Issuu

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HIỀN Mã sinh viên: 1101180

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HIỀN Mã sinh viên: 1101180

NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG APIGENIN TRONG CÚC HOA VÀNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Nguyên Hà 2. ThS. Nguyễn Thị Hằng Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng LỜI CẢM ƠN

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo sát hàm lƣợng Apigenin

trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, ngoài sự làm

U Y

việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, em đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ

từ phía nhà trƣờng, thầy cô, gia đình và bạn bè.

Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Việt

ẠO

Hùng - Phó Viện Trƣởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời đã tạo rất

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Nguyên Hà - Phó Trƣởng bộ môn

H Ư

Hóa phân tích - Độc chất, ThS. Đặng Thị Ngọc Lan - GV Bộ môn Hóa phân tích -

TR ẦN

Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận này. Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Nguyễn Thị Hằng - Khoa

Nghiên cứu phát triển - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng, ngƣời đã tận tình

10 00

hƣớng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong Viện Pháp Y Quốc Gia, Khoa

Nghiên cứu phát triển, Khoa Vật lý đo lƣờng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng đã

Í-

hỗ trợ em trong quá trình nghiên cứu.

-L

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt là

ÁN

những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trƣờng.

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong quá

Em xin chân thành cảm ơn!

IỄ N

ÀN

trình học tập, nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Trần Thị Hiền

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

U Y

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3

ẠO

Tổng quan về cúc hoa vàng ...........................................................................3

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.1.

1.1.1. Đặc điểm thực vật......................................................................................3

H Ư

1.1.2. Phân bố ......................................................................................................3

TR ẦN

1.1.3. Thành phần ................................................................................................4 1.1.4. Tác dụng của Cúc hoa vàng ......................................................................5

Tổng quan về Apigenin .................................................................................5

10 00

1.2.

1.2.1. Tính chất ....................................................................................................5

Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................................7

Í-

1.3.

1.2.2. Tác dụng của Apigenin..............................................................................6

-L

1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao................................................7

ÁN

1.3.2. Máy HPLC ................................................................................................7

IỄ N

ÀN

1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký .............................................8 1.3.4. Ứng dụng của HPLC .................................................................................9 1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) ........................11 1.3.6. Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin..............12

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................14 2.1.

Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu ................................................14

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..............................................................................14

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................14

2.1.2. Hóa chất, dung môi .................................................................................14

Nội dung nghiên cứu ...................................................................................15

2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................15

U Y

2.2.

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ....................................................................................15

ẠO

2.3.2. Pha dung dịch chuẩn................................................................................15

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký .............................................................15

H Ư

2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC ....................16 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu .......................................................................19

TR ẦN

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................21

3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc ký .................21

10 00

3.1.1. Chiết xuất .................................................................................................21

3.1.2. Pha dung dịch thử .....................................................................................22

3.1.3. Pha dung dich chuẩn.................................................................................22

-L

Í-

3.1.4. Lựa chọn cột sắc ký ..................................................................................22

ÁN

3.1.5. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện .................................................................22

3.1.6. Lựa chọn tốc độ dòng ...............................................................................23

IỄ N

ÀN

3.1.7. Lựa chọn pha động ...................................................................................23

3.2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng theo tiêu chuẩn AOAC..........................................................................................................27 3.2.1. Độ đặc hiệu ...............................................................................................27 3.2.2. Độ tƣơng thích của hệ thống sắc ký .........................................................28 3.2.3. Độ lặp lại của phƣơng pháp......................................................................29

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3.2.4. Độ tuyến tính ............................................................................................30

3.2.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ ............................33

3.2.5. Độ đúng của phƣơng pháp .......................................................................31

3.3. Xác định hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng .......................................35

U Y

3.4. Bàn luận ..........................................................................................................36

3.4.1. Lựa chọn phƣơng pháp .............................................................................36

ẠO

3.4.2. Điều kiện xử lý mẫu .................................................................................37

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

3.4.3. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng..........................................................37

H Ư

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

PHỤ LỤC

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Phần viết đầy đủ

DAD

Detector mảng diod (Diod Array Detector)

DĐTQ

Dƣợc điển Trung Quốc

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

EtOH

Ethanol

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid

H Ư

ẠO

Phần viết tắt

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Phổ hồng ngoại (Infra-red)

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

10 00

MeOH

Methanol

10.

12.

SKĐ

Sắc ký đồ

13.

S/N

Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise)

14.

STT

Số thứ tự

15.

UV-VIS

Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet Visible)

IỄ N

-L

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)

ÁN

Phổ khối lƣợng (Mass Spectrometry)

Í-

Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification)

RSD

ÀN

11.

