Nghiên cứu định tính, bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI VĂN DUẨN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, BÁN ĐỊNH LƯỢNG TANSHINON IIa TRONG CAO ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI VĂN DUẨN Mã sinh viên: 1101080

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH, BÁN ĐỊNH LƯỢNG TANSHINON IIa TRONG CAO ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn 1. TS. Nguyễn Thị Thuận 2. ThS. Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI-2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

Ơ

N

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân

H

thành tới TS. Nguyễn Thị Thuận và Th.S. Trần Thị Lan Hương, hai người

TP

Tôi cũng xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới:

.Q

tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.

ẠO

Tập thể giảng viên, kĩ thuật viên bộ môn Hóa Dược đã hết lòng giúp đỡ

N

G

Viện Dược liệu Trung Ương đã giúp tôi trong quá trình phân tích mẫu

H Ư

trên thị trường.

TR ẦN

Hai em Lê Đình Hùng-M3K67 và Lê Thị Quỳnh-M1K67 đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn.

B

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu nhà

10 00

trường, các giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt

A

tôi trong suốt 5 năm học qua.

H

Ó

Cuối cùng xin được cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Mai Văn Duẩn

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

ở bên tôi quan tâm chăm sóc, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC

Ơ

N

LỜI CẢM ƠN

H

MỤC LỤC

.Q

DANH MỤC CÁC BẢNG

TP

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ẠO

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 2

G

Đ

1.1. Đan sâm ...................................................................................................... 2

H Ư

N

1.1.1 Cây Đan sâm ........................................................................................ 2 1.1.2. Dược liệu Đan sâm .............................................................................. 4

TR ẦN

1.1.3. Cao Đan sâm ....................................................................................... 4 1.1.4. Tanshinon IIa ...................................................................................... 5

B

1.2. Tổng quan về phương pháp Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao .................... 9

10 00

1.2.1.Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng ......................................................... 9 1.2.2. Phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao ................................... 10

Ó

A

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 12

Í-

H

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................... 12

-L

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 12

ÁN

2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất............................................. 12

TO

2.1.3. Thiết bị dụng cụ nghiên cứu ............................................................. 12

ÀN

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 13

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

D

IỄ N

Đ

2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 13 2.3.1. Khảo sát và xây dựng phương pháp .................................................. 13 2.3.2. Thẩm định phương pháp ................................................................... 14 2.3.3. Phân tích mẫu cao Đan sâm trên thị trường ...................................... 16 2.3.4. Phương pháp xử lí kết quả ................................................................ 17 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 18

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3.1. Khảo sát xây dựng phương pháp.............................................................. 18 3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết................................................................... 18

N

H

Ơ

3.1.3. Tiêu chuẩn cho phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm ................................................................................. 19

N

3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký .................................................................. 18

.Q

3.2.1. Độ đặc hiệu, chọn lọc ........................................................................ 21

TP

3.2.2. Đường chuẩn- khoảng nồng độ hồi quy............................................ 23

ẠO

3.2.3. Độ lặp lại phương pháp ..................................................................... 24

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

3.2.4. Độ đúng ............................................................................................. 25

N

G

3.2.5. So sánh với phương pháp đã được công nhận .................................. 25

TR ẦN

H Ư

3.3. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ bộ một số mẫu cao thu được trên thị trường .................................................................................. 27 3.4. Bàn luận.................................................................................................... 30 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................... 32

10 00

B

4.1. Kết luận .................................................................................................... 32 4.2. Đề xuất ..................................................................................................... 32

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích .......................................................... 21

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ơ

N

: Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thông

: Ethanol

EtOAc

: Ethyl acetat

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

TP

.Q

U Y

N

EtOH

H

(Association of Officail Analytical Chemists)

: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

HPTLC

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

(High Perfomance Liquid Chromatography)

G

(High Perfomance Thin Layer Chromatography) : Hệ số lưu giữ

r

: Hệ số tương quan

RSD

: Độ lệch chuẩn tương tối

TR ẦN

H Ư

N

Rf

(Relative Standard Deviation) : Tiêu chuẩn cơ sở

TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TNHH

: Trách nhiệm hữu hạn

TW

: Trung ương

H

Ó

A

10 00

B

TCCS

-L

: Khả kiến (Visible)

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

VIS

: Tử ngoại (Ultraviolet)

Í-

UV

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

AOAC

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

Bảng 1.2. So sánh một số tham số của TLC và HPTLC................................. 11

N

DANH MỤC CÁC BẢNG

H

Bảng 2.1. Mẫu thử thu thập trên thị trường dùng để phân tích....................... 16

U Y

N

Bảng 3.1. Giá trị Rf ứng với Tanshinon IIa của các vết sắc ký....................... 22

TP

Bảng 3.3. Hàm lượng Tanshinon IIa trong mẫu thử cao Đan sâm nghiên cứu ......................................................................................................................... 24

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Bảng 3.4. Kết quả độ thu hồi........................................................................... 25

Đ

Bảng 3.5. Kết quả của mẫu thử cao E1 theo phương pháp HPTLC ............... 26

H Ư

N

G

Bảng 3.6. Kết quả phân tích bán định lượng mẫu thử cao E1 bằng phương pháp HPLC ...................................................................................................... 26

TR ẦN

Bảng 3.7. Kết quả T-test ................................................................................. 27 Bảng 3.8. Kết quả đường chuẩn của chất chuẩn Tanshinon IIa...................... 28

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Bảng 3.9. Hàm lượng Tanshinon IIa trong các mẫu thử phân tích trên thị trường .............................................................................................................. 29

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Bảng 3.2. Kết quả đánh giá đường chuẩn của chất chuẩn Tanshinon IIa ....... 23

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

Hình 1.1. Hình ảnh cây và rễ Đan sâm............................................................. 2

N

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

H

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Tanshinon IIa............................................... 5

.Q

Hình 3.2. Vết sắc ký mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, dung dịch chuẩn Tanshinon IIa .................................................................................................. 21

ẠO

TP

Hình 3.3. Hình ảnh vết sắc ký của mẫu thử cao Đan sâm/cồn và mẫu trắng thêm chuẩn Tanshinon IIa............................................................................... 22

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hình 3.4. Đường chuẩn dung dịch Tanshinon IIa .......................................... 24

N

G

Hình 3.5. Hình ảnh vết sắc của các mẫu phân tích trên thị trường................ 28

H Ư

Hình 3.6. Đường chuẩn Tanshinon IIa tiến hành phân tích mẫu trên thị trường .............................................................................................................. 29

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

Hình 3.7. Thông tin quảng bá công dụng của cao F ...................................... 30

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

Hình 3.1. Vết sắc ký của mẫu chiết bằng EtOAc ............................................ 19

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm là một vị thuốc đã được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới với

Ơ

N

các tác dụng tác dụng chống đông, giãn mạch, kháng khuẩn và chống viêm.

H

Đan sâm được áp dụng trên lâm sàng ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và

U Y

N

một số nước châu Á khác trong đó có Việt Nam [16],[25]. Hiện nay ở Việt

TP

đang không ngừng gia tăng, một số bệnh viện lớn ở Việt Nam đã sử dụng các

ẠO

chế phẩm từ Đan sâm trong điều trị. Trên thị trường Việt Nam, trừ các chế

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

phẩm thuốc sắc, ngâm rượu dùng nguyên dược liệu, các chế phẩm có Đan sâm

N

G

chủ yếu dùng dạng cao Đan sâm. Trong khi đó, Việt Nam lại chưa có tiêu chuẩn

H Ư

quy định cách điều chế và kiểm nghiệm cao Đan sâm. Vì vậy, xây dựng các

TR ẦN

tiêu chuẩn cho cao Đan sâm phù hợp với điều kiện Việt Nam là điều cần thiết.

Tanshinon IIa là một trong những hợp chất chính trong Đan sâm. Dược

B

điển Việt Nam IV có quy định bắt buộc thử định tính dược liệu Đan sâm phải

10 00

có Tanshinon IIa. Do đó với mục đích góp phần xây dựng tiếu chuẩn cao Đan

A

sâm chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định tính, bán định lượng

H

Ó

Tanshinon IIa trong cao Đan sâm” với ba mục tiêu chính:

Í-

1. Xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa trong

-L

cao Đan sâm bằng phương pháp HPTLC

ÁN

2. Thẩm định phương pháp vừa xây dựng

cao thu được trên thị trường.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

3. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ bộ một số mẫu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Nam nhu cầu sử dụng thuốc từ Đan sâm cũng như các dược liệu khác nói chung

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đan sâm

Ơ

N

1.1.1 Cây Đan sâm

H

Đan sâm, hay còn gọi là huyết

.Q

tên như vậy là vì rễ cây này giống khoa

học

Salvia

ẠO

Tên

TP

sâm mà lại có màu đỏ (Đan là đỏ).

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

multiorrhiza Bunge., thuộc họ Hoa

N

G

môi Lamiaceae (Labiatae) [9].

H Ư

Hình 1.1. Hình ảnh cây và rễ Đan sâm

TR ẦN

1.1.1.1. Mô tả thực vật

Đan sâm là loại cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, toàn thân mang lông ngắn

B

màu vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5cm, màu đỏ nâu.

10 00

Thân vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối: 3-5 lá chét, đặc biệt có thể

A

có 7. Lá chét giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn

H

Ó

có dìa. Lá chét dài 2-7,5cm, rộng 0,8-5cm. Mép lá chét có răng cưa tù. Mặt trên

Í-

lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có

-L

lông nhưng dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá chét thành múi nhỏ. Cụm

ÁN

hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay ở kẽ lá, chùm hoa dài 10-20cm. Hoa mọc

TO

vòng, mỗi vòng 3-10 hoa thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

sâm, xích sâm, huyết căn. Sở dĩ có

D

IỄ N

Đ

ÀN

môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn. Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lồi ra ở môi trên. Quả nhỏ,

dài 3 mm, rộng 1,5 mm. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo) mùa quả tháng 6-9 [9].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

3

1.1.1.2. Thành phần hóa học Các thành phần hóa học của Đan sâm đã được nghiên cứu từ đầu những

Ơ

N

năm 30 của thế kỉ trước [19]. Hiện tại có hơn 100 chất hóa học được tách chiết

H

và xác định từ Đan sâm. Dựa trên tính tan của các chất hóa học thì có thể chia

TP

- Thành phần tan trong nước

ẠO

Các thành phần tan trong nước của Đan sâm chủ yếu là các acid phenolic

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

[22]. Hơn 30 hợp chất acid phenolic đã được tách ra từ Đan sâm bao gồm acid

N

G

salvianolic A, acid salvianolic B, acid salvianolic C, acid rosmarinic, acid

TR ẦN

lithospermic và các dẫn xuất khác [16].

H Ư

protocatechuic, protocatechu aldehyd, carnosol hay danshensu, acid - Thành phần tan trong dầu

B

Các thành phần tan trong dầu được phân loại thành bốn nhóm chính. Việc

10 00

phân loại này phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, tính chất quang hóa và mối quan

A

hệ sinh tổng hợp giữa các thành phần.

H

Ó

+ Diterpenoid Tanshinon: một số chất được biết đến nhiều như

Í-

Tanshinon I, IIa, IIb, hydroxy Tanshinon IIa, methylenTanshinon,

-L

tanshindiol-A,…

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

+ Tricyclic Tanshinon quinon: một số hợp chất của nhóm này như là miltiron, dehydromiltiron, , 1R-hydroxymiltiron,…

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

nước, các thành phần tan trong dầu và các thành phần khác [22].

U Y

N

các nhóm thành phần trong Đan sâm ra làm ba loại: các thành phần tan trong

+ Royleanon Tanshinon: trong tổng số 9 hợp chất royleanon Tanshinon, bên cạnh 6 hợp chất isoTanshinon như là isoTanshinon I, IIa, isocryptoTanshinon,…. Còn có nhưng hợp chất khác như là danshenxinkun A, danshenxinkun B,… + Các hợp chất liên quan đến sinh tổng hợp các Tanshinon: Chúng là những chất liên quan đến sinh tổng hợp của các Tanshinon. Nhóm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

4

này cũng bao gồm các chất nhân tạo. Những hợp chất này thường là các sản phẩm bị oxy hóa của nhóm quinon, chủ yếu là các lacton và

Ơ

N

anhydrit, những hợp chất không màu, cũng có thể phát huỳnh quang

H

[24].

U Y

N

c. Các hợp chất khác

TP

daucosterol tìm thấy trong cao chiết EtOH, trong khi đó vitamin E và tannin

ẠO

được tìm thấy trong dịch chiết EtOAc. Trong vài năm qua, những nghiên cứu

Đ

N

càng ngày được nghiên cứu toàn diện hơn [16].

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

còn chỉ ra Đan sâm còn có các hợp chất polysaccarid, các hợp chất này Đang

H Ư

1.1.2. Dược liệu Đan sâm

TR ẦN

Dược liệu Đan sâm (Radix Salviae miltiorrhizae) là rễ phơi khô hay sấy khô của cây Đan sâm (Salvia multiorrhiza Bunge) [9],[ 11].

B

Rễ ngắn, thô, đôi khi ở đầu rễ còn sót lại gốc của thân cây. Rễ hình trụ dài,

10 00

hơi cong queo, có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nhỏ; dài 10-20 cm,

A

đường kính 0,3 – 1 cm. Mặt ngoài màu đỏ nâu hoặc đỏ nâu tối, thô, có vân nhăn

H

Ó

dọc. Vỏ rễ già bong ra, thường có màu nâu tía. Thể chất cứng và giòn, mặt bẻ

Í-

gãy không chắc có vết nứt, hoặc hơi phẳng và đặc, phần vỏ màu đỏ nâu và phần

-L

gỗ màu vàng xám hoặc màu nâu tía với bó mạch màu trắng vàng, xếp theo

ÁN

hướng xuyên tâm. Mùi nhẹ, vị hơi đắng và se. Dược liệu từ cây trồng tương đối

TO

mập chắc, đường kính 0,5 – 1,5 cm. Mặt ngoài màu nâu đỏ, có nếp nhăn dọc,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Là các hợp chất khó phân loại: β-sitosterol, baicalin, acid ursolic và

D

IỄ N

Đ

ÀN

phần vỏ bám chặt vào gỗ không dễ bóc ra. Chất chắc, mặt bẻ gãy tương đối

phẳng, hơi có dạng chất sừng [2].

1.1.3. Cao Đan sâm Hiện nay có thể phân loại cao Đan sâm trên thị trường ra làm 3 loại chính là cao chiết nước, cao chiết trong cồn, cao chiết cồn-nước.

Thành phần hoạt chất trong mỗi loại cao trên có sự khác nhau.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

5

- Cao chiết trong nước: Thành phần chủ yếu sẽ là các thành phần tan trong nước như là acid salvianolic A, acid salvianolic B, acid salvianolic C,

Ơ

N

acid rosmarinic, acid protocatechuic, protocatechu aldehyd,… [17].

H

- Cao chiết trong cồn: Thành phần chủ yếu sẽ là các thành phần tan

U Y

N

trong dầu như là Tanshinon I, IIa, IIb, methylenTanshinon, tanshindiol-A,…

TP

1.1.4. Tanshinon IIa

ẠO

Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh[14],

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Việt Nam, … Tanshinon IIa là một trong những chất chính được dùng để định

N

G

tính, có thể định lượng dược liệu Đan sâm và cao Đan sâm [2], [15], [21].

H Ư

1.1.4.1. .Cấu trúc hóa học [18]

TR ẦN

Cấu trúc hóa học Tanshinon IIa thể hiện ở hình 1.2.

B

Tên IUPAC:

10 00

1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-

A

naphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-

H

Ó

dione.

Í-

Công thức phân tử: C19H18O3

-L

Khối lượng phân tử: 294.3444 g/mol

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Tanshinon IIa

ÁN

1.1.4.2. Tính chất

TO

- Là bột màu đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25°C), tan tốt trong

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

- Cao chiết cồn-nước: Thành phần của cả hai loại cao trên [24].

D

IỄ N

Đ

ÀN

các dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực trong methanol (5 mg/ml), ethanol (5mg/ml) ở 25°C, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25mg/ml) [18].

- Tanshinon IIa thuộc nhóm diterpenoid do có khung terpenoid, ngoài ra trong phân tử còn có nhóm lacton và xeton. Tính chất hóa học của Tanshinon IIa có đầy đủ tính chất của terpenoid [24].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

6

- Tanshinon IIa không bền vững ở nhiệt độ cao, ánh sáng, độ ẩm và tiếp xúc với oxy. Dưới tác động của các tác nhân trên, nó có xu hướng bị phân hủy.

Ơ

N

Đó có thể là lí do chính trong việc giảm hàm lượng Tanshinon IIa trong toàn

H

bộ quá trình chiết, cô đặc, xát hạt, sấy khô [20],[ 25].

U Y

N

- Vì có nhân thơm nên có thể sử dụng detector UV-VIS để định tính, định

TP

[25].

ẠO

1.1.4.3. Các phương pháp định tính, định lượng Tanshinon IIa trong cao

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Dược điển Việt Nam IV chưa có tiêu chuẩn cho cao Đan sâm, tuy nhiên

N

G

với dược liệu Đan sâm thì ngoài các phép thử khác, dược điển Việt Nam IV có

H Ư

yêu cầu định tính Tanshinon IIa bằng sắc ký lớp mỏng:

TR ẦN

+ Điều kiện sắc ký: Bản mỏng: Silica gel G, dung môi khai triển: Benzen - ethyl acetat (19 : 1).

B

+ Sử dụng bột Đan sâm chuẩn và dung dịch Tanshinon IIa chuẩn làm

10 00

các dung dịch chất đối chiếu.

A

- Dược điển Trung Quốc chưa có tiêu chuẩn định tính cho cao Đan sâm,

H

Ó

quy trình phân tích định tính với dược liệu thì tương tự quy trình phân tích định

Í-

tính trong dược điển Việt Nam IV. Dược điển Trung Quốc có tiến hành định

-L

lượng Tanshinon IIa trong dược liệu Đan sâm với phương pháp HPLC pha đảo.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

+ Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh: Cột C18 và pha động: methanol : nước (75: 25). Bước sóng phát hiện là 270 nm. Thể tích tiêm mẫu: 5 µl.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

lượng Tanshinon IIa. Tanshinon hấp thu mạnh UV ở bước sóng từ 254–280

+ Dung dịch đối chiếu là dung dịch Tanshinon IIa chuẩn hòa tan trong methanol, dung dịch thử là bột dược liệu Đan sâm đun hồi lưu và chiết trong methanol.

- Ngoài ra, viện Dược liệu TW có xây dựng một tiêu chuẩn nội bộ (TCCS) để định lượng Tanshinon IIa trong dược liệu bằng phương pháp HPLC. Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng để xác định hàm lượng Tanshinon IIa trong cao.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

7

Quy trình định lượng Tanshinon IIa theo TCCS của viện Dược liệu TW như sau:

Ơ

N

+ Chuẩn bị dung dịch chuẩn, thử:

H

Chuẩn bị mẫu Tanshinon IIa đối chiếu: cân chính xác khoảng 5

U Y

N

mg mẫu chất, hoà tan trong chính xác 5 ml methanol, thu được dung

TP

dung dịch này, tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau

ẠO

để thu được các dung dịch xây dựng đường chuẩn.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng 2 (g) dược liệu Đan

N

G

sâm đã tán nhỏ, sấy khô và xác định độ ẩm. Chuyển vào bình tam

H Ư

giác 50 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm trong 30 phút, lọc

TR ẦN

vào bình định mức 25 ml. Thêm tiếp 10 ml methanol vào bã, siêu âm tiếp trong 15 phút, lọc tiếp vào bình định mức 25 ml trên. Bổ sung

B

methanol đến vạch mức, thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ

10 00

chính xác khoảng 80 mg/ml.

A

+ Điều kiện tiến hành phân tích:

H

Ó

Hệ thống máy: HPLC, hãng Shimadzu, Nhật Bản, Cột: C18,

Í-

hệ dung môi: Acetonitril (B) – H2O (A), tốc độ dòng: 0,7 ml/phút

-L

UV: 270 nm

ÁN

Chương trình rửa giải: B (%)

A (%)

Kiểu rửa giải

0 - 10

65

35

Đẳng dòng

10 - 20

65 - 90

35 - 10

Gradient

20 – 30

90

10

Đẳng dòng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Thời gian (phút)

30

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

dịch mẫu Tanshinon IIa đối chiếu có nồng độ khoảng 1 mg/ml. Từ

Stop

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

8

- Theo tác giả Nguyễn Thị Thu Hòa và cộng sự: Tanshinon IIa trong cao Đan sâm có thể được định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và định

Ơ

N

lượng bằng HPLC như sau [7]

H

Định tính:

U Y

N

+ Lấy 0,1 g cao đặc, thêm 5 ml ether lắc, để yên 1h, lọc. Bốc hơi dịch

TP

dùng làm dung dịch thử.

N

G

+ Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl. triển khai sắc ký đến khi dung

H Ư

môi đi được 15 cm. sáng thường.

B

Định lượng:

TR ẦN

+ Lấy bản sắc ký ra, để khô ở nhiệt độ phòng và quan sát dưới ánh

10 00

+ Cân chính xác 0,1 g cao đặc cho vào bình nón nút mài. Thêm chính

A

xác 50 ml MeOH, và cân. Đun hồi lưu cách thủy trong 1 giờ, làm

H

Ó

lạnh, cân lại, bổ sung phần khối lượng bị mất bằng MeOH, trộn đều,

Í-

lọc qua màng lọc 0,45µm.

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

+ Điều kiện sắc ký: pha tĩnh là cột C18 (4,6 × 250nm, 5µm), pha động:

IỄ N D

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

+ Pha động: Toluen - ethyl acetat (19 : 1).

ẠO

+ Bản mỏng: Silica gel GF254

hỗn hợp MeOH: nước (80:20), bước sóng 270nm, thể tích tiêm

20µl, tốc độ dòng 1,5ml/phút, nhiệt độ phòng.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml ethyl acetat (TT)

Thực tế, hiện nay các công ty sản xuất, kinh doanh dược liệu đang và sẽ

được trang bị ngày càng nhiều các máy HPTLC, tuy nhiên mới chỉ ứng dụng chủ yếu để định tính nguyên liệu. Vì vậy chúng tôi đề xuất kết hợp sử dụng chức năng thứ hai của HPTLC là định lượng/ bán định lượng các thành phần trong dược liệu và cao, cụ thể ở đây là định tính và bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

9

1.2. Tổng quan về phương pháp Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Phương pháp Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) chủ yếu dựa trên

Ơ

N

nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng (TLC).

H

1.2.1.Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng

U Y

N

Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng TLC xảy ra khi cho pha động chuyển

TP

phẳng. Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua

ẠO

điểm xuất phát- nơi hỗn hợp các chất cần phần tích đã được đưa lên bản mỏng.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Trong quá trình di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp thụ (pha tĩnh)

N

G

nhờ các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân

H Ư

bố khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của

TR ẦN

pha động với các tốc độ khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách riêng ra ở cá vị trí khác nhau trên bản mỏng. Pha động

B

bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp

10 00

và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm dựa trên

A

độ phân cực của các thành phần trong dung dịch.

H

Ó

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số

Í-

lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng cách di chuyển của

Rf=

dR dM

TO

ÁN

-L

chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

D

IỄ N

Đ

ÀN

Trong đó:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

động qua pha tĩnh. Trong TLC pha tĩnh được rửa một lớp mỏng lên giá đỡ

- dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích - dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm) - Rf: có giá trị dao động từ 0 - 1.

Trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 - 0,8 [3].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

10

1.2.2. Phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC bản chất là TLC, trong đó các bước tiến hành đều được tự động

Ơ

N

hóa một phần hoặc toàn bộ, và sử dụng bản mỏng hiệu năng cao.

H

Về nguyên tắc, bản mỏng hiệu năng cao không khác nhiều so với bản

U Y

N

mỏng sắc ký lớp mỏng thông thường, chỉ khác là được tráng lớp pha tĩnh mỏng

TP

hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân tích được tăng lên bởi vì:

ẠO

Vết sắc ký nhỏ hơn, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi dùng ít hơn

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

[3].

N

G

Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại

H Ư

và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phân tích

TR ẦN

bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các sai số có thể gặp phải. Quá trình phun mẫu được tiến hành

B

bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ phun và không có

10 00

nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng. Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển

A

về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp

H

Ó

lại của kết quả khi tiến hành tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn

Í-

UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng

-L

trong định tính và định lượng [8].

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Thiết bị HPTLC bao gồm: - Thiết bị chấm mẫu tự động

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

hơn (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao

- Thiết bị khai triển tự động - Buồng chụp ảnh được điều khiển thông qua phần mềm winCATs và phần mềm Video Scan trên máy tính: quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kĩ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính.

So sánh một số tham số của TLC và HPTLC tại bảng 1.2 [1].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

11

Bán tự động

Thủ công

Kích thước hạt

5-6µm

10-12 µm

Độ dày lớp pha tĩnh

100 µm

250 µm

Chiều cao đĩa lý thuyết

12 µm

30 µm

N

Thấp hơn

Giới hạn phát hiện (sử

TP

cao

ẠO

100-500 pg

Đ G

VIS Giới hạn phát hiện (sử

H Ư

10 00

B

quang)

50-100 ng

TR ẦN

dụng máy quét huỳnh

5-10 pg

N

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

dụng máy đo hấp thụ UV-

1-5 ng

Các ưu thế của HPTLC so với HPLC là:

A

- Thời gian phân tích ít hơn và chi phí phân tích rẻ hơn

H

Ó

- Chi phí duy tu, bảo dưỡng thấp

Í-

- Không cần biện pháp lọc hay đuổi khí đối với dung môi pha động

-L

- Lượng pha động sử dụng ít hơn cho mỗi mẫu hoàn toàn mới cho mỗi lần phân tích, không có chất nhiễm

- Có thể phát hiện bằng mắt thường- vì đây là một hệ thống mở - Những hợp chất không hấp thụ UV có thể được phát hiện bằng cách phun hiện màu sau khi khai triển mẫu [15].

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

- Không có sự liên quan giữa lần phân tích trước, pha tĩnh và pha động

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Hiệu lực tách

U Y

Công nghệ

Ơ

TLC

H

HPTLC

.Q

Tham số

N

Bảng 1.2. So sánh một số tham số của TLC và HPTLC

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

12

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

Ơ

N

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

N

H

Cao Đan sâm do Công ty TNHH Tư Vấn Y Dược Quốc Tế (IMC) sản

.Q

2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất

TP

- Chất chuẩn Tanshinon IIa (Shyuanye): B20257 - 20mg (hàm lượng

ẠO

98%). LOT: KJ0719CA14

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Các mẫu cao Đan sâm thu thập được:

N

G

+ Cao đặc đan sâm 1 (IMC) chiết bằng cồn: kí hiệu là mẫu cao E0

H Ư

+ Cao đặc đan sâm 2 (IMC) chiết bằng cồn: kí hiệu là mẫu cao E1

TR ẦN

+ Cao đặc đan sâm 3 (IMC) chiết bằng cồn: kí hiệu là mẫu cao E2 + Cao đặc đan sâm (IMC) chiết bằng nước: kí hiệu là mẫu cao N

B

+ Cao đan sâm dạng bột khô: kí hiệu mẫu cao R

A

là mẫu cao F

10 00

+ Cao đan sâm dạng viên nang cứng (CT TNHH Fito pharma): kí hiệu

H

Ó

- Nước cất, ethyl acetat, toluen đạt tinh khiết phân tích.

Í-

2.1.3. Thiết bị dụng cụ nghiên cứu

-L

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag: bộ phận chấm

ÁN

mẫu bán tự động Linomat 5, bộ phận triển khai sắc ký ADC2, buồng chụp ảnh

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

sắc ký TLC VISUALIZED, phần mềm xử lí kết quả VideoScan

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

xuất.

- Bản mỏng kính HPTLC silica gel 60 F254 (MERCK) - Cân phân tích AUW 220 - Máy ly tâm Kubota 6500 - Máy lắc siêu âm Bandelin Sonorex Super RK 106 - Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 10 và 25 mL, cốc có mỏ, pipet

các loại, autopipet 10-100, 100-1000 µl

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

13

- Ống ly tâm ( thông tin về thể tích) - Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0.45µl

Ơ

N

2.2. Nội dung nghiên cứu

H

- Xây dựng phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa trong

.Q

- Thẩm định phương pháp vừa xây dựng.

TP

- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ bộ một số mẫu cao

ẠO

thu được trên thị trường.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.3. Phương pháp nghiên cứu

N H Ư

2.3.1.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký

G

2.3.1. Khảo sát và xây dựng phương pháp

TR ẦN

- Pha tĩnh: bản mỏng Silica gel F254.

- Pha động: Sau khi tham khảo một số tài liệu tham khảo chúng tôi lựa

B

chọn một số hệ pha động để khảo sát xem hệ dung môi pha động nào thích hợp

10 00

nhất để xây dựng phương pháp phân tích:

A

+ Hệ pha động 1: Benzen: EtOAc= 19:1 [2]

H

Ó

+ Hệ pha động 2: CHCl3: MeOH = 9:1 [23]

Í-

+ Hệ pha động 3: Toluen: EtOAc= 19 : 1 [7]

-L

- Khảo sát điều kiện phát hiện: hiện vết sắc ký dưới đèn UV-VIS, chọn

ÁN

bước sóng thích hợp để phân tích Tanshinon IIa.

TO

- Lựa chọn thể tích mẫu đưa lên bản mỏng và tốc độ chấm mẫu để sau khi

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

cao Đan sâm bằng phương pháp HPTLC.

D

IỄ N

Đ

ÀN

triển khai sắc ký thu được sắc ký đồ có vết rõ, gọn đẹp, các vết tách nhau hoàn toàn.

2.3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết Dựa trên độ tan của cao Đan sâm, chúng tôi tìm cách để phân tán cao Đan sâm, khảo sát dung môi và quy trình chiết nào là thích hợp nhất để chiết xuất Tanshinon IIa trong cao Đan sâm .

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

14

- Phân tán cao Đan sâm: khảo sát dung môi nước, ethanol, methanol và ethyl acetat (EtOAc)

Ơ

N

- Hai dung môi dùng để chiết Tanshinon IIa mà chúng tôi khảo sát là ether

N

H

và EtOAc

U Y

2.3.2. Thẩm định phương pháp

TP

hiệu, đường chuẩn và khoảng nồng độ hồi quy, độ lặp lại của phương pháp và

ẠO

độ thu hồi.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hiện nay chưa có tài liệu chính thức nào đưa ra các yêu cầu về các giới

N

G

hạn thông số để đánh giá kỹ thuật bán định lượng, nên khóa luận chỉ xác định

H Ư

các thông số trên và đưa ra cùng với các giới hạn chấp nhận khi thẩm định kết

TR ẦN

quả định lượng theo AOAC và một số tài liệu khác [1].

2.3.2.1. Độ đặc hiệu-chọn lọc

B

Xử lý mẫu trắng và mẫu chuẩn theo quy trình được xây dựng, tiến hành

10 00

khai triển sắc ký đồng thời các mẫu sau theo điều kiện đã chọn: mẫu trắng, mẫu

A

chuẩn Tanshinon IIa, mẫu thử cao Đan sâm phân tích.

H

Ó

Phương pháp được coi là có chọn lọc khi:

Í-

- Trong sắc ký đồ mẫu trắng không có vết có Rf tương ứng với Rf của

-L

Tanshinon IIa chuẩn.

TO

ÁN

- Vết mẫu phân tích khai triển có vết tương ứng với vết Tanshinon IIa chuẩn, vết tách hoàn toàn

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Quy trình phân tích mẫu được đánh giá qua các tiêu chí: tính chọn lọc-đặc

D

IỄ N

Đ

ÀN

2.3.2.2. Đường chuẩn và khoảng hồi quy Pha 6 dung dịch chất chuẩn từ C1-C6 nồng độ khác nhau. Tiến hành sắc

ký 6 vết dung dịch trên với thể tích 3µl/ vết. Xây dựng phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn, xác định hệ số tương quan r.

Nếu 0,99 ≤ r ≤ 1: Có tương quan hồi quy rõ rệt [13].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DấyKèmQuyNhƥn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

15

2.3.2.3. Ä?áť™ lạp lấi phĆ°ĆĄng phĂĄp Phân tĂ­ch 6 mẍu tháť­ T1-T6 tᝍ cháşż phẊm cao Ä?an sâm khảo sĂĄt tĂ­nh Ä‘áť™ lᝇch

Ć

N

chuẊn tưƥng đᝑi RSD cᝧa kết quả giᝯa cåc lần phân tích.

.Q

2.3.2.4. Ä?áť™ Ä‘Ăşng

TP

Ä?ưᝣc Ä‘ĂĄnh giĂĄ qua Ä‘áť™ thu háť“i, sáť­ d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp thĂŞm chuẊn. Tiáşżn

áş O

hĂ nh nhĆ° sau: lẼy ba mẍu tháť­ cao Ä?an sâm phân tĂ­ch, thĂŞm cĂšng máť™t lưᝣng

Ä?

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

chuẊn và o tᝍng mẍu th᝭ trư᝛c khi x᝭ lí mẍu sẽ đưᝣc ba mẍu T1+C, T2+C,

H ĆŻ

kiᝇn, tính đ᝙ thu hᝓi theo công thᝊc:

N

G

T3+C, sau khi x᝭ lí mẍu thÏ tiến hà nh sắc ký cåc dung dᝋch trên trong cÚng điᝠu

Trong Ä‘Ăł:

10 00

- ∆: Ä?áť™ chᝇch (%)

B

TR ẌN

đ?‘ĽĚ… ∆ = ( -1) Ă— 100 Âľ

A

- �̅ : Giå trᝋ trung bÏnh cᝧa kết quả th᝭ nghiᝇm

H

Ă“

- ¾: Giå trᝋ th᝹c hoạc giå trᝋ đưᝣc chẼp nhận là đúng

Ă?-

Theo AOAC, thÏ gi᝛i hấn chẼp nhận cᝧa đ᝙ thu hᝓi là 97-103% nếu hà m

-L

lưᝣng ≼ 1%, là 95-105% nếu hà m lưᝣng ≼ 0,1% [13].

Ă N

2.3.2.5. So sånh v᝛i phưƥng phåp đã công nhận

TO

Mẍu cao E1 đưᝣc phân tích bẹng phưƥng phåp HPTLC m᝛i đưᝣc xây

Diáť…n Ä‘Ă n háť— trᝣ giĂĄo d᝼c : Ä?/C 1000B Trần HĆ°ng Ä?ấo Tp Quy NhĆĄn NgĆ°áť?i sĂĄng láş­p : Nguyáť…n Thanh TuẼn - Chᝧ quản tĂ i nguyĂŞn : Nguyáť…n Thanh TĂş

U Y

N

2,7% nếu hà m lưᝣng ≼ 1% và RSD ≤ 3,7% nếu hà m lưᝣng ≼ 0,1% [13].

H

Gi᝛i hấn đ᝙ lạp lấi đᝑi v᝛i 1 phưƥng phåp đᝋnh lưᝣng theo AOAC là RSD≤

D

Iáť„ N

Ä?

Ă€N

d᝹ng (th᝹c hiᝇn tấi trư�ng đấi h�c Dưᝣc Hà N᝙i) và phưƥng phåp HPLC theo TCCS cᝧa viᝇn Dưᝣc liᝇu TW (th᝹c hiᝇn tấi viᝇn Dưᝣc liᝇu TW).

- Xáť­ lĂ­ mẍu tháť­: Cân 3 mẍu cao, cân chĂ­nh xĂĄc khoảng 3 mg cao Ä?an sâm, chuyáťƒn vĂ o bĂŹnh tam giĂĄc 50 ml. phân tĂĄn cao báşąng cĂĄch thĂŞm 3 ml nĆ°áť›c vĂ o. ThĂŞm khoảng 15 ml methanol, siĂŞu âm trong 30 phĂşt, láť?c vĂ o bĂŹnh Ä‘áť‹nh mᝊc 25 ml. ThĂŞm tiáşżp 10 ml methanol vĂ o bĂŁ, siĂŞu

Ä?Ăłng gĂłp PDF báť&#x;i GV. Nguyáť…n Thanh TĂş

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

16

âm tiếp trong 15 phút, lọc tiếp vào bình định mức 25 ml trên. Bổ sung methanol đến vạch mức.

Ơ

N

- Tiến hành sắc ký và điều kiện sắc ký xem ở mục 1.1.4.3.

N

H

Kết quả thu được từ hai phương pháp được so sánh với nhau bằng T-test.

U Y

2.3.3. Phân tích mẫu cao Đan sâm trên thị trường

TP

Tanshinon IIa, xây dựng đường chuẩn hồi quy cho dãy dung dịch chuẩn.

ẠO

Tiến hành phân tích định tính, bán định lượng 5 mẫu cao thu được trên thị

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

trường theo phương pháp đã được thẩm định. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử lần

N

G

lượt ở bảng 2.1.

H Ư

Bảng 2.1. Mẫu thử thu thập trên thị trường dùng để phân tích

A

10 00

B

Cao E1

Số thứ tự mẫu thử

TR ẦN

Tên mẫu thử

H

Ó

Cao E2

E1-3 E2-1

-L

Í-

E2-2 E2-3 Cao F

TO

ÁN

E1-2

F-1 F-2

Cao N

N-1

D

IỄ N

Đ

ÀN

E1-1

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc pha thành dãy dung dịch chất chuẩn

N-2 Cao R

R-1 R-2

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

17

2.3.4. Phương pháp xử lí kết quả Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lí

Ơ

N

bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPTLC. Ảnh chụp sắc ký đồ được

H

chuyển sang xử lí bằng phần mềm VideoScan. Phần mềm này sẽ dựa trên hình

.Q

(hoặc chiều cao) tương ứng.

TP

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm

ẠO

toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

tính toán: kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối, xây dựng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

đường chuẩn, độ đúng khi xử lí kết quả thực nghiệm.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

ảnh sắc ký đồ vừa được chụp để ghi lại thành các pic và tính toán diện tích pic

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

18

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát xây dựng phương pháp

Ơ

N

3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký

H

- Pha tĩnh: Bản mỏng thủy tinh HPTLC Silica gel 60 F254

U Y

N

- Pha động: Sau khi khảo sát 3 pha động (mục thì chúng tôi nhận thấy

TP

thấp.

ẠO

+ Hai hệ dung môi là Benzen: EtOAc (19:1) và Toluen: EtOAc (19:1)

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

thì vết sắc ký đều đẹp, cho sắc ký đồ gọn, hệ số lưu giữ Rf của các vết

N

G

thích hợp. Xem xét dung môi Toluen ít độc hơn dung môi Benzen nên

TR ẦN

pha động cho các bước tiếp theo.

H Ư

chúng tôi chọn hệ dung môi pha động 3 là Toluen : EtOAC (19:1) làm - Lựa chọn bước sóng phát hiện: Tanshinon IIa là một chất có màu có thể

B

quan sát bằng mắt thường nên chúng tôi lựa chọn bước sóng phát hiện

10 00

Tanshinon IIa là ánh sáng khả kiến.

A

3.1.2. Lựa chọn dung môi chiết

H

Ó

- Thực nghiệm cho thấy, cao đặc đan sâm/cồn không thể hòa tan/chiết trực

Í-

tiếp bằng lượng nhỏ các dung môi ethanol, methanol và EtOAc. Vì vậy chúng

-L

tôi đã phân tán cao trong một lượng nước tối thiểu (3ml/3g cao) sau đó chiết

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

bằng dung môi thích hợp. + Dung môi ether khả năng chiết tốt, tuy nhiên nhận thấy là dung môi

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

+ Pha động CHCl3 : MeOH (9:1) cho ra vết sắc kí với hệ số lưu giữ

này rất dễ bay hơi nên tiến hành sẽ dễ gây sai số về nồng độ khi tiến hành, mặt khác ether có khả năng gây ra cháy nổ cao nên việc lựa chọn dung môi ether làm dung môi chiết là không phù hợp. + Với dung môi EtOAc ít bị bay hơi hơn so với ether và không gây nguy cơ cháy nổ. Quan sát các vết sắc ký của các mẫu thử chiết cao Đan sâm ở hình 3.1.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H Ư

Hình 3.1. Vết sắc ký của mẫu chiết bằng EtOAc

TR ẦN

Nhận xét: Các mẫu thử có các vết sắc ký có hệ số lưu giữ Rf tương đồng với Tanshinon IIa chuẩn cho thấy EtOAc có thể chiết được Tanshinon IIa. vết

B

sắc ký lên gọn, tách tốt. nên trong phương pháp chuẩn bị mẫu chúng tôi lựa

10 00

chọn EtOAc làm dung môi chiết Tanshinon IIa trong cao Đan sâm.

A

3.1.3. Tiêu chuẩn cho phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon

H

Ó

IIa trong cao Đan sâm

-L

HPTLC

Í-

3.1.3.1. Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được đưa vào phân tích bằng

ÁN

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn,

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

mẫu trắng

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

19

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn + Dung dịch chuẩn gốc : cân chính xác khoảng 25mg Tanshinon IIa hòa tan với EtOAc trong bình định mức 5 ml. + Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,25; 0,35; 0,45; 0,55; 0,65; 0,75 mg/ml.

- Xử lí mẫu:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

20

Cân chính xác khoảng 3g cao Đan sâm, thêm 3 ml nước từ từ vào để phân tán cao Đan sâm. Sau đó cho 4 ml dung môi EtOAc vào, lắc kĩ

Ơ

N

dung dịch trong vòng 5 phút. Sau đó cho ống chiết vào li tâm trong vòng

H

5 phút. Ly tâm xong, đổ dịch chiết vào bình định mức 10 ml. Chiết 2 lần

U Y

N

nữa tương tự như trên với thể tích lần lượt 3 và 3 ml dung môi EtOAc.

TP

đủ. Lọc dịch chiết qua phễu lọc 0.45µm trước khi chấm dung dịch lên

ẠO

bản mỏng.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Mẫu trắng:

N

G

Cân chính xác khoảng 3g cao Đan sâm/nước, thêm 3 ml nước từ từ

H Ư

vào để phân tán cao Đan sâm. Sau đó cho 4 ml dung môi EtOAc vào, lắc

TR ẦN

kĩ dung dịch trong vòng 5 phút. Sau đó cho ống chiết vào li tâm trong vòng 5 phút. Ly tâm xong, đổ dịch chiết vào bình định mức 10 ml. Chiết

B

2 lần nữa tương tự như trên với thể tích lần lượt 3 và 3 ml dung môi

10 00

EtOAc. Các dịch chiết được cho vào bình định mức 10ml, rồi thêm

A

EtOAc cho đủ. Lọc dịch chiết qua phễu lọc 0.45µm trước khi chấm dung

H

Ó

dịch lên bản mỏng.

Í-

3.1.3.2. Điều kiện phân tích

-L

- Bản mỏng: kính thủy tinh Silica gel F254. Hoạt hóa bản mỏng ở 110˚C

ÁN

trong vòng 30 phút.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

- Pha động: Toluen: EtOAc (19:1)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Các dịch chiết được cho vào bình định mức 10ml, rồi thêm EtOAc cho

- Thể tích mẫu đưa lên bản mỏng: 3-5 µl

- Độ rộng vết chấm: 4 mm - Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng - Ánh sáng phát hiện: ánh sáng khả kiến - Phần mềm xử lí kết quả: VideoScan

3.1.3.3. Định tính và định lượng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

21

- Định tính: Sắc ký đồ mẫu thử phải có vết có màu tím hồng và có Rf tương đương với vết Tanshinon IIa chuẩn.

Ơ

N

- Bán định lượng: Kết quả phân tích phải thu được đường chuẩn hồi quy,

N

H

độ lặp lại và độ đúng đạt giá trị theo quy định.

.Q

3.2.1. Độ đặc hiệu, chọn lọc

TP

Hình 3.2 thể hiện sắc ký đồ của mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, các

ẠO

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

mẫu thử và dung dịch Tanshinon IIa chuẩn.

ÁN

-L

Hình 3.2. Vết sắc ký mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước, dung dịch chuẩn Tanshinon IIa

TO

Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu trắng chiết cao Đan sâm/nước không xuất

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

3.2. Thẩm định phương pháp phân tích

D

IỄ N

Đ

ÀN

hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu thử chứa Tanshion IIa. Trên bản mỏng khác: chấm 6 vết dung dịch chuẩn C1-C6, 6 vết của 6 mẫu thử khác nhau T1-T6, 3 vết của 3 dung dịch trộn Tr1, Tr2, Tr3 (cao Đan sâm + chuẩn Tanshinon IIa). Sau khi khai triển, quan sát ở sắc ký đồ ở ánh sáng khả

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

22

kiến, kết quả thu được ở hình 3.3. Giá trị Rf và độ lệch chuẩn tương đối của các

TR ẦN

Hình 3.3. Hình ảnh vết sắc ký của mẫu thử cao Đan sâm/cồn và mẫu trắng thêm chuẩn Tanshinon IIa

Mẫu

Rf

chuẩn

mẫu chuẩn

C1

0,4260

Ó

T1

0,3960

Tr 1

0,4090

0,4130

T2

0,4020

Tr 2

0,4020

0,4050

T3

0,3990

Tr 3

0,4020

0,3990

T4

0,4040

C5

0,4020

T5

0,4040

C6

0,3960

T6

0,4020

Đ

ÀN

TO

C4

IỄ N

Mẫu thử

Rf

Mẫu trộn

mẫu thử

A

H

ÁN

-L

Í-

C2 C3

D

10 00

B

Bảng 3.1. Giá trị Rf ứng với Tanshinon IIa của các vết sắc ký Rf mẫu trộn

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

vết ở bảng 3.1.

Trung bình = 0,4041 SD = 0,0073 RSD = 1.79 %

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

23

Nhận xét: Sắc ký đồ của mẫu thử có các vết chính Tanshinon IIa có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn. Giá

Ơ

N

trị Rf của từng mẫu chuẩn và mẫu thử có độ lệch chuẩn tương đối RSD= 1,79

N

H

% < 3%. Như vậy phương pháp đảm bảo độ chọn lọc- đặc hiệu.

U Y

3.2.2. Đường chuẩn- khoảng nồng độ hồi quy

N

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Đ

Nồng độ(*) (mg/ml)

Dung dịch

ẠO

Bảng 3.2. Kết quả đánh giá đường chuẩn của chất chuẩn Tanshinon IIa Diện tích (mAU)

0,2646

C2

0,3528

71466,2

0,4410

90179,3

0,5292

104661,7

0,6174

117213,0

0,7056

127694,7

TR ẦN

H Ư

C1

C3

10 00

B

C4 C5

-L

Í-

r2

H

Ó

PT hồi quy

A

C6

y = -182965x2+ 352547x-30282 0,9998 0,9999

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

r

49972,7

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

Kết quả phân tích được đưa ra ở hình 3.4 và bảng 3.2

.Q

Nồng độ các dung dịch chuẩn: 0,27; 0,36; 0,45; 0,54; 0,63; 0,72 mg/ml.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

24

đường chuẩn Tanshinon IIa 140000

Ơ H

80000 60000

N U Y

40000

.Q

20000 0

0,1

0,2

0,3

0,4

TP

0 0,5

0,6

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

G

Đ

Hình 3.4. Đường chuẩn dung dịch Tanshinon IIa

H Ư

N

Nhận xét: Dựa vào đường chuẩn và phương trình hồi quy, ta thấy được mối tương quan giữa diện tích và nồng độ là mối tương quan bậc hai, có tính hồi quy.

10 00

B

3.2.3. Độ lặp lại phương pháp

TR ẦN

hồi quy cao với r = 0,9999 gần với 1. Như vậy đường chuẩn đạt yêu cầu về tính

Kết quả xác định độ lặp lại được thể hiện trong bảng 3.3.

Mẫu thử

Hàm lượng Tanshinon IIa (%)

T1

0,0945

T2

0,0996

T3

0,0970

T4

0,1028

T5

0,1009

T6

0,0970

Trung bình

0,0987

SD

0,0027

RSD (%)

2,79

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

Bảng 3.3. Hàm lượng Tanshinon IIa trong mẫu thử cao Đan sâm nghiên cứu

IỄ N D

0,8

ẠO

nồng độ (mg/ml)

0,7

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

diện tích

100000

N

y = -182965x2 + 352547x - 30282 R² = 0,9998

120000

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

25

Nhận xét: Hàm lượng Tanshinon IIa thu được có độ lệch chuẩn tương đối

Ơ

N

RSD=2,79 % < 3,7 %, như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt.

H

3.2.4. Độ đúng

.Q

Lượng

Độ thu hồi

(Tr)

IIa thêm vào

Tanshinon IIa

(mg)

thu hồi

TP

Lượng Tanshinon

ẠO

Vết mẫu thử trộn

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 3.4. Kết quả độ thu hồi

Tanshinon IIa (%)

2

1,764

3

1,764

96,05

1,6938

96,02

1,6778

95,11 95,73

10 00

B

Trung bình

1,6943

H Ư

1,764

TR ẦN

1

N

G

(mg)

A

Nhận xét: Độ đúng của phương pháp được tính theo độ thu hồi, kết quả là

H

Ó

95,73 % > 95 %. Như vậy phương pháp có độ đúng tương đương với độ đúng

Í-

cần thiết của một phương pháp định lượng.

-L

3.2.5. So sánh với phương pháp đã được công nhận

ÁN

Phương pháp định lượng bằng HPLC đã được công nhận về độ chính xác,

TO

ổn định. Vì thế chúng tôi với mong muốn đánh giá tương đối về kết quả hàm

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

Kết quả xác định độ đúng thể hiện ở bảng 3.4.

định hàm lượng Tanshinon IIa bằng phương pháp HPTLC ở bảng 3.5 và kết quả xác định hàm lượng Tanshinon IIa bằng phương pháp HPLC ở bảng 3.6.

D

IỄ N

Đ

ÀN

lượng Tanshinon IIa bằng phương pháp HPTLC so với HPLC. Kết quả xác

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

26

Bảng 3.5. Kết quả của mẫu thử cao E1 theo phương pháp HPTLC Thử 1

Thử 2

Thử 3

Lượng cân

3,110

3,077

2,940

Độ pha loãng

10

10

10

Diện tích pic

58180,93

57625,57

56403,42

Nồng độ (mg/ml)

0,2182

0,2136

Hàm lượng (%)

0,0702

0,0694

Ơ H N

0,0693

Đ

ẠO

TP

0,2036

Chuẩn

Lượng cân (g)

10 00

B

Độ pha loãng (lần) Diện tích pic

2401678

0,040

H

Ó

Nồng độ (mg/ml)

A

(mAU)

Thử 2

Thử 3

1,3282

1,2393

1,2224

25

25

25

2197951

2108156

2079491

0,0366

0,0351

0,0346

0,0689

0,0708

0,0698

ÁN

-L

Í-

Hàm lượng (%)

Thử 1

TR ẦN

Mẫu

H Ư

pháp HPLC

N

G

Bảng 3.6. Kết quả phân tích bán định lượng mẫu thử cao E1 bằng phương

TO

Chúng tôi tiến hành tính T-Test kết quả của hai phương pháp, kết quả ở

bảng 3.7. Kết quả T-test p= 0,767527 > 0,05 cho thấy kết quả hàm lượng

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

.Q

(mAU)

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

Mẫu

D

IỄ N

Đ

ÀN

Tanshinon IIa trong mẫu thử cao Đan sâm tính theo 2 phương pháp HPLC và HPTLC không có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê. Phương pháp vừa mới xây dựng có kết quả tương đương với phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn cơ sở đã được công nhận.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

27

Bảng 3.7. Kết quả T-test Mẫu

Hàm lượng (%)

HPTLC

1

0,0702

2

0,0694

3

0,0693

1

0,0689

2

0,0708

3

0,0698

T-test

Ơ H N

ẠO

TP

0,767527

Đ

0,000403

N H Ư

TR ẦN

Như vậy phương pháp vừa xây dựng đã đáp ứng được yêu cầu định tính và bán định lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm.

B

3.3. Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm tra sơ bộ một số mẫu

10 00

cao thu được trên thị trường

A

Kết quả bán định lượng các chế phẩm được thể hiện trong hình 3.5, bảng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

3.8, hình 3.6 (đường cong chuẩn) và bảng 3.9 (bán định lượng các cao).

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

0,000776

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

HPLC

SD

N

Phương pháp

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

28

Hình 3.5. Hình ảnh vết sắc của các mẫu phân tích trên thị trường

Ơ

0,294

66558,34

C2

0,392

75616,13

C3

0,49

C4

0,588

C5

0,686

C6

0,784

TP

.Q

C1

G

Đ

ẠO

83644,48 89690,16

N

93647,94

H Ư

95804,27

y = -94435 x2+ 161968x + 26940

TR ẦN

PT hồi quy r2

0,9999

10 00

B

r

0,9998

Ó

A

(*) Nồng độ đã được hiệu chỉnh theo hàm lượng chuẩn tinh khiết

120000

Í-

H

đường chuẩn tanshinon IIa

ÁN

-L

y = -94435x2 + 161968x + 26940 R² = 0,9998 100000

TO

80000

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

(mAU)

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

H

Diện tích

N

Nồng độ (*) (mg/ml)

Dung dịch

N

Bảng 3.8. Kết quả đường chuẩn của chất chuẩn Tanshinon IIa

40000

D

IỄ N

Đ

ÀN

60000

20000 0 0

0,1

0,2

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

29

Hình 3.6. Đường chuẩn Tanshinon IIa tiến hành phân tích mẫu trên thị

Ơ

Bảng 3.9. Hàm lượng Tanshinon IIa trong các mẫu thử phân tích trên thị

N

Bán định lượng

Hàm lượng

Tanshinon IIa (%)

Tanshinon IIa

TP

.Q

Hàm lượng

chấm

1

+

2

+

1

0,0647 0,0637

+

0,0702

+

0,0694

+

0,0693

1

+

0,0510

2

+

0,0499

3

+

0,0497

H

3

Ó

2

TO

ÁN

-L

Cao E2

ẠO



Đ

2

G



N

1

H Ư



A

Cao E1

2

Í-

Cao R



TR ẦN

Cao F

1

B

Cao N

10 00

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

trung bình (%)

0,0644

0,0696

0,0502

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Định tính

H

trường Mẫu cao Vết

N

trường

D

IỄ N

Đ

ÀN

(-) Không phát hiện thấy Tanshinon IIa Kết luận: 1. Mẫu cao N: không phát hiện thấy Tanshinon IIa 2. Mẫu cao F: không phát hiện thấy Tanshinon IIa 3. Mẫu cao R: Có chứa Tanshinon IIa, với hàm lượng là 0,0644% 4. Mẫu cao E1: Có chứa Tanshinon IIa với hàm lượng là 0,0696%

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

30

5. Mẫu cao E2: Có chứa Tanshinon IIa với hàm lượng là 0,0502% Các mẫu cao có sự khác nhau về kết quả định tính và bán định lượng.

Ơ

N

3.4. Bàn luận

H

Trong quá trình xây dựng phương pháp HPTLC, chúng tôi sử dụng

U Y

N

detector Videoscan, detector này phân tích vết thông qua ảnh chụp có thể làm

TP

lượng bằng detector densitometer, nên chúng tôi chỉ tiến hành xác định hàm

ẠO

lượng Tanshinon IIa trong cao Đan sâm ở mức bán định lượng.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Thành phần hoạt chất trong mỗi loại cao khác nhau sẽ có sự khác nhau

N

G

dẫn đến công dụng hay chỉ định của mỗi cao Đan sâm sẽ phải khác nhau. Tuy

H Ư

nhiên trên thị trường, các chế phẩm cao trên thị trường chưa nói rõ đây là loại

TR ẦN

cao và thành phần hoạt chất là gì, hàm lượng bao nhiêu vì đó mới là cơ sở để đưa ra công dụng hay chỉ định cho một sản phẩm. Hai trong năm mẫu cao Đan

B

sâm chúng tôi phân tích không tìm thất Tanshinon IIa, lấy ví dụ cao F không

10 00

tìm thấy Tanshinon IIa vì nó là cao chiết nước nhưng công bố công dụng, chỉ

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

định (Hình 3.7) những tác dụng sinh học của Tanshinon IIa.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

dẫn đến sai số nên detector này chưa có độ nhạy và khả năng phát hiện hàm

Hình 3.7. Thông tin quảng bá công dụng của cao F [5].

Nhận thấy nữa đó là có sự chênh lệch khá lớn về hàm lượng Tanshinon IIa (một thành phần có tác dụng sinh học quan trọng) trong các mẫu cao Đan sâm (ba mẫu có hàm lượng lần lượt là 0,0502 %; 0,0644 % và 0,0696 %). Điều

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

31

này ảnh hưởng nhiều tới chất lượng (tác dụng sinh học) của các cao nói chung

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

và các chế phẩm chứa cao Đan sâm nói riêng trên thị trường.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

32

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận

Ơ

N

Trong khóa luận này, qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi đã

H

hoàn thành được các mục tiêu đề ra:

.Q

trong cao Đan sâm.

TP

2. Đánh giá được phương pháp vừa xây dựng:

ẠO

- Phương pháp vừa xây dựng được có độ chọn lọc cao, khoảng hồi quy

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

tốt (r = 0,9999), độ lặp lại tốt (RSD = 2,79 %), độ đúng tốt (tỉ lệ thu

N

G

hồi = 95,73 %), đều đạt yêu cầu cho một phương pháp định lượng.

H Ư

- Phương pháp vừa mới xây dựng có kết quả tương đương với phương

TR ẦN

pháp HPLC theo tiêu chuẩn cơ sở của viện Dược liệu TW. 3. Phân tích một số mẫu cao trên thị trường. Kết quả định tính và kết quả

B

bán định lượng Tanshinon IIa trong các mẫu cao có sự khác biệt lớn.

10 00

4.2. Đề xuất

A

Do thời gian và điều kiện có hạn nên chúng tôi chỉ mới thực hiện trên các

H

Ó

mẫu cao chiết trong cồn, chúng tôi đề xuất:

Í-

- Sử dụng detector densitometer để tăng độ chính xác của phương

-L

pháp, cho phép định lượng cao Đan sâm thay vì chỉ bán định lượng. phương pháp định tính, bán định lượng/định lượng trên các mẫu cao chiết trong nước và mẫu cao chiết cồn-nước để đảm bảo có thể định lượng được các loại cao khác nhau trên thị trường.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

- Để hoàn thiện thêm về tiêu chuẩn cho các loại cao Đan sâm, xây dựng

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, bán định lượng Tanshinon IIa

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

N

Phạm Kim Anh (2014), Nghiên cứu bán định lượng một số vitamin trong

Ơ

1.

N

H

hỗn hợp bằng phương pháp HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại

TP

Bộ Y Tế ( 2007), Hóa phân tích, Tập 2, NXB Y Học, tr.205-208

4.

Domesco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, tại trang web

Đ

ẠO

3.

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hà Nội.

Đông Y Minh Phúc FITÔCOROM, truy cập ngày:13/05/2106, tại trang

H Ư

5.

N

http://www.domesco.com/c/dan-sam--tam-that/.

Mach/Fitocoton-722153.

B

Fito Pharma (2014), Đan sâm Tam thất, truy cập ngày-10/05, tại trang

10 00

6.

TR ẦN

webhttp://dongyminhphuc.com/Tim-Thuoc-Theo-Benh/Tim-

web http://www.fitoco.com/product-items/dan-sam-tam-that/.

Nguyễn Thị Thu Hòa, Trần Việt Hùng và Nguyễn Thị Bích Thu (2012),

A

7.

H

Ó

"Định tính và định lượng tanshinon IIa trong cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ

Í-

và đan sâm bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao", Tạp chí

-L

Dược liệu. 17, tr. 370-375. Đinh Thị Thúy Hương (2014), Xây dựng quy trình định lượng

ÁN

8.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và

9.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chủ biên, Nhà xuất bản Y học,

.Q

2.

U Y

học Dược Hà Nội.

HPTLC, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội. Đỗ Tât Lợi (2004), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.818.

10.

LTD Tasly Phar International Co. Thiên sứ hộ tâm đan, truy cập ngày 20/04/2016, tại trang web http://www.tasly.com.vn/ct-sp/744/thien-suho-tam-dan.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

11.

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Traphaco Đan sâm Tam thất, truy cập ngày 20/04-2016, tại trang web http://www.traphaco.com.vn/san-pham/dan-sam-tam.

N

Viện Dược liệu (2002), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,

Ơ

12.

N

Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia (2010),

U Y

13.

H

Tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr.732.

ẠO Đ G

biên, Stationery Office Books

Machindra J. Chavan, Devanand B. Shinde and Pravin S. Wakte (2011),

TR ẦN

15.

N

British Pharmacopoeia Commission (2014), British Pharmacopoeia, chủ

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Tiếng Anh 14.

TP

bản khoa học và kĩ thuật, Hà Nội, tr.24-58.

High-Performance ThinLayer Chromatography (HPTLC), pp.117.

B

Hanqing Pang, Liang Wu and Yuping Tang (2016), "Chemical Analysis

10 00

16.

of the Herbal Medicine Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma

Ó

Hildebert Wagner and Gudrun Ulrich-Merzenich. Evidence and Rational

H

17.

A

(Danshen)", Molecules. 21(1).

National Center for Biotechnology Information Tanshinone IIA,

-L

18.

Í-

Based Research on Chinese Drugs, Springer-Verlag Wien, Wien, tr.254.

ÁN

accessed date: 23/04/2016,

TO

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/164676.

IỄ N

Đ

ÀN

19.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật, Nhà xuất

Limin Zhou MSc, Zhong Zuo PhD và Moses Sing Sum Chow PharmD (2005), "Danshen: an overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use", J Clin Pharmacol. 45(12), pp. 1345-

D

59.

20.

M. Liu and X. H. Xia (2010), Study on the chemical stability of tanshinone IIa, Zhong Yao Cai. 33(4), pp. 606-9.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

21.

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Marina Santiago và Scott Strobel (2013), "Thin layer chromatography", Methods Enzymol. 533, pp. 303-24.

N

Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia

Ơ

22.

N

H

miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht,

TP

miltiorrhiza) in Medicine Volume 1, Springer Netherlands, Dordrecht, Yuan-yuan Jiang, Long Wang và Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

24.

ẠO

pp.140.

Yufei Feng, Shaowa Lu và Shuang Sun (2012), "Analysis of Salvia

H Ư

25.

N

G

miltiorrhiza) in Medicine Volume 2, Springer Netherlands, pp.119-129.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

miltiorrhiza (Danshen)", African Journal of Microbiology Research.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Yuan-yuan Jiang, Long Wang and Li Zhang (2015), Dan Shen (Salvia

.Q

23.

U Y

pp. 97-102.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial