NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO BẠC SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT LÁ ĐIỀU (Anacardium occidentale)

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO BẠC

vectorstock.com/25513003

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO BẠC SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT LÁ ĐIỀU (Anacardium occidentale) BY TRƯƠNG QUANG TOẢN WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO BẠC SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT LÁ ĐIỀU (Anacardium occidentale)

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành:

7420201

Sinh viên thực hiện:

TRƯƠNG QUANG TOẢN

Mã số sinh viên:

15126152

Niên khóa:

2015 - 2019

Tháng 09 năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HẠT NANO BẠC SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT LÁ ĐIỀU (Anacardium occidentale)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

TRƯƠNG QUANG TOẢN

Tháng 09 năm 2019

LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy TS. Huỳnh Văn Biết – người thầy kính yêu đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:  Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nhiệm Bộ môn, các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học – trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường.  Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường – trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện để em có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  Thầy PGS. TS. Lê Quang Luân và các anh, chị phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano – Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thực tập và chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý báu trong lĩnh vực Vật liệu Nano.  Chị KS. Phạm Thị Hồng Phi, chị ThS. Nguyễn Thị Thu, chị ThS. Đào Uyên Trân Đa, bạn Louis-Paul Clerc, em Đoàn Huyền Thư và các bạn phòng Sinh học Phân tử – Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã cùng đồng hành và giúp đỡ em trong suốt thời gian hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Cuối cùng con xin gửi lời biết ơn chân thành, sâu sắc nhất đến cha mẹ, người đã nuôi nấng, tạo mọi điều kiện để con có thể học tập và rèn luyện bản thân cho đến ngày hôm nay.

Xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN CỦA TÁC GIẢ Tôi cam đoan kết quả trình bày trong khóa luận này là do tôi thực hiện.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 09 năm 2019 Người thực hiện

Trương Quang Toản i

TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, hạt nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh sử dụng dịch chiết lá điều (Anacardium occidentale). Các nhóm chất alkaloid, saponin và tannin có mặt trong dịch chiết đóng vai trò là tác nhân khử và ổn định hạt nano bạc. Quy trình tổng hợp nano bạc được tối ưu là: 10 ml AgNO3 1 mM và 100 μl dịch chiết lá điều tại 90oC trong vòng 60 phút. Đặc tính của hạt nano bạc được kiểm tra bằng phương pháp UV-vis, đỉnh hấp thụ ánh sáng tối đa của dung dịch là 420 nm cho thấy sự có mặt của nano bạc trong dung dịch. Đặc điểm của hạt nano bạc như hình dạng và kích thước được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy hạt nano bạc có kích thước từ 6 – 32 nm. Khả năng ức chế sự phát triển nấm của dung dịch nano bạc được đánh giá bằng cách kiểm tra sự ức chế nấm Colletotrichum capsici trong điều kiện in-vitro. Nano bạc có sự ức chế đáng kể lên sự phát triển của nấm Colletotrichum capsici, sự phát triển của sợi nấm bị ức chế khoảng 72% trong môi trường có bổ sung nano bạc với nồng độ 50 ppm. Nấm bị tiêu diệt hoàn toàn khi tiếp xúc với dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm trong 10 phút. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của nano bạc trong việc thay thế các loại thuốc hóa học để phòng trừ bệnh thán thư trên ớt do nấm Colletotrichum capsici gây ra.

Từ khóa: Anacardium occidentale; Colletotrichum capsici; nano bạc.

ii

SUMMARY In this study, green synthesis of silver nanoparticles was done using leaf extracts of cashew (Anacardium occidentale). The alkaloids, saponins and tannins present in the extract act as both reducing and capping agent. The optimized silver nanoparticles synthesis process is 10 ml AgNO3 1 mM and 100 Οl extract, at 90 °C for 1 hour. The formation of nanosilver was confirmed by UV-Vis Spectroscopy. The absorbance peak at 420 nm indicated the presence of silver nanoparticles in the solution. The characterization of the AgNPs such as their size and shape was performed by Transmission Electron Microscopy (TEM) techniques which indicated a size range of 6 to 32 nm. The ability to inhibit fungal growth of nano silver solution was assessed by examining the inhibition of Colletotrichum capsici in in-vitro. Silver nanoparticle has the ability to significantly inhibit the growth of Colletotrichum capsici. Mycelium growth was inhibited about 72% in PGA medium with 50 ppm concentration of silver nanoparticles. The fungus was completely killed when exposed to 100 ppm nano-silver solution for 10 minutes. The results of this study show the potential of silver nanoparticle in replacing chemical fungicides to prevent anthracnose on chili caused by Colletotrichum capsici.

Keywords: Anacardium occidentale; Colletotrichum capsici; silver nanoparticle.

iii

MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i XÁC NHẬN CỦA TÁC GIẢ...........................................................................................i TÓM TẮT....................................................................................................................... ii SUMMARY................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................... viii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................ix Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài..................................................................................................... 2 1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1 Vật liệu nano bạc ....................................................................................................... 3 2.1.1 Giới thiệu vật liệu nano bạc .................................................................................... 3 2.1.2 Tính chất hạt nano bạc ............................................................................................ 3 2.1.2.1 Tính chất quang học ............................................................................................ 4 2.1.2.2 Tính chất điện ...................................................................................................... 4 2.1.2.3 Tính chất từ .......................................................................................................... 5 2.1.2.4 Tính chất nhiệt ..................................................................................................... 5 2.1.2.5 Tính chất xúc tác ................................................................................................. 5 2.1.3 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc ......................................................................... 6 2.1.3.1 Phương pháp vật lý .............................................................................................. 6 2.1.3.2 Phương pháp hóa học .......................................................................................... 7 2.1.3.3 Phương pháp sinh học ......................................................................................... 8 2.1.4 Ứng dụng hạt nano bạc trong nông nghiệp ............................................................ 9 2.1.4.1 Đối với trồng trọt ................................................................................................. 9 2.1.4.2 Đối với thủy sản .................................................................................................. 9 iv

2.1.4.3 Đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm ................................................................... 10 2.2 Cây điều (Anacardium occidentale) ........................................................................ 10 2.2.1 Mô tả thực vật ....................................................................................................... 10 2.2.2 Một số công dụng chính ....................................................................................... 11 2.3 Nấm Colletotrichum capsici và bệnh thán thư trên ớt ............................................ 12 2.3.1 Bệnh thán thư trên ớt ............................................................................................ 12 2.3.2 Nấm Colletotrichum capsici ................................................................................. 14 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... Error! Bookmark not defined.

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 16 3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 16 3.2.1 Mẫu thực vật ......................................................................................................... 16 3.2.2 Mẫu vi sinh ........................................................................................................... 16 3.2.3 Thiết bị .................................................................................................................. 16 3.2.4 Dụng cụ................................................................................................................. 16 3.2.5 Hóa chất ................................................................................................................ 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 16 3.3.1 Chiết dịch từ lá điều.............................................................................................. 16 3.3.2 Định tính các nhóm chất hóa học trong dịch chiết lá điều ................................... 17 3.3.2.1 Định tính nhóm chất tannin ............................................................................... 17 3.3.2.2 Định tính nhóm chất flavonoid .......................................................................... 17 3.3.2.3 Định tính nhóm chất saponin ............................................................................... 17 3.3.2.4 Định tính nhóm chất alkaloid .............................................................................. 17 3.3.3 Tổng hợp hạt nano bạc ......................................................................................... 17 3.3.4 Kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của nano bạc ....................................................... 18 3.3.5 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc .............................................................. 18 3.3.5.1 Khảo sát thể tích dịch chiết lá điều .................................................................... 18 3.3.5.2 Khảo sát nhiệt độ tạo nano bạc .......................................................................... 19 3.3.5.3 Khảo sát thời gian tạo nano bạc......................................................................... 19 3.3.6 Kiểm tra hình dạng và kích thước hạt nano bạc ................................................... 19 3.3.7 Khảo sát khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của nano bạc ................. 20 3.3.7.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên sự phát triển ...................... 20 v

3.3.7.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với nano bạc ............................. 20 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 21 4.1 Định tính các nhóm chất hóa học trong dịch chiết lá điều ...................................... 21 4.1.1 Định tính nhóm chất tannin .................................................................................. 21 4.1.2 Định tính nhóm chất flavonoid ............................................................................. 21 4.1.3 Định tính nhóm chất saponin ................................................................................ 22 4.1.4 Định tính nhóm chất alkaloid ............................................................................... 23 4.2 Tổng hợp nano bạc .................................................................................................. 23 4.3 Kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của nano bạc .......................................................... 24 4.4 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc ................................................................. 25 4.4.1 Khảo sát thể tích dịch chiết lá điều ....................................................................... 25 4.4.2 Khảo sát nhiệt độ tạo nano bạc ............................................................................. 26 4.4.3 Khảo sát thời gian tạo nano bạc............................................................................ 26 4.5 Kiểm tra hình dạng và kích thước hạt nano bạc ...................................................... 27 4.6 Khảo sát khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của nano bạc .................... 28 4.6.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ lên khả năng ức chế nấm .......................... 28 4.6.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc lên khả năng ............................... 30 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 32 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 32 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 33 PHỤ LỤC

vi

vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT AgNPs

silver nanoparticles

Ctv

cộng tác viên

PGA

potato glucose agar

TEM

Transmission Electron Microscopy

UV-vis

ultraviolet-visible

viii

DANH SÁCH HÌNH Tên hình ................................................................................................................ trang Hình 2.1 Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt .............................................. 3 Hình 2.2 Sự phụ thuộc của màu sắc dung dịch nano bạc vào hình dạng............. 3 Hình 2.3 Cây điều (Anacardium occidentale) ..................................................... 11 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh thán thư trên ớt do nấm .......................................... 13 Hình 2.5 Bào tử nấm C. capsici .......................................................................... 14 Hình 2.6 Nấm C. capsici trên môi trường PGA .................................................. 14 Hình 4.1 Kết quả định tính nhóm chất tannin. .................................................... 21 Hình 4.2 Kết quả định tính nhóm chất flavonoid. .............................................. 22 Hình 4.3 Kết quả định tính nhóm chất saponin. ................................................. 22 Hình 4.4 Kết quả định tính nhóm chất alkaloid. .................................................. 23 Hình 4.5 Kết quả tổng hợp nano bạc. .................................................................. 24 Hình 4.6 Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch nano bạc ..................................... 24 Hình 4.7 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc ................. 25 Hình 4.8 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc ................. 26 Hình 4.9 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc ................. 26 Hình 4.10 Hình dạng và kích thước hạt nano bạc................................................ 27 Hình 4.11 Phân bố kích thước hạt nano bạc ........................................................ 28 Hình 4.12 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc. .............. 28 Hình 4.13 Sợi nấm C. capsici dưới kính hiển vi.................................................. 29 Hình 4.14 Nấm C. capsici trên môi trường PGA ................................................ 30 Hình 4.15 Sợi nấm C. capsici dưới kính hiển vi.................................................. 31

ix

DANH SÁCH BẢNG Tên bảng ............................................................................................................... trang Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thể tích dịch chiết đến khả năng ức chế nấm ............. 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp đến khả năng ức chế nấm. ............. 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian tổng hợp đến khả năng ức chế nấm ............. 27 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát triển của ........... 29 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với nano bạc lên tỉ lệ ức chế .......... 30

x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Công nghệ nano là một lĩnh vực công nghệ mới đã và đang cuốn hút không chỉ các nhà nghiên cứu khoa học mà còn cả các ngành công nghiệp vì tính ứng dụng cao của nó đối với cuộc sống của con người. Các sản phẩm của công nghệ nano đã được thương mại hóa và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như điện tử, y học, sinh học, hóa học, môi trường, dệt may, mỹ phẩm, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Một trong những sản phẩm được ứng dụng rộng rãi nhất của công nghệ nano đó là hạt nano bạc.

Từ xa xưa bạc đã được con người dùng để phòng bệnh do có đặc tính kháng lại một số chủng vi khuấn, vi rút, tảo, nấm. Tuy nhiên, khi chúng ở kích thước nano thì các tính chất vật lý, hóa học, sinh học khác hẳn so với dạng khối, đặc biệt khá năng kháng khuẩn của bạc ở kích thước nano (từ 1-100 nm) tăng lên gấp 50.000 lần so với kích thước bạc dạng khối. Như vậy, 1 gam bạc nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm mét vuông chất nền. Mặt khác, khi bạc có kích thước phân tử từ 3 - 5 nm, với kích thước vi mô này nano bạc có khả năng bao bọc và phá vỡ cấu trúc tế bào của vi khuẩn, từ đó vô hiệu hóa sự phát triển của chúng. Từ năm 1973, các nghiên cứu đều cho thấy rằng dưới tác dụng của các hạt nano bạc, tế bào của hơn 650 loài vi khuẩn bị phá hủy và tiêu diệt.

Ngoài ra, nano bạc còn có tính năng ngăn mùi hôi, kháng khuẩn và ngăn ngừa vi khuẩn phát sinh tới 99,99%, ích lợi hơn gấp nhiều lần so với các sản phẩm kháng khuẩn khác. Đồng thời không gây tác dụng phụ cho người sử dụng, không gây độc cho con người, vật nuôi và không gây ô nhiễm môi trường.

Hiện nay, trong nước và trên thế giới có rất nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra nano bạc, trong đó phương pháp hóa học vẫn được sử dụng chủ yếu, tuy nhiên phương pháp này thường tạo ra nhiều chất thải độc hại cho con người cũng như môi trường sinh thái. Do đó, một phương pháp mới đang được khá nhiều người quan tâm đó là tổng hợp nano bạc sử dụng các hợp chất tách chiết từ thực vật, phương pháp này có tính ưu việt hơn phương pháp hóa học, quy trình, thao tác thực hiện khá đơn giản, chi phí thấp và giảm được đáng kể các chất thải độc hại ra môi trường.

Cây điều (Anacardium occidentale) là một loại cây công nghiệp được trồng rất 1

nhiều tại Việt Nam, sản phẩm thu hoạch chủ yếu là hạt điều. Tuy không có lợi ích về mặt kinh tế nhưng lá điều lại là một vị thuốc dân gian được sử dụng trong việc điều trị bệnh, đặc biệt là các bệnh ngoài da vì dịch chiết lá điều có tính kháng sinh, có khả năng kháng lại nấm, vi khuẩn và ký sinh trùng. Một số nghiên cứu đã cho thấy thành phần của dịch chiết lá điều có chứa các nhóm chất quan trọng như alkaloid, tannin, saponin và đường do đó rất thích hợp cho việc sử dụng làm tác nhân khử trong việc tổng hợp nano bạc.

Với những lý do đã nêu trên “Nghiên cứu tổng hợp hạt nano bạc sử dụng dịch chiết lá điều (Anacardium occidentale)” đã được thực hiện.

1.2 Mục tiêu của đề tài Tổng hợp thành công hạt nano bạc bằng phương pháp hóa học xanh, sử dụng dịch chiết lá điều (Anacardium occidentale) làm tác nhân khử.

1.3 Nội dung thực hiện Tách chiết dịch chiết lá điều (Anacardium occidentale) Phân tích định tính một số nhóm chất quan trọng có trong dịch chiết Tổng hợp hạt nano bạc và tối ưu quy trình tổng hợp Khảo sát khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của dung dịch nano bạc tổng hợp được

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vật liệu nano bạc 2.1.1 Giới thiệu vật liệu nano bạc Nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Nano bạc có nhiều ưu điểm vượt trội nhờ vào diện tích bề mặt lớn nên có thể giải phóng được lượng ion Ag + lớn hơn rất nhiều so với bạc dạng khối.

Các hạt nano kim loại nói chung và nano bạc nói riêng đều xảy ra hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt (Hình 2.1). Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen tùy vào hình dạng, kích thước và nồng độ của dung dịch nano bạc (Hình 2.2) (Trần Thu Hà, 2011).

Hình 2.1 Hiện tượng cộng hưởng

Hình 2.2 Sự phụ thuộc của màu sắc

plasmon bề mặt của hạt nano bạc

dung dịch nano bạc vào hình dạng và

(www.sigmaaldrich.com).

kích thước hạt (Kevin, 2009).

Nano bạc có khả năng kháng khuẩn với phổ rất rộng và không gây hiện tượng kháng thuốc như các loại kháng sinh nhờ một cơ chế rất đặc biệt. Đầu tiên nano bạc sẽ kết hợp với thành tế bào của vi khuẩn, sau đó sẽ xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn, kết hợp với sulphydryl (SH) của enzyme chuyển hóa oxi làm chặn quá trình hô hấp và trao đổi chất, cuối cùng là tiêu diệt vi khuẩn.

2.1.2 Tính chất hạt nano bạc Hạt nano kim loại có hai tính chất khác biệt so với vật liệu khối đó là hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước. Tuy nhiên, do đặc điểm các hạt nano có tính kim loại, tức 3

là có mật độ điện tử tự do lớn thì các tính chất thể hiện có những đặc trưng riêng khác với các hạt không có mật độ điện tử tự do cao.

2.1.2.1 Tính chất quang học Tính chất quang học của hạt nano bạc trộn trong thủy tinh làm cho các sản phẩm từ thủy tinh có các màu sắc khác nhau đã được người La Mã sử dụng từ hàng ngàn năm trước. Các hiện tượng đó bắt nguồn từ hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt (surface plasmon resonance) do điện tử tự do trong hạt nano hấp thụ ánh sáng chiếu vào. Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dưới tác dụng của điện từ trường bên ngoài như ánh sáng. Thông thường các dao động bị dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể trong kim loại khi quãng đường tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thước. Nhưng khi kích thước của kim loại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình thì hiện tượng dập tắt không còn nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hưởng với ánh sáng kích thích. Do vậy, tính chất quang của hạt nano được có được do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến từ quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Ngoài ra, mật độ hạt nano cũng ảnh hưởng đến tính chất quang. Nếu mật độ loãng thì có thể coi như gần đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hưởng của quá trình tương tác giữa các hạt (Klabunde và ctv, 2009).

2.1.2.2 Tính chất điện Tính dẫn điện của kim loại rất tốt, hay điện trở của kim loại nhỏ nhờ vào mật độ điện tử tự do cao trong đó. Đối với vật liệu khối, các lí luận về độ dẫn dựa trên cấu trúc vùng năng lượng của chất rắn. Điện trở của kim loại đến từ sự tán xạ của điện tử lên các sai hỏng trong mạng tinh thể và tán xạ với dao động nhiệt của nút mạng (phonon). Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại (dòng điện I) dưới tác dụng của điện trường (U) có liên hệ với nhau thông qua định luật Ohm: U = IR, trong đó R là điện trở của kim loại. Định luật Ohm cho thấy đường I-U là một đường tuyến tính. Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc vùng năng lượng. Hệ quả của quá trình lượng tử hóa này đối với hạt nano là I - U không còn tuyến 4

tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I - U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực (Klabunde và ctv, 2009).

2.1.2.3 Tính chất từ Theo Klabunde và ctv (2009) các kim loại quý như vàng, bạc,... có tính nghịch từ ở trạng thái khối do sự bù trừ cặp điện tử. Khi vật liệu thu nhỏ kích thước thì sự bù trừ trên sẽ không toàn diện nữa và vật liệu có từ tính tương đối mạnh. Các kim loại có tính sắt từ ở trang thái khối như các kim loại chuyển tiếp sắt, cô ban, ni ken thì khi kích thước nhỏ sẽ phá vỡ trật tự sắt từ làm cho chúng chuyển sang trạng thái siêu thuận từ. Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi có từ trường và không có từ tính khi từ trường bị ngắt đi, tức là từ dư và lực kháng từ hoàn toàn bằng không.

2.1.2.4 Tính chất nhiệt Nhiệt độ nóng chảy Tm của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể. Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các nguyên tử lân cận nhất định có liên kết mạnh gọi là số phối vị. Các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ có số phối vị nhỏ hơn số phối vị của các nguyên tử ở bên trong nên chúng có thể dễ dàng tái sắp xếp để có thể ở trạng thái khác hơn. Như vậy, nếu kích thước của hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm. Ví dụ, hạt vàng 2 nm có Tm = 500°C, kích thước 6 nm có Tm = 950°C (Kildeby và ctv, 2005).

2.1.2.5 Tính chất xúc tác Do hạt nano có số lượng nguyên tử hoạt động trên bề mặt lớn hơn so với kim loại khối nên hạt nano sử dụng trong xúc tác sẽ tốt hơn so với các chất rắn thông thường. Hạt nano có cấu trúc rất chặt chẽ về kích thước nguyên tử mà lượng lớn khác thường của các nguyên tử có trên bề mặt. Có thể đánh giá sự tập trung này bởi công thức: Ps = 4N(-1/3)×100 Trong đó: Ps: tỉ số của số nguyên tử trên bề mặt N: Tổng số nguyên tử trong hạt vật liệu Một hạt nano với 13 nguyên tử ở cấu hình lớp vỏ ngoài thì có tới 12 nguyên tử trên bề mặt và chỉ một ở phía trong. Hạt nano bạc 3 nm có chứa khoảng 1000 nguyên tử thì có 40% tổng số nguyên tử trên bề mặt. Hạt có đường kính 150 nm chứa khoảng 107 5

nguyên tử thì có khoảng 1% nguyên tử trên bề mặt. Từ hiệu ứng bề mặt này, có sự thay đổi khả năng phản ứng của hạt nano từ hiệu ứng giam cầm điện tử. Từ sự thay đổi này trong cấu trúc điện tử có thể làm tăng hoạt tính xúc tác một cách đặc biệt trong hạt nano mà khác rất nhiều so với hiệu ứng ở vật liệu khối. Phổ quang học chỉ ra rằng cấu trúc điện tử của kim loại nhỏ hơn khoảng 5 nm so với vật liệu khối. Một lượng nhỏ các nguyên tử kéo theo kết quả của sự thành lập các dải electron với phạm vi của các electron hóa trị lớn hơn, và trong vùng nhỏ hơn của dải hóa trị. Sự biến đổi năng lượng và cấu trúc điện tử được phát ra bởi độ cong bề mặt của hạt nano kim loại làm tăng độ co bóp của hàng rào so với vật liệu khối. Hằng số hàng rào nhỏ hơn là nguyên nhân làm thay đổi trung tâm của dải d tới những năng lượng cao hơn, làm tăng khả năng phản ứng của bề mặt chất bị hút bám.

Có sự gia tăng một số cạnh và góc trong hàng rào kim loại và điều này có thể làm cho phản ứng khác so với bề mặt phẳng của kim loại. Sự gia tăng phản ứng tại những vị trí sắp xếp hụt của các hạt có thể rất lớn, nó quyết định một mức độ rất lớn hoạt tính xúc tác của vật liệu, mặc dù sự tập trung này là rất thấp.

Những hạt nano của một dãy lớn của sự chuyển tiếp giữa kim loại và oxit kim loại đã được tìm thấy những hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào kích thước hạt, điều này đang được nghiên cứu mạnh mẽ. Hình dạng, sự ổn định và sắp xếp của các hạt đã được chứng minh là có ảnh hưởng tới hoạt tính xúc tác và vì thế cũng là đề tài của nhiều nghiên cứu hiện nay. Trong các ứng dụng cụ thể của hạt nano, hoạt tính xúc tác cần đến một chất nền phù hợp để ổn định, bảo vệ, ngăn ngừa sự kết tụ và có thể thu hồi lại. Hiện nay có nhiều sự quan tâm trong việc tìm kiếm các phương pháp có hiệu quả để chế tạo vật liệu xúc tác có hạt nano với các chất nền như các oxit vô cơ, nhôm, silica và titan hay các polyme (Klabunde và ctv, 2009).

2.1.3 Phương pháp chế tạo hạt nano bạc 2.1.3.1 Phương pháp vật lý Phương pháp vật lý bao gồm ba phương pháp chính thường được sử dụng trong nghiên cứu là phương pháp cơ học và phương pháp bốc bay và phương pháp hình thành từ pha khí (gas - phase).

Phương pháp cơ học bao gồm các phương pháp tán, nghiền, hợp kim cơ học, vật liệu ở dạng bột được nghiền đến kích thước nhỏ hơn. Ngày nay, các máy nghiền thường 6

dùng là máy nghiền kiểu hành tinh hay máy nghiền quay. Phương pháp này thường được dùng để tạo vật liệu không phải là hữu cơ như là kim loại (Michael và ctv, 2004).

Phương pháp bốc bay gồm các phương pháp quang khắc (lithography), bốc bay trong chân không (vacuum deposition), vật lí, hóa học. Các phương pháp này áp dụng hiệu quả để chế tạo màng mỏng hoặc lớp bao phủ bề mặt tuy vậy cũng có thể dùng nó để chế tạo hạt nano bằng cách cạo vật liệu từ đế. Tuy nhiên phương pháp này không hiệu quả lắm để có thể chế tạo ở quy mô thương mại (Michael và ctv, 2004).

Phương pháp hình thành từ pha khí (gas - phase) gồm các phương pháp nhiệt phân (flame pyrolysis), nổ điện (electro-explosion), đốt laser (laser ablation), bốc bay nhiệt độ cao, plasma. Nguyên tắc của các phương pháp này là hình thành vật liệu nano từ pha khí. Nhiệt phân là phương pháp có từ rất lâu, được dùng để tạo các vật liệu đơn giản như carbon, silicon. Phương pháp đốt laser thì có thể tạo được nhiều loại vật liệu nhưng lại chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm vì hiệu suất của chúng thấp. Phương pháp plasma một chiều và xoay chiều có thể dùng để tạo rất nhiều vật liệu khác nhau nhưng lại không thích hợp để tạo vật liệu hữu cơ vì nhiệt độ của nó có thể đến 9000oC. Phương pháp hình thành từ pha khí dùng chủ yếu để tạo lồng carbon (fullerene) hoặc ống carbon, rất nhiều các công ty dùng phương pháp này để chế tạo (Michael và ctv, 2004).

2.1.3.2 Phương pháp hóa học Phương pháp hóa học bao gồm hai phương pháp chính thường được sử dụng trong nghiên cứu là phương pháp hóa học ướt và hóa học xanh.

Phương pháp hóa ướt (wet chemical) bao gồm các phương pháp chế tạo vật liệu dùng trong hóa keo (colloidal chemistry), phương pháp thủy nhiệt, sol-gel và kết tủa.

Theo phương pháp này, các dung dịch chứa ion khác nhau được trộn với nhau theo một tỷ phần thích hợp, dưới tác động của nhiệt độ, áp suất mà các vật liệu nano được kết tủa từ dung dịch. Sau các quá trình lọc, sấy khô, thì thu được các vật liệu nano.

Trong phương pháp hóa học, phương pháp từ dưới lên thường sử dụng vì nó có khả năng kiểm soát tốt kích thước và độ phân tán của các hạt. Các tác nhân hóa học thường ở dạng dung dịch lỏng nên còn gọi đây là phương pháp hóa ướt. Dung dịch ban đầu có chứa các muối của các kim loại như HAuCl4, H2PtCl6, AgNO3. Tác nhân khử ion kim loại Ag +, Au+ thành Ag0, Au0 ở đây là các chất hóa học như Sodium citrate, Tanic acid, Vitamin C, Sodium Borohydride, Ethanol (cồn), Ethylene Glycol (phương pháp sử 7

dụng các nhóm rượu đa chức như thế này còn có một cái tên khác là phương pháp polyol). Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, phương pháp tĩnh điện được sử dụng để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt hóa bề mặt. Phương pháp tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử. Phương pháp bao phủ phức tạp hơn nhưng đồng thời tính chất các hạt vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Phương pháp thường được dùng để chế tạo các hạt nano Ag, Au, Pt, Pd, Rh với kích thước từ 10 đến 100 nm (Michael và ctv, 2004).

Phương pháp hóa học xanh là phương pháp tương tự với phương pháp hóa học ướt, tuy nhiên tác động xấu của các loại chất khử hóa học độc hại được giảm thiểu bằng cách thay thế chất khử bằng các hợp chất tự nhiên được tách chiết từ thực vật, tảo, nấm…

Nhờ sở hữu các thành phần có khả năng khử sinh học như peptide, acid sorbic, acid citric, euphol, polyhydroxy limonoid, acid ascorbic, acid retinoic, tannins và acid ellagic, các nhà khoa học tin rằng có thể sử dụng các dịch chiết tự nhiên này để tổng nano kim loại, trong đó có nano bạc mà không cần bổ sung tác nhân khử. Ngoài ra, thành phần của thực vật thường hay chứa các hoạt chất giúp làm bền hóa nano bạc mới được sinh ra như protein, amino acid, enzyme, polysaccharide, tannin, saponin…

Hiện nay, trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp thành công nano bạc bằng các dịch chiết từ thực vật như: Diệp hạ châu - Phyllanthus niruri (Suresh và ctv, 2015), Tỏi - Allium sativum (Von White và ctv, 2012), Chanh - Citrus medica (Prathna và ctv, 2011), Hành - Allium cepa (Saxena và ctv, 2010), Trà - Camellia sinensis (Sun và ctv, 2014),…

Trong phạm vi đề tài này, dịch chiết lá điều (Anacardium occidentale) được sử dụng với vai trò là tác nhân khử để tổng hợp nano bạc từ tiền chất bạc.

2.1.3.3 Phương pháp sinh học Khi khoa học ngày càng phát triển, con người lại càng chú ý hơn về các vấn đề bảo vệ sức khỏe cũng chính là bảo vệ môi trường. Hiện con người đang hướng về việc phát triển công nghệ xanh. Trong bối cảnh chạy đua để phát triển công nghệ xanh trong tổng hợp vật liệu, không dùng các hóa chất độc để tổng hợp nano kim loại, các nhà khoa học sử dụng vi sinh vật để tổng hợp các hạt nano. Phương pháp sinh học sử dụng các tác 8

nhân như nấm, vi khuẩn, vi rút có khả năng khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại.

Dưới tác dụng của những tác nhân này ion bạc sẽ bị chuyển thành hạt nano bạc. Đã có báo cáo rằng các hạt nano bạc có độ ổn định cao (40 nm) có thể được tổng hợp bằng cách hấp thụ các ion bạc dung dịch với sự có mặt của môi trường của vi khuẩn không gây bệnh, Bacillus licheniformis (Kalishwaralal và ctv, 2008). Các tinh thể nano bạc của các chế phẩm khác nhau được tổng hợp thành công bởi Pseudomonas stutzeri AG259 (Klaus và ctv, 1999). Các chủng vi khuẩn kháng bạc, Pseudomonas stutzeri AG259, phân lập từ một mỏ bạc, tích tụ các hạt nano bạc bên trong nội tạng, cùng với một số sulfua bạc, có kích thước từ 35 đến 46 nm (Slawson và ctv, 1992),… Tuy nhiên, phương pháp này hiện nay có hiệu suất tổng hợp nano bạc tương đối thấp.

2.1.4 Ứng dụng hạt nano bạc trong nông nghiệp 2.1.4.1 Đối với trồng trọt Phòng và trị bệnh do nấm, khuẩn và virus gây ra (thay thế hoàn thoàn thuốc bảo vệ thực vật hóa học dùng để phòng trị bệnh trên cây trồng). Sử dụng nano bạc thường xuyên định kỳ theo các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây giúp cây trồng ngăn ngừa chủ động từ xa dịch bệnh, giảm chi phí trong việc bảo vệ thực vật, tăng giá trị nông sản phẩm. Nâng cao khả năng hấp thụ ánh sáng cho bộ lá cây trồng qua đó làm Tăng hiệu suất quang hợp của cây trồng, tăng cường vận chuyển dinh dưỡng về các cơ quan dự trữ, giúp cây trồng tăng năng suất, sản lượng.

Sử dụng nano bạc trong việc sản xuất giá đỗ và rau mầm làm tăng chất lượng giá đỗ: giảm quá trình gây mùi hôi trong quá trình trồng rau mầm và sản xuất giá đỗ, tăng thời gian bảo quản, tiêu diệt vi khuẩn và nấm gây bệnh thối nhũn… Bổ sung nano bạc vào nước cắm hoa, giúp hoa tươi lâu, kéo dài thời gian chơi hoa, giảm mùi hôi thối và các bệnh thối nhũn hoa… (nanobacsuper.com).

2.1.4.2 Đối với thủy sản Nano bạc giúp cải thiện môi trường ao nuôi, giảm mùi hôi tanh của nước, phòng và trị bệnh do các vi sinh vật đơn bào gây ra trên tôm, cá, ba ba, ếch (nấm, vi khuẩn và virus gây bệnh). Nano bạc thể hiện vai trò diệt khuẩn cực mạnh trong môi trường nước.

Trong quá trình di chuyển và phân tán ở môi trường nước chúng vừa khử mùi và tiêu diệt mầm bệnh. Các hạt nano bạc tồn tại trong môi trường nước trong quá trình phân tán và di chuyển chúng sẽ bám hút nên bề mặt tế bào vi khuẩn và diệt chúng theo cơ chế 9

đặc thù. Các hạt nano bạc có kích thước nhỏ bé giải phóng liên tục ra các ion bạc, các ion bạc này tiêu diệt vi khuẩn thông qua các cơ chế khác nhau (nanobacsuper.com).

2.1.4.3 Đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm Nano bạc có tác dụng phòng và trị bệnh thông qua việc phun nano bạc trong môi trường sống của vật nuôi. Sử dụng nano bạc pha loãng với nước phun định kỳ 7 - 10 ngày có tác dụng phòng bệnh rất tốt, chúng sẽ tiêu diệt các nhóm vi khuẩn, nấm gây bệnh trên vật nuôi tồn tại ở môi trường sống. Ngoài ra nano bạc còn có tác dụng khử mùi hôi chuồng trại, giúp không khí sạch hơn qua đó phòng bệnh cho vật nuôi một cách chủ động (đặc biệt là bệnh hô hấp). Sử dụng nano bạc cho vật nuôi ăn hoặc uống: Tiêu diệt vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (tiêu chảy, phân trắng), phòng và trị bệnh cầu trùng trên gà… (nanobacsuper.com).

2.1.4.4 Vai trò của Nano Bạc đối với quá trình quang hợp của cây trồng Quang hợp là quá trình chuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học dự trữ cần thiết cho tất cả sinh vật trên trái đất. Khi cường độ ánh sáng yếu, khả năng hấp thụ ánh sáng vào lá kém do đó hiệu suất quang hợp bị giảm sút. Nano bạc làm tăng khả năng hấp thụ ánh sáng qua lá do đó tăng hiệu suất quang hợp. Quang phổ mặt trời là liên tục, do đó sự hấp thụ ánh sáng của các sắc tố quang hợp là gián đoạn mạnh nhất là tại vùng ánh sáng tím, xanh và đỏ. Khi hấp thụ hạt nano bạc, ngoài tác dụng diệt khuẩn, nấm dựa vào tính chất vật lý của hạt nano bạc hấp thụ ánh sáng trong dải sóng 390 – 420 nm nên khi đó tại bước sóng này cường độ ánh sáng được hấp thụ tăng cường.

Phổ hấp thụ của hạt nano bạc cho thấy rõ đỉnh hấp thụ ở bước sóng 420 nm do đó có một sự hỗ trợ về mặt hấp thụ ánh sáng rất lớn khi nó xâm nhập vào tế bào thực vật.

Ngoài ra tại đây chúng giao động do tính chất đặc trưng của hạt kim loại (hiện tượng plasmon) nên sinh ra nhiều năng lượng bổ xung cho các quá trình trao đổi chất và tổng hợp chất (nanobacsuper.com).

2.2 Cây điều (Anacardium occidentale) 2.2.1 Mô tả thực vật Tên khoa học: Anacardium occidentale Điều là một loại cây to, cao khoảng 8 - 9m, lá mọc so le, cuống ngắn, phiến lá hơi hình trứng, nhẵn, dai, dài 10-20cm. Hoa nhỏ, trắng mùì thơm dịu, mọc thành chùy tận cùng. Quả khô, không tự mở, hình thận, dài 2-3cm, vỏ ngoài cứng, trên mặt có những 10

hõm, cuống quả phình to thành hình trái lê hay hình quả điều. to bằng nắm tay, màu đỏ, vàng hay trắng, khi quan sát toàn bộ có cảm tưởng như phần cuống quả phình ra là quả và phần quả thật đính trên là hạt do đó có tên khác là là “điều lộn hột”. Hạt hình thận, chứa dầu béo (Hình 2.3).

Hình 2.3. Cây điều (Anacardium occidentale) (islandherbsandspices.com). Điều có lẽ vốn là một cây nguồn gốc những nước vùng nhiệt đới châu Mỹ, nhưng từ lâu đã được đưa đi trồng rộng rãi ở nhiều nước nhiệt đới châu Á như Ấn Độ, Việt Nam (miền Nam), Campuchia. Điều sống được trên những đất pha cát mà nhiều cây khác không sống được (Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, 1993).

2.2.2 Một số công dụng chính Rất nhiều bộ phận của cây điều được khai thác để sử dụng: Phần cuống quả phình ra mà nhân dân vẫn thường gọi là quả được sử dụng trên thị trường với tên “táo ca giu” (Pomme de Caiou) được dùng tươi hay đóng hộp,phần quả thật (nhân dân gọi nhầm là hạt) được sử dụng trên thị trường thế giới với tên “hạt giẻ ca giu” (Noix de Cajou), nhựa vỏ và thân cây điều đều được sử dụng làm thuốc và làm thực phẩm.

Cuống quả khi thật chín có chất thịt ngọt, hơi chua, mùi thơm như mùi dâu chín, chứa vitamin B1 và hàm lượng vitamin C rất cao: Gấp 10 lần trong chuối, 5 lần trong cam và chanh. So với quả màu đỏ, quả màu vàng chứa nhiều vitamin C hơn và ít riboflavin hơn. Ngoài ra còn chứa muối vô cơ, canxi, phospho và sắt.

Quả thực gồm vỏ quả cứng chiếm khoảng 69%, nhân 26% còn lại là vỏ nhân. Tất cả đều được sử dụng: Từ vỏ quả chiết bằng ête cho bôm điều (baume de cajou) thường gọi nhầm là dầu điều, vì đây không phải là chất béo mà là chất nhựa dầu (bôm). Bôm điều là một chất lỏng sánh, màu nâu đen nhạt, rất hắc. Thành phần chủ yếu của bôm này là cardola và anacardic acid. Cardol là hoạt chất chủ yếu của bôm điều. Đây là một chất 11

lỏng màu vàng đỏ nhạt, ra ngoài trời rất chóng chuyển thành nâu, và có tác dụng gây phồng giống như sâu ban miêu. Hơi của nó cũng có tác dụng kích ứng đối với mắt, gây ho, gây viêm đường hô hấp.

Vỏ nhún là lớp vỏ mỏng phủ lên nhân. Thành phần chủ yếu của vỏ nhân là cardol và anacardic acid, do đó cần loại khỏi nhân khi dùng hạt. Nhân hạt chứa 47,13% dầu; 9,7% hợp chất nitơ; 5,9% tinh bột. Nhân ép nguội cho chất dầu béo màu vàng nhạt, không mùi, vị và các hằng số lý hoá gần giống như hằng số lý hoá của dầu hạnh nhân.

Thành phần chủ yếu cùa dầu này là sitosterin là một phytostearin đặc biệt. Vỏ thân cây điều tươi chứa 4-7% tannin catechic. Nhựa điều: Khi khía lên vỏ thân cây tươi, một chất dịch chảy ra có vị chát chứa tannin catechic, cardol và acid anacardic. Thân một số cây điều già hoặc có bệnh chảy ra một chất gôm hình giọt dài hay ngắn, màu vàng nhạt hay nâu nhạt, tan một phần trong nước lạnh, hầu như hoàn toàn tan trong nước nóng. Thành phần chủ yếu của chất gôm này bao gồm 8% arabin, dextrin, basorin, một ít đường, tannin catechic, cardol và acid anacardic. Do chất cardol nên gôm này có tác dụng gây kích ứng (Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, 1993).

2.3 Nấm Colletotrichum capsici và bệnh thán thư trên ớt 2.3.1 Bệnh thán thư trên ớt Colletotrichum là một trong những tác nhân gây bệnh thực vật quan trọng nhất trên toàn thế giới, là nguyên nhân gây bệnh thán thư - một bệnh hại kinh tế quan trọng với phổ ký chủ rộng bao gồm ngũ cốc, đậu, rau, trồng cây lâu năm và hoa quả cây. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây ra là một trong số những bệnh có ý nghĩa kinh tế quan trọng nhất làm giảm năng suất từ 10 đến 80% ở một số quốc gia đang phát triển. Bệnh thán thư gây hại chủ yếu trên quả ớt chín, gây thiệt hại nghiêm trọng cho quả ớt cả trước và sau khi thu hoạch.

Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do các loài nấm Colletotrichum spp. gây ra bao gồm nấm Colletotrichum acutatum, Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporioides,… Các loài nấm Colletotrichum spp. có thể gây bệnh trên hầu hết các bộ phận của cây ớt trong bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào, tuy nhiên bệnh trên quả là có ý nghĩa kinh tế quan trọng hơn cả. Triệu chứng trên quả lúc đầu là những vết bệnh dạng ngậm nước và sau đó trở nên mềm nhũn đồng thời xuất hiện những vết lõm nhỏ, sạm lại (có màu nâu vàng hay màu rám nắng), vết bệnh có thể bao trùm hết bề mặt quả và xuất hiện những 12

thương tổn phức tạp. Bề mặt của vết bệnh trở nên ẩm ướt tạo thành đĩa cành với những lông gai màu đen trông rất cứng. Những vòng tròn đồng tâm thường xuất hiện bên trong vết lõm (chỉ ở trong phạm vi vết lõm). Trong vài trường hợp vết bệnh màu nâu mà không phải là màu da cam và sau đó cũng hình thành những lông cứng (Hình 2.4).

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh thán thư trên ớt do nấm Colletotrichum capsici gây ra. (Nguyễn Thanh Phong, 2011) Bào tử của nấm từ các mô trên quả bị bệnh hoặc từ các bộ phận khác hay tàn dư cây bệnh phát tán đến toàn cây, toàn ruộng do nước mưa, nước tưới. Các bào tử mới nảy mầm và sinh sản trong mô bệnh và sau đó phân tán sang những quả khác. Người chăm sóc cũng có thể mang bào tử thông qua các thiết bị hay dụng cụ nông nghiệp trong quá trình chăm sóc cây trồng. Bệnh thường xuất hiện trong những điều kiện thời tiết ấm và ẩm ướt. Nhiệt độ khoảng 27°C là thuận lợi cho sự phát triển của bệnh mặc dù bệnh xuất hiện ngay cả khi nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn 27°C. Thiệt hại nặng xảy ra khi thời tiết có mưa nhiều bởi vì các bào tử nấm ở những quả bị bệnh được phát tán nhờ nước mưa đến những quả khác và kết quả là làm bệnh thêm trầm trọng. Bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên quả chín nhiều hơn khi những quả này có mặt một thời gian dài trên cây mặc dù bệnh có thể xuất hiện trên cả quả xanh lẫn quả chín. Nấm bệnh xâm nhập vào đồng ruộng thông qua việc trồng những cây bị nhiễm bệnh hoặc bệnh lan truyền từ vụ này qua vụ khác qua tàn dư cây bệnh hoặc trên những cây ký chủ phụ. Những cây ký chủ phụ bao gồm cỏ dại và các loài cây thuộc họ cà như cà chua, khoai tây (Robert và ctv, 1999).

13

2.3.2 Nấm Colletotrichum capsici Như các loài nấm Colletotrichum spp., loài Colletotrichum capsici gây ra rất nhiều triệu chứng bệnh mà không đặc trưng bởi các vết bệnh điển hình. Có nghĩa là dựa vào triệu chứng thì không thể nhận dạng thậm chí tới mức độ giống hoặc loài. Vì vậy, việc phân lập và nuôi cấy trên môi trường nhân tạo đồng thời phân tích dưới kính hiển vi là thực sự cần thiết. Chỉ có thể nhận biết chắc chắn nấm bệnh qua việc kiểm tra bằng kính hiển vi khi ổ bào tử đã hình thành trên vết bệnh điển hình hoặc là cấy mô bị bệnh để phân lập và nhận dạng. Các loài nấm sẽ sinh trưởng trên môi trường agar chuẩn như PGA (có tác dụng cho việc phát hiện sự sản sinh chất sắc tố của tế bào nấm) và PCA (cho việc xúc tiến sự hình thành bào tử).

50 µm

Hình 2.6 Nấm C. capsici trên môi trường PGA.

Hình 2.5 Bào tử nấm C. capsici.

Sự phát triển của nấm ảnh hưởng đến các mô mới bởi sự sản sinh giác bám màu nâu khi bào tử nảy mầm. Những giác bám này thâm nhập vào bề mặt của cây và các chồi ngủ hoặc các bộ phận đang sinh trưởng của cây gây ra các triệu chứng khác nhau bao gồm các vết bệnh rất điển hình được gọi chung là bệnh loét. Đĩa cành trên quả, lá và thân, tròn hoặc thon dài, kích thước khoảng 350 µm. Lông gai màu nâu, có từ 1 - 5 vách ngăn, cứng, phình to ở phía gốc, phía đỉnh nhọn, mảnh và màu sắc nhạt dàn, kích thước khoảng 250 x 6 µm.

Bào tử phân sinh hình lưỡi liềm, trong suốt, đỉnh nhọn, đơn bào, không có vách ngăn, được hình thành từ cành bào tử hình trụ màu nâu nhạt (Hình 2.5).

Tản nấm trên môi trường PGA đàu tiên có màu trắng sau chuyển dàn thành màu xám.

Sợi nấm hình thành mịn, màu trắng đến xám tối trên bề mặt tản nấm (Hình 2.6). Đôi khi vào ban ngày có thể nhìn thấy những khoang màu trên bề mặt tản nấm. Lông gai được hình 14

thành trên những vùng mỏng hơn, hạch nấm hiếm gặp hoặc không có. Cụm bào tử màu nâu sẫm đến màu da cam. Giác bám và các cấu trúc phụ của chúng hình thành với số lượng lớn áp vào bề mặt đĩa Petri. Trên môi trường PCA sợi nấm mọc thưa thớt, màu sắc mờ nhạt và có rất ít cụm bào tử. Giác bám màu nâu đỏ, kích thước 9 - 14 µm x 6,5 - 11,5 µm dạng hình chuỳ hoặc hình trứng. Triệu chứng của bệnh do các loài nấm gây ra thể hiện rất khác nhau, thường là vết bệnh điển hình nhỏ hoặc to được hình thành trên lá và quả (chủ yếu là trên quả), đôi khi cả ở trên thân. Nhưng trong một số trường hợp khác bệnh có thể phát triển như một đốm màu hơi đỏ tía hoặc nâu mà không có sự hình thành vết bệnh rõ ràng. Thân và cuống lá có thể bị tróc vỏ, cụm hoa bị tàn lụi và chết đen khi bệnh phát triển mạnh ở giai đoạn này (Nguyễn Thanh Phong, 2011).

15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử - Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2019 – 8/2019.

3.2 Vật liệu 3.2.1 Mẫu thực vật Lá điều (lá bánh tẻ) được thu hái từ tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu.

3.2.2 Mẫu vi sinh Mẫu nấm Colletotrichum capsici được cung cấp bởi Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

3.2.3 Thiết bị Máy khuất từ (Bibby Scientific – Anh)

Tủ cấy vô trùng (Bioquell – Anh)

Máy ly tâm (Hettich - Đức)

Lò vi sóng (Sharp – Nhật)

Máy sấy (Memmert - Đức)

Máy UV-Vis (Shimadzu – Nhật)

Bể ổn nhiệt (Memmert - Đức)

Kính hiển vi TEM (Jeol – Mỹ)

3.2.4 Dụng cụ Ống ly tâm

Ống đong

Ống nghiệm

Bình định mức

Cốc thủy tinh

Bình tam giác

Micropipet

Giấy lọc

3.2.5 Hóa chất Bạc nitrat (AgNO3) (Trung Quốc)

Axit sunfuric (H2SO4) (Trung Quốc)

Natrihiđroxit (NaOH) (Trung Quốc)

Amoniac (NH3) (Trung Quốc)

Sắt (III) clorua (FeCl3) (Trung Quốc)

Thuốc thử Bouchard (Trung Quốc)

Axit clohiđric (HCl) (Trung Quốc)

Polyvinyl alcohol (Trung Quốc)

3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Chiết dịch từ lá điều Lá điều tươi được sấy khô sau đó nghiền thành bột mịn.

16

Cân 1 g bột lá cho vào 20 ml nước cất đun sôi trong 10 phút.

Ly tâm dịch chiết với tốc độ 7000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ tạp chất.

Bảo quản dịch chiết ở 4oC. 3.3.2 Định tính các nhóm chất hóa học trong dịch chiết lá điều 3.3.2.1 Định tính nhóm chất tannin Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch chiết. Ống nghiệm 1: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% nếu xuất hiện màu nâu đen thì phản ứng dương tính. Ống nghiệm 2: Thêm 2 giọt dung dịch gelatin 1% nếu xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính.

3.3.2.2 Định tính nhóm chất flavonoid Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch chiết. Ống nghiệm 1: Thêm một ít bột Mg kim loại, nhỏ từng giọt dung dịch HCl đặc, để yên 1 - 2 phút. Nếu dung dịch chuyển sang màu đỏ thì phản ứng dương tính. Ống nghiệm 2: Cho vào vài giọt NaOH 10% nếu thấy kết tủa vàng, thì cho tiếp 1 ml nước cất nếu tủa tan và màu vàng tăng lên thì phản ứng dương tính.

3.3.2.3 Định tính nhóm chất saponin Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch chiết. Ống nghiệm 1: Lắc mạnh ống nghiệm trong 2 phút, sau đó để yên 15 phút, nếu tạo cột bọt bền thì phản ứng dương tính. Ống nghiệm 2: Nhỏ thêm 3 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ tím thì phản ứng dương tính.

3.3.2.4 Định tính nhóm chất alkaloid Chuẩn bị một ống nghiệm.

Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vào thuốc thử Bouchardat, quan sát ống nghiệm.

3.3.3 Tổng hợp hạt nano bạc Cho vào ống falcon 10ml dung dịch AgNO3 và 1ml PVA 5%.

Lấy 100 µl dịch chiết cho vào ống falcon vortex 1 phút.

Cho ống falcon vào bể ổn nhiệt.

Cài đặt nhiệt độ là 100o C, thời gian tổng hợp là 30 phút.

Sau mỗi 10 phút, đảo nhẹ ống falcon 1 lần.

17

3.3.4 Kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của nano bạc Dung dịch nano bạc sau khi tổng hợp được đo phổ hấp thụ ánh sáng bằng máy UV-vis để kiểm tra sự có mặt của nano bạc trong dung dịch.

3.3.5 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc 3.3.5.1 Khảo sát thể tích dịch chiết lá điều Tiến hành khảo sát khi cố định các thông số như sau: Nồng độ dung dịch AgNO3: 1 mM. Thời gian tạo nano bạc: 60 phút.

Nhiệt độ phản ứng: 90oC. Thể tích dung dịch AgNO3: 10ml.

Bước 1: Tổng hợp nano bạc: Cho vào ống falcon 10 ml dung dịch AgNO3 và 1ml PVA 5%.

Lấy v (ml) dịch chiết cho vào ống falcon vortex 1 phút.

Thể tích dịch chiết (v) được khảo sát tại 4 mức: 50, 100, 150, 200 µl.

Cho ống falcon vào bể ổn nhiệt.

Cài đặt nhiệt độ là 90o C, thời gian tổng hợp là 60 phút.

Sau mỗi 10 phút, đảo nhẹ ống falcon 1 lần.

Bước 2: Chuẩn bị môi trường PGA bổ sung nano bạc: Cho dung dịch nano bạc bổ sung vào môi trường PGA với nồng độ 50ppm.

Trộn đều môi trường PGA và dung dịch nano bạc khi môi trường còn nóng. Đổ 20ml môi trường ra mỗi đĩa petri và chờ nguội.

Bước 3: Cấy nấm lên môi trường có bổ sung nano bạc: Nấm C. capsici được tăng sinh trên môi trường PGA. Sau 7 ngày tăng sinh, sử dụng đầu tip vô trùng tạo các khoanh nấm hình tròn có đường kính 7 mm.

Cấy khoanh nấm C. capsici lên môi trường PGA có bổ sung nano bạc và môi trường PGA đối chứng (không chứa nano bạc).

Các đĩa petri đã cấy nấm được đặt trong tủ ủ tại nhiệt độ phòng cho nấm phát triển.

Sau 5 ngày, tiến hành quan sát và đo đường kính tản nấm, mỗi đĩa petri được đo 3 lần (chiều ngang, chiều dọc, chiều chéo) và lấy giá trị trung bình.

Bước 4: Xử lý kết quả: Mỗi nghiệm thức khảo sát được lặp lại 3 lần, từ kết quả đo đường kính tản nấm 18

tính tỉ lệ ức chế nấm theo công thức: Tỉ lệ ức chế nấm (%) = ((D-d)/D) x 100 (Vincent, 1947).

Trong đó: D: đường kính tản nấm (cm) trên môi trường PGA không bổ sung nano bạc. d: đường kính tản nấm (cm) trên môi trường PGA có sung nano bạc.

Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 18 bằng phương pháp LSD. Từ kết quả xử lý thống kê đưa ra được thể tích dịch chiết tối ưu nhất.

3.3.5.2 Khảo sát nhiệt độ tạo nano bạc Điều kiện khảo sát như mục 3.3.5.1.

Thể tích dịch chiết tối ưu được chọn ở mục 3.3.5.1.

Nhiệt độ tạo nano bạc khảo sát ở 3 mức: 80, 90 và 100oC. Tiến hành thí nghiệm tương tự như các bước ở mục 3.3.5.1. => Dựa vào kết quả xử lý thống kê để chọn ra nhiệt độ tối ưu nhất.

3.3.5.3 Khảo sát thời gian tạo nano bạc Điều kiện khảo sát như mục 3.3.5.2.

Nhiệt độ tối ưu được chọn ở mục 3.3.5.2.

Thời gian tạo nano bạc khảo sát ở 4 mức: 30, 60, 90, và 120 phút.

Tiến hành thí nghiệm tương tự như các bước ở mục 3.3.5.1. => Dựa vào kết quả xử lý thống kê để chọn ra thời gian độ tối ưu nhất.

3.3.6 Kiểm tra hình dạng và kích thước hạt nano bạc Dung dịch nano bạc tổng hợp tại điều kiện tối ưu đã được khảo sát tại mục 3.3.5. sau đó được kiểm tra hình dạng và kích thước bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscope) JEOL JEM-1400, USA tại phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Vật liệu Polyme và Compozit (Key national laboratory of polymer and composite materials) - Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh.

Kết quả sau khi chụp TEM được xử lý bằng các phần mềm Photoshop CS6 và ImageJ 1.52a để tính kính thước hạt theo phương pháp của Vippola và ctv (2016).

Số liệu kích thước hạt sau khi tính được thống kê bằng phần mềm Microsoft excel 2016 để tạo biểu đồ phân bố kích thước hạt.

19

3.3.7 Khảo sát khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của nano bạc 3.3.7.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên sự phát triển của nấm Colletotrichum capsici Nấm C. capsici được tăng sinh trên môi trường PGA. Sau 7 ngày tăng sinh, sử dụng đầu tip vô trùng tạo các khoanh nấm hình tròn có đường kính 7mm.

Cấy khoanh nấm C. capsici lên môi trường PGA có bổ sung nano bạc ở nồng độ khác nhau (10, 20, 30, 40 và 50 ppm) và môi trường PGA không chứa nano bạc.

Các đĩa petri đã cấy nấm được đặt trong tủ ủ tại nhiệt độ phòng cho nấm phát triển.

Sau 5 ngày, tiến hành quan sát và đo đường kính tản nấm, mỗi đĩa petri được đo 3 lần (chiều ngang, chiều dọc, chiều chéo) và lấy giá trị trung bình.

3.3.7.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với nano bạc lên sự phát triển của nấm Colletotrichum capsici Nấm C. capsici được tăng sinh trên môi trường PGA. Sau 7 ngày tăng sinh, sử dụng đầu tip vô trùng tạo các khoanh nấm hình tròn có đường kính 7mm.

Nhúng khoanh nấm C. capsici vào dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm trong các khoảng thời gian khác nhau: 0,05; 5; 10; 15; 20 phút.

Cấy khoanh nấm C. capsici lên môi trường PGA. Các đĩa petri đã cấy nấm được đặt trong tủ ủ tại nhiệt độ phòng cho nấm phát triển.

Sau 5 ngày, tiến hành quan sát và đo đường kính tản nấm, mỗi đĩa petri được đo 3 lần (chiều ngang, chiều dọc, chiều chéo) và lấy giá trị trung bình.

20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Định tính các nhóm chất hóa học trong dịch chiết lá điều 4.1.1 Định tính nhóm chất tannin Tannin là những hợp chất tự nhiên thuộc nhóm polyphenol phổ biến trong thực vật. Chúng có vị chát, có tính thuộc da. Có nghĩa là có khả năng liên kết với protein của da tạo thành cấu trúc bền vững với quá trình thối rữa. Tannin có thể chia thành hai loại chính: tannin thủy phân được và tannin ngưng tụ.

a)

b)

c)

Hình 4.1 Kết quả định tính nhóm chất tannin. (a) Ống đối chứng: Chỉ chứa dịch chiết. (b) Ống nghiệm 1: Dịch chiết phản ứng với FeCl3. (c) Ống nghiệm 2: Dịch chiết phản ứng với gelatin.

Sau khi tiến hành thí nghiệm định tính nhóm chất tannin trong dịch chiết lá điều kết quả thu được là: ống nghiệm 1 có xuất hiện kết tủa màu đen và ống nghiệm 2 có xuất hiện kết tủa bông màu trắng (Hình 4.1). Kết quả này cho thấy cả hai ống đều có phản ứng dương tính vì vậy có thể kết luận được là trong dịch chiết có chứa nhóm chất tannin.

4.1.2 Định tính nhóm chất flavonoid Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon. Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường.

Sau khi tiến hành thí nghiệm định tính nhóm chất flavonoid trong dịch chiết lá điều kết quả thu được là: ống nghiệm 1 dung dịch không đổi màu và ống nghiệm 2 dung dịch 21

chuyển sang màu nâu đen (Hình 4.2). Kết quả này cho thấy cả hai ống đều có phản ứng âm tính vì vậy có thể kết luận được là trong dịch chiết không chứa nhóm chất flavonoid.

a)

b)

c)

Hình 4.2 Kết quả định tính nhóm chất flavonoid. (a) Ống đối chứng: Chỉ chứa dịch chiết. (b) Ống nghiệm 1: Dịch chiết phản ứng với Mg và HCl. (c) Ống nghiệm 2: Dịch chiết phản ứng với NaOH.

4.1.3 Định tính nhóm chất saponin Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. saponin có một số tính chất đặc biệt. Dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin trierpenoid và saponin steroid.

a)

b)

c)

Hình 4.3 Kết quả định tính nhóm chất saponin. (a) Ống đối chứng: Chỉ chứa dịch chiết. (b) Ống nghiệm 1: Dịch chiết tạo bọt sau khi lắc. (c) Ống nghiệm 2: Dịch chiết phản ứng với H2SO4.

Sau khi tiến hành thí nghiệm định tính nhóm chất saponin trong dịch chiết lá điều kết quả thu được là: ống nghiệm 1 dung dịch tạo cột bọt cao và bền và ống nghiệm 2 22

xuất hiện kết tủa đỏ tím (Hình 4.3). Kết quả này cho thấy cả hai ống đều có phản ứng dương tính vì vậy có thể kết luận được là trong dịch chiết có chứa nhóm chất saponin.

4.1.4 Định tính nhóm chất alkaloid Alkaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, thường có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi có trong động vật, thường có dược lực tính mạnh.

a)

b)

Hình 4.4 Kết quả định tính nhóm chất alkaloid. (a) Ống đối chứng: Chỉ chứa dịch chiết. (b) Ống thử nghiệm: Dịch chiết phản ứng với Bouchardat.

Sau khi tiến hành thí nghiệm định tính nhóm chất alkaloid trong dịch chiết lá điều kết quả thu được là: xuất hiện kết tủa đỏ trong ống nghiệm sau khi thêm thuốc thử (Hình 4.4). Kết quả này cho thấy ống thử nghiệm có phản ứng dương tính vì vậy có thể kết luận được là trong dịch chiết có chứa nhóm chất alkaloid. Qua kết quả định tính một số nhóm chất có trong dịch chiết cho thấy trong thành phần dịch chiết lá điều có chứa saponin, alkaloid và tannin. Như vậy, dịch chiết thu được có thể sử dụng để thực hiện phản ứng tổng hợp nano bạc. Các nhóm chất saponin, alkaloid và tannin sẽ đóng vai trò là chất khử Ag+ thành nano bạc, đồng thời giúp ổn định hạt nano bạc trong dung dịch.

4.2 Tổng hợp nano bạc Sau 30 phút, dung dịch AgNO3 trong ống falcon chuyển từ màu trắng trong suốt sang màu vàng (Hình 4.5), là màu đặc trưng của dung dịch nano bạc. Kết quả này bước đầu cho thấy dịch chiết lá điều có khả năng khử ion Ag+ thành hạt nano bạc tại điều kiện nhiệt độ 100oC. Tuy nhiên, để có thể khẳng định chính xác dung dịch thu được có chứa nano bạc thì cần đo phổ hấp thụ ánh sáng của nano bạc.

23

b)

a)

Hình 4.5 Kết quả tổng hợp nano bạc. (a) Trước phản ứng; (b) Sau phản ứng.

4.3 Kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng của nano bạc

OD

2 420 nm

1.5 1 0.5 300

350

400

450

500

550

600

Bước sóng (nm)

Hình 4.6 Phổ UV-vis của dung dịch nano bạc.

Sau khi đo phổ hấp thụ ánh sáng (UV-vis) của dung dịch nano bạc tổng hợp có thể thấy rằng dung dịch có đỉnh hấp thụ ánh sáng cực đại tại 420 mn (Hình 4.6). Đỉnh hấp thụ này hoàn toàn phù hợp với phổ hấp thụ ánh sáng đặc trưng của dung dịch nano bạc.

Ngoài ra có thể thấy chân peak khá rộng, điều này giúp dự đoán rằng dung dịch nano bạc tổng hợp được có sự phân bố kích thước hạt khá rộng.

Qua các kết quả kiểm tra phổ hấp thụ ánh sáng có thể kết luận rằng dung dịch tổng hợp được là dung dịch nano bạc. Tuy nhiên quy trình tổng hợp nano bạc trên chưa phải là một quy trình tối ưu, vì vậy cần phải tiến hành tối ưa quy trình tổng hợp nano bạc.

24

Mục tiêu chính của đề tài là tổng hợp được dung dịch nano bạc có khả năng ức chế nấm tốt, vì vậy cần phải tiến hành tối ưu quy trình bằng cách khảo sát khả năng ức chế nấm C. capsici của dung dịch nano bạc khi thay đổi các điều kiện tổng hợp. Các yếu tố được tối ưu bao gồm: thể tích dịch chiết lá điều, nhiệt độ tổng hợp và thời gian tổng hợp.

4.4 Tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc 4.4.1 Khảo sát thể tích dịch chiết lá điều Sự phát triển của nấm C. capsici trên môi trường PGA cho thấy sự ảnh hưởng của thể tích dịch chiết đến khả năng ức chế nấm của nano bạc (Hình 4.7).

1 cm

50µl

100µl

150µl

200µl

Đối chứng

Hình 4.7 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc với thể tích dịch chiết dùng để tổng hợp khác nhau.

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thể tích dịch chiết đến khả năng ức chế nấm C. capsici của nano bạc Tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) Thể tích dịch chiết (µl) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 Trung bình 50 57,33 57,52 57,42 57,42d ± 0,08 100 72,00 75,16 74,19 73,78a ± 1,32 150 64,00 64,71 66,45 65,05b ± 1,03 200 60,67 61,44 62,58 61,56c ± 0,78 Chữ số có các ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 95%.

Khi tăng thể tích dịch chiết từ 50 µl lên 100 µl thì tỉ lệ ức chế nấm tăng từ 57,42% lên 73,78% (Bảng 4.1). Tuy nhiên khi tiếp tục tăng dần thể tích lên 150 µl và 200 µl thì tỉ lệ ức chế nấm lại giảm xuống còn 61,56% (Bảng 4.1). Qua kết quả này có thể nhận xét rằng khi tăng thể tích dịch chiết lên tới 100 µl thì lượng chất khử đạt tới điểm cân bằng để khử hoàn toàn ion Ag+ thành nano bạc. Nếu tiếp tục tăng thể tích dịch chiết thì lượng chất khử dư sẽ làm ức chế tác dụng kháng nấm của dung dịch nano bạc, tác động này là do lượng dịch chiết lớn sẽ làm đẩy nhanh quá trình tổng hợp nano bạc dẫn tới kích thước hạt nano sẽ tăng đồng thời ngăn cản quá trình giải phòng Ag+.

25

4.4.2 Khảo sát nhiệt độ tạo nano bạc Sự phát triển của nấm C. capsici trên môi trường PGA cho thấy sự ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp đến khả năng ức chế nấm của nano bạc (Hình 4.8).

1 cm

o

o

o

80 C

100 C

90 C

Đối chứng

Hình 4.8 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc với nhiệt độ dùng để tổng hợp kháng nhau.

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp đến khả năng ức chế nấm C. capsici của nano bạc Tỉ lệ ức chế nấm (%) Nhiệt độ tổng hợp (oC) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 Trung bình 80 50,00 52,38 50,34 50,91c ± 1,05 90 74,31 74,83 72,79 73,98a ± 0,87 100 60,42 61,90 59,86 60,73b ± 0,86 Chữ số có các ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 95%.

Khi tăng nhiệt độ từ 80oC lên 90oC tỉ lệ ức chế nấm nấm tăng từ 50,91% lên tới 73,98%, tuy nhiên khi nhiệt độ tăng lên tới 100oC thì tỉ lệ ức chế nấm lại giảm xuống còn 60,73% (Bảng 4.2). Điều này cho thấy tại 90oC là nhiệt độ mà phản ứng tổng hợp xảy ra với tốc độ tối ưu nhất, còn ở 100 oC tốc độ tổng hợp xảy ra quá nhanh làm tăng kích thước hạt nano và dẫn tới giảm khả năng ức chế nấm của nano bạc.

4.4.3 Khảo sát thời gian tạo nano bạc Sự phát triển của nấm C. capsici trên môi trường PGA cho thấy sự ảnh hưởng của thời gian tổng hợp đến khả năng ức chế nấm của nano bạc (Hình 4.9).

1 cm

30 phút

60 phút

90 phút

120 phút

Đối chứng

Hình 4.9 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc với thời gian dùng để tổng hợp khác nhau.

26

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian tổng hợp đến khả năng ức chế nấm C. capsici của nano bạc Tỉ lệ ức chế nấm (%) Thời gian tổng hợp (phút) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 Trung bình 30 68,49 70,83 69,86 69,73b ± 0,96 60 75,34 77,78 76,03 76,38a ± 1,03 90 69,18 70,14 68,49 69,27b ± 0,68 120 62,33 61,81 64,38 62,84c ± 1,11 Chữ số có các ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 95%.

Khi tăng thời gian tổng hợp từ 30 phút lên 60 phút tỉ lệ ức chế nấm tăng từ 69,73% lên 76,38%, tuy nhiên khi tiếp tục tăng thời gian phản ứng lên 90 phút và 120 phút thì tỉ lệ ức chế nấm lại giảm xuống còn 62,84% (Bảng 4.3). Qua đó cho thấy thời gian 60 phút là khoảng thời gian vừa đủ cho phản ứng tổng hợp xảy ra hoàn toàn, nếu để phản ứng tiếp tục diễn ra trong thời gian dài hơn sẽ tạo điều kiện cho các hạt nano bị kết tụ lại làm tăng kích thước hạt dẫn tới giảm khả năng ức chế nấm của dung dịch nano bạc.

Qua các kết quả khảo sát các yếu tố tác động đến quá trình tổng hợp nano bạc, sau khi xử lý thống kê đưa ra được điều kiện tổng hợp nano bạc tối ưu là: Thể tích dịch chiết: 100 µl ; Nhiệt độ tổng hợp: 90oC ;Thời gian tổng hợp: 60 phút.

4.5 Kiểm tra hình dạng và kích thước hạt nano bạc Kết quả chụp hạt nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy hạt nano trong dung dịch có hình dạng chủ yếu là hình cầu (Hình 4.10).

24nm

Hình 4.10 Hình dạng và kích thước hạt nano bạc.

27

12nm

Các hạt nano bạc tổng hợp được có kích thước trung bình là 19 nm phân bố từ 6 nm tới 32 nm. Trong đó, kích thước hạt chiếm tỉ lệ cao nhất là 10 – 20 nm chiếm tỉ lệ 49% tổng số hạt khảo sát (Hình 4.11). Sự phân bố kích thước hạt nano bạc trong dung dịch khá rộng (6 - 32 nm), kết quả này hoàn toàn phù hợp với dự đoán khi dựa vào kết quả đo phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch là chân peak khá rộng chứng tỏ hạt nano bạc tổng hợp được có sự phân bố kích thước hạt khá rộng.

60% 49%

Tỷ lệ phân bố (%)

50%

38%

40% 30% 20% 10%

8%

6%

0% 0 - 10

10 - 20

20 - 30

40 - 30

Kích thước hạt (nm)

Hình 4.11 Phân bố kích thước hạt nano bạc.

4.6 Khảo sát khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của nano bạc 4.6.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ lên khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của nano bạc Sự phát triển của nấm C. capsici trên môi trường PGA cho thấy ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát triển của nấm (Hình 4.12).

1 cm

Đối chứng

10 ppm

20 ppm

30 ppm

40 ppm

50 ppm

Hình 4.12 Nấm C. capsici trên môi trường PGA có bổ sung nano bạc với nồng độ khác nhau.

28

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát triển của C. capsici Tỉ lệ ức chế nấm (%) Nồng độ (ppm) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 Trung bình 10 45,39 43,54 38,78 42,57e ± 2,78 20 53,29 55,10 53,06 53,82d ± 0,91 30 61,84 61,90 58,50 60,75c ± 1,59 40 66,45 65,31 64,63 65,46b ± 0,75 50 73,68 71,43 69,39 71,50a ± 1,75 0 (Đối chứng) 0,00 0,00 0,00 0,00f ± 0,00 Chữ số có các ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 95%.

Khi tăng nồng độ nano bạc từ 0 ppm lên 50 ppm thì tỉ lệ ức chế nấm tăng dần từ 0% lên tới 71,52% (Bảng 4.4). Kết quả này cho thấy khi càng tăng nồng độ nano bạc trong môi trường thì tỉ lệ ức chế nấm càng tăng. Tại nồng độ 50 ppm sợi nấm phát triển rất yếu tuy nhiên nồng độ này vẫn chưa đủ để ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm.

Trong phạm vi đề tài này, nồng độ nano bạc tổng hợp được là khoảng 100 ppm và bị giảm 50% còn 50 ppm khi trộn với môi trường PGA (tỉ lệ 1:1), vì vậy khó có thể khảo sát ở các điểm nồng độ cao hơn 50 ppm. Trong môi trường PGA bình thường hệ sợi nấm C. capsici phát triển rất tốt và phân bố dày đặc trong môi trường (Hình 4.15). Ngược lại, trong môi trường có chứa nano bạc, sợi nấm C. capsici bị ức chế mạnh và phát triển rất chậm (Hình 4.13). Kết quả này chứng tỏ các hạt nano bạc trong môi trường đã có tác dụng ức chế rất lớn làm ngăn cản sự phát triển của hệ sợi nấm.

50 µm

50 µm

Hình 4.13 Sợi nấm C. capsici dưới kính hiển vi. (a) Sợi nấm trong môi trường bình thường. (b) Sợi nấm trong môi trường bổ sung nano bạc

29

4.6.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc lên khả năng ức chế nấm Colletotrichum capsici của nano bạc Sự phát triển của nấm C. capsici trên môi trường PGA cho thấy ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với nano bạc lên tỉ lệ ức chế nấm (Hình 4.14)

1 cm

0,05 phút

5 phút

15 phút

10 phút

20 phút

Đối chứng

Hình 4.14 Nấm C. capsici trên môi trường PGA với thời gian tiếp xúc với nano bạc khác nhau.

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với nano bạc lên tỉ lệ ức chế C. capsici Tỉ lệ ức chế nấm (%) Thời gian tiếp xúc (phút) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 Trung bình 0,05 41,65 43,55 42,92 42,71c ± 0,79 5 58,14 56,87 56,87 57,29b ± 0,60 10 100,00 100,00 100,00 100,00a ± 0,00 15 100,00 100,00 100,00 100,00a ± 0,00 20 100,00 100,00 100,00 100,00a ± 0,00 Đối chứng 0,00 0,00 0,00 0,00d ± 0,00 Chữ số có các ký tự theo sau khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 95%.

Khi tăng thời gian tiếp xúc giữa nấm với nano bạc từ 0,05 phút lên 10 phút thì tỉ lệ ức chế nấm tăng dần từ 42,71% lên tới 100% (Bảng 4.5). Tại 10 phút, 15 phút và 20 phút tỷ lệ kháng nấm đều đạt 100% (Bảng 4.5).

Quan sát sợi nấm dưới kính hiển vi (Hình 4.15), có thể thấy, khi cho sợi nấm tiếp xúc với dung dịch nano bạc nồng độ 100 ppm trong 10 phút thì sợi nấm bị co rút và hư hỏng, điều này này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Kabir và ctv (2011). Sau khi nuôi cấy trên môi trường PGA sau 5 ngày, tản nấm hoàn toàn không phát triển, điều này chứng tỏ sợi nấm đã bị tiêu diệt hoàn toàn. Kết quả có thể được giải thích theo Panacek và ctv (2006) là khi nhúng tản nấm vào dung dịch nano bạc các hạt nano bạc đã đi vào tế bào nấm và phản ứng với nhóm sunfuahydrin (- SH) của phân tử enzyme chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa enzyme này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của vi nấm và liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA dẫn đến gây chết tế bào.

30

50 µm

50 µm

Hình 4.15 Sợi nấm C. capsici dưới kính hiển vi. (a) Sợi nấm trong môi trường bình thường. (b) Sợi nấm sau khi tiếp xúc với dung dịch nano bạc 100ppm trong 10 phút.

Kết quả khảo sát khả năng ức chế nấm C. capsici đã cho thấy nano bạc có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm ngay cả ở những nồng độ rất thấp đồng thời trong thời gian ngắn đã có thể tiêu diệt được nấm C. capsici. Điều này nói lên được rằng nano bạc hoàn toàn có khả năng ứng dụng trong việc phòng trừ nấm C. capsici gây bệnh thán thư trên ớt. Trước tình hình hiện nay, việc sử dụng các chế phẩm thuốc hóa học diệt nấm độc hại trong nông nghiệp đã và đang để lại những hậu quả nghiêm trọng cho môi trường và sức khỏe con người. Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp mới an toàn hơn và hiệu quả hơn trong công tác bảo vệ thực vật là một điều hết sức cần thiết. Tiềm năng của nano bạc sẽ mở ra một hướng đi mới, giúp tạo ra được những chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật an toàn, hiệu quả và thân thiện với môi trường. Qua đó giúp duy trì sự cân bằng của hệ sinh thái và xây dựng một nền nông nghiệp bền vững trong tương lai.

31

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong thành phần dịch chiết lá điều có chứa saponin, alkaloid và tannin, các nhóm chất này đóng vai trò là tác nhân khử Ag+ thành nano bạc đồng thời giúp ổn định hạt nano bạc.

Các điều kiện tổng hợp nano bạc được tối ưu là: 10 ml AgNO3 (1 mM) và 100 μl dịch chiết lá điều, nhiệt độ tổng hợp là 90oC, thời gian tổng hợp là 60 phút.

Dung dịch nano bạc tổng hợp được có đỉnh hấp thụ ánh sáng cực đại tại 420 nm.

Các hạt nano bạc trong dung dịch có hình cầu và có kích thước trung bình là 19 nm phân bố từ 6 nm tới 32 nm.

Sự phát triển của nấm C. capsici bị ức chế khoảng 72% trong môi trường PGA có bổ sung nano bạc với nồng độ 50 ppm. Nấm C. capsici bị tiêu diệt hoàn toàn sau khi tiếp xúc với dung dịch nano bạc có nồng độ 100 ppm trong 10 phút.

5.2 Đề nghị Tiếp tục tối ưu hóa quy trình tổng hợp nano bạc để tạo ra hạt có kích thước nhỏ, đồng đều và kháng nấm tốt hơn.

Tiến hành thử nghiệm tác dụng ức chế nấm của dung dịch nano bạc trên phạm vi nhà lưới và đồng ruộng.

Tiếp tục nghiên cứu đề tài trên nhiều loại dịch chiết từ nhiều loài thực vật khác nhau.

32

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Trần Thu Hà. 2011. Hiện tượng cộng hưởng plasmon bê mặt của các hạt nano kim loại, Luận văn thạc sĩ Vật Lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

2. Lê Thị Lành. 2015. Nghiên cứu chế tạo vàng nano và một số ứng dụng. Luận án Tiến sĩ Hóa học, Đại học Huế.

3. Huỳnh Thị Mỹ Linh. 2013. Nghiên cứu tổng hợp hạt nano bạc từ bạc nitrat bằng tác nhân khử dịch chiết nước lá bàng. Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Đại học Đà Nẵng.

4. Nguyễn Thanh Phong. 2011. Nghiên cứu tình hình bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) hại ớt tại Quỳnh Phụ - Thái Bình. Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

5. Tài nguyên cây thuốc Việt Nam. 1993. Viện Dược Liệu. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật.

Tài liệu tiếng nước ngoài 6. Kildeby N.L., Ole Z.A., Ramus E.roge, Tomlarsen, Rene P. and F.R. Jacob. 2005.

Silver Nanopraticle 14: 15-16.

7. Kevin G.S. and C.S. Juan. 2009. Light Emitting Diode Irradiation Can Control the Morphology and Optical Properties of Silver Nanoparticles, Journal of the American Chemical Society 132: 1825-1827.

8. Klabunde K.J. and R.M. Richards. 2009. Nanoscale material in Chemistry. 2nd edition, Jonh Wiley and Sons, Inc., New Jersey, USA. 9. Kalishwaralal K., Deepak V., Ramkumarpandian S., Nellaiah H. and G. Sangiliyandi. 2008. Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles by the culture supernatant of Bacillus licheniformis. Materials Letters 62: 4411-4413.

10. Klaus T., Joerger R., Olsson E. and C.G. Granqvist. 1999. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated. Proceedings of the National Academy of Sciences 96: 13611-13614.

11. Lamsal K., Kim S.W., Jung J.H., Kim Y.S., Kim K.S. and Y.S. Lee. 2011. Application of Silver Nanoparticles for the Control of Colletotrichum Species In Vitro and Pepper Anthracnose Disease in Field. Mycobiology 39: 194-199.

12. Michael J.P. 2004. Nanomaterials – the driving force. Nanotoday 7: 20 13. Pancek A., Kvitek L., Prucek R., Vecerova R., Pizurova N., Sharma V.K., Nevecna T. and R. Zboril. 2006. Silver colloid nanoparticles: Synthesis, characterization and their antibacterial activity. Journal of Physical Chemistry B 110: 16248-16253.

14. Prathna T., Chandrasekaran N., Raichur A.M. and A. Mukherjee. 2011. Biomimetic synthesis of silver nanoparticles by Citrus limon (lemon) aqueous extract and theoretical prediction of particle size. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 82: 152-159.

15. Robert P.D., Pernezny K.L. and T.A. Kucharek, 1999. Anthracnose caused by Colletotrichum sp. on pepper. Institute of Food and Agricutural Sciences 178.

33

16. Saxena A., Tripathi R. and R. Singh. 2010. Biological synthesis of silver nanoparticles by using onion (Allium cepa) extract and their antibacterial activity.

Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures 5:427-432.

17. Slawson R., Trevors J. and H. Lee. 1992. Silver accumulation and resistance in Pseudomonas stutzeri. Archives of Microbiology 158.

18. Sun Q., Cai X., Li J., Zheng M., Chen Z. and C-P. Yu. 2014. Green synthesis of silver nanoparticles using tea leaf extract and evaluation of their stability and antibacterial activity. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 444: 226-231.

19. Suresh U., Murugan K., Benelli G., Nicoletti M., Barnard D.R. and C. Panneerselvam. 2015. Tackling the growing threat of dengue: Phyllanthus nirurimediated synthesis of silver nanoparticles and their mosquitocidal properties against the dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitology Research 114: 1551-1562.

20. Vincent J.M. 1947. The esters of 4-hydroxybenzoic acid and related compounds. Part I. Methods for the study of their fungistatic properties.

Journal of the Society of Chemical Industry 66: 149-155.

21. Vippola M., Valkonen M., Sarlin E., Honkanen M. and H. Huttunen. 2016. Insight to Nanoparticle Size Analysis—Novel and Convenient Image Analysis Method Versus Conventional Techniques. Nanoscale Research Letters 11: 169.

22. Von White G., Kerscher P., Brown R.M., Morella J.D., McAllister W. and D. Dean.

2012. Green synthesis of robust, biocompatible silver nanoparticles using garlic extract. Journal of Nanomaterials 2012: 1-12.

Tài liệu internet 23. Bùi Công Hải, Ứng dụng của nano bạc trong Nông nghiệp, truy cập từ: https://nanobacsuper.com/nano-bac-va-ung-dung-cua-nano-bac-trong-nong-nghiep, ngày truy cập: 01/04/2019.

34

PHỤ LỤC  Phụ lục 1 Công thức môi trường PGA: - Khoai tây: 200 gam - D-glucose: 20 gam - Agar: 20 gam - Nước cất: 1 lít  Phụ lục 2 Kết quả khảo sát thể tích dịch chiết lá điều Thể tích dịch chiết (µl) 50 100 150 200 Đối chứng

Đường kính tản nấm (cm) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 N D C N D C N D C 2,8 2,8 2,9 2,8 2,9 2,9 2,8 2,9 3,0 2,2 1,9 2,2 2,0 2,0 1,9 2,1 1,9 2,1 2,6 2,5 2,4 2,5 2,4 2,6 2,4 2,6 2,3 2,6 2,8 2,6 2,7 2,7 2,6 2,7 2,5 2,7 5,8 5,6 5,7 5,7 5,8 5,9 5,9 5,9 5,8

N: chiều ngang; D: chiều dọc; C: chiều chéo  Phụ lục 3 Kết quả khảo sát nhiệt độ tổng hợp Nhiệt độ tổng hợp (oC) 70 80 90 100 Đối chứng

Đường kính tản nấm (cm) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 N D C N D C N D C 2,9 2,8 2,8 2,7 2,6 2,9 2,7 2,7 2,9 3,2 3,0 3,1 3,0 3,0 3,1 3,2 3,2 3,0 2,0 1,9 1,9 2,0 1,9 1,9 2,1 2,2 2,0 2,5 2,6 2,7 2,5 2,6 2,6 2,7 2,6 2,7 5,6 5,4 5,5 5,7 5,6 5,5 5,7 5,6 5,5

N: chiều ngang; D: chiều dọc; C: chiều chéo  Phụ lục 4 Kết quả khảo sát thời gian tổng hợp Thời gian tổng hợp (phút) 30

Đường kính tản nấm (cm) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 N D C N D C N D C 2,2 2,3 2,2 2,2 2,0 2,1 2,1 2,3 2,1

60 90 120 Đối chứng

1,9 2,3 2,5 5,6

2,0 2,2 2,6 5,5

1,8 2,1 2,5 5,6

1,9 2,2 2,4 5,5

1,7 2,0 2,6 5,4

1,7 2,2 2,6 5,6

2,0 2,3 2,4 5,6

1,7 2,0 2,5 5,5

1,9 2,4 2,4 5,6

N: chiều ngang; D: chiều dọc; C: chiều chéo  Phụ lục 5 Kết quả khảo sát nồng độ nano bạc Nồng độ nano bạc (ppm) 10 20 30 40 50 Đối chứng

Đường kính tản nấm (cm) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 N D C N D C N D C 3,4 3,5 3,5 3,4 3,5 3,5 3,7 3,8 3,6 3,1 3,1 3,0 2,8 3 2,9 3,0 2,9 3,1 2,7 2,6 2,6 2,6 2,5 2,6 2,7 2,7 2,8 2,3 2,5 2,4 2,4 2,5 2,3 2,5 2,4 2,4 2,2 2,0 1,9 2,0 2,1 2,2 2,1 2,2 2,3 6,0 5,6 5,7 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6 5,6

N: chiều ngang; D: chiều dọc; C: chiều chéo  Phụ lục 6 Kết quả khảo sát thời gian tiếp xúc với nano bạc Thời gian tiếp xúc (phút) 0,05 5 10 15 20 Đối chứng

Đường kính tản nấm (cm) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 N D C N D C N D C 3,7 3,8 3,8 3,6 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,0 2,9 2,8 2,9 3,0 3,0 2,9 2,9 3,1 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 6,1 5,9 6,0 6,0 5,9 5,9 5,8 6,0 6,0

N: chiều ngang; D: chiều dọc; C: chiều chéo  Phụ lục 7 Kết quả chuyển đổi tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) bằng phương pháp arcsin (x)1/2 Ảnh hưởng của thể tích dịch chiết đến khả năng ức chế nấm của nano bạc.

Thể tích dịch chiết (µl) 50 100

Tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 Trung bình 49,21 49,33 49,27 49,27 ± 0,05 58,05 60,11 59,47 59,21 ± 0,86

150 200

53,13 51,16

53,55 51,61

54,6 52,29

53,76 ± 0,62 51,69 ± 0,46

 Phụ lục 8 Kết quả chuyển đổi tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) bằng phương pháp arcsin (x)1/2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp đến khả năng ức chế nấm của nano bạc.

Nhiệt độ tổng hợp (oC) 80 90 100

Tỉ lệ ức chế nấm (%) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 45,00 46,36 45,19 59,55 59,89 58,56 51,01 51,88 50,69

Trung bình 45,52 ± 0,6 59,33 ± 0,56 51,19 ± 0,5

 Phụ lục 9 Kết quả chuyển đổi tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) bằng phương pháp arcsin (x)1/2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp đến khả năng ức chế nấm của nano bạc.

Thời gian tổng hợp (phút) 30 60 90 120

Tỉ lệ ức chế nấm (%) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 55,85 57,31 56,70 60,23 61,88 60,69 56,28 56,88 55,85 52,14 51,83 53,36

Trung bình 56,62 ± 0,6 60,93 ± 0,7 56,34 ± 0,42 52,44 ± 0,66

 Phụ lục 10 Kết quả chuyển đổi tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) bằng phương pháp arcsin (x)1/2 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát triển của nấm.

Nồng độ (ppm) 10 20 30 40 50 0 (Đối chứng)

Tỉ lệ ức chế nấm (%) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3 1,15 1,15 1,15 42,35 41,29 38,52 46,89 47,93 46,75 51,85 51,88 49,89 54,6 53,92 53,51 59,13 57,69 56,41

Trung bình 0,86 ± 0 40,72 ± 1,61 47,19 ± 0,53 51,21 ± 0,93 54,01 ± 0,45 57,74 ± 1,11

 Phụ lục 11 Kết quả chuyển đổi tỉ lệ ức chế nấm C. capsici (%) bằng phương pháp arcsin (x)1/2 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với nano bạc lên tỉ lệ ức chế nấm.

Thời gian tiếp xúc (phút)

Tỉ lệ ức chế nấm (%) Lần lặp lại 1 Lần lặp lại 2 Lần lặp lại 3

Trung bình

0,05 5 10 15 20 Đối chứng

40,48 49,89 88,85 88,85 88,85 1,15

41,16 48,84 88,85 88,85 88,85 1,15

40,79 48,84 88,85 88,85 88,85 1,15

40,81 ± 0,28 49,19 ± 0,49 88,85 ± 0 88,85 ± 0 88,85 ± 0 1,15 ± 0

 Phụ lục 12 Kết quả xử lý thống kê khảo sát thể tích lá điều

One-way ANOVA: r1 versus f1 Method Null hypothesis

All means are equal

Alternative hypothesis

Not all means are equal

Significance level

α = 0,05

Equal variances were assumed for the analysis.

Factor Information Factor

Levels

f1

4

Values 50; 100; 150; 200

Analysis of Variance Source

DF

Adj SS

Adj MS

F-Value

P-Value

f1

3

161,554

53,8514

107,05

0,000

Error

8

4,024

0,5030

Total

11

165,579

Model Summary S

R-sq

R-sq(adj)

R-sq(pred)

0,709248

97,57%

96,66%

94,53%

Means f1

N

Mean

StDev

95% CI

50

3

49,2700

0,0600

(48,3257; 50,2143)

100

3

59,210

1,054

(58,266; 60,154)

150

3

53,760

0,757

(52,816; 54,704)

200

3

51,687

0,569

(50,742; 52,631)

Pooled StDev = 0,709248

Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence f1

N

Mean

100

3

59,210

150

3

53,760

Grouping A B

200

3

51,687

50

3

49,2700

C D

Means that do not share a letter are significantly different.

Fisher Individual 95% CIs Residual Plots for r1

 Phụ lục 13 Kết quả xử lý thống kê khảo sát nhiệt độ tổng hợp

One-way ANOVA: r2 versus f2 Method Null hypothesis

All means are equal

Alternative hypothesis

Not all means are equal

Significance level

α = 0,05

Equal variances were assumed for the analysis.

Factor Information Factor

Levels

f2

Values

3

80; 90; 100

Analysis of Variance Source

DF

Adj SS

Adj MS

F-Value

P-Value

f2

2

289,384

144,692

310,25

0,000

Error

6

2,798

0,466

Total

8

292,183

Model Summary S

R-sq

R-sq(adj)

R-sq(pred)

0,682910

99,04%

98,72%

97,85%

Means f2

N

Mean

StDev

95% CI

80

3

45,517

0,737

(44,552; 46,481)

90

3

59,333

0,691

(58,369; 60,298)

100

3

51,193

0,616

(50,229; 52,158)

Pooled StDev = 0,682910

Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence f2

N

Mean

90

3

59,333

100

3

51,193

80

3

45,517

Grouping A B C

Means that do not share a letter are significantly different.

Fisher Individual 95% CIs Residual Plots for r2

 Phụ lục 14 Kết quả xử lý thống kê khảo sát thời gian tổng hợp

One-way ANOVA: r3 versus f3 Method Null hypothesis

All means are equal

Alternative hypothesis

Not all means are equal

Significance level

α = 0,05

Equal variances were assumed for the analysis.

Factor Information Factor

Levels

f3

Values

4

30; 60; 90; 120

Analysis of Variance Source

DF

Adj SS

Adj MS

F-Value

P-Value

f3

3

108,373

36,1243

66,14

0,000

Error

8

4,369

0,5462

Total

11

112,742

Model Summary S

R-sq

R-sq(adj)

R-sq(pred)

0,739020

96,12%

94,67%

91,28%

Means f3

N

Mean

StDev

95% CI

30

3

56,620

0,733

(55,636; 57,604)

60

3

60,933

0,851

(59,949; 61,917)

90

3

56,337

0,517

(55,353; 57,321)

120

3

52,443

0,809

(51,459; 53,427)

Pooled StDev = 0,739020

Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence f3

N

Mean

Grouping

60

3

60,933

30

3

56,620

B

90

3

56,337

B

120

3

52,443

A

C

Means that do not share a letter are significantly different.

Fisher Individual 95% CIs Residual Plots for r3

 Phụ lục 15 Kết quả xử lý thống kê khảo sát nồng độ nano bạc

One-way ANOVA: r4 versus f4 Method Null hypothesis

All means are equal

Alternative hypothesis

Not all means are equal

Significance level

α = 0,05

Equal variances were assumed for the analysis.

Factor Information Factor

Levels

f4

6

Values 0; 10; 20; 30; 40; 50

Analysis of Variance Source

DF

Adj SS

Adj MS

F-Value

P-Value

5

6522,46

1304,49

1005,81

0,000

Error

12

15,56

1,30

Total

17

6538,02

f4

Model Summary S

R-sq

R-sq(adj)

R-sq(pred)

1,13884

99,76%

99,66%

99,46%

Means f4

N

Mean

StDev

95% CI

0

3

1,150

0,000

(-0,283; 2,583)

10

3

40,72

1,98

(39,29; 42,15)

20

3

47,190

0,645

(45,757; 48,623)

30

3

51,207

1,140

(49,774; 52,639)

40

3

54,010

0,551

(52,577; 55,443)

50

3

57,743

1,361

(56,311; 59,176)

Pooled StDev = 1,13884

Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence f4

N

Mean

50

3

57,743

40

3

54,010

30

3

51,207

Grouping A B C

20

3

47,190

10

3

40,72

0

3

1,150

D E F

Means that do not share a letter are significantly different.

Fisher Individual 95% CIs Residual Plots for r4

 Phụ lục 16 Kết quả xử lý thống kê khảo sát thời gian tiếp xúc với nano bạc

One-way ANOVA: r5 versus f5 Method Null hypothesis

All means are equal

Alternative hypothesis

Not all means are equal

Significance level

α = 0,05

Equal variances were assumed for the analysis.

Factor Information Factor

Levels

f5

6

Values 0,00; 0,05; 5,00; 10,00; 15,00; 20,00

Analysis of Variance Source

DF

Adj SS

Adj MS

F-Value

P-Value

5

19333,6

3866,71

47993,95

0,000

Error

12

1,0

0,08

Total

17

19334,5

f5

Model Summary S

R-sq

R-sq(adj)

R-sq(pred)

0,283843

99,99%

99,99%

99,99%

Means f5

N

Mean

StDev

95% CI

0,00

3

1,150

0,000

(0,793; 1,507)

0,05

3

40,810

0,340

(40,453; 41,167)

5,00

3

49,190

0,606

(48,833; 49,547)

10,00

3

88,85

0,00

(88,49; 89,21)

15,00

3

88,85

0,00

(88,49; 89,21)

20,00

3

88,85

0,00

(88,49; 89,21)

Pooled StDev = 0,283843

Fisher Pairwise Comparisons Grouping Information Using the Fisher LSD Method and 95% Confidence

f5

N

Mean

Grouping

20,00

3

88,85

A

15,00

3

88,85

A

10,00

3

88,85

A

5,00

3

49,190

0,05

3

40,810

0,00

3

1,150

B C D

Means that do not share a letter are significantly different.

Fisher Individual 95% CIs Residual Plots for r5