tử tự do, và sau đó chiếu vào nó một chùm tia sáng có những bước sóng xác định ứng đúng với các tia phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu. Khi đó các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ năng lượng và tạo ra phổ hấp thụ nguyên tử của nó.

Trên cơ sở xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy phổ nguyên tử chỉ sinh ra khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái hơi. Vì vậy muốn thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo AAS) cần thực hiện các bước sau: -Hoá hơi mẫu phân tích, đưa về trạng thái khí. Mục đích của quá trình này là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích. Có thể nguyên tử hoá mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc bằng kĩ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và có ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS. -Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tử.

Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích hướng vào khe đo để đo cường độ của nó.

-Ghi nhận tín hiệu đo và kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp.

36

1.2.6. Phương pháp chưng ninh Phương pháp chưng ninh là phương pháp lấy chất từ hỗn hợp bằng dung môi để tách biệt, cô và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Đây là một trong những phương pháp chiết tách đơn giản nhất.

Có thể chưng ninh từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn. Có thể dùng bình cầu có sinh hàn hồi lưu hay dùng nồi áp suất để chưng ninh.

Đun nóng hợp chất với dung môi trong nồi áp suất trong một khoảng thời gian nhất định thu được dịch chiết có lẫn bã rắn. Lọc nóng hoặc để lắng cho trong rồi lọc bỏ bã rắn sẽ thu được dịch chiết.

Tuy là phương pháp đơn giản nhưng việc lựa chọn dung môi cũng hết sức nghiêm ngặt. Dung môi sử dụng phải thỏa mãn một số điều kiện sau: - Hòa tan tốt các cấu tử cần chiết tách, không hòa tan hay hòa tan rất ít các cấu tử khác. Đây là điều kiện quan trọng hàng đầu, bắt buộc phải có.

- Không tương tác hóa học với cấu tử cần chiết tách.

- Thân thiện với môi trường.

- Không gây độc hại cho người sử dụng và môi trường xung quanh - Dễ kiếm, giá thành rẻ.

- Dễ đuổi dung môi ra khỏi dịch chiết.

- Không có tương tác, phá hủy dụng cụ chiết tách…

1.2.7. Phương pháp phân tích vi sinh vật Tiêu chuẩn quy định về mật độ cho phép của các vi sinh vật trong thực phẩm thay đổi tùy theo nhóm vi sinh vật cần phân tích, đối tượng thực phẩm, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của từng nước. Đối với các vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêu chuẩn thường quy định không cho

37

phép sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong một đơn vị khối lượng thực phẩm nhất định. Trường hợp này cần định tính sự hiện diện của vi sinh vật.

Thông thường, tiêu chuẩn quy định mật độ vi sinh vật cho phép hiện diện trong một khối lượng thực phẩm nhất định, trong trường hợp này cần tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu kiểm tra.

Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm quan trọng được quy

định bởi Bộ Y tế là: tổng số vi khuẩn hiếu khí, E. coli và tổng số nấm men, nấm mốc. Các chỉ tiêu vi sinh vật trên được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức

độ vi sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm.

38

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - HÓA CHẤT Thiết bị- Dụng cụ: Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ( Công ty dược danapha Đà Nẵng), tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thuỷ tinh, bình tam giác, phễu chiết, nồi áp suất, bình hút ẩm, buret, pipet, phễu lọc chân không, bếp điện…

Hoá chất: CaCl2, nước cất, fixanal NaOH 0,1N, HNO3, cồn tuyệt đối.

Hình 2.1. Lò nung và tủ sấy

Hình 2.2. Hoá chất CaCl2 và NaOH

39

2.2. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM Xác định độ ẩm

Quả bứa

Xử lý nguyên liệu

Làm sạch Hong khô Xay nhỏ

Hàm lượng tro Nguyên liệu sau khi xử lý Thành phần kim loại

Chiết tách HCA Xác định tổng lượng axit Dịch chiết HCA

pH Thể tích Thời gian

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

Tổng hợp Canxi hydroxycitrat Tinh chế

Xác định hàm lượng canxi

Canxi hydroxycitrat tinh khiết

Định lượng các axit (HPLC)

Đo phổ IR

Đo phổ HPLC

40

2.3. NGUYÊN LIỆU 2.3.1. Cây bứa Cây cao 6- 7m. Cành và nhánh dài, mảnh, mọc xoè ngang. Vỏ cây màu xám tro. Lá mọc đối, mép nguyên, nhẵn bóng, có nhiều điểm mờ. Vỏ quả màu vàng ở ngoài, phía trong hơi đỏ, vị chua, có nhiều múi mọng nước, ăn được.

Hoa có màu vàng nhạt, mọc thành chùm. Quả chín thường được hái về ăn, vỏ quả phơi khô dùng làm thuốc chữa một số bệnh. thu hái vào các tháng 6-7, quả mọng mang đài tồn tại, vỏ quả dày, có khía múi, phía trong hơi đỏ chứa 6-10 hạt (hình 2.3).

Hình 2.3. Cây và quả bứa ở Quảng Ngãi

41

2.3.2. Thu nguyên liệu Nguyên liệu được lấy ở xã Bình Hải và xã Bình Hoà , huyện Bình Sơn, tỉnh Quảng Ngãi. Chọn các loại quả chín có vỏ màu vàng, mềm, ít nhựa, dễ dùng dao để tách lấy vỏ. Cơm bao quanh hạt dày, rõ ràng, màu trắng vàng xem hình 2.4.

Hình 2.4. Quả bứa ở Quảng Ngãi 2.3.3. Xử lý nguyên liệu Qủa bứa sau khi thu hái còn chứa nhiều tạp chất. Do đó, giai đoạn làm sạch nguyên liệu càng cẩn thận thì hiệu quả của các quá trình chiết tách sau này càng cao. Đầu tiên, nguyên liệu được thu nhận về cần loại bỏ những quả bị hư tổn, quả xanh, loại bỏ hết bụi bẩn, tạp chất bằng cách rửa bằng nước sạch và lau khô bằng vải sạch. Sau khi khô nước, cắt bỏ cuống quả, tách bỏ

42

ruột chỉ lấy phần vỏ và tiến hành làm sạch ruột và hong khô phần vỏ của quả.

Vỏ bứa đem sấy khô rồi xay thành bột.

Hình 2.5. Vỏ bứa đã làm sạch

Hình 2.6. Mẫu vỏ quả bứa khô cắt nhỏ

Hình 2.7. Mẫu vỏ quả bứa khô dạng bột mịn

43

2.4. XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VẬT LÝ 2.4.1. Xác định độ ẩm Dụng cụ, thiết bị: Cốc thủy tinh để đựng mẫu, tủ sấy, bình hút ẩm, cân phân tích Cân khoảng 10g vỏ bứa tươi cho vào cốc thủy tinh đã được sấy khô và biết khối lượng chính xác, sau đó cho vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 800C trong 3h. Sau khi sấy ta lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi cốc thủy tinh nguội hẳn thì tiến hành cân tính khối lượng trên cân phân tích. Sau đó cứ khoảng 30 phút ta lại tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp là không đổi hay có sai số khoảng 0,005g thì dừng quá trình sấy.

Dựa vào các kết quả thu được, ta tính được khối lượng vỏ quả Bứa trước và sau khi sấy. Từ đó, ta tính được độ ẩm trong vỏ Bứa dựa vào công thức sau: H=

Trong đó:

mo − m1 ⋅ 100 mo

-

H: độ ẩm (%)

-

m0: khối lượng vỏ quả tươi trước khi sấy (g)

-

m1: khối lượng vỏ quả sau khi sấy (g)

2.4.2. Xác định hàm lượng tro Dụng cụ, thiết bị: Cốc sứ đựng mẫu, lò nung, bình hút ẩm, cân phân tích.

Cân khoảng 4g vỏ đã được sấy khô cho vào cốc sứ đã sấy khô và biết chính xác khối lượng. Cho cốc sứ có chứa vỏ vào lò nung và nung ở 8000C. Sau 6h ta thấy vỏ đã được tro hóa hoàn toàn. Lúc này tro có dạng bột mịn,

44

màu trắng. dùng kẹp dài lấy bát sứ ra khỏi lò nung, cho vào bình hút ẩm cho

đến khi cốc nguội hẳn thì cân cốc trên cân phân tích và tính khối lượng.

Sau 30 phút tiến hành quá trình trên một lần cho đến khi khối lượng giữa hai lần liên tiếp là không đổi hay sai số 0,0001 g thì dừng quá trình tro hóa. Hàm lượng tro trong vỏ được tính theo công thức: H=

Trong đó:

m1 ⋅ 100 m0

- H: hàm lượng tro trong vỏ sấy khô (%) - m0: khối lượng vỏ khô trước khi tro hóa (g) - m1: khối lượng vỏ sau khi tro hóa (g)

2.4.3. Xác định hàm lượng một số kim loại bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Dùng cân phân tích cân chính xác từ 1- 1,5g mẫu, cho vào chén sứ nung ở 7000C trong 6 giờ đến khi mẫu khô và chuyển sang màu trắng.Trường hợp mẫu khô nhưng chưa có màu trắng, ta thêm 2- 3 giọt HNO3 vào; tiếp tục nung cho đến khi khô và xuất hiện màu trắng. Để nguội chén sứ, đem định mức thành 50ml bằng nước cất rồi tiến hành đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ quả bứa khô.

2.4.4. Chuẩn độ tổng lượng axit thu được bằng phương pháp chuẩn độ axit- bazơ Pha chính xác 1 lít dung dịch NaOH chuẩn 0,1N từ fixanal, rồi sau đó dùng phễu rót vào buret sạch đến vạch số 0. Dùng pipet lấy vào 3 bình nón đã rửa sạch và tráng bằng nước cất mỗi bình 5ml dung dịch chiết (đã được tẩy màu) và thêm 1- 2 giọt phenolphtalein. Tiến hành chuẩn độ cho đến khi dung dịch có màu hồng bền vững trong 30 giây. Xác định hàm lượng axit tổng số

45

trong vỏ quả bứa theo tiêu chuẩn TCVN 4589-88. Nhỏ NaOH 0,1N từ buret

Vcd 100 X = K .n. .

1 V P xuống, cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững.

Tính kết quả: Độ axit toàn phần theo phần trăm (X1) tính bằng công thức: Trong đó: n : số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ V ml dịch thử; Vcd : thể tích mẫu cô đặc (ml); P : trọng lượng mẫu thử, tính bằng gam; K: hệ số của loại axit, K = 0,006904.

Dùng phương pháp chuẩn độ để xác định tổng lượng axit hữu cơ có trong mẫu chiết.

2.4.5. Chưng ninh bằng nồi áp suất để thu dịch chiết axit Vỏ quả bứa khô: Quả bứa sau khi rửa sạch, hong khô tiến hành bổ quả

để loại bỏ ruột và hạt. Vỏ quả được cắt thành mẫu nhỏ có kích thước bằng ngón tay út đem sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C trong vòng 28 giờ đến khi vỏ quả khô hoàn toàn, xay vỏ quả khô thành bột mịn và sử dụng để chiết hữu cơ.

Chưng ninh trong nồi áp suất: Cân chính xác khoảng 10g mẫu vỏ quả khô, cho vào cốc thuỷ tinh 500ml với 200ml nước cất. Thực hiện chưng ninh trong nồi áp suất trong thời gian 90 phút. Thu được dung dịch chiết, phần bã rắn được chiết lặp lại một lần nữa để thu hồi toàn bộ lượng axit có trong mẫu.

Dịch chiết thu được có màu nâu đỏ. Trộn dịch chiết với 4 gam than hoạt tính và ngâm trong nước ấm 30 phút, sau đó lọc than hoạt tính, rửa lại 2 lần, mỗi lần 10ml nước để thu hồi hết axit. Dịch chiết sau khi xử lý bằng than hoạt tính bị mất màu hoàn toàn. Trộn lẫn dịch lọc và rửa, cô đặc đến 50ml, xử lý với

46

100ml etanol, để yên 15 phút để kết tủa hết pectin (kết tủa màu trắng sữa).

Lọc bỏ kết tủa. Phần kết tủa rửa 2 lần để thu hồi hết axit. Trộn các dịch chiết, cô đặc đến thể tích 50ml và lưu giữ ở 40C trong tủ lạnh đến khi sử dụng để chuẩn độ, kiểm tra bằng HPLC.

Hình 2.8. Dịch chiết chưa tẩy màu

Hình 2.9. Dịch chiết đã tẩy màu

Hình 2.10. Dịch chiết sau khi cô đặc

Hình 2.11. Kết tủa pectin 2.4.6. Xác định hàm lượng HCA trong mẫu bằng phương pháp HPLC [12] HPLC phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp được sử dụng để nghiên cứu gồm máy sắc kí lỏng cao áp hãng Knauer trang bị với bơm loại áp suất thấp hãng Knauer, và lắp cột sắc kí Knauer C18: 250 mm x 4,6 ID x 5µm. Bộ

47

tổng hợp dung môi: quaternary LP Gradient, hãng Knauer. Quá trình dò được thực hiện bằng đetectơ Knauer UV: khoảng bước sóng 190- 740 nm.

Pha động gồm (A) metanol MeOH và (B) là H3PO4 0,01 M với tốc độ dòng 1,5 ml/m. Quá trình tách các pic tốt khi chất A trong B thay đổi từ 1030% trong thời gian 0- 25 phút, 90% A trong B trong thời gian 30 phút, sau 5 phút cân bằng với 90% A. Chất chuẩn và mẫu được lọc qua Millipore lọc 0,45

µm và tiêm vào HPLC. Xây dựng đường chuẩn: Phương pháp xây dựng đường chuẩn được thực hiện bằng cách dựa vào kết quả phân tích một chuỗi các mẫu HCA chuẩn. Năm mẫu dung dịch chuẩn chứa 10- 32ppm HCA tự do được tiêm vào HPLC, thao tác rửa giải được thực hiện như phần thảo luận ở trên, và kết quả thu được các diện tích pic. Đường cong HCA được vẽ dựa trên biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ của HCA và diện tích pic (trung bình của 3 lần chạy).

Khoảng nồng độ mẫu chuẩn cần để xây dựng đường chuẩn được xác

định dựa vào nồng độ thực của HCA có trong mẫu. Khoảng nồng độ này tính từ giá trị giới hạn dưới (LLOQ) đến giá trị giới hạn trên (ULOQ).

Xác định giá trị giới hạn: Giá trị giới hạn (LOQ) được định nghĩa như nồng độ thấp nhất của HCA mà có thể xác định với độ tin cậy và chính xác <20%.

Xác định axit hữu cơ có trong mẫu: Mẫu được chuẩn bị bằng cách pha loãng theo tỉ lệ 1:100 với nước cất 2 lần cất, vỏ quả chưng ninh với nước cất tỉ lệ 1:50. Thể tích của mỗi mẫu được tiêm vào HPLC là 20µl, HCA thu được trực tiếp dựa vào diện tích pic, bằng cách áp dụng hệ số pha loãng và sử dụng

đường chuẩn. Nồng độ của HCA trong mẫu được tính bằng g/100g mẫu dựa theo công thức sau:

48

% HCA =

[( SI × Am ) − Int ]× Vdm × Kpl × 10 .000 Mn

Trong đó: SI: hệ số góc đường chuẩn; Int: hệ số b của đường chuẩn; Am: diện tích pic sắc kí; Vdm: thể tích mẫu sau khi cô đặc dùng cho HPLC; Kpl: hệ số pha loãng; Mn: khối lượng mẫu (gam).

Chất chuẩn: (-)-Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate, cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, công thức C12H10Ca3O16.xH2O. Thông tin chi tiết của chất chuẩn như sau:

Tên sản phẩm

:

(-)-Calcium

threo-hydroxycitrat

tribasic hydrate, BioChemika, Garcinia Cambogia Extract, ~19,5% Ca.

Số sản phẩm

: 55128

Văn phòng sản xuất

: Fluka.

Công thức phân tử

: C12H10Ca3O16.xH2O.

Khối lượng phân tử

: 530,43 (cơ bản khan).

Màu sắc

: Hơi nâu.

Dạng tồn tại

: Bột.

Chuẩn độ (trao đổi ion)

: Axit threo-hydroxycitric 67,3%.

Hàm lượng cacbon

: 24,11%.

Hàm lượng Hiđro

: 2,82%.

Phổ 1HNMR

: Phù hợp.

Toàn bộ những thông tin trên được ghi trong Giấy chứng nhận chất lượng ngày 4 tháng 2 năm 2005 của hãng Sigma-Aldrich.

Hình 2.12. Lọ chất chuẩn

49

Chuẩn bị HCA tự do: Calcium threo-hydroxycitrat tribasic hydrate (50mg) cho vào cốc 50ml chứa 5ml nước, và xử lý với 500mg Dowex 50 [H+]. Hỗn hợp được khuấy trong thời gian 10 phút, sử dụng khuấy từ. Tách lấy phần dung dịch, và nhựa được rửa với nước có pH trung tính. Nước rửa và dung dịch được trộn lẫn tới thể tích 25ml, khuấy trộn và lọc bằng giấy lọc.

Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10ppm đến 320ppm.

2.4.7. Tổng hợp muối canxihydroxycitrat của HCA Dịch chiết sau khi cô đặc được trung hòa axit bằng cách cho thêm dung dịch CaCl2 (32g/100ml dịch). Dung dịch thu được được khuấy trộn khoảng 30-120 phút. Khi thêm CaCl2 vào, lúc đầu xuất hiện ít kết tủa trắng, sau xuất hiện ngày càng dày đặc tạo thành bùn, pH của hỗn hợp bùn thích hợp từ 9,511. Sử dụng dung dịch NaOH 10% (44,4g/400ml nước) để chỉnh độ pH. Hỗn hợp bùn được lọc và rửa với nước cất để loại bỏ tất cả muối bám vào. Nước rửa ra được kiểm tra ion clorua và việc lọc rửa kết thúc khi không còn phát hiện ion clorua trong nước rửa. Phần bánh ướt được sấy khô ở nhiệt độ 1000C

để thu được dạng bột khô màu nâu xám là muối HCCa. Tiến hành cân khối lượng để tính toán hiệu suất của quá trình chuyển hóa.

Hình 2.13. Muối HCCa tạo thành

Hình 2.14. Muối HCCa đã sấy khô

50

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. MỘT SỐ TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA NGUYÊN LIỆU 3.1.1. Độ ẩm của nguyên liệu Bằng phương pháp trọng lượng, độ ẩm của nguyên liệu được xác định và tổng hợp ở bảng kết quả 3.1 Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ quả bứa sấy khô STT

Khối lượng vỏ

Khối lượng vỏ

Khối lượng nước

Độ ẩm

mẫu

trước khi sấy (g)

sau khi sấy (g)

trong vỏ (g)

(%)

1

10,097

9,249

0,848

8,39

2

10,098

9,277

0,821

8,13

3

10,099

9,230

0,869

8,61

Nhận xét: Độ ẩm trong vỏ quả bứa khô khoảng 8,37 ± 0,24%, độ ẩm trung bình trong vỏ quả bứa là 8,37%. Với độ ẩm này, tôi đã bảo quản nguyên liệu trong thời gian dài làm thí nghiệm nhưng không bị hư hỏng.

3.1.2. Hàm lượng tro Kết quả xác định hàm lượng tro của nguyên liệu được trình bày ở bảng 3.2 như sau: Bảng 3.2: Kết quả xác định tỉ lệ tro trong vỏ quả bứa sấy khô

Khối Khối STT lượng vỏ lượng mẫu đã sấy khô cốc (g) (g)

Khối lượng vỏ sấy khô + cốc trước khi tro hóa (g)

Khối lượng vỏ + cốc sau khi tro hóa (g)

Khối lượng tro (g)

Tỉ lệ tro (%)

1

4,039

16,750

20,789

16,792

0,042

1,04

2

4,150

19,560

23,710

19,603

0,043

1,03

3

4,221

32,120

36,341

32,166

0,046

1,09

51

Nhận xét: Hàm lượng tro trong vỏ quả bứa khô khoảng 1,06 ± 0,03 %.

Hàm lượng tro trong vỏ quả bứa khô là rất thấp, chiếm khoảng 1,05 % khối lượng vỏ quả bứa khô.

3.1.3. Xác định thành phần kim loại bằng phương pháp AAS Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ bứa khô bằng phương pháp đo AAS được xác định ở bảng 3.3 Bảng 3.3. Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ bứa Tên kim

Phương pháp thử

Kết quả

Hàm lượng cho phép

loại

AAS

(mg/L)

(mg/kg)

1

Sn

TCVN 6193-1996

0,0043

40

2

Pb

TCVN 6193-1996

0,6715

2

3

Zn

TCVN 6193-1996

5,3224

40

4

Cu

TCVN 6193-1996

2,2675

30

5

Fe

TCVN 6177-1996

26,512

x

6

As

TCVN 6193-1996

KPH

1

30,1019

x

STT

7

Tổng Cu, Zn, Fe

Nhận xét: Thành phần kim loại nặng trong vỏ quả bứa thấp, kết quả so sánh với tiêu chuẩn CODEX STAN 164 – 1989: Tiêu chuẩn về chất lượng trái cây và hàm lượng kim loại nặng cho phép trong các loại rau quả quy định tại Quyết định số 867/1998/QĐ – BYT của Bộ Y Tế ngày 4/4/1998 về việc ban hành Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm thì các hàm lượng kim loại nặng nằm trong khoảng cho phép. Như vậy có thể sử dụng vỏ quả bứa để làm thực phẩm hoặc dược phẩm mà không ảnh hưởng đến sức khỏe con người.

52

3.1.4. Xác định tổng lượng axit trong mẫu chiết bằng phương pháp chuẩn độ Kết quả xác định tổng lượng axit trong mẫu chiết từ vỏ quả bứa khô bằng phương pháp chuẩn độ thu được kết quả trình bày ở bảng 3.4 dưới đây.

Bảng 3.4. Kết quả xác định tổng lượng axit trong vỏ quả bứa Dung Mẫu

môi

STT

P (g)

chiết

1

10,000

Vcd

V

(ml) (ml)

50

5

Vỏ quả Bứa

2

10,095

50

5

Nước

khô 3

10,105

50

n (ml)

Tổng

Tổng lượng

TB 3

lượng

axit trung

l ần

axit

bình

chuẩn

(g/100g)

(g/100g)

25,9

17,88

26,0

17,95

26,1

18,02

23,9

16,35

24,0

16,42

24,1

16,48

20,2

13,80

20,3

13,87

20,1

13,73

16,06

5

Nhận xét: Tổng lượng axit chuẩn độ được trong mẫu vỏ bứa khô chiết với dung môi nước là 16,06%. So sánh với kết quả của các loài đã nghiên cứu như: Garcinia cambogia (17 – 19,2%), Garcinia india (12,48 – 15,1%), Garcinia cowa (27,1%) thì kết quả vỏ quả bứa Quảng Ngãi chiết trong nước cho kết quả trung bình.

53

3.2. XÁC ĐỊNH HCA TRONG MẪU CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) Axit HCA có khuynh hướng bị lacton hóa trong suốt quá trình gia nhiệt. Đối với phương pháp sắc ký lỏng cao áp ta có thể định lượng HCA và các axit khác mà không cần phải sấy dịch chiết.

Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị HCA tự do và dung dịch chuẩn axit citric cho HPLC: Calcium threo-hydroxycitrate tribasic hydrate (50 mg) cho vào cốc 50ml chứa 5,0 ml nước và xử lý với 500 mg Dowex 50 [H+]. Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn HCA có nồng độ thay đổi từ 10 ppm đến 320 ppm. Dung dịch chuẩn axit citric được chuẩn bị riêng biệt có nồng độ từ 2 đến 30 ppm sử dụng nước cất 3 lần cất.

3.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn được xác định bằng cách thay đổi nồng độ của 05 mẫu chuẩn từ 10 đến 320 ppm. Phương trình đường chuẩn HCA là: C = 1,37A – 6,88 với A là diện tích pic của HCA, C là nồng độ HCA, hệ số tương quan R2 = 0,999698 (hình 3.5). Phương trình đường chuẩn axit citric là: C = 2.55A – 5,43; hệ số tương quan R2 = 0,999799 (hình 3.6)

Hình 3.1. Đường chuẩn HCA

54

Hình 3.2. Đường chuẩn axit citric 3.2.2. Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả bứa Thành phần axit hữu cơ xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

được tính bằng công thức: Công thức tính HCA:

Cm (ppm) = (1,37 * Am – 6,88) * Vcđ * Kpl / m

Công thức tính CA:

Cm (ppm) = (2,55 * Am – 5,43) * Vcđ * Kpl / m Cm (%)

= Cm (ppm) / 10000

Trong đó: Cm (ppm): Nồng độ tính bằng ppm Cm (%): Nồng độ phần trăm Am

: Diện tích pic sắc kí

Vcđ

: Thể tích mẫu cô đặc (ml)

Kpl

: Hệ số pha loãng

m

: Trọng lượng mẫu thử (g)

55

Bảng 3.5. Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả bứa bằng HPLC Dung Mẫu

môi chiết

Vỏ quả bứa khô

Nước

STT mẫu

Am m (g)

HCA

Axit

Vcđ

HCA

Kpl

(%)

citric

1

10,423 238,537 5,512

50

100

2

10,325 232,618 5,298

50

100

3

10,210 229,248 5,110

50

100

15,348 15,085 15,047

Hình 3.3. Sắc kí đồ mẫu axit HCA chuẩn Hình 3.3. Sắc kí đồ mẫu axit HCA chuẩn

Axit citric (%) 0,413 0,391 0,372

56

Hình 3.4. Sắc kí đồ mẫu vỏ quả bứa khô trong nước Axit chủ yếu được tìm thấy trong vỏ quả bứa bằng HPLC là HCA được thể hiện trên sắc kí đồ hình 3.4. Pic thứ yếu được xác định là pic của axit citric.

Xác định pic HCA được dựa vào pic của axit HCA chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 4,939 phút, tương tự pic của axit citric xác định nhờ pic axit chuẩn xuất hiện ở thời gian lưu là 5,623 phút (hình 3.3). Thời gian lưu của HCA và axit citric tìm thấy trong mẫu là 4,955 phút và 5,606 phút.

57

3.3. TỔNG HỢP MUỐI CANXI CỦA HCA 3.3.1 Quy trình Dịch chiết sau khi cô đặc được trung hòa axit bằng cách cho thêm dung dịch CaCl2 (32g/100ml dịch). Dung dịch thu được được khuấy trộn khoảng 30-120 phút. Khi thêm CaCl2 vào, lúc đầu xuất hiện ít kết tủa trắng, sau xuất hiện ngày càng dày đặc tạo thành bùn, pH của hỗn hợp bùn thích hợp từ 9,511. Sử dụng dung dịch NaOH 10% (44,4g/400ml nước) để chỉnh độ pH. Hỗn hợp bùn được lọc và rửa với nước cất để loại bỏ tất cả muối bám vào. Nước rửa ra được kiểm tra ion Clorua và việc lọc rửa kết thúc khi không còn phát hiện ion clorua trong nước rửa. Phần bánh ướt được sấy khô ở nhiệt độ 1000C

để thu được dạng bột khô màu nâu xám là muối HCCa. Tiến hành cân khối lượng để tính toán hiệu suất của quá trình chuyển hóa.

Hình 3.5. Muối HCCa tạo thành

Hình 3.6. Muối HCCa đã sấy khô

58

3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chuyển hoá tạo muối Canxi của HCA Để đánh giá, khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình chuyển hoá tạo muối HCCa, ta tiến hành thử nghiệm ở 04 mẫu dịch chiết được điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 10% và khuấy trộn cẩn thận, dùng pH kế để kiểm soát pH của dung dịch. Các mức pH được khảo sát trong 04 mẫu tương ứng lần lượt là: 9,5; 10; 10,5 và 11. Sau đó, cho cùng một lượng dung dịch CaCl2 vào các mẫu thử.

Kết quả quan sát cho thấy: mẫu 1 xuất hiện kết tủa trắng mịn ở phía dưới, dung dịch phía trên màu nâu vàng đậm, mẫu 2 kết tủa trắng mịn, dạng bùn ở phía dưới nhiều hơn, dung dịch phía trên màu nâu vàng nhạt hơn, mẫu 3 kết tủa trắng mịn, dạng bùn ở phía dưới nhiều, xuất hiện những hạt kết tủa trắng thô, dung dịch phía trên màu vàng; mẫu 4 kết tủa trắng mịn, dạng bùn ở phía dưới, những hạt kết tủa trắng thô xuất hiện nhiều hơn, lớp dung dịch trên màu vàng nhạt. Sau khi lọc rửa các lớp kết tủa của các mẫu, phần kết tủa trắng mịn thu được là muối HCCa, phần kết tủa trắng thô là Ca(OH)2. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối tạo thành vào pH được thể hiện qua bảng 3.6 và đồ thị hình 3.7 như sau: Bảng 3.6. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào pH STT mẫu

Khối lượng mẫu (g)

Lượng axit (g)

1

100,352

15,274

2

100,418

15,284

3

100,125

15,240

4

100,086

15.234

pH

9,5 10 10,5 11

Khối lượng muối lý thuyết (g)

Khối lượng muối thực tế (g)

19,459

15,153

19,472

16,652

85,517

19,416

16,513

85,052

19,408

16,505

85,044

Hiệu suất (%) 77,871

59

Khối lượng muối thu được (g)

17 16,5 16 15,5 15 14,5 14 9,5

10

10,5

11

pH

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào pH Nhận xét: Từ kết quả khảo sát thu được ở bảng 3.6 và đồ thị biểu diễn hình 3.7 cho thấy ở giá trị pH = 10 thì ta thu được khối lượng muối lớn nhất là 16,652g (H = 85,517%).

3.3.3. Khảo sát theo thể tích Dịch chiết axit thu được bằng phương pháp chưng ninh, sau khi đã tẩy màu bằng than hoạt tính và lọc bỏ kết tủa pectin, đem cô đặc đến các thể tích lần lượt là: 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml. Cho dịch chiết tác dụng với dung dịch CaCl2 (32g/100ml nước), cố định pH = 10 bằng cách dùng dung dịch NaOH 10%. Dung dịch thu được được khuấy trộn khoảng 30–120 phút. Hỗn hợp bùn được lọc và rửa với nước cất để loại bỏ tất cả muối bám vào. Nước rửa ra được kiểm tra ion clorua và việc lọc rửa kết thúc khi không còn phát hiện ion clorua trong nước rửa. Phần bánh ướt được sấy khô ở nhiệt độ 1000C

để thu được dạng bột khô màu nâu xám là muối HCCa. Kết quả khảo sát sự

60

phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào thể tích axit được thể hiện qua bảng 3.7 và đồ thị hình 3.8 như sau: Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào thể tích axit

STT mẫu

Khối lượng mẫu (g)

Thể Lượng

tích

axit (g)

axit (ml)

Khối lượng

Khối lượng

muối lý

muối thực tế

thuyết (g)

(g)

Hiệu suất (%)

1

100,315

15,268

100

19,452

15,173

78,005

2

100,305

15,266

150

19,450

15,983

82,175

3

100,247

15,257

200

19,438

16,656

85,690

4

100,414

15,282

250

19,470

16,655

85,552

5

100,102

15,234

300

19,409

16,576

85,405

Khối lượng 17 muối thu được (g) 16.5 16 15.5 15 14.5 14 100

150

200

250

300

Thể tích axit (ml)

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào thể tích axit

61

Nhận xét: Từ kết quả thu được ở bảng 3.7 và đồ thị ở hình 3.8 cho thấy lượng muối đạt khối lượng lớn nhất là 16,656g (H = 85,690%) ứng với thể tích axit là 200ml.

3.3.4. Khảo sát theo thời gian Tiến hành thí nghiệm tương tự như trên với các giá trị cố định tương

ứng như sau: thể tích axit là 200ml và pH = 10. Thay đổi thời gian khuấy trộn lần lượt là: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối vào thời gian khuấy trộn được thể hiện qua bảng 3.8 và hình 3.9 như sau: Bảng 3.8. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào thời gian khuấy trộn

STT mẫu

Khối lượng mẫu (g)

Lượng axit (g)

Thời

Khối lượng

Khối lượng

Hiệu

gian

muối lý

muối thực

suất

(phút)

thuyết (g)

tế (g)

(%)

1

100,162

15,245

30

19,422

14,712

75,752

2

100,306

15,267

60

19,450

15,589

80.150

3

100,318

15,269

90

19,452

16,786

86,295

4

100,295

15,265

120

19,447

16,754

86,152

62

Khối lượng 17 muối thu được (g) 16.5 16 15.5 15 14.5 14 13.5 30

60

90

120

Thời gian khuấy trộn (phút)

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào thời gian khuấy trộn Nhận xét: Từ kết quả bảng 3.8 và đồ thị biểu diễn ở hình 3.9 cho thấy khi tăng thời gian khuấy trộn thì khối lượng muối tăng và sau thời gian 90 phút thì khối lượng muối giảm không đáng kể. Vì vậy, thời gian khuấy 90 phút được chọn làm thời gian tối ưu.

3.3.5. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng phổ hồng ngoại (IR) Để kiểm tra sản phẩm muối HCCa tạo thành ta chụp phổ hồng ngoại IR so với phổ hồng ngoại của canxihydroxycitrat chuẩn.

Hình 3.10. Máy đo phổ hồng ngoại (IR)

63

Hình 3.11. Phổ IR của HCCa chuẩn

64

Hình 3.12. Phổ IR của muối HCCa Kết quả chụp phổ IR của muối canxihydroxycitrat (HCCa) (hình 3.12 )

65

so với muối canxihydroxycitrat (HCCa) chuẩn (hình 3.10) cho thấy xuất hiện các píc lần lượt có bước sóng 3310 cm-1 ứng với phổ dao động của nhóm –OH và có píc ứng với bước sóng 1582 cm-1 ứng với nhóm C=O trong nhóm (-COO)2Ca. Về hình dáng, phổ IR của muối HCCa và HCCa chuẩn tương tự nhau.

3.4.6. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Để kiểm tra sản phẩm muối tạo thành ta tiến hành kiểm tra sản phẩm muối HCCa thu được bằng phổ HPLC rồi so sánh với phổ HPLC của (-)HCCa chuẩn.

Đo HPLC bằng máy D-7000HPLC, điều kiện sắc kí cột sắc kí RP 18, 5µm, 4,6x250mm, dung môi A: pha động H3PO4 0,1%; dung môi B: ACN ( 95:5), detector: 205nm, tốc độ dòng 1ml/phút. Đo tại công ty dược Danapha

Đà Nẵng.

Kết quả kiểm tra bằng phổ HPLC thể hiện ở hình 3.13 và hình 3.14 dưới đây:

20

Intensity (mV)

15

10

5

0 0.0 0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

Retention Time (min)

Hình 3.13. Phổ HPLC của (-)-HCCa chuẩn

5.5 STD

66

CALCIUM HYDROXYCITRATE

10

8

Intensity (mV)

6

4

2

3,89

2,35 2,88

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Retention Time (min) Hình 3.14. Sắc kí đồ của muối HCCa Nhận xét: Kết quả đo phổ HPLC cho thấy thời gian lưu của muối HCCa đã tổng hợp là 3,89 phút. So sánh với kết quả đo HPLC của HCCa chuẩn có thời gian lưu là 3,804 phút. Do đó có thể kết luận là đã tổng hợp thành công muối HCCa. Tuy nhiên, trên phổ đồ tổng hợp xuất hiện 2 số pic nhỏ. Như vậy, ngoài thành phần chính của muối tổng hợp được HCCa còn có lẫn 1 ít tạp chất nên chúng ta cần phải tinh chế muối HCCa đã tổng hợp. Hàm lượng HCCa trong muối đã tổng hợp được xác định bằng HPLC là 91,351%.

67

3.5. TINH CHẾ MUỐI Muối HCCa điều chế ở trên có độ tinh khiết là 91,351% .Nó cần phải

được tinh chế để xác định cấu trúc và sử dụng làm thực phẩm chức năng .

Quá trình tinh chế muối HCCa được thực hiện như sau: Cho sản phẩm muối HCCa được điều chế ở dạng rắn ta đi rửa nhiều lần bằng nước cất cụ thể như sau: -Lần 1: muối HCCa khi ta tổng hợp muối từ nấu 100gam mẫu ta rửa 10 lần bằng 5lít nước cất. Sấy khô ở 800C trong 24h . Lấy mẫu đo HPLC tại công ty danapha Đà Nẵng (hình 3.16).

- Lần 2: Lấy sản phẩm lần 1 tiến hành rửa và lọc 10 lần bằng 5lít nước cất. Lọc chất rắn, sấy khô sau đó tiến hành đo HPLC ( hình 3.17).

- Lần 3: Lấy sản phẩm lần 2 tiền hành rửa và lọc 10 lần bằng 5lít nước cất 10 lần. Lọc chất rắn, sấy khô sau đó tiến hành đo HPLC( hình 3.18).

Hình 3.15. Máy HPLC ( D-7000)

68

10

Intensity (mV)

6

4

CALCIUM HYDROXYCITRATE

8

3,90

2

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Retention Time (min) Hình 3.16. Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 1

69

CALCIUM HYDROXYCITRATE

10

8

Intensity (mV)

6

4

2

0 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11

Retention Time (min) Hình 3.17 . Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 2

70

CALCIUM HYDROXYCITRATE

12 10 8

Intensity (mV)

6 4 2 0 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11

Retention Time (min) Hình 3.18. Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 3

71

Nhận xét: Dựa vào 3 sắc kí đồ trên cho ta kết quả bảng 3.9 như sau: Bảng 3.9. Kết quả diện tích pic của phổ HPLC của sản phẩm muối HCCa STT

Hình

RT

Diện tích

% diện tích

pic

pic

1

3.16

3,90

99179

92,428

2

3.17

3,90

100970

93,089

3

3.18

3,91

103050

93,589

Sau khi ta tiến hành rửa sạch chất rắn thì các tạp chất giảm thế hiện qua 02 pic nhỏ có thời gian lưu 2,36 và 2,89 phút. Pic thể hiện muối HCCa có diện tích lớn nhất và đạt được độ tinh khiết 93,589%.

3.6. KIỂM TRA HÀM LƯỢNG CANXI TRONG SẢN PHẨM MUỐI HCCa Tiến hành kiểm tra hàm lượng canxi có trong sản phẩm muối HCCa tạo thành bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS). Kết quả xác

định hàm lượng canxi trong muối HCCa tạo thành được thể hiện ở bảng 3.10 dưới đây: Bảng 3.10. Kết quả hàm lượng canxi trong muối HCCa bằng AAS Kim

Phương pháp thử

Kết quả

Hàm lượng cho phép

loại

(AAS)

(mg/L)

(mg/L)

Canxi

TCVN 6660 - 2000

17292,1

–

72

Nhận xét: Hàm lượng canxi trong sản phẩm HCCa là thành phần kim loại chính, kết quả canxi xác định được bằng phương pháp AAS là 17292,1 mg/L (chiếm 17,29%). Như vậy có thể sử dụng sản phẩm HCCa tạo thành để làm thực phẩm hoặc dược phẩm mà không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người theo quyết định số 867/1998/QĐ-BYT của Bộ Y Tế ngày 4 tháng 4 năm 1998 về việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm 3.7. KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM

MUỐI HCCa. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật mẫu muối HCCa như sau: Bảng 3.10. Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh của muối canxihydroxycitrat.

TT

Tên chỉ tiêu

Đơn vị tính

Phương pháp thử

Kết quả thử nghiệm

1

Tổng vi khuẩn đếm

kl/g

TCVN 4884:2005

KPH

được 2

E. coli

kl/g

FAO

KPH

3

Tổng bào tử nấm men -

kl/g

TCVN 4993-89

KPH

mốc

Ghi chú: - Kph: không phát hiện

Như vậy, kết quả phân tích cho thấy mẫu muối canxihydroxycitric thỏa mãn Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm của Bộ Y tế.

73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận Trong đề tài nghiên cứu chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau: 1/ Độ ẩm trong vỏ bứa khô: 8,37 %, Hàm lượng tro trong vỏ bứa khô:1,06 % Thành phần kim loại nặng gồm: Sn(0,0043mg/L), Pb(0,6715mg/L), Zn(5,3224mg/L), Cu(2,2675mg/L), Fe(26,512mg/L).

2/ Chứng minh được sự có mặt của HCA trong vỏ quả bứa bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Hàm lượng (-)-HCA tìm thấy trong vỏ quả bứa khô (15,348%), axit thứ yếu là axit citric (0,413%). Xác định được tổng lượng axit có trong mẫu chiết là 16,06 (g/100g).

3/ Đã khảo sát và xây dựng quy trình chuyển hoá tạo muối canxi của HCA chiết từ vỏ bứa khô. Khối lượng muối HCCa ở dạng rắn tạo thành trung bình là 16,698 g/100g mẫu, hiệu suất tạo muối vào khoảng 77,871% – 86,295%.

4/ Đã kiểm tra sản phẩm muối HCCa tạo thành bằng phổ hồng ngoại (IR), sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Hàm lượng muối HCCa trong sản phẩm chuyển hoá là 93,589% ứng với thời gian lưu là 3,91 phút.

5/ Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh và hàm lượng một số kim loại nặng của sản phẩm muối canxihydroxycitrat tổng hợp được nằm trong khoảng cho phép.

Kiến nghị 1/

(-)-HCA có tính năng chống béo phì hiệu quả được cung cấp chủ

yếu dưới dạng các muối. Vì vậy, chúng ta nên tiếp tục nghiên cứu theo hướng

74

điều chế và ứng dụng các muối của (-)-HCA ở dạng muối kép để tăng hiệu quả trong sản xuất dược liệu hay thực phẩm chức năng với mục đích giảm cân.

2/

Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách (-)-HCA từ vỏ quả bứa

theo quy mô công nghiệp để sản xuất thực phẩm giảm cân chứa (-)-HCA tại Việt Nam.

75

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1]. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2003), Đồ hộp- phương pháp

xác định hàm lượng axit tổng số và axit bay hơi, Quyết định số 76/2003/QĐ-BNN. [2].

Bộ Y Tế (1998), Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực

phẩm, Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT. [3].

Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở Hoá

học phân tích, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

[4].

Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Hà Nội.

[5].

Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh.

[6].

Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học Hà Nội.

[7].

Hồ Viết Quý (1998), Các phương pháp phân tích hiện đại và ứng dụng

trong hoá học, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

[8].

Đặng Quang Vinh (2007), Nghiên cứu chiết tách và xác định axit hydroxy citric trong lá, vỏ quả của cây bứa, Luận văn thạc sĩ khoa học hoá hữu cơ, Khoa hoá, Đại học Đà Nẵng.

Tiếng Anh [9].

BhabaniS.Jena,

Guddadarangavvanahally,

Jayaprakasha,

Kunnumpurath K. Sakariah (2002), "Organic Acids from Leaves, Fruits, and Rinds of Garcinia cowa", Journal of Agricultural and Food

chemistry, 50(12), 3431- 3434.

76

[10]. Gokaraju et al. (2005), “New double salts of (-)-hydroxycitric acid and a process for preparing the same”, International Application Published

under The Patent Cooperation Treaty (PCT), WO 2005/099679 A1.

[11]. Gokaraju et al. (2007), “Triple mineral salts of (-)-hydroxycitric acid and processes for preparing the same”, United States Patent US

7,208,615 B2.

[12].

Jayaprakasha, K. Sakariah, K. K (1998), “Determination of organic acids

in

Garcinia cambogia (Desr.) by HPLC”, Journal of

Chromatography A, 806(2), 337-339.

[13]. Karanam Balasubramanyam, Bhaskaran Chandrasekhar, Candadai Seshadri Ramadoss, Pillarisetti Venkata Subba Rao (2000), “Soluble double metal salt of group ia and iia of (-) hydroxycitric acid, process of preparing the same and its use in beverages and other food products without effecting their flavor and properties”, United States Patent US 6,160,172.

[14]. Lowenstein, J. M. (1971), “Effect of (-)-hydroxyxitrat on fatty acid synthesis by rat liver inViVo”, The Journal of Biological Chemistby, 246(3), 629-632.

[15]. Muhammed Majeed, Vladimir Badmaev, Ramaswamy Rajendran (2004), “Process for the production of potassium hydroxy citric acid, and compositions containing the potassium hydroxy citric acid”, United

States Patent US 6,770,782 B1.

[16]. Samuel et al. (2007), “Hydroxycitric acid complex metal salts, composition, and methods”, United States Patent US 7, 214,823 B2.

[17]. Shrivastava et al. (2001), “Magnesium (-)hydroxycitrate, method of preparation, applications, and compositions in particular pharmaceutical

77

containing same”, United States Patent US 6,221,901 B1.

[18]. Soni MG, Burdock GA, Preuss HG, Stohs SJ, Ohia SE, Bagchi D. (2004), “Safety assessment of (-)-hydroxycitric acid and Super CitriMax, a novel calcium/potasium salt”, Food and Chemical

Toxicology, 42(9), 1513-1529.

i

LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thanh Hưng

ii

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... vi DANG MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................vii DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................viii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1. Lý do chọn đề tài .............................................................................................. 1 2. Mục đích nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..................................................................... 3 3.1. Đối tượng nghiên cứu: .............................................................................. 3 3.2. Phạm vi nghiên cứu: ................................................................................. 3 4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 3 4.1. Nghiên cứu lý thuyết: ............................................................................... 3 4.2. Phương pháp thực nghiệm: ....................................................................... 3 5. Ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của đề tài .................................................... 4 6. Cấu trúc của luận văn ....................................................................................... 4 CHƯƠNG 1 . TỔNG QUAN................................................................................... 5 1.1. CÂY BỨA .................................................................................................... 5 1.1.1. Bộ chè ................................................................................................... 5 1.1.1.1. Họ Chè (Theaceae) ......................................................................... 5 1.1.1.2. Họ Măng cụt (Clusiaceae) .............................................................. 5 1.1.2. Bứa........................................................................................................ 6 1.1.3. Phân loại bứa ......................................................................................... 7 1.1.3.1. Bứa mọi.......................................................................................... 7 1.1.3.2. Bứa mủ vàng .................................................................................. 9 1.1.3.4. Garcinia cowa Roxb ..................................................................... 11 1.1.3.5. Garcinia cambogia........................................................................ 13

iii

1.1.3.6. Garcinia indica ............................................................................. 14 1.1.3.7. Garcinia atro Viridis ..................................................................... 15 1.1.3.8. Garcinia dulcis ............................................................................. 16 1.1.3.9. Garcinia hombroniana .................................................................. 16 1.1.3.10. Garcinia echinocarpa .................................................................. 17 1.1.4. Dẫn xuất của HCA .............................................................................. 17 1.1.4.1. Hoá học của (-)-HCA .................................................................. 17 1.1.4.2. Muối của HCA ............................................................................ 24 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP KĨ THUẬT ............................................................ 31 1.2.1. Các phương pháp phân huỷ mẫu phân tích .......................................... 31 1.2.2. Phương pháp trọng lượng .................................................................... 32 1.2.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu ................................................... 32 1.2.2.2. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu ...................................... 32 1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................................ 33 1.2.4. Phương pháp chuẩn độ axit- bazơ ....................................................... 34 1.2.5. Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) ............................. 34 1.2.6. Phương pháp chưng ninh ..................................................................... 36 1.2.7. Phương pháp phân tích vi sinh vật ....................................................... 36 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 38 2.1. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - HÓA CHẤT ........................................................ 38 2.2. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ...................................................... 39 2.3. NGUYÊN LIỆU .......................................................................................... 40 2.3.1. Cây bứa ............................................................................................... 40 2.3.2. Thu nguyên liệu................................................................................... 41 2.3.3. Xử lý nguyên liệu ................................................................................ 41 2.4. Xác định một số tính chất vật lý ................................................................... 43 2.4.1. Xác định độ ẩm ................................................................................... 43 2.4.2. Xác định hàm lượng tro ....................................................................... 43

iv

2.4.4. Chuẩn độ tổng lượng axit thu được bằng phương pháp chuẩn độ axit- bazơ ....................................................................................... 44 2.4.5. Chưng ninh bằng nồi áp suất để thu dịch chiết axit .............................. 45 2.4.6. Xác định hàm lượng HCA trong mẫu bằng phương pháp HPLC ........................................................................................................... 46 2.4.7. Tổng hợp muối canxi hydroxycitrat của HCA .................................... 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 50 3.1. MỘT SỐ TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA NGUYÊN LIỆU ............................. 50 3.1.1. Độ ẩm của nguyên liệu ........................................................................ 50 3.1.2. Hàm lượng tro ..................................................................................... 50 3.1.3. Xác định thành phần kim loại bằng phương pháp AAS........................ 51 3.1.4. Xác định tổng lượng axit trong mẫu chiết bằng phương pháp chuẩn độ .................................................................................. 52 3.2. Xác định HCA trong mẫu chiết bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ................ 53 3.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn .......................................................... 53 3.2.2. Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa .................................. 54 3.3.TỔNG HỢP MUỐI CANXI CỦA HCA ....................................................... 57 3.3.1 Quy trình ............................................................................................. 57 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chuyển hoá tạo muối Canxi của HCA ........................................................................ 58 3.3.3. Khảo sát theo thể tích ......................................................................... 59 3.3.4. Khảo sát theo thời gian ....................................................................... 61 3.3.5. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng phổ hồng ngoại (IR) ................. 62 3.3.6. Kiểm tra sản phẩm muối HCCa bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) .............................................................................................. 65 3.5. Tinh chế muối .............................................................................................. 67 3.6. Kiểm tra hàm lượng canxi trong sản phẩm muối HCCa ............................... 71 3.7. Kiểm tra các chỉ tiêu Vi sinh vật trong sản phẩm muối HCCa. ..................... 72

v

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 75 QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO) PHỤ LỤC.

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AAS

: Atomic Absorption Spectrometric

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

IR

: Infrared spectroscopy

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Mô tả các đặc điểm của HCA

20

3.1

Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ quả bứa sấy khô

50

3.2

Kết quả xác định tỉ lệ tro trong vỏ quả bứa sấy khô

50

3.3

Kết quả xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ

51

bứa 3.4

Kết quả xác định tổng lượng axit trong vỏ quả Bứa

52

3.5

Kết quả xác định axit hữu cơ trong vỏ quả Bứa bằng

55

HPLC 3.6 3.7

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối thu được vào pH Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối thu

58 60

được vào thể tích axit 3.8.

Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của khối lượng muối thu

61

được vào thời gian khuấy trộn 3.9

Kết quả diện tích pic của phổ HPLC của sản phẩm muối

71

HCCa 3.10

Kết quả hàm lượng canxi trong muối HCCa bằng AAS

71

3.11

Kết quả xác định một số chỉ tiêu vi sinh của muối

72

canxi hydroxycitrat.

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình

Tên hình

Trang

1.1

Quả, lá, hoa và cây bứa ở Quảng Ngãi

6

1.2

Cây bứa mọi ở Quảng Ngãi

8

1.3

Hoa, lá, quả của cây bứa mủ vàng

9

1.4

Cây bứa nhà ở Quảng Ngãi

10

1.5

Quả tai chua ở Quảng Ngãi

12

1.6

Lá, quả Garcinia cambogia

13

1.7

Cây, quả Garcinia Indica và Kokam

14

1.8

Hoa, lá, quả và cây Garcinia atroViridis

15

1.9

Quả Garcinia dulcis

16

1.10

Quả Garcinia hombroniana

16

1.11

Lá, hoa của Garcinia echinocarpa

17

1.12

Cấu trúc đồng phân của axit hiđroxi xitric

19

1.13

Cấu trúc của axit hiđroxi xitric lacton

19

1.14

Cấu thức thông thường các muối một kim loại

25

1.15

Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm IA

26

và IIA 1.16

Công thức thông thường muối cặp kim loại nhóm II

27

1.17

Công thức thông thường muối ba kim loại

28

2.1

Tủ sấy và lò nung

38

2.2

Hoá chất CaCl2 và NaOH

38

2.3

Cây và quả bứa ở Quảng Ngãi

40

2.4

Quả bứa ở Quảng Ngãi

41

ix

2.5

Vỏ bứa đã làm sạch

42

2.6

Mẫu vỏ quả bứa khô cắt nhỏ

42

2.7

Mẫu vỏ quả bứa khô dạng bột mịn

42

2.8

Dịch chiết chưa tẩy màu

46

2.9

Dịch chiết đã tẩy màu

46

2.10

Dịch chiết sau khi cô đặc

46

2.11

Kết tủa pectin

46

2.12

Lọ chất chuẩn

48

2.13

Muối HCCa tạo thành

49

2.14

Muối HCCa đã sấy khô

49

3.1

Đường chuẩn HCA

53

3.2

Đường chuẩn axit citric

54

3.3

Sắc kí đồ mẫu axit HCA chuẩn

55

3.4

Sắc kí đồ mẫu vỏ Bứa khô trong nước

56

3.5

Muối HCCa tạo thành

57

3.6

Muối HCCa đã sấy khô

57

3.7

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng

59

muối thu được vào pH 3.8

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng

60

muối thu được vào thể tích axit 3.9

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng

62

muối thu được vào thời gian khuấy trộn 3.10

Máy đo phổ hồng ngoại (IR)

62

3.11

Phổ IR của HCCa chuẩn

63

3.12

Phổ IR của muối HCCa

64

x

3.13

Phổ HPLC của (-)-HCCa chuẩn

65

3.14

Sắc kí đồ của muối HCCa

66

3.15

Máy HPLC (D-7000)

67

3.16

Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 1

68

3.17

Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 2

69

3.18

Sắc kí đồ của muối HCCa tinh chế lần 3

70