TR ẦN

Chromatography)

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

U Y

Tên bảng

Trang

3.1

Khối lƣợng các mẫu thử Cúc hoa vàng

3.2

Tỷ lệ dung môi ACN : H2O chạy gradient tại các thời điểm

3.3

Thời gian lƣu của mẫu chuẩn và mẫu thử số 1

3.4

Giá trị thời gian lƣu và diện tích pic của mẫu chuẩn

3.5

Giá trị hàm lƣợng của mẫu thử số 1

3.6

Bảng biểu thị giữa nồng độ và diện tích pic của mẫu chuẩn

3.7

Kết quả biểu thị % tìm lại của khối lƣợng chuẩn thêm vào

3.8

Kết quả LOD và LOQ

3.9

Giá trị diện tích pic và thời gian lƣu LOD

3.10

Kết quả xác định hàm lƣợng của Apigenin trong các mẫu thử

ẠO

Bảng

21 23 27

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

DANH MỤC CÁC BẢNG

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Trang

U Y

Tên ảnh, sơ đồ Cúc hoa vàng

1.2

Công thức cấu tạo Apigenin

1.3

Sơ đồ nguyên lý máy HPLC

1.4

Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

3.1

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn ở tỷ lệ MeOH : H3PO4 = 52 : 48

3.2

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (1) ở tốc độ 0,8 ml/phút

3.3

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (2) ở tốc độ 1,0 ml/phút

3.4

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (2) ở tốc độ 0,7 ml/phút

3.5

SKĐ Apigenin mẫu chuẩn điều kiện (3) ở tốc độ 0,7 ml/phút

3.6

SKĐ Apigenin mẫu thử

3.7

Phổ của Apigenin chuẩn (đƣờng màu đỏ) và phổ Apigenin thử

10 00

TR ẦN

H Ư

ẠO

1.1

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hình

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3 5 8 11

ÁN

Đồ thị tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ Apigenin

IỄ N

ÀN

3.8

-L

Í-

(đƣờng màu xanh)

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là trong lĩnh vực

U Y

y, dƣợc học, ngày càng có nhiều nghiên cứu các thành phần hoạt chất mang hoạt tính

sinh học trong dƣợc liệu có tác dụng phòng, chữa bệnh, mang lại tiềm năng rất lớn cho

việc sử dụng dƣợc liệu làm nguyên liệu làm thuốc chữa các bệnh nan y. Xu thế tất yếu

ẠO

là kết hợp hai nền y học cổ truyền và y học hiện đại nhằm giải quyết những khó khăn

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

của Y học. Trong những năm gần đây, xu hƣớng quay trở lại sử dụng các sản phẩm

thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc để phòng và điều trị bệnh đang ngày càng trở nên thịnh

H Ư

hành trên thế giới.

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thƣờng gặp trong dƣợc liệu có tác dụng

TR ẦN

chống oxy hóa và các gốc tự do. Apigenin là một flavonoid thiên nhiên có hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ cúc hoa vàng. Các nghiên cứu gần đây cho thấy apigenin là

10 00

một chất chống oxy hóa, có đặc tính chống viêm và chống ung thƣ [13], [18]. Nó có thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thƣ bằng cách bắt giữ các chu kỳ tế bào ở giai

đoạn G2/M. Apigenin có khả năng gây ảnh hƣởng trên nhiều loại phân tử. Hầu hết tác

dụng qua trung gian ức chế nitric oxid synthase-2 (NOS2), yếu tố cảm ứng tăng áp oxy

Í-

(hypoxia inducible factor 1α HIF-1α), lipoxygenase, cyclooxygenase-2 (COX-2) và

-L

yếu tố tăng sinh mạch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF) [5], [18].

ÁN

Cây cúc hoa vàng đƣợc trồng nhiều ở nƣớc ta từ hàng nghìn năm trƣớc lấy hoa

dùng chữa các chứng nhức đầu, đau mắt, chảy nƣớc mắt, cao huyết áp, sốt… [6], [13],

ÀN

[17]. Ngoài ra, cúc hoa vàng đƣợc sử dụng kết hợp trong cái bài thuốc chữa hƣ nhƣợc

IỄ N

thần kinh, chữa đinh râu, viêm màng tiếp hợp dị ứng… [6]. Trong DĐVN, DĐTQ

cũng có chuyên luận riêng về cúc hoa vàng, tuy nhiên lại không đề cập đến thành phần apigenin. Hiện nay, nguồn gốc và chất lƣợng dƣợc liệu đang rất khó quản lý do còn gặp rất nhiều khó khăn, thiếu những dữ liệu chuẩn làm cơ sở nhận biết, xác định dƣợc liệu.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 2

Để góp phần bổ sung bộ dữ liệu chuẩn dƣợc liệu cho Dƣợc điển Việt Nam phục vụ công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khảo sát

hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu

U Y

1. Khảo sát và thẩm định phương pháp định lượng Apigenin bằng HPLC.

năng cao” nhằm các mục tiêu:

2. Khảo sát sơ bộ hàm lượng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng trên thị

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

trường hiện nay.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cúc hoa vàng

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Tên khác: kim cúc, hoàng cúc, dã cúc, cam

U Y

cúc, khổ ý, bioóc kim (Tày).

Tên khoa học: Chrysanthemum indicum L.

ẠO

Tên đồng nghĩa: Chrysanthemum procumbens

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Lour.

H Ư

Đặc điểm thực vật: Cây thảo, sống hàng

Họ: Cúc (Asteraceae)

năm hay sống dai, cao 20-50 cm. Thân mọc

TR ẦN

thẳng, nhẵn, có khía dọc, phân cành ở ngọn.

Hình 1.1: Cúc hoa vàng

Lá thơm, mọc so le, hình bầu dục, có thùy sâu, không lông, mép có răng cƣa nhọn,

10 00

không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dƣới nhạt, cuống lá ngắn, có tai ở gốc. Cụm hoa hình đầu, màu vàng hơi nâu, đôi khi còn đính cuống; đƣờng kính 0,5

cm đến 1,2 cm. Tổng bao gồm 4 đến 5 hàng lá bắc, mặt ngoài màu xanh hơi xám

hoặc nâu nhạt, ở giữa hai bên mép rất nhạt và khô xác. Có 2 loại hoa: Hoa hình

Í-

lƣỡi nhỏ một vòng, đơn tính, không đều ở phía ngoài; nhiều hoa hình ống, đều,

-L

mẫu năm, lƣỡng tính ở phía trong. Chất nhẹ, mùi thơm, vị đắng. Quả bế trụi. Hoa

ÁN

thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau. Hoa hái về đem đổ rồi phơi 3 - 4

nắng đến khô. Nếu trời râm, phải sấy than hoặc lửa nhẹ [3], [5], [6], [18].

IỄ N

ÀN

1.1.2. Phân bố Cúc hoa vàng phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ẩm và cận nhiệt đới Bắc bán cầu:

Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ấn Độ, Cúc hoa vàng đƣợc trồng làm cây cảnh, và từ lâu đƣợc trồng làm thuốc ở Trung Quốc, Nhật Bản [16], [22].

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 4

Ở Việt Nam, Cúc hoa vàng đƣợc trồng từ lâu đời. Cúc hoa vàng đƣợc dùng làm thuốc hay ƣớp chè, nấu rƣợu và đƣợc trồng nhiều ở các làng Nghĩa Trai (Hƣng

Yên), Nhật Tân và Tế Tiêu (Hà Nội)… [16], [17].

1.1.3. Thành phần

Trong cúc hoa vàng có chứa tinh dầu, carotenoid, các acid amin, vitamin A,

U Y

flavonoid và một số loại sesquiterpen.

- Tinh dầu: α-pinen, β-pinen, sabinen, mycren, α-terpinen, p.cymen, cineol, αthuyon, chrysanthenon, borneol, chrysanthetriol, linalyl acetat, germacren D,

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

nerolidol, γ-cadinen, α-selinen, caryophyllen, mourolol [13], [17].

- Thành phần chủ yếu tinh dầu cúc hoa vàng một số vùng Trung Quốc: 1,8-cineol

H Ư

(0,62-7,34%), (+)-(1R,4R)-camphor (0,17-27,56%), caryophyllen oxid (0,54-5,8%), beta-phellandren (0,72-1,87%), (-)-(1S,2R,4S)-borneol acetat (0,33-8,46%), 2-

TR ẦN

methyl-6-(p-tolyl)hept-2-en (0,3-8,6%), 4,6,6-trimethylbicyclo[3.1.1]hept-3-en-2ylacetat (0,17-26,48%) và hexadecanoic acid (0,72-15,97%) [13], [17].

10 00

- Carotenoid: chrysanthemoxanthin [13], [17].

- Sesquiterpen: arteglasin A, yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, cumambrin A,

angeloylajadin, tuncfulin [17].

- Flavonoid: luteolin, quercetin, apigenin, luteolin-7-O-beta-D-glucopyranosid, chrysanthemin,

Í-

apigenin-7-O-β-D-galactopyranosid,

apigenin-7-O-glucosid,

-L

acacilin, baicalin, luteolin-7-O-β-D-glucopuranosid, 4’-methoxyluteolin-7-O-β-D-

ÁN

glucopyranosid, cyanidin-3-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosid) [17].

- Acid phenol: acid clorogenic, acid quinic-4-O-cafeciat, acid quinic-3,4-di-O-

IỄ N

ÀN

cafciat [17]. - Acid amin: adenin, cholin, stachydrin [17].

- Thành phần khác: indicumenon, β- sitosterol, α- amyrin, friedelin, sesamin, adenin, cholin, stachydrin và vitamin A [17].

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 5

1.1.4. Tác dụng của Cúc hoa vàng Cúc hoa vàng có vị ngọt, hơi đắng, tính bình hơi mát, có tác dụng thanh nhiệt,

giải cảm, tán phong thấp, giáng hỏa, giải độc [6]. Cúc hoa vàng có nhiều tác dụng

dƣợc lý nhƣ tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống gốc tự do, kháng khuẩn,

U Y

hạ huyết áp và có hoạt tính gây phản vệ [6], [10]. Cúc hoa vàng có tác dụng chống

viêm thực nghiệm trên chuột cống trắng [10]. Dịch chiết ethanol cúc hoa vàng có

tác dụng chống viêm, điều hòa miễn dịch dịch thể và tế bào và hoạt động thực bào

ẠO

đơn nhân [6].

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Cúc hoa vàng có tác dụng hạ huyết áp trên động vật thí nghiệm (chó), cũng

nhƣ có tác dụng tốt đối với bệnh nhân cao huyết áp. Khả năng làm hạ huyết áp của

H Ư

cúc hoa vàng có thể là hiệu quả của tác dụng ức chế phản xạ vận mạch có nguồn gốc trung tâm và tác dụng ức chế adrenalin [6].

TR ẦN

Bài thuốc chứa cúc hoa vàng cũng đƣợc dùng để điều trị cho bệnh nhân suy nhƣợc thần kinh loại hƣng phấn tăng, đa số có nguyên nhân do sang chấn tinh thần.

10 00

Phƣơng pháp chữa là hạ hƣng phấn, an thần, phối hợp với châm cứu đã đạt kết quả tốt [6].

Cúc hoa vàng thƣờng đƣợc dùng để chữa: phong cảm lạnh, cúm, viêm não,

viêm mủ da, viêm vú, chóng mặt, cao huyết áp, đau mắt đỏ, chảy nhiều nƣớc mắt,

-L

Í-

viêm gan. Dùng ngoài chữa trị đinh nhọt, rắn cắn, chấn thƣơng bầm dập [5], [6]. 1.2. Tổng quan về Apigenin

ÀN

ÁN

1.2.1. Tính chất

Công thức phân tử C15H10O5

IỄ N

Phần trăm thành phần: C 66,67%, H

3,73%, O 29,60% [13]. Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: 5,7Dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1Hình 1.2: Công thức cấu tạo Apigenin

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 6

benzopyran-4-on [13]. Tên khác: 4',5,7-Trihydroxyflavon; 2-(p-hydroxyphenyl) -5,7- dihydroxychromon

Trọng lƣợng phân tử: 270,24

Điểm nóng chảy: 345-350°C. Điểm sôi: 555,51°C ở 760 mmHg

U Y

Hấp thụ tối đa: UV tối đa (Ethanol): 340 nm

Apigenin (4',5,7-trihydroxyflavon) là một flavonoid tự nhiên, thuộc nhóm flavon

đƣợc tìm thấy trong nhiều loài thực vật, nhƣng rau mùi tây, cần tây và cúc hoa là

ẠO

những nguồn phổ biến nhất. Nó là một chất rắn kết tinh màu vàng [6], [17], [18].

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Độ hòa tan: Hòa tan trong dimethylsulfoxid (27 mg/ml) hoặc dung dịch KOH

1M (50mg/ml). Thực tế không tan trong nƣớc, tan vừa phải trong rƣợu nóng. Hệ số

H Ư

phân bố (log K) đƣợc tính từ tỷ lệ hòa tan của apigenin trong n-octanol và nƣớc là

TR ẦN

2,87 [6], [17], [18].

Một số glycosid tự nhiên hình thành bởi sự kết hợp của apigenin với đƣờng bao gồm: Apiin, Apigetrin (apigenin-7-glucosid), Vitexin (apigenin-8-C-glucosid),

10 00

Isovitexin (apigenin-6-C-glucosid hoặc homovitexin, saponaretin), Rhoifolin (apigenin-7-O-neohesperidosid)... Có thể thu đƣợc apigenin từ apiin bằng cách đun

sôi với axid, từ apigenin-7-glucosid thủy phân bằng enzyme với emulsin hoặc đun

với H2SO4 15% [6], [17], [18].

-L

Í-

1.2.2. Tác dụng của Apigenin

ÁN

Apigenin ức chế sự hoạt động của collagenase liên quan đến viêm khớp dạng

thấp (RA) và nội độc tố tạo nitric oxid (NO) trong đại thực bào.Apigenin cũng giảm nội độc tố biểu hiện trên cyclooxygenase-2 (COX-2). Tóm lại, những kết quả cho

IỄ N

ÀN

thấy apigenin có hoạt tính chống viêm quan trọng có liên quan đến ngăn chặn nitric

oxide qua trung gian COX-2 và các bạch cầu đơn nhân, apigenin có thể điều trị các bệnh viêm nhiễm [18], [9]. Apigenin có hiệu quả ức chế sự tiến triển ung thƣ tuyến tiền liệt ở chuột bởi suy giảm IGF-I (Insulin - like growth factors - các yếu tố sinh trƣởng tƣơng tự insulin). Nồng độ IGF-I trong máu cao sẽ làm giảm tiết GH qua cơ chế điều hòa

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 7

ngƣợc. IGF-I đóng vai trò quan trọng đối với việc điều tiết các hoạt động của tế bào không những trong trạng thái sinh lý mà còn trong các quá trình bệnh lý kể cả ung

thƣ [9].

Apigenin hoạt động hoạt hóa vận chuyển monoamin, một trong số ít các chất

U Y

có tác dụng này, đã cải thiện nhiều rối loạn bệnh học thần kinh, đặc biệt là phụ

thuộc cocain, thông qua cách điều chỉnh các hoạt động vận chuyển oxidase [9], [18].

Apigenin cũng có thể kích thích tế bào thần kinh ngƣời trƣởng thành, bằng

ẠO

cách thúc đẩy sự phân hóa tế bào thần kinh, có thể điều trị các bệnh thần kinh, rối

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

loạn và bị tổn thƣơng, nghiên cứu trên chuột và ảnh hƣởng trên ngƣời vẫn chƣa

H Ư

1.3. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao

đƣợc chứng minh [9].

1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

TR ẦN

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha

10 00

động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của các chất này với

pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các

yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector và đƣợc ghi

Í-

lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của

-L

chất phân tích [1].

ÁN

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký

khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc

IỄ N

ÀN

ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1]. 1.3.2. Máy HPLC Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đƣa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi [1].

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 8

Hệ thống cấp dung môi

Bộ phận tiêm mẫu

Hệ thu nhận xử lý dữ liệu (máy ghi, máy tính)

Bơm

Cột sắc ký

U Y

Detector

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Thải

Hình 1.3: Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC

1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký

H Ư

1.3.3.1. Thời gian lưu tR

TR ẦN

Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector.Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là

hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất [1].

10 00

Thời gian chết tM là thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ. Thời gian lƣu hiệu chỉnh t’R = tR– tM.

1.3.3.2. Hệ số dung lượng k’

Í-

Hệ số k’ mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột. Hệ số k’ còn đƣợc

k’ =

t'R tR - tM = tM tM

ÁN

-L

gọi là hệ số phân bố khối lƣợng giữa 2 pha:

ÀN

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ V S/VM.

1.3.3.3. Hệ số chọn lọc α Hệ số chọn lọc  đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.

IỄ N

Thƣờng lựa chọn điều kiện sắc ký để k’ = 1 – 5 là tốt nhất [1].

=

k'2 tR2 - tM = k'1 tR1 - tM

Thƣờng chọn  dao động từ 1,05 – 2. Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài [1].

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 9

1.3.3.4. Độ phân giải Rs Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc

RS: độ phân giải

U Y

Trong đó:

2(tR,B - tR,A) [1] WB + WA

RS =

ký:

ẠO

WA, WB: lần lƣợt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic

tR,A , tR,B: thời gian lƣu chất A, B

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

RS  1,5 thì 2 pic coi nhƣ tách nhau hoàn toàn

1.3.3.5. Hệ số bất đối AF

H Ư

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, đƣợc tính theo công thức: W1/20 2a

TR ẦN

AF =

Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic đƣợc đo ở 1/20 chiều cao của pic

10 00

a: khoảng cách từ đƣờng hạ vuông góc từ đỉnh pic đến mép đƣờng cong phía trƣớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic [1].

Trong định lƣợng yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2

1.3.3.6. Số đĩa lý thuyết

-L

Í-

Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý

ÁN

thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa

pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột sắc ký [1].

IỄ N

ÀN

tR tR 2 N = 16 [ ]2= 5,54 [ ] W W1/2 Trong đó: W: là chiều rộng pic ở đáy pic W1/2: là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

1.3.4. Ứng dụng của HPLC 1.3.4.1. Định tính Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 10

 So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lƣu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký [1].

 So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm

chuẩn đối chiếu [1].

U Y

 So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector

DAD (có hệ số match  0,995) [1].

 Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức

ẠO

(IR) hoặc số khối (MS) [1].

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1.3.4.2. Định lượng

Tất cả các phƣơng pháp định lƣợng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

H Ư

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.

Phƣơng pháp chuẩn nội

Phƣơng pháp thêm chuẩn

Phƣơng pháp chuẩn ngoại

10 00

TR ẦN

Có 3 phƣơng pháp định lƣợng thƣờng đƣợc sử dụng trong sắc ký:

Trong khuôn khổ khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phƣơng phápthêm

chuẩn.

Ƣu điểm của phƣơng pháp thêm chuẩn là có độ chính xác cao vì nó loại trừ

-L

Í-

đƣợc sai số do các yếu tố ảnh hƣởng, đặc biệt là ảnh hƣởng của quá trình xử lý mẫu

ÁN

(chiết xuất, tinh chế các chất từ dạng bào chế…) [1].

Tiến hành :

IỄ N

ÀN

Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký.

Thêm vào mẫu thử những lƣợng đã biết của chất chuẩn tƣơng ứng với các

thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều

kiện. Nồng độ chƣa biết CX của mẫu thử đƣợc tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ ΔC (lƣợng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao) pic ΔS theo công thức :

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 11

CX = SX

ΔC ΔS

sắc ký một mẫu thử và mẫu thử đã đƣợc thêm chuẩn nhƣ trên.Sử dụng một pic

Có thể tính toán nồng độ CX của mẫu thử theo một công thức khác: Tiến hành

1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)

U Y

không muốn định lƣợng của mẫu thử nhƣ là một chuẩn nội [1].

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, đƣợc dùng

ẠO

phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

– 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ

đƣờng kính 1 mm, chiều dài 10 mm. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau

H Ư

đó đƣợc tách ra thành các bƣớc sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser.Mỗi diod nhạy với một bƣớc sóng nhất

TR ẦN

định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bƣớc sóng khác nhau cùng một lúc. Thông thƣờng, chỉ có một hoặc hai bƣớc sóng đƣợc theo dõi trong quá trình chạy

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

sắc ký. Theo dõi hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic [1].

Hình 1.4: Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

Quang phổ và sắc ký đồ có thể đƣợc biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ

thống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bƣớc sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bƣớc sóng và thời gian [1].

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 12

Ứng dụng: Đầu dò DAD cho phép lựa chọn bƣớc sóng phù hợp nhất cho phân tích, có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của

các chất, ngoài ra detector DAD dùng để xác định độ tinh khiết của pic [1].

H U Y

Tên nghiên cứu

Nội dung

TLTK

STT

Các nghiên cứu đã thực hiện:

Nghiên cứu chiết - Chiết xuất bằng EtOH

[14]

1.3.6. Một số nghiên cứu đã thực hiện về Cúc hoa vàng và Apigenin

ẠO

xuất, phân lập, tinh - Định tính bằng sắc ký lớp mỏng MeOH: H20 (5 : 1 : 0,1)

Cúc hoa vàng

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

chế Linarin trong với pha động khai triển Cloroform:

H Ư

- Phân lập: bằng sắc ký cột tinh

- Cột: RP 18 (250mm x 4mm; 5µm)

Định tính, định

[10]

10 00

TR ẦN

- Tinh chế: bằng phƣơng pháp kết

- λ = 334 nm

Cúc hoa vàng bằng

- Pha động: MeOH : acid acetic 4%

lƣợng Linarin trong

( 52 : 48) - Thể tích tiêm: 20 µL

Nghiên cứu chiết - Chiết siêu âm tần số 60 MHz; dung

[8]

ÁN

-L

Í-

HPLC

IỄ N

ÀN

xuất Flavonoid toàn môi: ethanol 50%; nhiệt độ: 600C; phần trong Cúc hoa chiết 2 lần với tỷ lệ dung môi/dựợc vàng

liệu mỗi lần 10/1; thời gian chiết: 60 phút/lần - Hàm lƣợng flavonoid toàn phần đạt 12,54 mg/g

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 13

Định lƣợng

- Cột: Phenomenex GenimiRP - C18

Apigenin trong Cúc

- λ = 338 nm

hoa vàng bằng

[7]

HPLC

- Pha động: Acetonitril: acid formic

0,1 % (40:60)

U Y

- Thể tích tiêm: 20 µL

- Dung dịch đệm borat kiềm pH =

định lƣợng

8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế

Apigenin trong

15 kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt

dƣợc liệu Bán chi

độ cột mao quản 25oC, thời gian điện

liên bằng phƣơng

di 15 phút

pháp điện di mao

- λ = 268 nm

quản

- Hàm lƣợng Apigenin: 1,80 – 3,10

[9]

H Ư

ẠO

Xây dựng quy trình

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Hàm lƣợng Apigenin: 0,0178 %

10 00

mg/g

Hiện nay các tài liệu dƣợc điển: Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Nhật…chúng tôi

nhận thấy chƣa có tài liệu nào công bố bổ sung phƣơng pháp định lƣợng Apigenin

trong Dƣợc liệu. Vì vậy cần thực hiện khảo sát để có phƣơng pháp định lƣợng phù

-L

Í-

hợp, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Dựa trên nghiên cứu “Định lượng Apigenin

ÁN

trong Cúc hoa vàng bằng HPLC” của nhóm tác giả Nguyễn Minh Chính, Nguyễn

Trọng Điệp, Đào Văn Đôn, Hoàng Việt Dũng, Nguyễn Văn Long, Đoàn Cao Sơn [5] vừa là tiền đề vừa làm cơ sở cho chúng tôi phát triển và mở rộng nội dung của

IỄ N

ÀN

nghiên cứu này. Chúng tôi khảo sát hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng ở các mẫu đang lƣu hành trên thị trƣờng Hà Nội bằng các điều kiện sắc ký khác nhau. Từ đó, có thể thu đƣợc kết quả chính xác, có ý nghĩa thực tiễn để bổ sung vào tiêu chuẩn định lƣợng Apigenin trong chuyên luận Cúc hoa vàng của DĐVN.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 14

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

U Y

Mẫu nghiên cứu: Hoa của cây Cúc hoa vàng (Chryranthemum indicium Lour)

đã đƣợc phơi khô. Nguyên liệu đƣợc bảo quản nơi khô ráo, đƣợc định tính về hóa

học và sơ bộ kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn DĐVN IV, sau đó đƣợc nghiền thành bột

ẠO

thô mịn hoặc bột nửa mịn theo quy định của DĐVN IV trƣớc khi tiến hành chiết lấy

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Apigenin. Các mẫu đƣợc mua tại cơ sở chế biến dƣợc liệu An Bình, cơ sở Nguyễn

Thế Viễn – Huyện Văn Lâm Hƣng Yên và tại các cửa hàng khác nhau trên phố Lãn

H Ư

Ông – Hà Nội vào tháng 03/2016. 2.1.2. Hóa chất, dung môi

TR ẦN

Các hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn độ tinh khiết phân tích hoặc HPLC.

10 00

- Dung môi và hóa chất: ethanol, methanol, aceton, nƣớc cất, acetonitril, acid phosphoric…

biển thiết lập).

Chất chuẩn: chuẩn làm việc Apigenin – hàm lƣợng 98,5% (do Viện Hóa sinh

Nồi cách thủy

ÁN

-L

Í-

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị

Máy chiết siêu âm Elma

Máy li tâm EBA 21

Máy cất thu hồi dung môi

Cân phân tích Sartorius 0,1 mg

Máy lọc hút chân không, màng lọc 0,45 µm

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1200 series kết nối

IỄ N

ÀN

DAD/FLD -

Tủ sấy, phễu lọc thủy tinh, giấy lọc

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu, bơm tiêm

Bộ lọc dung môi hút chân không, màng lọc 0,45 µm

Bình định mức các loại: 10 ml, 20 ml, 25 ml, 100 ml, 1000 ml

Cốc có mỏ các loại: 50 ml, 100 ml, 200 ml, 1000 ml

U Y

2.2. Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn Apigenin với

các hợp chất khác trong dịch chiết Cúc hoa vàng.

ẠO

- Thẩm định các điều kiện định lƣợng Apigenin trong các mẫu Cúc hoa vàng.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lƣợng Apigenin có trong các mẫu Cúc hoa vàng

trên thị thƣờng.

H Ư

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử

TR ẦN

2.3.1.1. Chiết xuất

Vì Apigenin tan tốt trong MeOH nên chúng tôi quyết định chọn MeOH làm dung

10 00

môi chiết và pha mẫu chuẩn, mẫu thử.

Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn xử

lý mẫu theo phƣơng pháp chiết siêu âm.

2.3.1.2. Pha dung dịch thử

-L

Í-

Bổ sung MeOH vào cốc có mỏ chứa cắn sau khi bốc hơi dung môi, sau đó chuyển sang bình định mức bổ sung MeOH vừa đủ tới vạch.

ÁN

2.3.2. Pha dung dịch chuẩn

Pha dung dịch chuẩn gốc Apigenin, từ chuẩn gốc pha dung dịch chuẩn Apigein

IỄ N

ÀN

ở nồng độ phù hợp, pha các dung dịch chuẩn thứ cấp từ dung dịch chuẩn gốc để thẩm định độ tuyến tính.

2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 2.3.3.1. Dung môi chạy pha động Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký, nó quyết định thời gian lƣu giữ của chất phân tích và hiệu quả tách sắc ký.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 16

Cặp dung môi đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là MeOH : H2O; ACN : H2O. Mặt khác Apigenin có 2 nhóm –OH gắn vào nhân benzo - γ -

pyron ở vị trí 5, 7 và một nhóm –OH phenol nên Apigenin có tính acid. Do đó, để

định lƣợng tốt thì pha động cần bổ sung thêm acid (H3PO4) sẽ giảm thiểu đƣợc hiện

U Y

tƣợng kéo đuôi. 2.3.3.2. Chọn cột sắc ký

Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với

ẠO

nhiều tính ƣu việt. Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

vàng, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phƣơng pháp tách chiết, định

lƣợng một số thành phần trong Cúc hoa vàng, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố

H Ư

pha đảo trong nghiên cứu này.

Trong định lƣợng sắc ký pha đảo, cột thƣờng dùng là C8 và C18, có kích thƣớc

TR ẦN

hạt nhồi là 5 µm hoặc 10 µm, với chiều dài cột là 15 cm hoặc 25 cm. Chúng tôi tiến

10 00

2.3.3.3. Chọn tốc độ dòng

hành khảo sát trên các loại cột trên.

Qua các tài liệu tham khảo [5], [6], [9], [10], [21] chúng tôi thƣờng thấy tốc độ

dòng đƣợc khảo sát là 0,8 ml/phút và 1,0 ml/phút. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo

Í-

gian lƣu tối ƣu.

sát trong khoảng 0,7 - 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời

-L

2.3.3.4. Chọn bước sóng phát hiện

ÁN

Do cấu trúc Apigenin có vòng thơm nên có khả năng hấp thu quang phổ tử

ngoại. Xác định cực đại hấp thụ dựa vào phổ UV trong khoảng 190 – 800 nm.

IỄ N

ÀN

2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn AOAC Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ Cúc hoa vàng bằng phƣơng

pháp HPLC đƣợc thẩm định thông qua các chỉ tiêu: - Độ đặc hiệu - Độ tƣơng thích hệ thống sắc ký - Độ lặp lại của phƣơng pháp - Độ tuyến tính và khoảng xác định

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 17

- Độ đúng - Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ

2.3.4.1. Độ đặc hiệu

Là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt của các tạp chất khác

nhƣ tiền chất, chất tƣơng tự, chất chuyển hóa…trong phép thử định lƣợng, độ đặc

U Y

hiệu là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hƣởng bởi

tất cả các yếu tố khác nhằm hƣớng đến kết quả chính xác.

Cách xác định: tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử. Ghi lại các thông

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

số về thời gian lƣu và diện tích pic.

Yêu cầu: thời gian lƣu của mẫu chuẩn và mẫu thử phải tƣơng đƣơng nhau. hấp thụ.

TR ẦN

2.3.4.2. Độ tương thích của hệ thống sắc ký

H Ư

Hình ảnh chồng phổ của 2 mẫu phải có hình dạng giống nhau về số đỉnh cực đại

Độ tƣơng thích của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác

định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý xong.

10 00

Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bịở trên,

ghi lại các giá trị về thời gian lƣu, diện tích pic. Độ tƣơng thích của hệ thống đƣợc

biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.

Í-

Yêu cầu: RSD  2,0 %.

-L

2.3.4.3. Độ lặp lại

ÁN

Độ lặp lại của một phƣơng pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình

phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử

IỄ N

ÀN

nghiệm đƣợc áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, đƣợc xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu thử nhƣng các lần lặp lại phải đƣợc thực hiện từcông đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu...) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 18

Cách tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình. Độ lặp lại

đƣợc biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD của các đáp ứng phân tích.

H U Y

(*)

X% =

Trong đó:

St, Sc là diện tích pic mẫu thử và mẫu chuẩn

ẠO

mt, mc là khối lƣợng của mẫu thử và mẫu chuẩn

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hàm lƣợng Apigenin trong Cúc hoa vàng đƣợc tính theo công thức:

HL % là hàm lƣợng thực của Apigenin trong mẫu chuẩn (= 98,5 %)

TR ẦN

2.3.4.4. Độ tuyến tính và khoảng xác định

H Ư

Yêu cầu: RSD  2,0 %.

Độ tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Nó

10 00

đƣợc biểu thị bằng phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ sốtƣơng quan R. Khoảng xác định: Là khoảng nồng độ đã đƣợc khảo sát đảm bảo tuyến tính

(gọi là khoảng tuyến tính). Khảo sát nồng độ từ 50 % đến 150 % nồng độ lý thuyết

của mẫu.

-L

Í-

Cách xác định: Chuẩn bị một dãy chất chuẩn gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng xác định. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

ÁN

pic bằng phƣơng trình hồi quy tuyến tính.

Yêu cầu: R2  0,99 (R  0,995).

IỄ N

ÀN

2.3.4.5. Độ đúng Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị

thực. Cách xác định: tiến hành pha 1 dung dịch chuẩn và 3 dung dịch thử riêng biệt theo quy trình pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thêm vào mỗi mẫu thử một lƣợng chất chuẩn (10%, 20%, 30% so với lƣợng hoạt chất có sẵn). Tổng nồng độ

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 19

của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Độ đúng sẽ đƣợc tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lƣợng chất đối chiếu tìm đƣợc so với lƣợng chất đối chiếu

thêm vào.

Yêu cầu: Độ tìm lại nằm trong khoảng 98,0 – 102,0 %.

U Y

2.3.4.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3 lần

nhiễu đƣờng nền (S/N = 3/1).

ẠO

LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

đƣờng nền (S/N = 10/1).

Cách xác định: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu

H Ư

đƣờng nền (S/N). Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện đƣợc bằng sắc ký. Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B) và

TR ẦN

mẫu thử (S). Thiết lập tỷ số S/N.

Yêu cầu: RSD diện tích pic LOD < 10,0 %

10 00

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các phƣơng pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lƣợng đặc

Tính giá trị trung bình:

Í-

trƣng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel.

∑

ÁN

-L

- Tính độ lệch chuẩn: ∑

RSD 

S  100 % X

IỄ N

ÀN

√

Tính độ lệch chuẩn tƣơng đối:

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 20

Phƣơng tình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: y = ax + b, sử dụng phần mềm Microsoft Excel

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

U Y

để xử lý và vẽ đồ thị.

Giới thiệu trích đoạn bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial