Nghiên cứu phương pháp xác định Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HÀ MÃ SINH VIÊN: 1101139

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THU HÀ MÃ SINH VIÊN: 1101139

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Trần Cao Sơn ThS. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

i

LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm

H N

tới những ngƣời đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong thời gian qua.

Ơ

N

hoàn thành khóa luận là lúc em xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Thu Hà

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Em cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Đặng Thị Ngọc Lan đã định hƣớng cho em trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ góp ý hoàn thành khóa luận.

Em xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài.

Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng em xin dành cho gia đình, bạn bè đã chăm sóc, cổ vũ, động viên em trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ trong cuộc sống.

Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy đã nỗ lực và cố gắng hết sức nhƣng không tránh khỏi nhƣng thiếu sót, em kính mong nhận đƣợc những ý kiến chỉ bảo và phê bình của quý thầy cô.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

.Q

U Y

Trƣớc hết em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Cao Sơn, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

ii

MỤC LỤC ……………………………………………………………...……ii

H

Ơ

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT …………...……….....v

N

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ………………………………………………………………..i

U Y

N

DANH MỤC CÁC BẢNG ……………………………………………...….vi

TP

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

ẠO

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 2

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.1. Tổng quan về Auramin O ........................................................................... 2

N

G

1.1.1.Khái quát chung .................................................................................... 2

H Ư

1.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa lý ................................................................... 2

TR ẦN

1.1.3.Độc tính ................................................................................................. 3 1.1.4.Các quy định về hàm lƣợng của Auramin O ........................................ 4

B

1.2. Tổng quan phƣơng pháp xác định Auramin O .......................................... 4

10 00

1.2.1. Các phƣơng pháp đã đƣợc thực hiện để xác định Auramin O............. 4 1.2.2. Phƣơng pháp LC-MS/MS .................................................................... 8

Ó

A

1.2.2.1. Sắc kí lỏng (HPLC)........................................................................ 9

Í-

H

1.2.2.2. Khối phổ....................................................................................... 10

-L

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13

ÁN

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................... 13

TO

2.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị................................................................ 13

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ …………………………...….vii

D

IỄ N

Đ

ÀN

2.2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................. 13 2.2.1.1. Chất chuẩn ................................................................................... 13 2.2.1.2. Hoá chất, dung môi ...................................................................... 13 2.2.2. Trang thiết bị ...................................................................................... 14 2.2.2.1. Thiết bị ......................................................................................... 14 2.2.2.2. Dụng cụ ........................................................................................ 14

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

iii

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 14

Ơ

2.3.2 . Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ..................................................... 15

N

2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định chất màu AUO bằng LC-MS/MS .. 15

H

2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp .................................................................... 15

U Y

N

2.3.4. Ứng dụng phƣơng pháp ..................................................................... 15

TP

2.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu......................................................................... 16

ẠO

2.4.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu sơ bộ………………………………………16

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.4.3. Phƣơng pháp chiết pha rắn………………………………………….16

N

G

2.4.4. Phƣơng pháp thẩm định ..................................................................... 18

H Ư

2.4.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc ................................................................ 18

TR ẦN

2.4.4.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng……………………….. 18 2.4.4.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................. 19

10 00

B

2.4.4.4. Độ lặp lại và độ thu hồi................................................................ 19 2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................. 20

A

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 21

H

Ó

3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định AuO bằng LC-MS/MS ...................... 21

-L

Í-

3.1.1. Tối ƣu hóa các điều kiện khối phổ ..................................................... 21

ÁN

3.1.1.1. Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm ........................................ 21

TO

3.1.1.2. Tối ƣu hóa các điều kiện MS ....................................................... 22

D

IỄ N

Đ

ÀN

3.1.2. Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng .................................................... 23

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 15

3.1.2.1. Chọn pha tĩnh ............................................................................... 23 3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động ..................................................... 23

3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ............................................................ 25 3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu .................................................................. 25 3.2.2. Khảo sát dung môi chiết .................................................................... 26 3.2.3. Khảo sát cột chiết pha rắn SPE .......................................................... 28

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

iv

3.2.4. Khảo sát dung môi rửa giải ................................................................ 29

Ơ

3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc ...................................................................... 31

N

3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích .......................................................... 31

H

3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) ................ 32

U Y

N

3.3.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ................................................... 34

TP

3.4. Kết quả xác định AUO trong một số mẫu TACN.................................... 38

ẠO

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 41

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Kết luận ........................................................................................................... 41

N

G

Kiến nghị ......................................................................................................... 42

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

PHỤ LỤC

H Ư

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ...................................................................... 36

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

v

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Amoni acetat

AF

Formic acid

Acid formic

AUO

Auramine O

Auramin O (vàng ô)

Association of Official

Hiệu hội các cộng đồng

Analytical Communities

phân tích chính thức

Atmospheric pressure chemical

Chế độ ion hóa hóa học ở

ionization

áp suất khí quyển

CAV

Cell Accelerator Voltage

Thế gia tốc màng

CE

Collision Energy

ESI

Electronspray ionization

FLD

Fluoroscence detector

Ơ H N

U Y

TP

.Q

B

10 00

Balance

High performance liquid

A

HPLC

ẠO

Đ

G N

TR ẦN

H Ư

Năng lƣợng va chạm

Hydrophilic – lipophilic

HLB

N

Amonium acetate

APCI

Ion hóa phun điện tử Detector huỳnh quang Cân bằng ƣa nƣớc- ƣa béo Sắc ký lỏng hiệu năng cao

H

Ó

chromatography

Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ

Í-

LC-MS/MS

2 lần

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

MS

Mass spectrometry

Khối phổ

R(%)

Recovery

Hiệu suất thu hồi

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SCX

Strong Cation eXchange

Trao đổi cation mạnh

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SPE

Solid phase extraction

Chiết pha rắn

TO

ÁN

-L

mass spectrometry

ÀN Đ IỄ N D

Tiếng việt

AA

AOAC

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Tiếng anh

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Ký hiệu

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

vi

Thin Layer Chromatography

Sắc kí lớp mỏng

WAX

Weak Anion eXchange

Trao đổi anion yếu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

TLC

N

Thức ăn chăn nuôi

TACN

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

vii

DANH MỤC BẢNG

Ơ

Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các

N

Bảng 1.1. Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007.............................. 4

N

H

nền mẫu khác nhau............................................................................................ 5

.Q

LC-MS hoặc LC-MS/MS ................................................................................... 7

TP

Bảng 2.1. Số điểm IP cho các kỹ thuật phân tích ........................................... 18

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích AUO bằng ESI(+)-MS/MS....................... 21

G

Đ

Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS đối với chế độ ion dương .................. 23

H Ư

N

Bảng 3.3. Chương trình gradient phân tích Auramin O ................................ 24 Bảng 3.4. So sánh các loại dung môi chiết đến diện tích pic của AUO ......... 27

TR ẦN

Bảng 3.5. Khảo sát cột SPE đến độ thu hồi của AUO .................................... 28 Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải .................................................... 30

10 00

B

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong dung môi ......... 35 Bảng 3.8. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong nền mẫu……….35

Ó

A

Bảng 3.9. Độ lặp lại và thu hồi của AUO trên nền mẫu TACN..................... 37

Í-

H

Bảng 3.10. Kết quả xác định hàm lượng AUO trong một số mẫu TACN tại Hà

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Nội ................................................................................................................... 39

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

viii

H

Ơ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramin O ................................................... 3

N

DANH MỤC HÌNH VẼ

N

Hình 1.2. Mô hình hệ thống LC-MS/MS ........................................................ 11

TP

Hình 3.2. Sắc kí đồ dung dịch chuẩn AUO 50 ng/mL phân tích bởi các hệ

ẠO

gradient ........................................................................................................... 25

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hình 3.3. Quy trình xử lý mẫu khảo sát .......................................................... 26

N

G

Hình 3.4. Sắc ký đồ AUO khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau ........... 27

H Ư

Hình 3.5. Khảo sát các loại cột SPE ............................................................... 29

TR ẦN

Hình 3.6. Quy trình xử lý mẫu tối ưu .............................................................. 31 Hình 3.7. Sắc đồ pic AUO ở mẫu thêm chuẩn, mẫu chuẩn và mẫu trắng ...... 32

B

Hình 3.8. Sắc đồ AUO tại LOD 0,2 ng/mL ( tương đương 8 µg/kg trên mẫu)

10 00

......................................................................................................................... 33 Hình 3.9. Sắc đồ AUO tại LOQ 0,5 ng/mL ( tương đương 20 µg/kg trên mẫu)

Ó

A

......................................................................................................................... 33

Í-

H

Hình 3.10. Đường chuẩn AUO trong dung môi ............................................. 36

-L

Hình 3.11. Đường chuẩn AUO trong nềnmẫu…………………………………..36

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Hình 3.12. Sắc đồ phân tích lặp lại mẫu AUO nồng độ 25 ng/mL……………38

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

Hình 3.1. Sắc đồ các ion sản phẩm……………………………………………….22

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 1

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhận đƣợc sự

Ơ

N

quan tâm ngày càng lớn của xã hội và các cơ quan quản lý. Trong những năm

N

H

trở lại đây, việc sử dụng các chất cấm trong chăn nuôi gia súc, gia cầm đã gây

U Y

nhiều bức xúc và là một vấn đề có nguy cơ tiềm tàng gây ảnh hƣởng tiêu cực

TP

các yêu cầu giám sát gắt gao hơn.

ẠO

Chất Auramin O hay còn gọi là chất vàng ô đƣợc dùng phổ biến trong

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

công nghiệp dệt may, sơn hay tạo màu trong ve quét tƣờng hoặc để nhuộm

N

G

màu vi khuẩn [25]. Ở Việt Nam, các cơ quan chức năng của Bộ NN&PTNT

H Ư

đã phát hiện đƣợc nhiều cơ sở sản xuất thức ăn chăn nuôi trộn chất màu này

TR ẦN

vào trong thức ăn cho gà với mong muốn tạo màu vàng bắt mắt cho da và chân gà để dễ bán. Khi ngƣời tiêu dùng ăn thịt gà thì sẽ hấp thụ luôn lƣợng

B

Auramin O còn tồn dƣ, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây

10 00

ung thƣ [18]. Chính vì vậy, từ 11/2015 Bộ NN&PTNN đã ban hành thông tƣ

A

bổ sung Auramin O vào danh mục các chất cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh

H

Ó

doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam [2].

Í-

Từ yêu cầu quản lý trên, về mặt chuyên môn cần có các phƣơng pháp

-L

phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm soát đƣợc lƣợng Auramin

ÁN

O có trong các mẫu thực phẩm cần giám sát. Xuất phát từ nhu cầu thực tế và

TO

những đặc tính ƣu việt của kỹ thuật LC-MS/MS trong phân tích, chúng tôi đã

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

đến sức khỏe con ngƣời. Chính vì vậy, các cơ quan quản lý ngày càng đƣa ra

D

IỄ N

Đ

ÀN

tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp xác định Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS. 2. Áp dụng phƣơng pháp trên để xác định hàm lƣợng Auramin O trong

một số mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trƣờng.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 2

Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Auramin O

Ơ

N

1.1.1. Khái quát chung

N

H

Auramin O (dạng muối hydrochlorid) thuộc phân nhóm dẫn xuất

U Y

ketoimin của nhóm thuốc nhuộm diphenylmethan. Auramin đƣợc tổng hợp

TP

base; CAS N. 101–61–1) với một hỗn hợp gồm ure, acid sulfamic và lƣu

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

huỳnh trong amoniac ở 175ºC. Auramin sulfat hình thành trong phản ứng có

Đ

thể sử dụng trực tiếp trong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển sang dạng

N

G

Auramin base hay dạng muối hydrochlorid [20], [28]. Sản xuất Auramin O

H Ư

diễn ra đầu tiên ở châu Âu nhƣng hiện nay nó chỉ đƣợc sản xuất chủ yếu ở Ấn

TR ẦN

Độ và Trung Quốc [13].

Thuốc nhuộm Auramin O đƣợc sử dụng phổ biến trong công nghiệp

10 00

B

nhuộm da, nhuộm giấy, tạo màu sơn. Ngoài ra Auramin O còn đƣợc dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang trong nhuộm nhanh vi khuẩn acid có trong

A

đờm, mô nhiễm bệnh; kết hợp cùng thuốc nhuộm Rhodamin trong phép

H

Ó

nhuộm Auramin-Rhodamin để phát hiện các vi khuẩn Mycobacterium

Í-

tuberculosis [25].

-L

Auramin O đã từng đƣợc sử dụng ở một số nƣớc nhƣ một loại màu thực

ÁN

phẩm [10]. Auramin O đã đƣợc phát hiện với một tỷ lệ nhỏ ở các mẫu thực

TO

phẩm từ Ấn Độ [30], bao gồm cả đậu Hà Lan tƣơi [24]. Những năm gần đây,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

bằng cách nung nóng 4,4'- bis (dimethylaminodiphenyl) methan (Michler’s

D

IỄ N

Đ

ÀN

Auramin O cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều mẫu thực phẩm ở các quốc gia nhƣ: Việt Nam và Trung Quốc [16].

1.1.2. Cấu trúc, tính chất hóa lý  Tính chất hóa lý [15],[20] - Tinh thể ánh kim, màu từ vàng nhạt đến vàng nâu.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3

- Điểm nóng chảy: 267ºC

Ơ

N

- Độ hòa tan: Hơi tan trong nƣớc (10 mg/ml) và ethanol (20 mg/ml); tan trong ethylen glycol, methyl ether (60 mg/ml).

N

H

 Cấu trúc:

TR ẦN

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Auramin O Công thức phân tử : C17H21N3.HCl

10 00

B

Tên đầy đủ: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid

H

1.1.3. Độc tính

Ó

A

Tên gọi khác: Auramin O, basic yellow 2, vàng ô.

-L

Í-

Năm 1933, Muller đã báo cáo 2 ca lâm sàng ung thƣ bàng quang ở công

ÁN

nhân làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất Auramin O [31]. Những năm

TO

sau đó, các nghiên cứu thuần tập đã chỉ ra rằng có một tỷ lệ tƣơng đối cao các

ÀN

công nhân làm việc trong nhà máy sản xuất Auramin bị ung thƣ bàng quang,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

Auramin O có chứa nhân anthraquinon, một nhân thơm có đa vòng nhƣ công thức cấu tạo dƣới đây:

D

IỄ N

Đ

tuyến tiền liệt hoặc dạ dày [18]. Các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của Auramin trên động vật. Kết quả cho thấy, Auramin O làm tổn thƣơng ADN trên gan, thận, tuỷ xƣơng của chuột nhắt và chuột cống với liều LD50 là 135 mg/kg [23], gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột [8]. Trên thỏ, Auramin O gây chết và làm tăng sinh các tế bào biểu mô đƣờng tiết niệu gợi ý cho ung thƣ bàng quang [8]. Tổ chức

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 4

nghiên cứu ung thƣ thế giới IARC đã xếp Auramin O vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thƣ cho ngƣời [18].

H

Ơ

N

1.1.4. Các quy định về hàm lượng của Auramin O Ở châu Âu, việc sản xuất Auramin và Auramin hydrochlorid phải tuân

U Y

N

theo quy định của chỉ thị 2004/37/EC áp dụng cho các hoạt động mà ngƣời

TP

[11]. Chỉ thị 2004/93/EC ngày 21 tháng 9 năm 2004 xếp Auramin và muối

ẠO

của nó vào nhóm không đƣợc có mặt trong các thành phần của mỹ phẩm [10].

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 1.1. Giá trị giới hạn quốc tế của Auramin năm 2007 [14] Giá trị giới hạn –

Giá trị giới hạn-

gia

8 tiếng (mg/m3)

Thời gian ngắn

Ghi chú

H Ư

N

Quốc

TR ẦN

(mg/m3)

Australia 0,08 aerosol có thể hít

Hƣớng dẫn nồng độ

hít phải

kĩ thuật (dựa trên

10 00

Thụy Sĩ

B

phải

0,32 aerosol có thể

H

Ó

A

0,08

tính khả thi)

Í-

Ở Việt Nam, Auramin và các dẫn xuất đã bị cấm nhập khẩu, sản xuất,

-L

kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm [2]. Theo quy

ÁN

định của Bộ NN&PTNT, giới hạn phát hiện mà phƣơng pháp thử cần phải đạt

TO

để phân tích Auramin O trong thức ăn chăn nuôi là 1 mg/kg [3].

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

lao động phải tiếp xúc với chất gây ung thƣ hoặc các chất gây đột biến gen

D

IỄ N

Đ

ÀN

1.2. Tổng quan phƣơng pháp xác định Auramin O 1.2.1. Các phương pháp đã được thực hiện để xác định Auramin O Nghiên cứu xác định Auramin O đƣợc bắt đầu vào những năm 1970,

1980 bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC và phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng TLC. Các nghiên cứu đƣợc tiến hành từ những năm 1990 đến

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 5

nay sử dụng phƣơng pháp HPLC và khối phổ có độ nhạy cao hơn và chọn lọc

Đánh giá phƣơng pháp

(-)

[5]

B

TLC

10 00

- Soi màu dƣới ánh sáng thƣờng hoặc bằng ánh sáng cực tím

Ó

H

Í-

ÁN

-L

- 39 loại thuốc nhuộm Chiết mẫu bằng ethanol, siêu âm, lọc.

- Auramin O

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Đậu tƣơng

HPLC-DAD

LOD: 0,25 µg/mL [22]

- Cột hypesil C18

R(%) : 95%

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

ẠO Đ G N

Hòa tan thuốc nhuộm, tách rửa bằng n-butanolacid acetic-nƣớc (4:1:5) hay nbutanol-ethanolnƣớc (9:1:1)

[29]

H Ư

Thuốc nhuộm sinh học

(-)

TR ẦN

Chiết bằng hexan HPLC và ethanol, lắc lỏng lỏng với acid acetic và nhựa trao đổi anion lỏng, chiết với ethyl acetact, rửa ethyl acetat với amoniac 5%

TP

.Q

Đối tƣợng

Mô tôm

TLT K

U Y

Phƣơng pháp

Xử lý mẫu,

A

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Nền mẫu

N

H

Ơ

Bảng 1.2. Một số phương pháp xác định và định lượng Auramin O trong các nền mẫu khác nhau

N

hơn.

- Pha động: Kênh A: methanol Kênh B: aceticamonium 0,5% - Bƣớc sóng 436 nm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 6

Đối tƣợng HPLC- DAD

LOD: 0,25 µg/g

- Bƣớc sóng 440 nm

R: 95-116%

- Pha động:

ẠO

- Chiết lỏng lỏng HPLC – FDA với các dung môi - Cột ODS hữu cơ phân cực và - Pha động: không phân cực Kênh A: AA - Làm sạch bằng qua cột Oasis HLB 20mM (chỉnh PH 4,5 = acid acetic) - Auramin O, Kênh B: ACN rhodamin B, pararosanilin

H Ư

[27]

LOQ: 0,125 µg/g R: 70,2-102,8 %

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

LOD: 0,05 µg/g

Í-L

Chiết bằng ACN : H2O (7:3)

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Sản phầm từ đậu

D

Đ

N

Kênh B: H3PO4 0,03%

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Kênh A: MeOH

HPLC- detector UV

LOD: 0,05 mg/kg [26] R: 88 – 93%

Basic orange II, acid orange II và auramin O

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

.Q

- Cột YMC hydrosphere-C18

Thực phẩm đóng hộp

[16]

N

- Auramin O và chrysoidin II

U Y

Cá

TLT K

N

Đánh giá phƣơng pháp

Ơ

Phƣơng pháp

Xử lý mẫu,

H

Nền mẫu

Do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kỹ thuật LC-MS và LC-MS/MS đã đƣợc ứng dụng để nghiên cứu phân tích Auramin O trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau. Bảng 1.3 giới thiệu một số phƣơng pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng LC-MS hoặc LC-MS/MS.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 7

Xử lý mẫu

Phƣơng pháp

Đánh giá TLT phƣơng K pháp

Rhodamin B, auramin O và pararosanilin

- Chiết lỏng lỏng với các dung môi hữu cơ phân cực và không phân cực

LC-ESI-MS/MS

(-)

H

Ơ

Đối tƣợng

ẠO

- Pha động:

[27]

N

G

Đ

Kênh A: AA 20mM (chỉnh PH - Làm sạch 4,5 = acid acetic) bằng qua cột Kênh B: ACN Oasis HLB

TR ẦN

10 00

B

- Chiết bằng methanol - Làm sạch qua cột SPE C18

Ó

A

Chrysoidin và Auramin O

LOD: 1,28 µg/kg LOQ: 4,27 µg/kg R: 80,1 95,3%

[32]

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Thực phẩm

UPLC-MS/MS

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q TP

- cột ODS

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Thực phẩm đóng hộp

U Y

N

Nền mẫu

N

Bảng 1.3. Một số phương pháp xác định Auramin O trong thực phẩm bằng LC-MS hoặc LC-MS/MS

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LC-MS/MS

Đ

Kênh B: ACN

N

- Chiết bằng HPLC-MS ACN : AF 2% - Cột C18 - Qua cột SPE - Pha động : MCX Kênh A : ACN

TR ẦN

H Ư

Chyrsoidin, Auramin O, Astrazone orange G

Kênh B : AF 0,1 %

LOQ: 5 µg/kg

[17]

R: 71,3 92,5%

H

Ó

A

10 00

B

Bột ớt

LOD: 2 µg/kg

-L

Í-

1.2.2. Phương pháp LC-MS/MS

ÁN

Sắc kí lỏng khối phổ là một kỹ thuật mới nhƣng đã đƣợc ứng dụng để

TO

phân tích rộng rãi do có nhiều ƣu điểm : - Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

[21]

ẠO

TP

.Q

U Y

LOQ: 40 - Cột aligent ODS ng/g C18 R: 79,8- Qua cột SPE - Pha động: 95,2 % WAX Kênh A: AA 50mM (0,1% AF)

Ơ

- Chiết bằng MeOH : AA 50mM (1:1)

Đánh giá TLT phƣơng K pháp

H

Phƣơng pháp

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Chrysoidine G, Basic Thịt gà và Yellow 2, Acid các Orange I, sản phẩm Acid orange từ đậu II, Acid Yellow 36

Xử lý mẫu

N

Đối tƣợng

Nền mẫu

N

8

D

IỄ N

Đ

ÀN

phù hợp để phân tích các mẫu có hàm lƣợng độc tố ở mức thấp - Có khả năng tách các chất dựa theo m/z , do đó cùng với khả năng tách

các chất nhờ HPLC thì phƣơng pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều chất trong cùng một lần chạy - Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lƣợng và cấu tạo của chất nên rất đặc trƣng cho từng chất

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 9

- Có khả năng phân tích đƣợc những chất không thể phân tích bằng sắc kí khí, nhƣ các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt

Ơ

N

Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ

N

H

phận phát hiện là detector khối phổ [1], [6].

TP

.Q

Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn). Khi tiến hành chạy sắc kí, các

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

chất phân tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn

G

hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất

H Ư

N

khác nhau, nên khả năng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác

TR ẦN

nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [1],[5].

B

a. Pha tĩnh trong HPLC

10 00

Trong HPLC, pha tĩnh chính là bề mặt chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách

A

hỗn hợp chất phân tích. Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp

H

Ó

sắc kí lỏng pha liên kết thƣờng chia làm 2 loại: sắc kí pha thuận (NP-HPLC)

Í-

và sắc kí pha đảo (RP-HPLC).

-L

- Sắc kí pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các

ÁN

silica trần hoặc các silica đƣợc gắn các nhóm alkyl có ít cacbon mang các

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

1.2.2.1. Sắc kí lỏng (HPLC)

- Sắc kí pha đảo: pha tĩnh thƣờng là các silica đã đƣợc alkyl hóa, không

phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37 [1],[5]. b. Pha động trong HPLC Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc kí nhất định. Có thể chia pha động thành hai loại:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 10

- Pha động phân cực: có thành phần chủ yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực nhƣ

Ơ

N

methanol, acetonitril. Pha động loại này đƣợc dùng trong sắc kí pha liên kết

H

pha đảo.

U Y

N

- Pha động không phân cực: bao gồm các dung môi ít phân cực nhƣ

TP

(CS2), clorobutan, CCl4, toluen…

ẠO

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

năng rửa giải, ngƣời ta thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung

N

G

môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi

H Ư

thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ [1],[5].

TR ẦN

1.2.2.2. Khối phổ

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân

10 00

B

tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách

Ó

A

thêm hay bớt điện tích của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa, … Các ion

H

tạo thành này đƣợc tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin

-L

Í-

về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [1],[7].

ÁN

Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS đƣợc trình bày ở hình 1.2.

TO

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phân

D

IỄ N

Đ

ÀN

tích khối và bộ phận phát hiện.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

xyclopentan, n-pentan, n-hexan, n-heptan, 2-chloropropan, cacbondisulfua

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 11

H

Ơ

Detector/lƣu giữ số liệu

Bộ phân tích khối

N

Ion hóa

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

a. Nguồn ion hoá

Đ

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để

N

G

chuyển thành dạng hơi và đƣợc ion hóa nguyên tử. Các kĩ thuật ion hóa

H Ư

thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc kí lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (ESI)

tôi sử dụng kỹ thuật ESI.

TR ẦN

và ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI). Trong nghiên cứu này chúng

B

Kỹ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở

10 00

dạng khí. Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc

A

duy trì ở hiệu điện thế khoảng 1- 5kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển

H

Ó

thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân

Í-

tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc khi vào thiết bị phân tích khối phổ sẽ đƣợc

-L

kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi. Có hai chế độ bắn phá:

ÁN

bắn phá với chế độ ion dƣơng ESI(+) và ion âm ESI(-). Đối với chế độ

TO

ESI(+), ion đƣợc tạo thành thƣờng là ion [M+H]+ , còn đối với chế độ ESI(-),

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

Hình 1.2. Mô hình hệ thống LC-MS/MS

.Q

U Y

Sắc ký lỏng

N

Chân không

D

IỄ N

Đ

ÀN

ion đƣợc tạo thành thƣờng là ion [M-H]- [7].

b. Bộ phận phân tích khối Sau khi đã đƣợc ion hóa, các ion đƣợc đƣa đến bộ phận phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn phá thêm để thu đƣợc các ion con. Các kỹ thuật phân tích khối đƣợc sử

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 12

dụng phổ biến là bộ phận phân tích tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay. Bộ phân tích khối ba tứ cực đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ

Ơ

N

thuật LC-MS/MS và đây chính là kỹ thuật đƣợc chúng tôi sử dụng trong

H

nghiên cứu này.

U Y

N

Tứ cực có cấu tạo gồm 4 thanh điện cực song song tạo thành một

TP

đi qua bộ lọc này. Tứ cực thứ 1 (Q1) và thứ 3 (Q3) có vai trò nhƣ là các bộ

ẠO

lọc khối. Còn tứ cực thứ 2 (Q2) có vai trò nhƣ là buồng va chạm, tại đó các

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ion sau khi qua Q1 (ion mẹ) đƣợc bắn phá bởi năng lƣợng và khí trơ để tạo

H Ư

N

G

thành các ion nhỏ hơn (ion con). Các ion này đƣợc lựa chọn tại Q3 [1], [7] c. Bộ phận phát hiện:

TR ẦN

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion đƣợc đƣa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho

10 00

B

phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion dƣơng tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển.

Ó

A

Bộ phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

H

có độ nhạy cao. Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod làm bật ra các

-L

Í-

electron. Các electron thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo

ÁN

ra các electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Cứ nhƣ

TO

vậy tín hiệu sẽ đƣợc khuếch đại và đƣợc ghi lại. Tín hiệu này tỷ lệ thuận với

D

IỄ N

Đ

ÀN

lƣợng ion do đó tỷ lệ với nồng độ chất phân tích ban đầu [7].

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

khoảng trống để các ion bay qua. Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 13

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

N

H

Ơ

Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là các mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN) đƣợc thu thập trên thị trƣờng Hà Nội.

N

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

TP

.Q

2.2. Nguyên vật liệu – trang thiết bị

ẠO

2.2.1. Nguyên vật liệu

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.2.1.1. Chất chuẩn

H Ư

Pha dung dịch chuẩn:

TR ẦN

Ehrenstorfer. Bảo quản ở 20 ± 4oC.

N

G

Chuẩn gốc AUO dạng rắn (độ tinh khiết 75%) của hãng Dr

- Dung dịch chuẩn AUO nồng độ 150 µg/mL : Cân 0,02g chuẩn AUO

10 00

B

dạng rắn, hòa tan và định mức bằng methanol đến 100 mL, thu đƣợc chuẩn có nồng độ 150 µg/mL. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2-8˚C, có thể sử dụng

A

đƣợc trong 6 tháng.

H

Ó

- Dung dịch chuẩn trung gian AUO nồng độ 1 µg/mL : Hút 67 L chuẩn

Í-

AUO nồng độ 150

g/mL vào bình 10 mL và định mức đến vạch bằng

ÁN

-L

methanol. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ từ 2-8oC, có thể sử dụng đƣợc trong 3 tháng.

TO

- Dung dịch chuẩn trung gian AUO nồng độ 100 ng/mL: Hút 1 mL

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Tổng số mẫu là 15 mẫu

D

IỄ N

Đ

ÀN

chuẩn AUO nồng độ 1 g/mL vào bình định mức 10 mL và định mức đến

vạch bằng methanol. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2-8oC, có thể sử dụng đƣợc trong 3 tháng.

2.2.1.2. Hoá chất, dung môi Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 14

- Dung môi loại dùng cho sắc kí: acetoniril, methanol, acid formic của Merck, Đức.

Ơ

N

- Acid acetic, amoni acetat , acetonitril của Merck, Đức.

N

H

- Nƣớc cất 2 lần.

TP

.Q

2.2.2.1. Thiết bị

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

năng cao LC 1290 và khối phổ 6460.

G

- Cột sắc ký Agilent C18 (1,8 µm x 2,1mm x 50 mm) và tiền cột tƣơng

H Ư

N

ứng.

TR ẦN

- Máy lắc xoáy IKA.

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips.

B

- Máy li tâm Z383K, Hermle.

10 00

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.

Ó

H

2.2.2.2. Dụng cụ

A

- Bộ chiết pha rắn Supleco và máy hút chân không.

-L

Í-

- Micropipet có thể tích điều chỉnh đƣợc 20-200 µL, 100-1000 µL và 1000-5000 µL.

ÁN

- Bình định mức: 10 mL, 100 mL.

IỄ N

Đ

ÀN

TO

- Ống ly tâm nhựa 50 mL.

D

ẠO

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ của Agilent gồm máy sắc ký lỏng hiệu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

2.2.2. Trang thiết bị

- Vial loại 1,8 mL. - Pipet pasteur.

- Ống đong, phễu, giấy lọc.

- Ống SPE loại: C18, HLB, SCX.

2.3. Nội dung nghiên cứu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 15

2.3.1. Khảo sát các điều kiện xác định AUO bằng LC-MS/MS - Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: tìm các điều kiện tách sắc ký bao

Ơ

N

gồm pha động, pha tĩnh

N

H

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ƣu của MS để xác

TP

.Q

2.3.2 . Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

ẠO

- Khảo sát về dung môi chiết

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Khảo sát về bƣớc làm sạch bằng SPE.

N

G

2.3.3. Thẩm định phương pháp

H Ư

- Tính chọn lọc, đặc hiệu.

TR ẦN

- Giới hạn phát hiện LOD.

10 00

- Khoảng tuyến tính.

B

- Giới hạn định lƣợng LOQ. - Độ lặp lại.

Ó

A

- Độ thu hồi.

Í-

H

2.3.4. Ứng dụng phương pháp

-L

Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định hàm lƣợng AuO trong

ÁN

một số mẫu TACN trên thị trƣờng.

TO

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

định ion phân tử; lựa chọn các ion sản phẩm phù hợp.

D

IỄ N

Đ

ÀN

2.4.1. Phương pháp lấy mẫu - Các mẫu TACN đƣợc lấy từ 3 quận trên địa bàn Hà Nội là quận Hoàng Mai, quận Từ Liêm và quận Long Biên trong khoảng thời gian từ tháng 11/2015 – 12/2015 - Mỗi quận lấy 5 mẫu khác nhau.

- Mỗi mẫu lấy ít nhất 1 kg.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 16

- Bảo quản mẫu ở nơi thoáng mát, nhiệt độ phòng.

2.4.2. Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ

Ơ

N

- Các mẫu sau khi thu thập đƣợc mã hóa từ M-01 đến M-15.

N

H

- Đồng nhất tối thiểu 1 kg mẫu bằng máy đồng nhất mẫu HR1843,

U Y

Philips.

TP

thoáng mát, nhiệt độ 20 ± 4ºC.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.4.3. Phương pháp chiết pha rắn

Đ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp chiết pha rắn

H Ư

N

G

(SPE) để làm sạch mẫu phân tích.

Chiết pha rắn (hay chiết rắn-lỏng) là quá trình phân bố chất tan giữa 2

TR ẦN

pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nƣớc hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp phụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt nhỏ và xốp) gọi là

10 00

B

pha rắn.

Pha rắn (còn gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silica gel xốp

-

Ó

A

trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã đƣợc alkyl hóa nhóm –OH

Í-

H

bằng các gốc hydrocacbon mạch thẳng –C2, -C4, -C8, -C18,…hay nhân

-L

phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này

ÁN

đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ (thể tích 5-10ml) hoặc nén dƣới dạng đĩa dày 1-2

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

mm với đƣờng kính 3-4 cm (đĩa chiết).

-

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

- Mẫu sau khi đồng nhất có thể đem phân tích hoặc đƣợc bảo quản nơi

Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung

môi hữu cơ, dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết, pha rắn tƣơng tác với chất phân tích và liên kết với một (hoặc mhóm chất phân tích trên pha tĩnh. Sau đó dùng dung môi thích hợp hòa tan tốt các chất phân tích để rửa giải chúng ra khỏi pha tĩnh và thu chất phân tích.

Qui trình chiết pha rắn:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 17

 Hoạt hóa chất hấp phụ và pha rắn - Làm ƣớt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp

Ơ

N

phụ.

N

H

- Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp hấp phụ, lấp

U Y

đầy khoảng trống bằng dung môi.

TP

không hoàn toàn và độ thu hồi chất phân tích sẽ bị giảm.

- Dung dịch chứa chất phân tích đƣợc cho qua cột với tốc độ thích

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

G

hợp.

H Ư

- Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấp phụ.

TR ẦN

- Một vài thành phần ảnh hƣởng khác cũng có thể bị giữ lại.

- Các thành phần không bị hấp phụ sẽ bị loại ra ngoài cùng dung

B

môi.

10 00

- Pha rắn sẽ lƣu giữ chất phân tích và một số tạp chất.

A

 Loại tạp

H

Ó

- Loại bỏ chất gây ảnh hƣởng và nền mẫu chỉ giữ lại chất phân

Í-

tích.

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

- Nếu mẫu là dung dịch nƣớc, sử dụng hệ đệm hoặc hỗn hợp nƣớc-

IỄ N D

ẠO

 Hấp phụ chất phân tích lên cột

dung môi hữu cơ để rửa tạp.

- Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

- Không đƣợc để chất hấp phụ bị khô do khả năng hấp phụ xảy ra

sử dụng chính dung môi đó.

 Rửa giải - Dung môi đƣợc chọn phải phá vỡ dễ dàng tƣơng tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ.

- Thể tích dung môi rửa giải càng ít càng tốt nhƣng phải đảm bảo rửa sạch chất phân tích ra khỏi vật liệu hấp phụ.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 18

2.4.4. Phương pháp thẩm định

N

2.4.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc

H

Ơ

Để đánh giá tính chọn lọc của phƣơng pháp chúng tôi thực hiện phân

N

tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn

TP

.Q

thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu trên mẫu chuẩn.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Ngoài ra, tính chọn lọc còn đƣợc khẳng định bằng số điểm nhận dạng

G

và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu [12].

Số ion

n n 1 ion mẹ, 2 ion con 1 ion mẹ, 2 ion con

Số điểm IP n n 4 4

Ó

A

10 00

GCMS (EI hoặc CI) LC-MS GC-MS-MS LC-MS-MS

B

Kỹ thuật

TR ẦN

H Ư

N

Bảng 2.1. Số điểm IP cho các kỹ thuật phân tích

Í-

H

2.4.4.2. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

-L

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích

ÁN

trong mẫu có thể phát hiện đƣợc nhƣng chƣa thể định lƣợng đƣợc.

TO

Giới hạn định lƣợng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không đƣợc lên tín hiệu chất phân tích, mẫu

D

IỄ N

Đ

ÀN

mẫu thử mà ta có thể định lƣợng và cho kết quả có độ chụm mong muốn.

Xác định LOD,LOQ dựa trên tỉ lệ tín hiệu nhiễu đƣờng nền (S/N):

Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tí hiệu của chất phân tích (n=4). Xác định tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = signal to noise ratio) LOD là nồng độ mà tại đó S/N= 3

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 19

LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10 Trong đó:

S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

Ơ

N

N là nhiễu đƣờng nền

N

H

2.4.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

TP

.Q

phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích. Đƣờng chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

lƣợng đƣợc đo và nồng độ các chất phân tích.

G

Đ

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch

H Ư

N

chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ.

Sau đó vẽ đƣờng cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu đƣợc vào nồng độ,

TR ẦN

quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.

Sau khi xác định đƣợc khoảng tuyến tính của các chất tiến hành xây

10 00

B

dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hƣởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Vẽ đƣờng cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu

Ó

A

chất ngoại chuẩn và chia cho nội chuẩn (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ

Í-

H

chuẩn (trục hoành x).

-L

2.4.2.4. Độ lặp lại và độ thu hồi

ÁN

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

lẻ của các phép đo lặp lại.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc

giá trị đƣợc chấp nhận. Độ đúng là khái niệm định tính và có thể đƣợc biểu diễn định lƣợng dƣới dạng độ thu hồi. Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau của AuO và tính toán kết quả theo các công thức:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 20

- Độ lặp lại đƣợc biểu diễn theo độ lệch chuẩn SD hay độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD:

N

̅

Ơ

̅

∑

SD = √

.100%

H

RSD(%) =

.Q

Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm.

TP

x:

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Đ

C R(%) = C .100% c

- Độ thu hồi:

ẠO

n : Số lần thử nghiệm.

H Ư

N

Trong đó: R: độ thu hồi (%)

TR ẦN

C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL).

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

10 00

B

2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu

A

Các kết quả đƣợc tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

bị (phần mềm MassHunter). Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

xi : Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ “i”

U Y

N

Trong đó:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 21

Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

N

3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định AUO bằng LC-MS/MS

N

H

Ơ

3.1.1. Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ

U Y

3.1.1.1. Lựa chọn ion phân tử và ion sản phẩm

TP

dung dịch chuẩn AUO nồng độ 50 ng/mL vào khối phổ và thực hiện các khảo

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

sát bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn ion dƣơng. Lựa

G

Đ

chọn ion mẹ là ion có dạng [M+H]+; sau đó phân mảnh ion mẹ để thu đƣợc

N

các ion con. Ion con có cƣờng độ cao nhất đƣợc chọn làm ion định lƣợng, các

H Ư

ion con có cƣờng độ thấp hơn đƣợc sử dụng để khẳng định sự có mặt của chất

TR ẦN

phân tích (định tính). Năng lƣợng va chạm (CE) đƣợc tối ƣu tự động theo từng ion con dựa vào phần mềm của thiết bị.

10 00

B

Các kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.1, hình 3.1 và phụ lục 1.

Mảnh mẹ

Mảnh

phân tích

con (m/z)

A

Tên chất

Ó

Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích AUO bằng ESI(+)-MS/MS

ÁN

-L

Í-

H

(m/z)

268

CAV(V)

Ghi chú

147

28

4

Định lƣợng

252

36

4

Định tính

131

56

4

Định tính

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

AUO

CE (eV)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Để xác định các ion phân tử và ion sản phẩm của AUO, chúng tôi tiêm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 22

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

268  252

B

TR ẦN

H Ư

N

G

268  131

10 00

Hình 3.1. Sắc đồ các ion sản phẩm

A

3.1.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện MS

H

Ó

Để tối ƣu hóa điều kiện MS cho từng chất, chúng tôi sử dụng kỹ thuật

Í-

FIA, nghĩa là dung dịch chuẩn đƣợc bơm trực tiếp váo máy MS cùng với

-L

dòng pha động mà không qua cột sắc ký. Qua khảo sát ta thu đƣợc giá trị tối

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

ƣu của từng thông số cho chất phân tích. Giá trị đƣợc liệt kê trong bảng 3.2.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

Ơ

N

268  147

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 23

Bảng 3.2. Các thông số tối ưu của MS đối với chế độ ion dương

N

Chế độ ion dƣơng

Ơ

Ký hiệu

4000

Nhiệt độ nguồn khí khô

Gas Temp (oC)

300

Tốc độ dòng khí

Gas Flow (l/min)

ẠO

Nebulizer

(psi)

25

Dwell time (ms)

190

100

Ó

A

3.1.2. Lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng

Í-

H

3.1.2.1. Chọn pha tĩnh

-L

Cột tách là bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký, nó đóng góp một

ÁN

phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Qua tham khảo các tài

TO

liệu và với điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn cột tách là cột pha

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

TP N

G

Đ

6

H Ư

10 00

Thời gian dừng

Fragmentor (V)

TR ẦN

Năng lƣợng phân mành

N

Vcap (V)

U Y

Thế mao quản

B

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

H

Thông số

Gía trị tối ƣu

D

IỄ N

Đ

ÀN

đảo C18. Trong nghiên cứu này, cột sắc ký Agilent C18 (1,8 µm x 2,1mm x 50 mm) đã đƣợc sử dụng.

3.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động Trong LC-MS/MS, pha động không chỉ ảnh hƣởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hƣởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với kĩ thuật ESI, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất nền nhƣ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 24

acid acetic, acid formic, amoni acetat... Với pha tĩnh sử dụng là cột C18, không phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực. Do đó, pha động

Ơ

N

với 2 thành phần là dung dịch acetonitril (A) và acid formic 0,1% (B) đã đƣợc

H

sử dụng ở chế độ gradient. Dùng dung dịch chuẩn AUO 50 ng/mL để tiến

U Y

N

hành khảo sát các chƣơng trình gradient khác nhau đƣợc tóm tắt trong bảng

TP

mL/phút.

ẠO

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

Thành phần pha động Tỷ lệ ACN (%) Tỷ lệ HCOOH 0,1% (%) 30 70 30 70 70 30 70 30 30 70 30 70 60 40 60 40 100 0 100 0 40 60 40 60 20 80 20 80 80 20 80 20 20 80 20 80

TO

ÁN

H

-L

Í-

Gradient 2

Ó

A

10 00

Gradient 1

Thời gian (phút) 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 0,00 0,50 2,00 3,00 3,50 5,00 0,00 0,50 2,00 3,00 3,50 5,00

B

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 3.3. Chương trình gradient phân tích Auramin O

D

IỄ N

Đ

ÀN

Gradient 3

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

3.3. Cố định các điều kiện khối phổ nhƣ bảng 3.2 và tốc độ dòng là 0,5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 25

hệ gradient 3

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

hệ gradient 2

A

Hình 3.2. Sắc kí đồ dung dịch chuẩn AUO 50 ng/mL phân tích bởi các hệ gradient

H

Ó

Nhận xét: Trong 3 chƣơng trình gradient pha động, chƣơng trình

Í-

gradient 3 cho kết quả phân tích tốt nhất, píc sắc kí của AUO cân đối nhất,

-L

đỉnh pic gọn hơn, giảm hiện tƣợng kéo đuôi. Do vậy, chúng tôi lựa chọn

ÁN

chƣơng trình gradient 3 để tiến hành phân tích AUO.

TO

3.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

hệ gradient 1

D

IỄ N

Đ

ÀN

3.2.1. Chọn quy trình xử lý mẫu Trong thành phần của TACN có chứa nhiều tạp chất bẩn, do đó trƣớc

khi đo trên thiết bị LC - MS/MS cần phải xử lý, tách chiết mẫu để làm giàu mẫu, loại tạp chất, giảm ảnh hƣởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện. Qua tham khảo chúng tôi lựa chọn quy trình chiết nhƣ sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 26

Ơ

N

Cân 1 g mẫu phân tích vào ống ly tâm 50 mL

ẠO

TP

.Q

Lắc vortex 5 phút

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Rung siêu âm 30 phút

TR ẦN

Ly tâm 6000 vòng/5 phút

10 00

B

Lọc qua màng 0,45 µm

Í-

H

Ó

A

Lọc qua màng 0,2 µm

Hình 3.3. Quy trình xử lý mẫu khảo sát

TO

ÁN

-L

Chạy máy LC-MS/MS

ÀN

Các yếu tố đƣợc lựa chọn để khảo sát bao gồm:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

Thêm 10 mL methanol

D

IỄ N

Đ

- Khảo sát dung môi chiết - Khảo sát bƣớc làm sạch qua SPE trƣớc khi đo bằng LC – MS/MS

3.2.2. Khảo sát dung môi chiết Chúng tôi tiến hành khảo sát trên ba hệ dung môi chiết là: (1) methanol; (2) nƣớc và (3) acetonitrile đã đƣợc sử dụng để khảo sát. Cố định

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 27

các bƣớc chiết khác nhƣ quy trình trên sử dụng nền mẫu TACN không phát hiện AUO và thêm chuẩn để thu đƣợc nồng độ của AUO là 10 ng/mL trong

443

Acetonitril

19852

TP

ẠO

22932

chiết bằng nƣớc

chiết bằng ACN

chiết bằng methanol

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Methanol

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Nƣớc

U Y

Diện tích pic

.Q

Dung môi chiết

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

H

Bảng 3.4. So sánh các loại dung môi chiết đến diện tích pic của AUO

Ơ

N

dịch chiết phân tích trên máy. Các kết quả thu đƣợc nhƣ ở bảng 3.4.

Hình 3.4. Sắc ký đồ AUO khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 28

Nhận xét: sử dụng methanol làm dung môi chiết cho diện tích pic thu đƣợc lớn nhất. Do vậy chúng tôi lựa chọn sử dụng dung môi chiết là methanol

Ơ

N

cho các khảo sát tiếp theo.

N

H

3.2.3. Khảo sát cột chiết pha rắn SPE

TP

.Q

Oasis HLB để khảo sát hiệu quả chiết AUO. Chiết bằng methanol và thêm

ẠO

chuẩn vào mẫu ở nồng độ 100 ng/mL. Kết quả thu đƣợc theo bảng 3.5

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 3.5. Khảo sát cột SPE đến độ thu hồi của AUO

G

Độ thu hồi (R %)

H Ư

N

Loại SPE

C18

29,1 90,1 87,5

10 00

B

Oasis HLB

TR ẦN

SCX

Không qua cột

81,0

Ó

A

Nhận xét: Qua bảng trên ta thấy sử dụng cột C18 cho hiệu suất chiết

H

cao nhất. Cột HLB cũng cho hiệu suất thu hồi khá tốt, tuy nhiên chi phí lại

-L

Í-

cao hơn so với cột C18 do đó chúng tôi sử dụng cột C18 để đảm bảo làm sạch

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

tạp tốt nhất cũng nhƣ hiệu suất thu hồi tốt nhất.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 3 loại cột là SCX, C18 và

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hình 3.5. Khảo sát các loại cột SPE

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

29

D

IỄ N

Đ

ÀN

3.2.4. Khảo sát dung môi rửa giải AUO đƣợc chiết nhƣ hình 3.3, mẫu đƣợc thêm chuẩn ở mức 100

ng/mL và đƣợc qua cột C18, rửa giải bằng các dung môi khác nhau. Kết quả thu đƣợc theo bảng sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 30

Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải Diện tích píc

Methanol : H2O = 20 : 80

88

Methanol : H2O = 50 :50

1130

Methanol 100 %

211388

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Nhận xét: sử dụng methanol 100% giúp rửa giải AuO ra khỏi cột SPE

G

Đ

tốt nhất. Tỷ lệ dung môi methanol : H2O = 20 : 80 có thể dùng trong bƣớc loại

H Ư

N

tạp mà không làm mất hàm lƣợng AUO trong mẫu.

TR ẦN

Nhƣ vậy sau khi khảo sát một số điều kiện của quá trình xử lý mẫu,

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

chúng tôi đi đến quy trình chiết AUO từ mẫu TACN nhƣ sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

Loại dung môi

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 31

Ơ

N

Cân 1g mẫu phân tích vào ống ly tâm 50 mL

ẠO

TP

.Q

Lắc vortex 5 phút

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Rung siêu âm 30 phút

TR ẦN

Ly tâm 6000 vòng/5 phút

1. Hoạt hóa cột: 3 mL Methanol, 3 mL nƣớc.

10 00

B

Lọc qua màng 0,45 µm

3. Rửa tạp: 3 mL hỗn hợp nƣớc : methanol = 80:20 (v/v).

4. Rửa giải: 4 mL methanol.

Í-

H

Ó

A

Chiết pha rắn SPE cột C18

2. Nạp mẫu: Hút chính xác 1 mL dịch + 5 mL nƣớc qua cột.

Hình 3.6. Quy trình xử lý mẫu tối ưu

TO

ÁN

-L

Chạy máy LC-MS/MS

ÀN

3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

Thêm 10 mL methanol

D

IỄ N

Đ

3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc Để đánh giá tính chọn lọc tôi phân tích các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Hình 3.7 giới thiệu sắc đồ của AUO trên các nền mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 32

H

Ơ

N

mẫu chuẩn

G N H Ư TR ẦN

Hình 3.7. Sắc đồ pic AUO ở mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn và mẫu trắng

10 00

B

Nhận xét: Thời gian lƣu của AUO trên nền mẫu thêm chuẩn hoàn toàn giống với trên mẫu chuẩn, không xuất hiện pic ở mẫu trắng ở khoảng thời

Ó

A

gian của các píc nói trên.

H

Ngoài ra, để xác định tính đặc hiệu của phƣơng pháp LC-MS/MS,

-L

Í-

chúng tôi sử dụng kỹ thuật tính số điểm IP (điểm nhận dạng- identification

ÁN

point) theo quyết định 657/2002/EC của Châu Âu [12]. Đối với kỹ thuật sắc

TO

ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS), mỗi ion phân tử đƣợc tính 1 điểm, mỗi

ÀN

ion sản phẩm đƣợc tính 1,5 điểm. Trong nghiên cứu này, AUO đƣợc nhận

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

mẫu trắng

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

mẫu thêm chuẩn

D

IỄ N

Đ

dạng bởi 1 ion mẹ và 3 ion con, nên có số điểm IP là 5,5, do đó đáp ứng đƣợc yêu cầu của Châu Âu.

3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 33

LOD và LOQ đƣợc xác định thông qua đánh giá tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N). LOD đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 3;

Ơ

N

LOQ đƣợc xác định tại nồng độ thu đƣợc S/N khoảng bằng 10.

N

H

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ thấp gần giới hạn

.Q

LOQ.

TP

Kết quả thu đƣợc: LOD = 8 µg/kg

ẠO

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

LOQ = 20 µg/kg

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Hình 3.8. Sắc đồ AUO tại LOD 0,2 ng/mL (tương đương 8 µg/kg trên mẫu)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

phát hiện của thiết bị và xác định giá trị S/N. Dựa vào S/N để xác định LOD,

Hình 3.9. Sắc đồ AUO tại LOQ 0,5 ng/mL (tương đương 20 µg/kg trên mẫu)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 34

3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch

Ơ

N

chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ.

N

H

Đƣờng chuẩn đƣợc pha trên nền mẫu và trong dung môi để khảo sát sự ảnh

.Q

3.3.3.1. Đường chuẩn trong dung môi

TP

Pha dãy dung dịch chuẩn trong dung môi có nồng độ từ 0,5 ng/mL đến

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

50 ng/mL và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Kết quả đƣợc

G

Đ

trình bày tóm tắt trong bảng 3.7 và đƣờng chuẩn đƣợc trình bày trong hình

N

3.10

(ng/mL)

10 00

(cps.s) 619 1387

9779

10

19197

20

37972

50

95791

-L

H

Ó

3802

5

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Diện tích píc

Í-

A

1 2

B

0,5

TR ẦN

Nồng độ

H Ư

Bảng 3.7. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong dung môi

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

hƣởng của nền mẫu.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 35

y = 1919.2x - 185.79 R² = 0.9999

N

100000

H

Ơ

80000

.Q

40000

TP

20000 0

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

0

20

30

40

50

60

N

G

Đ

Nồng độ (ng/mL)

TR ẦN

3.3.3.2. Đường chuẩn trong nền mẫu

H Ư

Hình 3.10. Đường chuẩn AUO trong dung môi Để đánh giá ảnh hƣởng nền chúng tôi thực hiện pha dãy dung dịch

B

chuẩn từ 0,5 – 50 ng/mL trong nền dịch chiết mẫu trắng và tiến hành khảo sát.

10 00

Các kết quả đƣợc tóm tắt trong bảng 3.8 và đƣờng chuẩn đƣợc trình bày trong hình 3.11.

H

Ó

A

Bảng 3.8. Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ trong nền mẫu Diện tích píc (cps.s)

0,5

981

1

1903

2

4233

5

9989

10

20654

20

39616

50

99010

Í-

Nồng độ (ng/mL)

-L ÁN TO ÀN Đ

IỄ N D

10

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

60000

ẠO

Diện tích píc (cps.s)

120000

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 36

y = 1977.7x + 193.89 R² = 0.9999

N

100000

H

Ơ

80000

.Q

40000 20000

10

20

30

40

50

60

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

0

ẠO

0

H Ư

N

G

Nồng độ (ng/mL)

TR ẦN

Hình 3.11. Đường chuẩn AuO trong nền mẫu

H

Ó

A

10 00

B

Nhận xét: Cả hai đƣờng tuyến tính trong dung môi và trong nền mẫu đều có hệ số tƣơng quan R2 > 0,999 do đó trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tƣơng ứng. Ảnh hƣởng nền (Matrix effect) là ảnh hƣởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Ảnh hƣởng nền ≤ ± 15%. (anền mẫu - adung môi) ME = × 100 adung môi

ÁN

-L

Í-

Kết quả cho ME của phƣơng pháp là 3,1% do đó có thể sử dụng phƣơng trình đƣờng chuẩn trong dung môi để tính toán các kết quả phân tích.

TO

3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

60000

TP

Diện tích píc (cps.s)

120000

ÀN

Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp đƣợc đánh giá bằng cách

D

IỄ N

Đ

phân tích các mẫu thêm chuẩn ở các mức nồng độ khác nhau, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ. Các kết quả tính độ lệch chuẩn tƣơng đối và độ thu hồi đƣợc trình bày trong bảng 3.9.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 37

Bảng 3.9. Độ lặp lại và thu hồi của AUO trên nền mẫu TACN

N

2 mg/kg

R

Ctt

R

Ctt

R

(mg/kg)

(%)

(mg/kg)

(%)

(mg/kg)

(%)

1

0,52

103,2

0,816

81,6

1,98

2

0,45

90,5

0,86

86

1,96

97,8

3

0,53

106,6

0,972

97,2

2,00

100,2

4

0,54

107,9

0,968

96,8

2,09

104,6

5

0,50

99,1

0,824

1,72

86,2

6

0,51

102,4

1,092

109,2

1,77

88,4

TB

0,51

101,6

92,2

1,92

96,1

SD

0,03

RSD(%)

5,6

0,922

G

Đ

ẠO

H

N

TP

.Q

99

0,13

10,6

6,8

A

10 00

B

0,09

H

Ó

Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy độ lặp lại và độ thu hồi của AUO

-L

Í-

đều nằm trong khoảng giới hạn theo quy định của hội đồng châu Âu (AOAC).

ÁN

Phƣơng pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt khi phân tích AUO trong

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

TACN.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TR ẦN

H Ư

N

82,4

Ơ

Ctt

STT

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1 mg/kg

U Y

0,5 mg/kg

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Í-

Hình 3.12. Sắc đồ phân tích lặp lại mẫu AuO nồng độ 25 ng/mL

-L

Với các kết quả thẩm định, cho thấy phƣơng pháp có độ tin cậy, độ

TO

ÁN

nhạy và độ chính xác đáp ứng đƣợc các yêu cầu có thể ứng dụng trong phân tích AuO trong các nền mẫu là TACN.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

38

D

IỄ N

Đ

ÀN

3.4. Kết quả xác định AUO trong một số mẫu TACN Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành xác định hàm

lƣợng AUO trên các mẫu TACN đƣợc lấy trên thị trƣờng Hà Nội. Các kết quả đƣợc tổng hợp trong bảng 3.10.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 39

Địa điểm lấy mẫu

Kết quả

M-01

Quận Hoàng Mai

KPH

M-03

Đ

ẠO

79,7 µg/kg 22,8 µg/kg

Quận Từ Liêm

198 µg/kg

M-07

KPH

H Ư

M-06

TR ẦN

N

G

M-05

KPH

10 00

B

M-08 M-09

Ó H

Í-

M-11

ÀN

TO

ÁN

-L

M-12

Đ

KPH KPH

A

M-10

IỄ N D

N

TP

KPH

Quận Long Biên

KPH 1385 µg/kg

M-13

KPH

M-14

180 µg/kg

M-15

163 µg/kg

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

KPH

.Q

U Y

M-02

M-04

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

H

Ơ

Kí hiệu

N

Bảng 3.10. Kết quả xác định hàm lượng AUO trong một số mẫu TACN tại Hà Nội

Nhận xét: Theo kết quả ở bảng 3.10 phát hiện đƣợc 6/15 mẫu có chứa AUO hàm lƣợng từ 79,7 -1385 g/kg trong đó mẫu M-12 có hàm lƣợng AUO cao gần 1,4 mg/kg. Hàm lƣợng này cao hơn ngƣỡng giới hạn theo quy

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 40

định của bộ NN&PTNT trong TACN là 1 mg/kg. Do số lƣợng mẫu còn ít nên chƣa thể đánh giá xác thực về tình trạng sử dụng AUO trong TACN trên địa

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

bàn Hà Nội.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 41

Ơ

.Q

- Tách bằng sắc ký lỏng pha đảo sử dụng cột C18

TP

- Phân tích bằng MS/MS với nguồn ESI(+), chế độ MRM.

ẠO

- Chọn đƣợc chƣơng trình gradient: kênh A (ACN), kênh B (HCOOH

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

0,1%) nhƣ bảng 3.3

N

G

- Tốc độ dòng 0,5 ml/phút

H Ư

2. Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện chiết AUO trong TACN, cụ thể

TR ẦN

nhƣ sau: - Dung môi chiết: Methanol

B

- Làm sạch bằng cột SPE C18:

10 00

 Rửa giải bằng dung môi methanol

A

 Rửa tạp bằng dung môi methanol : H2O (20 : 80)

H

Ó

- Quy trình xử lý mẫu nhƣ hình 3.6

-L

nhƣ sau:

Í-

3. Đã thẩm định phƣơng pháp phân tích AUO trong TACN với các kết quả

ÁN

- Phƣơng pháp có tính chọn lọc đáp ứng yêu cầu; AUO đƣợc lựa chọn

TO

ba ion, một ion đƣợc sử dụng để định lƣợng và hai ion dùng để khẳng định sự

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

trong TACN, cụ thể nhƣ sau:

H

Kết luận 1. Đã khảo sát và lựa chọn đƣợc điều kiện LC-MS/MS để phân tích AUO

N

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

D

IỄ N

Đ

ÀN

có mặt của AUO. - Khoảng tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,5 ng/mL đến 50 ng/mL. - Giới hạn định lƣợng của AUO trong TACN từ 20 µg/kg, giới hạn phát hiện từ 8 µg/kg.

- Độ lặp lại và độ thu hồi của phƣơng pháp tốt. Hiệu suất thu hồi từ

82,4 đến 109,2 %

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 42

4. Đã sơ bộ đánh giá hàm lƣợng AUO trên một số mâu TACN ở Hà Nội với kết quả 6/15 mẫu dƣơng tính trong đó có 1 mẫu có hàm lƣợng AUO cao hơn

Ơ

N

giới hạn cho phép trong TACN.

H

Kiến nghị

.Q

dƣa muối...

TP

- Xây dựng quy trình xác định đƣợc đồng thời các nhóm chất màu

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

tƣơng tự Auramin O trong thực phẩm nhƣ Rhodamin, chrysoidin…

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

- Mở rộng thêm đối tƣợng phân tích trong thực phẩm nhƣ thịt gà, măng,

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

N

Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà

Ơ

N

Bộ NN&PTNT (2015), "Thông tư ban hành danh mục bổ sung hóa

U Y

2.

H

Nội.

.Q

chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng

TP

trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam", 42/2015/TT-

ẠO

Bộ NN&PTNT, Cục Chăn nuôi (2015), "Quyết định về việc mở rộng

G

3.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

BNNPTNT

H Ư

N

phạm vi chỉ định phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm", QĐ 846/TACN.

Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc kí lỏng hiệu năng cao và một số ứng

TR ẦN

4.

10 00

nhiên, NXB Y học.

A

Tiếng Anh

Ó

Allison R., Garratt N. (1989), "Solvent systems for thin layer

H

5.

B

dụng và nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự

Í-

chromatography of biological dyes", Medical laboratory sciences,

-L

46(2), pp. 113-119.

Ardrey R. E. (2003), Liquid chromatography-mass spectrometry: an

ÁN

6.

TO

introduction, John Wiley & Sons.

IỄ N

Đ

ÀN

7.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

1.

Bonser G. M., Clayson D. B., Jull J. W. (1956), "The induction of tumours of the subcutaneous tissues, liver and intestine in the mouse by certain dyestuffs and their intermediates", British journal of cancer,

D

10(4), p. 653.

8.

Case R., Hosker M. E., Mcdonald D. B., et al. (1954), "Tumours of the urinary bladder in workmen engaged in the manufacture and use of

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

certain dyestuff intermediates in the British chemical industry. Part II. Further consideration of the role of aniline and of the manufacture of

Ơ

N

auramine and magenta (fucshine) as possible causetive agents.", British

N

European Concil (1994), “European parliament and concil derective

European Commission (2004), Commission Directive 2004/93/EC of

TP

10.

.Q

94/36/EC on colors for use in foodstuffs”.

ẠO

21 September 2004 amending Council Directive 76/768/EEC for the

N

European Commission (2004), Directive 2004/37/EC of the European

H Ư

12.

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

purpose of adapting its Annexes II and III to technical progress.

Parliament and of the Council of 29 April 2004 on the protection of

TR ẦN

workers from the risks related to exposure to carcinogens or mutagens

European Communities (2002), The performance of Analytical

10 00

12.

B

at work.

Ó

Gessner T., Mayer U. (2000), "Triarylmethane and diarylmethane

H

13.

A

Methods and interpretation of results, (2002-657-EC).

Gestis (2007), "International limit values for chemical agents and

ÁN

14.

-L

Í-

dyes", Ullmann's encyclopedia of industrial chemistry.

TO

Health", BG Institute for Occupational Safety and Health.

D

IỄ N

Đ

ÀN

15.

16.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

9.

H

journal of industrial medicine, 11(2), pp. 213-216.

Green F. J. (1990), The Sigma-Aldrich handbook of stains, dyes and indicators, Aldrich Chemical Co. Huang Ya-Pei W. G.-F., Xia Kun,Wang Jiao-Qing,Cao Xu-Ni (2013), "Determination of chrysoidin II and auramine O in fish via high performance liquid chromatography", Chemical reagents, 26, pp. 1730.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

17.

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hui-Lan (2014), "Detemination of chrysoidin,auramine O,astrazon orange G and astrazon orange residue in chillies by solid phase

Ơ

N

extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass

N

H

spectrometry", Chinese Journal of analysis Labotarory, 33, pp. 100-

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Toxicology

and

occupational

health",

N

Lide D. (2008), "Handbook of Chemistry and Physics", CRC Press, 88,

TR ẦN

pp. 3-30.

21.

Sozialmed

H Ư

20.

Arbeitsmed

G

Präventivmed, 13, pp. 1-28.

ẠO

Kirsch P., Fleig I., Frentzel-Beyme R., et al. (1978), "Auramine.

Đ

19.

TP

Risks to Humans", 99, pp. 111-140.

Lin S., Tu H., Sun L., et al. (2011), "Simultaneous determination of

with

tandem

mass

10 00

coupled

B

five yellow dyes in foods by high performance liquid chromatography spectrometry",Chinese

journal

of

Ó

Meizhong L. (2005), "Determination of auramine O in legume-food by

H

22.

A

chromatography/Zhongguo hua xue hui, 29(1), pp. 79-82.

Í-

high per-formance liquid chromatography-diode array detector",

-L

Science and Technology of Food Industry, 8, p. 059.

Parodi S., Santi L., Russo P., et al. (1982), "DNA damage induced by

ÁN

23.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

auramine O in liver, kidney, and bone marrow of rats and mice, and in

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

IARC (2010), "IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic

.Q

18.

U Y

104.

a human cell line (alkaline elution assay and SCE induction)", Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A Current Issues, 9(56), pp. 941-952.

24.

Rao P., Bhat R. V. (2003), "A comparative study on the synthetic food colours usage in foods procured from urban and rural areas of Hyderabad", Nutrition & Food Science, 33(5), pp. 230-234.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

25.

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Silver H., Sonnenwirth A., Alex N. (1966), "Modifications in the fluorescence microscopy technique as applied to identification of acid-

Ơ

N

fast bacilli in tissue and bacteriological material", Journal of clinical

N

Tan Enling X. J. (2012), "Determination of Basic Orange Ⅱ Acid

U Y

26.

H

pathology, 19(6), pp. 583-588.

Tatebe C., Zhong X., Ohtsuki T., et al. (2014), "A simple and rapid

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

27.

TP

Industry, 18, pp. 27-31.

G

Đ

chromatographic method to determine unauthorized basic colorants

H Ư

N

(rhodamine B, auramine O, and pararosaniline) in processed foods", Food science & nutrition, 2(5), pp. 547-556.

Thetford D. (2000), "Triphenylmethane and related dyes", Kirk-Othmer

TR ẦN

28.

Encyclopedia of Chemical Technology.

B

Tonogai Y., Kingkate A., Halilamian C. (1983), "Quantitative

10 00

29.

Determination of Colorants in Dried Shrimp and Shrimp Paste Using Extraction

and

High

Performance

Liquid

A

lon-Exchange

Í-

Tripathi M., Khanna S. K., Das M. (2007), "Surveillance on use of

-L

30.

H

Ó

Chromatography", Journal of Food Protection®, 46(7), pp. 592-595.

ÁN

synthetic colours in eatables vis a vis Prevention of Food Adulteration

TO

Act of India", Food Control, 18(3), pp. 211-219.

D

IỄ N

Đ

ÀN

31.

32.

Von Müller A. (1933), "Bladder alterations due to amines. Experiences

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Orange Ⅱ and Auramine O in Bean Products", Guangdong Chemistry

from the industrial district of Basel (Ger.)", Z Urol Chir (Gynaekol), 36, pp. 202-219.

Wang J.-W., Zhong H.-J., Liang C.-Q. (2010), "Determimation of Chrysoidin and Auramine O in Food by Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry", Analysis and Testing Technology and Instruments, 2, p. 013.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

PHỤ LỤC

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

Phụ lục 1.

Kết quả lựa chọn ion phân tử

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

Phụ lục 2. Một số sắc ký đồ khảo sát và thẩm định phƣơng pháp Sắc đồ thêm chuẩn tại các nồng độ khác nhau

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Khảo sát dung môi rửa giải

rửa giải bằng MeOH : H2O (50:50)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

rửa giải bằng MeOH : H2O (20:80)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

rửa giải bằng MeOH

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

Phụ lục 3. Sắc đồ mẫu thực tế Mẫu phát hiện AuO

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Mẫu 5

Mẫu 12

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

Mẫu 6

Mẫu 15

D

IỄ N

Đ

ÀN

Mẫu 14 Mẫu không phát hiện AuO

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

Mẫu 4

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Mẫu 3

Mẫu 9

Mẫu 10

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

Mẫu 1

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial