Nghiên cứu định lượng Levetiracetam trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LIÊN Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

HÀ THỊ LIÊN Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy 2. ThS. Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện:

Trung tâm đánh giá tƣơng đƣơng sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

Ơ

nhà trường và các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy và

N

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học tôi đã được Ban giám hiệu

H

giúp đỡ trong suốt quá trình học tập tại trường. Sau một thời gian thực hiện đề tài

U Y

N

với rất nhiều nỗ lực và cố gắng, khi khóa luận này được hoàn thành là lúc tôi xin

TP

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.

ẠO

Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ơn tới PGS.TS Nguyễn Tƣờng Vy và Ths. Tạ Mạnh Hùng- Giám đốc Trung tâm

N

G

Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, là những

H Ư

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá

TR ẦN

trình thực hiện đề tài.

Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng

B

và Trung tâm Đánh giá Tƣơng đƣơng sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc

10 00

Trung ƣơng đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài tại đây. Tôi xin tỏ lòng

A

biết ơn đến toàn thể các anh, chị trong Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học

Ó

đã tạo điều kiện giúp đỡ, luôn tận tình giải đáp những thắc mắc trong công việc và

Í-

H

đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.

-L

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình tôi, cùng toàn thể bạn

ÁN

bè, những người luôn sát cánh, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016 Sinh viên

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

tập và nghiên cứu.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn

Hà Thị Liên

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Ơ

N

MỤC LỤC

U Y

ĐẶT VẤN ĐỀ

3

1.1.LEVETIRACETAM ……………………………………………………..

3

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa…………………………………

3

1.1.2. Tác dụng dƣợc lý và dƣợc động học…………………………………..

4

1.1.3. Chỉ định - chống chỉ định……………………………………………….

4

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trƣờng………………………………………

5

1.1.5. Các phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam…………………………

5

1.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO…………………………………….

7

1.2.1. Khái niệm……………………………………………………………….

7

ẠO

TP

.Q

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN …………………………………………………

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1

8

1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký…………………………

8

A

1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC……………………………………

H

Ó

1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký……………………

11 14

1.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC

15

1.3.1. Khái niệm………………………………………………………………..

15

1.3.2. Các chỉ tiêu thẩm định………………………………………………….

15

TO

ÁN

-L

Í-

1.2.5. Phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC………………………………..

ÀN

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ

19

D

IỄ N

Đ

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

N

H

Trang

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

19

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……………………………………….

19

2.1.2. Dụng cụ, máy móc, thiết bị……………………………………………..

20

Ơ

20 20

2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích……………………………………

21

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………….

21

2.3.1. Chuẩn bị mẫu huyết tƣơng tự tạo chứa LEVET……………………...

21

2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích……………………………………

22

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

tƣơng…………………………………………………………………………..

23

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

28

3.1. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LEVET TRONG HT

28

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn………………….

28

B

TR ẦN

H Ư

2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích…………………………………..

32

3.1.3. Quy trình phân tích Levetiracetam trong huyết tƣơng………………

33

A

10 00

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện tách chiết Levetiracetam....................

H

Ó

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH........................................

34

3.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính......................................................

36

3.2.3. Giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ).........................................................

36

3.2.4. Độ đúng - Độ chính xác…………………………………………………

37

3.2.5. Tỷ lệ thu hồi..............................................................................................

38

3.2.6. Độ ổn định của hoạt chất trong HT……………………………………

39

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................

44

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................

44

4.2. KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………

45

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu..........................................................................

Đ IỄ N D

34

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp HPLC định lƣợng LEVET trong huyết

N

H

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………………..

N

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

2

DĐH

Dược động học

3

ĐVTN

Động vật thí nghiệm

4

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ơ

CV

(High Performance Liquid Chromatography) Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao

HQC

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

5

G

Đ

(High Quality ControlSample) HT

Huyết tương

7

IS

Nội chuẩn (Internal Standard)

8

LCMS

Sắc ký lỏng khối phổ

TR ẦN

H Ư

N

6

(Liquid Chromatography Mass Spectrometry) LLOQ

Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification)

10

LQC

Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp

10 00

B

9

(Lower Quality Control sample)

A

Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình

MQC

12

NTN

13

PA

14

QC

Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control sample)

Ó

11

SKĐ

Sắc ký đồ

16

SPE

Chiết pha rắn (Solid-Phase Extration)

17

TKTW

Thần kinh trung ương

18

TĐSH

Tương đương sinh học

19

US-FDA

Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ

Đ

ÀN

TO

15

D

IỄ N

Tinh khiết phân tích (Pure Analysis)

ÁN

-L

Í-

H

Người tình nguyện

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TP

.Q

U Y

N

H

1

N

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, STT Ý nghĩa chữ viết tắt

(The United States Food and Drug Administration) 20

UV-VIS

Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet - Visible)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1

Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT

2.1

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

2.2

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.3

Các mẫu HT trắng dùng trong nghiên cứu

2.4

Các thiết bị đã dùng trong nghiên cứu

2.5

Thiết bị HPLC

2.6

Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn trong HT

2.7

Cách chuẩn bị mẫu QC trong HT

2.8

Chuẩn bị mẫu QC xác định độ đúng

3.1

Độ đúng của các mẫu thuộc các đường chuẩn

3.2

Kết quả xác định giá trị LLOQ

37

3.3

Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày

37

3.4

Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày

38

3.5

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của LEVET

38

3.6

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS

39

3.7

Kết quả độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn

39

3.8

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn

40

3.9

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ 2ºC - 8ºC

40

Ơ

6

19 20 20 22 22 24 36

41

3.11

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

42

3.12

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau xử lý (trong

43

TO ÀN

autosampler)

D

IỄ N

Đ

19

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

19

Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

3.10

N

Trang

-L

Nội dung

ÁN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Nội dung

Trang

Công thức cấu tạo của levetiracetam

3

3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của LEVET

28

3.2

SKĐ LEVET và nội chuẩn amoxicillin

3.3

SKĐ LEVET và nội chuẩn atenolol

3.4

SKĐ LEVET và nội chuẩn paracetamol

3.5

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung

29

30

Đ

31

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung

31

SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril : dung

TR ẦN

3.7

H Ư

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 6 : 94 (tt/tt)

32

SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng ACN

32

3.9

SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng acid HClO4

33

3.10

SKĐ mẫu HT sau khi chiết lỏng – lỏng với cloroform

33

3.11

SKĐ mẫu HT trắng

34

3.12

SKĐ mẫu HT trắng có chuẩn nội paracetamol

35

3.13

SKĐ mẫu chuẩn LEVET nồng độ 0,25 µg/mL có IS

35

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

3.8

B

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 4 : 96 (tt/tt)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

29

N

3.6

G

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 15 : 85 (tt/tt)

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

1.1

N

Hình

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 1

Ơ

Động kinh là một tình trạng bệnh lý của não do nhiều nguyên nhân khác nhau

N

ĐẶT VẤN ĐỀ

N

H

gây ra với bệnh cảnh rất phức tạp và đa dạng. Bệnh này có thể gặp ở mọi tuổi, mọi

.Q

kinh trên thế giới khoảng 0,5% dân số, thay đổi tùy theo từng quốc gia, từng vùng,

TP

từng dân tộc. Tại Việt Nam khoảng 2% dân số mắc bệnh và trong đó có đến 60% số

ẠO

bệnh nhân là trẻ em [8] [9] [12] [17]. Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Quốc tế chống động kinh ILAE (International League Against Epilepsy) xác định:

N

G

“Động kinh là tình trạng tái diễn ít nhất hai cơn động kinh trở lên cách nhau trên 24

H Ư

giờ, không phải do sốt cao và các nguyên nhân cấp tính khác như các rối loạn

TR ẦN

chuyển hóa, ngừng thuốc hay rượu đột ngột gây nên” [17] [23].Bệnh động kinh đang được xem là vấn đề thời sự với chuyên ngành tâm thần thần kinh. Mặc dù là

B

một nhóm bệnh lý rất nặng của hệ thần kinh nói chung, của não nói riêng, tuy nhiên

10 00

nếu điều trị sớm và phù hợp, số trường hợp khỏi bệnh chiếm tỷ lệ cao [1] [4] [8].

Trên thế giới, động kinh có thể được điều trị bằng bằng thuốc kháng động kinh hoặc

Ó

A

phẫu thuật đối với một số cá thể [12]. Tại Việt Nam số lượng bệnh nhân động kinh

H

được điều trị thành công bằng phương pháp phẫu thuật còn rất ít, hầu hết phải dùng

-L

Í-

thuốc kháng động kinh kéo dài.

Levetiracetam (C8H14N2O2, M =171,19 g/mol) là dẫn chất của pyrolidin, dùng để

ÁN

điều trị bệnh động kinh có hiệu quả và mới được Cơ quan quản lý Thuốc và thực

TO

phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép đăng ký lưu hành năm 2008. Levetiracetam

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc bệnh động

D

IỄ N

Đ

ÀN

(LEVET) có cấu trúc hóa học không giống với các thuốc điều trị động kinh khác

hiện có và là thuốc chống co giật mới trên thị trường Dược phẩm Việt Nam nên chi phí điều trị hiện tương đối cao. Để giảm gánh nặng điều trị cho bệnh nhân và cộng đồng, một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất các thuốc generic chứa dược chất LEVET. Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu về sinh khả dụng và tương đương sinh học các thuốc này là cần thiết để chứng minh các thuốc

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 2

generic có hiệu quả điều trị tương đương với thuốc biệt dược gốc. Dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có và tham khảo tài liệu [13] [14] [16] [22], chúng tôi đã tiến

H

Ơ

bằng phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu xây dựng một phương

N

hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng Levetiracetam trong huyết tương người

N

pháp phân tích LEVET trong huyết tương có đủ độ nhạy, độ chính xác và phù hợp

TP

.Q

(TĐSH) các thuốc chứa hoạt chất levetiracetam. Để đạt được mục tiêu này, đề tài thực hiện các nội dung:

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1. Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng levetiracetam trong huyết tương

G

Đ

bằng phương pháp HPLC.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

2. Thẩm định phương pháp xây dựng theo quy định của US-FDA.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

cho các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

Ơ

N

1.1. LEVETIRACETAM

N

H

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

.Q

- Công thức phân tử: C8H14N2O2

TP

- Khối lượng phân tử: 171,19372 g/mol.

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Công thức cấu tạo của LEVET được trình bày ở Hình 1.1.

ẠO

- Tên khoa học: (-)-(S)-α-Ethyl-2-oxo-1-pyrrolidin acetamid [21]

-L

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của levetiracetam [21]

ÁN

1.1.1.2. Tính chất hóa lý

TO

- Levetiracetam là chất bột, màu trắng đến trắng tinh, không mùi, vị đắng.

- Độ tan: Tan nhiều trong nước (104,0 g/100 mL), dễ tan trong cloroform (65,3

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

1.1.1.1. Công thức cấu tạo

D

IỄ N

Đ

ÀN

g/100 mL) và methanol (53,6 g/mL), tan trong ethanol (16,5 g/mL), ít tan trong acetonitril (5,7 g/100 mL) và thực tế không tan trong n-hexan [18].

1.1.2. Tác dụng dƣợc lý và dƣợc động học 1.1.2.1. Dược lý và cơ chế tác dụng Levetiracetam, dẫn xuất pyrolidin, là một thuốc chống co giật có cấu trúc hóa học không liên quan đến các thuốc điều trị động kinh khác hiện có. Cơ chế tác dụng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 4

của LEVET chưa được biết rõ. Ở động vật, LEVET không bảo vệ chống lại được cơn co giật đơn độc do dòng điện hoặc hóa chất. Thuốc chỉ bảo vệ rất ít kích thích

N

dưới mức tối đa và các test ngưỡng, nhưng bảo vệ được cơn co giật toàn thể thứ

H

Ơ

phát sau co giật cục bộ do hai hóa chất gây co giật tạo ra, có những đặc tính giống

N

như phức hợp co giật cục bộ thứ phát toàn thể ở người. LEVET cũng có đặc tính ức

TP

.Q

động kinh cục bộ phức hợp.

ẠO

LEVET không có ái lực với các thụ thể benzodiazepin, acid gama-aminobutyric

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

(GABA), glycin hay N-methyl-D-aspartat (NMDA). Thuốc tác dụng thông qua một

G

Đ

vị trí gắn đặc hiệu của mô não, đó là protein 2A của túi synap (protein SV2A). Sự

N

gắn kết này có thể hồi phục, bão hòa và có tính chất chọn lọc lập thể. LEVET chỉ

H Ư

gắn khu trú vào màng tế bào synap ở hệ TKTW mà không gắn vào các mô ngoại vi.

TR ẦN

LEVET ức chế sự bùng phát nhưng không ảnh hưởng tới kích thích thần kinh bình thường, vì thế thuốc ngăn ngừa có chọn lọc tính đồng bộ quá mức của sự bùng phát

10 00

1.1.2.2. Dược động học

B

dạng động kinh và sự lan truyền của cơn động kinh [2].

Khi dùng đường uống, thuốc nhanh chóng hấp thụ từ ống tiêu hóa với sinh khả

Ó

A

dụng xấp xỉ 100%, nồng độ tối đa trong máu thường đạt được trong vòng 1,3 giờ và

H

trạng thái cân bằng đạt được sau 2 ngày. Tỉ lệ thuốc liên kết protein huyết tương

-L

Í-

thấp, ít hơn 10%. Thể tích phân bố khoảng 0,7 lít/kg. Khoảng 25% liều dùng được

ÁN

hydroxy hóa thành chất chuyển hóa không có hoạt tính. LEVET không có ái lực cao

TO

với các CYP isoenzym và cũng không ức chế các isoenzym này. Khoảng 95% liều dùng được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng nguyên vẹn ban đầu và chất chuyển

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

chế ở mô hình chuột đã được làm giảm ngưỡng kích thích, tương tự người bị cơn

D

IỄ N

Đ

ÀN

hóa. Nửa đời thải trừ huyết tương của LEVET khoảng 6-8 giờ ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi, có thể ngắn hơn ở trẻ nhỏ. LEVET được bài xuất qua sữa mẹ, thuốc có

thể được thải trừ ra khỏi cơ thể nhờ thẩm tách máu [2].

1.1.3. Chỉ định - chống chỉ định 1.1.3.1. Chỉ định

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 5

Levetiracetam là một dẫn chất tương tự piracetam, được sử dụng trong điều trị động kinh. LEVET dùng phối hợp với các thuốc khác để:

N

- Điều trị cơn động kinh cục bộ, có hoặc không kết hợp với cơn động kinh

H

Ơ

toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ em từ 1 tháng tuổi trở lên.

N

- Điều trị cơn động kinh rung giật cơ ở người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên

em từ 12 tuổi trở lên bị bệnh động kinh toàn thể tiên phát.

TP

.Q

- Điều trị cơn động kinh toàn thể co cứng - co giật tiên phát ở người lớn và trẻ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Ngoài ra, LEVET có thể được sử dụng đơn độc trong điều trị cơn động kinh cục

G

Đ

bộ, có hoặc không kết hợp với cơn động kinh toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ

N

em từ 16 tuổi trở lên [2].

H Ư

1.1.3.2. Chống chỉ định

TR ẦN

Quá mẫn với LEVET hoặc các dẫn chất của pyrolidon [2].

1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trƣờng

B

Các chế phẩm LEVET trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng

10 00

250, 500, 750 hoặc 1000 mg; viên nén giải phóng kéo dài: 500, 750 mg; dung dịch uống 100 mg/mL (chai 150 mL, 300 mL); dung dịch pha truyền 100 mg/mL x 5 mL

Ó

A

[2]. Theo thống kê của Cục Quản lý dược và Tổng công ty dược Việt Nam hiện trên

H

thị trường dược phẩm Việt Nam có hơn 50 sản phẩm thuốc chứa hoạt chất LEVET,

-L

Í-

toàn bộ các sản phẩm này đều chưa có số liệu chứng minh TĐSH với thuốc biệt

ÁN

dược gốc Keppra do công ty U.C.B. Co., Ltd - Nhật Bản sản xuất [24].

TO

1.1.5. Các phƣơng pháp định lƣợng Levetiracetam

ÀN

Trong công thức cấu tạo của LEVET không có vòng thơm hay các nối đôi liên

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

bị bệnh động kinh rung giật cơ thiếu niên.

D

IỄ N

Đ

hợp, chỉ có một số dị tố (N, O), nên hấp thụ UV-VIS kém và không có phổ huỳnh quang. Do vậy, định lượng LEVET trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với

các detector phổ dụng như UV hoặc huỳnh quang gặp nhiều khó khăn. Hiện nay, để định lượng LEVET trong dịch sinh học đa số các tác giả sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS). Tuy vậy, phương pháp LCMS kỹ thuật phân tích phức tạp, thiết bị phân tích có giá trị kinh tế cao không phổ biến tại nhiều phòng thí

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 6

nghiệm ở nước ta. Do vậy, khó có thể áp dụng được. Một số phương pháp HPLC định lượng LEVET trong dịch sinh học đã được công bố tuy nhiên có độ nhạy

N

không cao, không áp dụng được cho các nghiên cứu SKD/TĐSH thuốc LEVET.

H

Ơ

Một số phương pháp định lượng LEVET trong HT người được trình bày ở Bảng

[16]

G

- Chuẩn nội: Lamivudin

ẠO

- Pha động: Acetonitril : nước, tỷ lệ 20 : 80

ethylacetat

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

.Q

lỏng - lỏng bằng - Cột Blue Orchid C18, 50 x 2 mm, 1,8 µm

TLTK

Đ

Chiết

Điều kiện sắc ký

TP

Phương pháp xử lý mẫu

H Ư

N

- Detector: MS Chiết SPE

- Cột C18, 100 x 3 mm, 1,8 µm

[13]

TR ẦN

- Pha động: Amoni acetat pH 3,2 : acetonitril, tỷ lệ 20 : 80

B

- Chuẩn nội: Chlonazepam

10 00

- Detector: MS

Tủa protein bằng acid - Cột Rp18, 5µm, 150 x 4,0 mm

[14]

Ó

A

perchloric và chiết lỏng - - Pha động: Acetonitril : dung dịch đệm

ÁN

-L

Í-

H

lỏng với cyclohexan

- Chuẩn nội: Không có - Detector: UV - Cột C8, 5 µm, 150 x 4,0 mm

[22]

TO

Tủa protein bằng MeOH,

KH2PO4 tỷ lệ 6 : 94

acid perchloric. Sau đó

phosphat chứa triethylamin, pH 6; tỷ lệ 6:5:89

chiết SPE.

- Chuẩn nội: Adenosin

D

IỄ N

Đ

ÀN

acetonitril, kẽm sulphat và - Pha động: MeOH : MeCN : dung dịch đệm

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT người

U Y

N

1.1.

- Detector: UV Nhận xét: -

Phương pháp 1 và 2: Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối với detector khối phổ (UPLC-MS) có độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn (thời

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 7

gian lưu của LEVET là 0,8 phút và IS là 1,2 phút) thích hợp cho các nghiên cứu DĐH của LEVET. Tuy nhiên phương pháp UPLC-MS hiện nay chỉ có

N

thể thực hiện được tại một số ít phòng thí nghiệm hiện đại vì thiết bị phức tạp

H

Ơ

và chi phí phân tích cao. Do thiết bị phân tích không phổ biến nên chúng tôi

N

không lựa chọn phương pháp này để định lượng LEVET trong HT người.

Phương pháp 3: Phân tích bằng HPLC với detector UV, quy trình xử lý tương

TP

.Q

đối phức tạp gồm 2 kỹ thuật tủa protein với acid và chiết lỏng - lỏng bằng cyclohexan. Tuy vậy, giới hạn định lượng của phương pháp không cao (1,0

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

µg/mL) không phù hợp để định lượng LEVET trong HT người tham gia các

G

Phương pháp 4: Phân tích bằng HPLC với detector UV, có giới hạn định

N

-

Đ

nghiên cứu SKD/TĐSH.

H Ư

lượng tốt (khoảng 0,1 µg/mL) tuy nhiên phương pháp xử lý mẫu rất phức tạp

TR ẦN

gồm hai bước tủa protein với hỗn hợp dung môi MeOH, acid perchloric và muối kẽm sulphat sau đó tiếp tục chiết SPE để loại tạp. Kỹ thuật chiết SPE có

B

chi phí cao khó áp dụng tạo các phòng thí nghiệm của nước ta.

10 00

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa của LEVET, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng LEVET trong

Ó

A

HT bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS bằng cách cải tiến các phương

H

pháp HPLC đã được công bố của các tác giả. Phương pháp xây dựng sử dụng chất

-L

Í-

nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp

ÁN

phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm

TO

nghiệm của Việt Nam.

ÀN

1.2. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

-

D

IỄ N

Đ

1.2.1. Khái niệm Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự

phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 8

nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: Hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [5], [7].

N

1.2.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

H

Ơ

1.2.2.1. Hệ thống bơm

N

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh được

TP

.Q

định, phù hợp với quá trình sắc ký.

1.2.2.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung

G

Đ

môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hòa

H Ư

N

tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí).

1.2.2.3. Bộ phận tiêm mẫu

TR ẦN

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay)

B

hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.

10 00

1.2.2.4. Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra

Ó

A

quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất,

H

chịu được áp suất cao tới vài trăm bar.

-L

Í-

Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký.

ÁN

Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm.

TO

1.2.2.5. Bộ phận phát hiện

ÀN

Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tùy theo bản chất của các chất cần phân

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

áp suất (thường 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn

D

IỄ N

Đ

tích mà sử dụng detector thích hợp, hiện nay có các loại detector sau: Detector hấp thụ UV-VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [5], [7].

1.2.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 1.2.3.1. Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR *Thời gian lưu (tR): Là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detertor và cho píc trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 9

của píc. Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ, với một chất nhất định tR là một hằng số khi tiến hành nhiều lần sắc ký trong cùng điều kiện.

N

Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực

H

Ơ

(tR’), được tính bằng công thức sau:

TP

.Q

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì píc bị loãng, thời gian phân tích kéo dài.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

* Thể tích lưu (VR): Thể tích lưu (VR) là thể tích dung môi đi qua cột cần để di

G

Đ

chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho píc trên sắc ký đồ.

N

VR= tR×Fc

H Ư

Với: Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian. khi ra khỏi hệ thống [5], [7].

B

1.2.3.2. Hệ số phân bố K

TR ẦN

Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến

10 00

Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung

Ó

CS CM

H

k

A

bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.

-L

Í-

Trong đó: CS và CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động.

ÁN

Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất

TO

pha tĩnh và nhiệt độ cột.Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [5].

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Với: tM là thời gian lưu của 1 chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh.

U Y

N

tR’ = tR - tM.

D

IỄ N

Đ

ÀN

1.2.3.3. Hệ số dung lượng k’ Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha

và được tính theo sức chứa của cột:

k'  k 

vS Qs t t t'   R  R 0 vR QM t '0 t0

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 10

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. Trong phân tích thường chọn cột, pha động

N

và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤ k ’≤8 [5], [7].

H

Ơ

1.2.3.4. Hệ số chọn lọc α

N

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số

ẠO

TP

.Q

K A k A' t( R ) A  tM    K B kB' t( R ) B  tM

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Qui ước: Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α >1. Để tách riêng 2

G

chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [5], [7].

H Ư

W 2a

TR ẦN

F

N

1.2.3.5. Hệ số đối xứng của píc F

Trong đó:

B

W: Chiều rộng của píc đo ở 1/20 chiều cao của píc.

10 00

a: Khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh píc đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao píc [5], [7].

Ó

A

1.2.3.6. Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Í-

H

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:

tR 2 tR 2 ] ] hay N  5,54[ W W 1

ÁN

-L

N  16[

2

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

Trong đó:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

chọn lọc α :

W1/2: Chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của đỉnh píc.

W: Chiều rộng của píc đo ở đáy píc [5], [7].

1.2.3.7.Độ phân giải Rs của cột Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) N  16[

1.18.(t( R ) A  t( R ) B ) tR 2 t ] N  5,54[ R ]2 hoặc Rs  W W1 W1 2 A  W1 2 B 2

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 11

Trong đó: t(R)A, t(R)B : Thời gian lưu của 2 píc liền kề nhau (A và B).

N

WA; WB: Độ rộng píc đo ở các đáy píc. W1/2A; W1/2B: Độ rộng píc đo ở nửa chiều

H

Ơ

cao píc. Yêu cầu: Rs > 1, giá trị Rs tối ưu ≥ 1,5 [5], [7].

N

1.2.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

TP

.Q

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của

ẠO

một hỗn hợp nhiều chất. Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

chia thành 2 loại:

G

Đ

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích

N

thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực.

TR ẦN

là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực.

H Ư

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền

B

hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon. Trong sắc ký hấp phụ pha

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

đảo: Pha tĩnh trên nền silica (Hình 1.2) có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất.

Hình 1.2. Gốc siloxan

Đ IỄ N D

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan: - R là các nhóm phân cực (ưa nước): Nhóm -OH hoặc các alkylamin -CH2-NH2, alkyl nitril - CH2-CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [15].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 12

- Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng

mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng phenyl. Do các nhóm -OH thân

H

Ơ

nước được thay thế bằng các gốc -R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica

N

cách alkyl hóa các nhóm -OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl (-R) của

cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [5].

TP

.Q

Tuy vậy do hiệu ứng lập thể nên những nhóm -OH tự do chưa được thay thế trong cấu trúc của pha tĩnh có thể gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

theo môi trường pH phân tích. Trong môi trường acid mạnh, pH < 2 thì có sự phân

G

Đ

ly các nhóm ether ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân

N

tích không thể tương tác với cột. Trong môi trường base (pH>7), các nhóm -OH

H Ư

trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base. Tương tác này khác với kiểu tương

TR ẦN

tác của chất tan với nhóm -SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi làm cho việc tích phân tính

B

diện tích hay chiều cao píc có độ chính xác không cao. Một trong những cách khắc

10 00

phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm -OH này. Cấu trúc pha

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

liên kết của cột LC-DB được trình bày ở hình 1.3.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân

Hình 1.3. Cấu trúc pha tĩnh cột LC-DB Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm -OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm -OH, được trình bày ở hình 1.4:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

N

H

Ơ

N

13

.Q

Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực

TP

để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

với những hợp chất phân cực mạnh [5] [7] [15].

Đ

1.3.4.2. Lựa chọn pha động cho HPLC

N

G

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố

H Ư

thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp. Trong sắc ký pha đảo, pha

TR ẦN

động là dung môi phân cực như: Nước, methanol, acetonitril… hoặc hỗn hợp của chúng. Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.

B

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như:

10 00

Độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng của đáy píc… nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng.

Ó

A

+ Yêu cầu của 1 pha động

H

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.

-L

Í-

- Hòa tan được chất cần phân tích.

ÁN

- Có độ tinh khiết cao.

- Nhanh đạt trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký.

TO

- Có tính kinh tế và không gây ô nhiễm môi trường.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Hình 1.4.Cấu trúc cột có gốc Isopropyl

D

IỄ N

Đ

ÀN

+ Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả - Bản chất của dung môi để pha pha động.

- Thành phần các chất trong pha động.

- pH của pha động.

- Tốc độ dòng của pha động.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 14

+ Chọn đệm - pH: Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH

N

thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.

H

Ơ

+Tốc độ dòng của pha động: Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng

N

hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách

TP

1.3.4.3. Lựa chọn Detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển thành

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

tín hiệu và được ghi trên SKĐ. Detector phổ biến nhất là detector UV - VIS. Tùy

H Ư

1.2.5.1. Cách đánh giá píc

N

1.2.5. Phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC

G

Đ

theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau [15].

TR ẦN

- Đánh giá diện tích píc: Để tính diện tích píc có thể dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẵn chương trình.

B

- Đánh giá chiều cao của píc với điều kiện các chỉ số k’ là hằng định. Đo chiều

10 00

cao của píc chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu thử từ thấp đến trung bình.

1.2.5.2. Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Ó

A

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng

H

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó.

-L

Í-

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: Phương pháp

ÁN

chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp

TO

chuẩn hóa diện tích. Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương. Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

U Y

các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [15].

D

IỄ N

Đ

ÀN

nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể

gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp. + Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 15

+ Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn: - Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian

N

lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.

H

Ơ

- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử.

N

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.

TP

.Q

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.

Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là: Chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

hóa nhiều điểm. Để chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu

G

Đ

có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng

H Ư

N

nhau.Tiến hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hay chiều cao) píc của chất chuẩn với chuẩn nội (SS/SIS) tìm ra nồng độ chất thử [5], [7].

TR ẦN

so với tỷ số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (CS/CIS). Dựa vào đường chuẩn để

B

1.3. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC

10 00

1.3.1. Khái niệm

Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng

Ó

A

nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để

H

đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm

-L

Í-

chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực

ÁN

hiện phân tích những mẫu được khảo sát.

TO

Phân tích dược chất trong dịch sinh học là cơ sở để đánh giá SKD và TĐSH trực tiếp và chính xác nhất. Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp là các chất chất nội

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.

D

IỄ N

Đ

ÀN

sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp. Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [11], [19].

1.3.2. Các chỉ tiêu thẩm định Nội dung thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các thẩm định phương

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 16

pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA [20] [25].

1.3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu

N

Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần

H

Ơ

phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác.

N

Nói cách khác, tính chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể nhận

TP

.Q

quả phải thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng, chất cần phân tích phân tách hoàn toàn với các píc tạp.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Tính chọn lọc - đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên SKĐ cho các

G

Đ

đáp ứng píc thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:

N

- Píc của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được

H Ư

hoàn toàn khỏi píc tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi T ≤ 2,0; độ phân giải

TR ẦN

(Rs) giữa píc của chất phân tích, píc IS với píc gần nhất phải lớn hơn 1,5.

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng píc của từng

B

mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng.

10 00

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng píc của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng.

Ó

A

1.3.2.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

H

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của píc (diện tích hay

-L

Í-

chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này phải

ÁN

được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi

TO

quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất).

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

diện “chất cần phân tích” và không bị “nhầm lẫn” bởi các chất khác. Do vậy, kết

D

IỄ N

Đ

ÀN

chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Đường chuẩn gồm: 1 mẫu trắng (dịch sinh học không có chuẩn và IS).

1 mẫu zero (dịch sinh học có chuẩn nội, không có chuẩn).

6 mẫu non-zero (dịch sinh học có bổ sung chuẩn và IS) có nồng độ chất chuẩn

pha trong cùng một mẫu dịch sinh học, bao phủ toàn bộ dãy nồng độ mong muốn.

Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 17

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp

N

bình phương tối thiểu). Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải

H

Ơ

tuyến tính và có hệ số R2 ≥ 0,98 và phải đáp ứng các điều kiện sau:

N

- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85-115%, trừ tại điểm

TP

.Q

- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Có hệ số tương quan r ≥ 0,99.

G

Đ

1.3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

N

LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ

TR ẦN

đúng và độ chính xác của phương pháp.

H Ư

đúng và độ chính xác chấp nhận được. Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ Mẫu được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn: Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải

B

bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng. Píc của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm

10 00

tách riêng và có thể tái lập với độ đúng từ 80 - 120%.

1.3.2.4. Độ đúng - độ chính xác

Ó

A

* Độ đúng (accuracy): Độ đúng của phương pháp phân tích là mức độ gần sát

H

của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết. Giá trị này phải nằm trong

-L

Í-

khoảng 85 - 115% và 80 - 120% đối với điểm gần giới hạn định lượng dưới.

ÁN

* Độ chính xác (precision): Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ

TO

thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

LLOQ được chấp nhận 80% -120%.

D

IỄ N

Đ

ÀN

ngày và độ lặp lại khác ngày, được biểu thị bằng giá trị của hệ số biến thiên CV(%).

Trong đánh giá TĐSH, độ chính xác của phương pháp bao gồm độ lặp lại

(repeatability) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác ngày) và độ tái lặp (reproducibility). Phương pháp xác định độ lặp lại là thực hiện phân tích trên một mẫu thử đồng nhất n lần (n ≥ 5) cùng một lúc và trong cùng một thời điểm hoặc khác ngày. Xác định độ hệ số biến thiên CV giữa các lần thử. Yêu cầu CV ≤ 15%,

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 18

riêng điểm gần giới hạn định lượng dưới cho phép CV ≤ 20%.

1.3.2.5. Tỷ lệ thu hồi

N

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui

H

Ơ

trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách được

N

pha trong dung môi phù hợp (thường sử dụng dung môi pha động). Về mặt lý

TP

.Q

giá tỷ lệ thu hồi đặc biệt với các trường hợp xử lý mẫu bằng chiết lỏng - lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE). Để xác định tỷ lệ thu hồi của phương pháp nên tiến hành trên 3

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

mẫu có nồng độ nằm trong khoảng đường chuẩn đã khảo sát, mỗi nồng độ tiến hành

G

Đ

ít nhất 3 lần. Tỷ lệ thu hồi không nên vượt quá 110% và không nên quá thấp; giá trị

H Ư

N

CV < 15% đối với mỗi nồng độ và tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15%.

TR ẦN

1.3.2.6. Độ ổn định

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc xử

B

lý, phân tích và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian

10 00

dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử. Do đó trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định sau:

Ó

A

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở điều

Í-

H

kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày, độ ổn định của dung

-L

dịch pha loãng (nếu có).

ÁN

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

TO

+ Độ ổn định sau 3 chu kì đông - rã đông.

D

IỄ N

Đ

ÀN

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

thuyết, chỉ tiêu này không bắt buộc phải đánh giá. Tuy nhiên, nên tiến hành đánh

khi đã xử lý (chiết tách). + Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định. + Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler): Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo quản ở điều kiện

lạnh ( thường ở -2 đến -8°C) [11] [19] [20].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 19

CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ - NỘI DUNG

H N

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

Ơ

N

VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

U Y

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

TP

trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3.

ẠO

Chuẩn

Chuẩn nội

Tên chất chuẩn

Levetiracetam

Hàm lượng (%)

99,27 (nguyên trạng)

Số kiểm soát

QT183030715

0208019

Nơi sản xuất

VKNTTPHCM

VKNTTW

Paracetamol 99,90

H Ư

N

G

Đ

Nội dung

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Độ tinh khiết

Nơi sản xuất

HPLC

Merck, Đức

HPLC

Merck, Đức

P.A

Merck, Đức

Cloroform

P.A

Merck, Đức

Í-

B

Hóa chất

P.A

Scharlau, Tây Ban Nha

10 00

Acetonitril Methanol

H

Ó

A

Kali dihydrogenphosphat

-L

Amoniac

ÁN

Bảng 2.3. Các mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu Nơi cung cấp

Hạn dùng

Bảo quản

Viện huyết học - truyền máu TW

12/05/2016

-35ºC ± 5ºC

15P007471

Viện huyết học - truyền máu TW

12/05/2016

-35ºC ± 5ºC

15P007333

Viện huyết học - truyền máu TW

12/05/2016

-35ºC ± 5ºC

15P007334

Viện huyết học - truyền máu TW

12/05/2016

-35ºC ± 5ºC

TO

Lô

D

IỄ N

Đ

ÀN

15P007308

15P007315

Viện huyết học - truyền máu TW

12/05/2016

-35ºC ± 5ºC

15P011075

Viện huyết học - truyền máu TW

02/06/2016

-35ºC ± 5ºC

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 20

2.1.2. Dụng cụ, máy móc, thiết bị Các dụng cụ, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.

Nhà sản xuất

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Shimadzu, Nhật

Cân phân tích

Sartorius-CP224S, Đức

Cân kỹ thuật

Sartorius, Đức

Máy lắc xoáy

Velp, Ý

G N H Ư

Micropipet

Eppendorf, Đức SUPLECO, Mỹ

TR ẦN

Ống chiết thủy tinh 15mL

Phenomenex, Đức Isolab, Đức

10 00

B

Cột sắc ký

Sigma 4-16K, Đức

EM Hirschmann, Đức

Pipet class A

A

Nhà sản xuất

Model

Bơm

Shimadzu

LC-20AD

Autosampler

Shimadzu

SIL-20AC HT

Detector

Shimadzu

SPD-M20A

Buồng ổn nhiệt cột

Shimadzu

CTO-10ASVP

Phần mềm điều khiển và xử lý kết

Shimadzu

LC solution

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

Bộ phận

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Đ

Sigma 2-16K, Đức

Máy ly tâm

Bảng 2.5.Thiết bị HPLC

N

U Y

.Q

TP

ẠO

GFL, Đức

Máy ly tâm

Bình định mức

H

Tên thiết bị

Máy lắc cơ học ngang

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Ơ

N

Bảng 2.4. Các thiết bị đã dùng trong nghiên cứu

D

IỄ N

Đ

ÀN

quả 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng phƣơng pháp HPLC định lƣợng LEVET trong huyết tƣơng - Quy trình chiết tách LEVET: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng lỏng, tủa protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu huyết tương tự

tạo chứa LEVET để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 21

- Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm, đảm bảo phân tách LEVET khỏi các thành phần tạp có trong mẫu, cho phép xác định

N

được lượng LEVET trong mẫu với độ đúng độ chính xác đáp ứng các quy định của

H

Ơ

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp phân tích thuốc trong dịch

N

sinh học [19], [20].

TP

.Q

Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát, theo 6

ẠO

chỉ tiêu như trong hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

học [19].

H Ư

- Giới hạn định lượng dưới.

N

- Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính.

G

Đ

- Tính đặc hiệu/chọn lọc.

- Tỷ lệ thu hồi.

B

- Độ ổn định huyết tương.

TR ẦN

- Độ đúng, độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày.

10 00

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chuẩn bị mẫu huyết tƣơng tự tạo chứa LEVET

Ó

A

2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc

H

- Dung dịch chuẩn gốc để pha đường chuẩn (CCA): Cân chính xác khoảng 25 mg

-L

Í-

chất chuẩn LEVET, hòa tan trong nước, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ

ÁN

LEVET khoảng 250 µg/mL.

TO

- Dung dịch chuẩn gốc để pha mẫu kiểm tra (QCA): Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn LEVET, hòa tan trong nươc, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

2.2.2. Thẩm định phƣơng pháp phân tích

D

IỄ N

Đ

ÀN

độ LEVET khoảng 250 µg/mL. - Dung dịch chuẩn nội gốc: Hòa tan chất chuẩn paracetamol trong MeOH để thu

được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 500 µg/mL. 2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu đường chuẩn Từ dung dịch chuẩn gốc CCA chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc WSS-CC2 và WSS-CC1 trong huyết tương có nồng độ LEVET tương ứng là 2,5 và 25 µg/mL.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 22

Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng, 01 mẫu HT trắng (BLK) có Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn (CC) trong HT được

H

Ơ

trình bày ở bảng 2.6

S3

S4

S5

S6

0,25

0,5

1,0

2,5

5,0

.Q

1000 1000 900

800

600

0

800

600

300

-

-

200

400

700 1000

-

-

-

-

-

-

V WSS-CC2 (µL)

-

-

100

200

0

Đ

V WSS-CC1 (µL)

10,0 17,5 25,0

TP

-

S8

G

400 1000

-

H Ư

N

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

-

S7

2.3.1.3. Chuẩn bị mẫu kiểm tra

TR ẦN

- Từ dung dịch QCA, pha các dung dịch chuẩn làm việc WSS-QC2 và WSS-QC1 trong HT có nồng độ LEVET tương ứng là 2,5 và 25,0 µg/mL.

B

- Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra (QC) trong HT được trình

10 00

bày ở bảng 2.7.

Bảng 2.7. Cách chuẩn bị mẫu QC trong HT V HT trắng(µL)

V WSS-QC1 (µL)

V WSS-QC2 (µL)

0,75

700

-

300

12,5

500

500

-

20,0

200

800

-

A

Nồng độ (µg/mL)

Ó

Mẫu

Í-

ÁN

HQC

-L

MQC

H

LQC

TO

2.3.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích

-

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

S2

Nồng độ (µg/mL) VHT trắng (µL)

U Y

S1

ẠO

BLK Zero

N

Bảng 2.6. Cách chuẩn bị mẫu đường chuẩn trong HT. Mẫu

N

thêm chuẩn nội (zero) và 08 mẫu HT có pha chuẩn LEVET.

D

IỄ N

Đ

ÀN

2.3.2.1. Xác định điều kiện sắc ký Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu

detector DAD, với các điều kiện sắc ký khác nhau như: - Lựa chọn bước sóng phát hiện - Lựa chọn pha động - Lựa chọn chất chuẩn nội - Lựa chọn tốc độ dòng

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 23

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng LEVET trong HT bằng phương pháp HPLC với detector PDA.

N

2.3.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương

H

Ơ

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết

N

tách LEVET từ huyết tương trên các mẫu chuẩn LEVET hòa tan trong huyết tương

TP

.Q

- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: Acetonitril

ẠO

(MeCN); methanol (MeOH) hoặc tác nhân gây tủa là acid như: acid percloric 20%.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: dietyleter, cloroform,

G

Đ

diclorometan và hỗn hợp dung môi dietyleter : Cloroform, diclorometan với các tỷ

H Ư

2.3.3.1. Độ chọn lọc - đặc hiệu

TR ẦN

2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích

N

lệ khác nhau.

Tiến hành chuẩn bị các mẫu: 06 mẫu HT trắng có nguồn gốc khác nhau, 06 mẫu

B

chuẩn có chứa IS và chuẩn LEVET ở nồng độ LLOQ (0,25 µg/mL) trong từng

10 00

nguồn mẫu HT trắng phía trên. Phân tích các mẫu trên theo qui trình thẩm định. Ghi lại sắc ký đồ, thông số píc và đáp ứng píc.

Ó

A

- Yêu cầu:

H

+ Píc của LEVET và IS cân đối, hệ số kéo đuôi T ≤ 2;

-L

Í-

+ Píc của LEVET và IS được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các píc tạp

ÁN

có trong mẫu, độ phân giải với píc gần nhất lớn hơn hoặc bằng 1,5;

TO

+ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của LEVET, đáp ứng píc của từng mẫu

D

IỄ N

Đ

ÀN

LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng;

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

trắng bằng các phương pháp như:

+ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng píc của từng mẫu LLOQ

phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng; 2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính - Tiến hành khảo sát khoảng nồng độ từ 0,25 µg/mL đến 25,0 µg/mL với 8 mẫu chuẩn có nồng độ cụ thể như sau: 0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,5 - 5,0 - 10,0 - 17,5 và 25,0 µg/mL. Chuẩn bị 05 đường chuẩn riêng biệt. Xử lý và phân tích theo qui trình thẩm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 24

định. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng píc.

- Xác định độ đúng của từng mẫu chuẩn.

N

2.3.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

H

Ơ

Chuẩn bị các mẫu sau: 6 mẫu HT trắng; 6 mẫu HT trắng có pha IS và LEVET ở

U Y

N

nồng độ 0,25 µg/mL và 01 đường chuẩn trong HT. Xử lý và phân tích các mẫu trên

TP

.Q

đúng và độ chính xác của các mẫu LLOQ.

ẠO

- Yêu cầu:

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

+ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của LEVET, đáp ứng píc trung bình của

G

Đ

mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng píc trung bình của mẫu trắng;

H Ư

N

+ Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80% - 120% so với nồng độ thực.

2.3.3.4. Độ đúng, độ chính xác

TR ẦN

+ Độ chính xác phải nhỏ hơn hoặc bằng 20%. * Độ đúng, độ chính xác trong ngày

B

Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương có nồng độ được xác định như trong

10 00

bảng dưới đây, mỗi lô 6 mẫu độc lập.

Mã

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

LQC

Khoảng nồng độ ≤ 3 x LLOQ

Í-

H

Mẫu

Ó

A

Bảng 2.8. Chuẩn bị mẫu QC xác định độ đúng

-L

Mẫu kiểm tra nồng độ MQC Gần điểm giữa của đường

ÁN

trung bình

TO

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

Giá trị (µg/mL) 7,5 12,5

chuẩn HQC

70% - 80% ULOQ

20,0

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

theo quy trình thẩm định. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng píc. Xác định nồng độ, độ

ÀN

Tiến hành chạy sắc ký các mẫu trên. Ghi lại săc ký đồ và đáp ứng píc. Dựa theo

D

IỄ N

Đ

đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu QC. Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh

nồng độ phân tích được với nồng độ thực có trong mẫu. Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính độ lệch CV% giữa các nồng độ phân tích được của mỗi lô trong mẫu QC được phân tích trong cùng một ngày.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 25

- Yêu cầu: + Độ đúng trung bình ứng với mỗi mức nồng độ QC phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%;

N

+ Độ lặp lại giữa các nồng độ phân tích được ứng với mỗi mức nồng độ QC có

Ơ

giá trị CV% ≤ 15%.

TR ẦN

H Ư

N

Chuẩn bị các lô mẫu QC (LQC, MQC, HQC) mỗi lô mẫu gồm ít nhất 6 mẫu độc lập. Chiết tách, phân tích, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng píc. Song song tiến hành với các lô mẫu QC trong pha động hoặc dung môi pha mẫu có nồng độ tương ứng.

Xác định tỷ lệ thu hồi của LEVET và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của

B

LEVET và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học với đáp ứng của LEVET

10 00

và IS trong mẫu QC pha trong dung môi pha mẫu.

-L

Í-

H

Ó

A

Tỷ lệ thu hồi được tính theo công thức :

ÁN

- Yêu cầu : +Tỷ lệ thu hồi giữa các nồng độ không khác nhau quá  15%.

TO

+ Giá trị CV% giữa các đáp ứng của chất phân tích và chuẩn nội trong các mẫu

D

IỄ N

Đ

ÀN

QC không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 5%.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

* Độ chính xác khác ngày Tiến hành đánh giá độ đúng, độ chính xác của phương pháp tương tự phần độ đúng, độ chính xác trong ngày. Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV% giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.

- Yêu cầu: Độ lặp lại giữa các giá trị độ đúng của các ngày phân tích ở mỗi nồng độ QC có giá trị CV% ≤ 15%.

2.3.3.5. Tỷ lệ thu hồi

+ Giá trị CV% giữa các đáp ứng của chất phân tích và chuẩn nội trong các mẫu

QC có qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%.

2.3.3.6. Độ ổn định * Độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn Phân tích, so sánh diện tích píc của dung dịch IS làm việc sau khi để ở nhiệt độ phòng 6 giờ với diện tích píc của dung dịch mới pha. Dung dịch IS được coi là ổn

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 26

định nếu độ lệch giữa diện tích píc trung bìnhcủa dung dịch sau bảo quản so với diện tích píctrung bình của dung dịch mới pha nhỏ hơn hoặc bằng 2%. Giá trị

N

CV(%) giữa các kết quả định lượng tại từng thời điểm phải ≤ 2%.

H

Ơ

*Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn

N

Phân tích, so sánh diện tích píc của dung dịch chuẩn gốc sau khi để ở nhiệt độ

TP

.Q

tương ứng. Dung dịch chuẩn gốc được coi là ổn định nếu độ lệch giữa diện tích píc trung bình của dung dịch sau bảo quản so với diện tích píc trung bình của dung dịch

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

mới pha nhỏ hơn hoặc bằng 2%. Giá trị CV(%) giữa các kết quả định lượng tại từng

G

Đ

thời điểm phải ≤ 2%.

N

* Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày

H Ư

Phân tích và so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở nhiệt độ 2ºC -

TR ẦN

8ºC sau 8 ngày và 17 ngày so với nồng độ của dung dịch ban đầu. Dung dịch chuẩn gốc được coi là ổn định nếu độ lệch giữa nồng độ trung bình của dung dịch sau bảo

B

quản so với nồng độ trung bình của dung dịch mới pha nhỏ hơn hoặc bằng 2%. Giá

10 00

trị CV(%) giữa các kết quả định lượng tại từng thời điểm phải ≤ 2%. * Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

Ó

A

Khảo sát độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và

H

HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35°C ± 5°C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau

-L

Í-

khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 - 24 giờ. Lặp lại chu kì

ÁN

đông - rã 2 lần nữa. Sau 3 chu kỳ đông - rã, tiến hành phân tích xác định nồng

TO

độLEVET có trong mẫu. So sánh với kết quả xác định nồng độ LEVET có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha. Nồng độ LEVET trong mẫu sau 3 chu kỳ

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

phòng một thời gian nhất định (4 giờ) với diện tích píc của dung dịch mới pha

D

IỄ N

Đ

ÀN

đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%. * Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 6 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông. Nồng độ LEVET trong mẫu được xử lý sau khi

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 27

bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng

N

độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.

H

Ơ

* Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

N

Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35°C ± 5°C,

TP

.Q

định khoảng sau 30, 45, 60 ngày. So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu. Nồng độ LEVET trong mẫu sau

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá

G

Đ

15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độphải nhỏ hơn hoặc

N

bằng 15%.

H Ư

*Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

TR ẦN

Chuẩn bị các lô mẫu LQCS và HQCS như bảng 2.8, bao gồm ít nhất 5 mẫu LQCS và HQCS. Xử lý, tiêm sắc ký ngay các mẫu đó để xác định nồng độ trung

B

bình ban đầu. Bảo quản trong autosampler sau một thời gian xác định (khoảng 24

10 00

giờ), tiến hành tiêm lại các mẫu trên để xác định nồng độ trung bình sau bảo quản.

Nồng độ trung bình mẫu tiêm sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-

Ó

A

sampler sai khác với nồng độ trung bình mẫu tiêm ngay sau khi xử lý không quá

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

15% và giá trị CV% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ QCS phải ≤15%.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 28

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ơ

N

3.1. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG LEVET TRONG HT

H

3.1.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn

U Y

N

Qua tham khảo các tài liệu và điều kiện sẵn có pha tĩnh, chúng tôi tiến hành khảo

TP

lệ pha động và sao cho píc của hoạt chất được tách rõ ràng, cân đối, đồng thời có

ẠO

thời gian phân tích phù hợp.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

3.1.1.1. Bước sóng phát hiện

G

Quét phổ hấp thụ của mẫu chuẩn LEVET dung dịch trong MeOH, ta được phổ

H Ư

N

của LEVET như hình 3.1 sau: mAU 9.15/ 1.00

TR ẦN

7 6

10 00

B

5 4

Ó

A

3

665 540

565

477

ÁN

0

263

Í-

-L

1

H

2

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

-1

200

300

400

500

600

700

nm

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

sát điều kiện sắc ký về bước sóng phát hiện, cột sắc ký, nội chuẩn và thành phần, tỉ

Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS của LEVET

Dựa vào phổ hấp thụ của LEVET ở trên, không xuất hiện cực đại hấp thụ của

LEVET trong khoảng bước sóng từ 200 nm. Do đó, kết hợp tham khảo một số tài liệu về phương pháp định lượng LEVET và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn bước sóng tiến hành chạy sắc ký là λ = 210 nm. Qua quá trình khảo sát điều kiện sắc ký, nhận thấy mẫu chuẩn đáp ứng tốt tại bước sóng λ = 210 nm.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 29

3.1.1.2. Lựa chọn cột sắc ký Tiến hành phân tích trên hệ sắc ký pha đảo: Chất phân tích ít phân cực và pha

N

động phân cực. Trong hai loại cột pha đảo thường được sử dụng là cột C8 và C18

H

Ơ

thì cột C8 phân cực hơn so với cột C18 ảnh hưởng đến khả năng phân tách LEVET

N

khỏi các thành phần tạp chất do vậy ít được sử dụng hơn. Kết hợp tham khảo một số

TP

.Q

sắc ký cột Phenomenex, C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm kết quả thực nghiệm thấy cột

ẠO

C18 có khả năng tách tốt và chọn lọc LEVET ra khỏi mẫu phân tích.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

3.1.1.3. Lựa chọn IS

G

Đ

Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất, và các chuẩn sẵn có ở

H Ư

N

phòng thí nghiệm chúng tôi khảo sát một số chất làm nội chuẩn như: paracetamol,

H -L

ÁN

0

2.5

5.0

7.5

min

0.0

2.5

5.0

7.5

min

Hình 3.2. SKĐ LEVET và nội chuẩn

Hình 3.3. SKĐ LEVET và nội chuẩn

Amoxicillin

atenolol

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

-25

0.0

/9.564

25

Í-

50

0

50

Ó

75

100

75

A

100

mAU 210nm,4nm (1.00)

IS/8.454

125

25

B

10 00

150

IS/8.760

Levetiracetam/5.851

175

mAU 210nm,4nm (1.00)

TR ẦN

Kết quả thu được các SKĐ như sau:

Levetiracetam/5.747

amoxicillin, atenolol.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

tài liệu định lượng LEVET trong dịch sinh học, chúng tôi tiến hành khảo sát trên cột

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 30

/7.673

mAU 210nm,4nm (1.00)

H

Ơ

100

N

/9.121

125

.Q

50

TP

25

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

0

2.5

5.0

7.5

10.0

G

0.0

Đ

-25

12.5

min

H Ư

N

Hình 3.4. SKĐ LEVET và nội chuẩn paracetamol Nhận xét:

TR ẦN

- Hình 3.2: Píc của LEVET dính với píc tạp. Vì vậy nếu muốn tách píc tạp cần tăng tỷ lệ đệm của pha động, như vậy sẽ làm thời gian lưu kéo dài và thời gian phân

10 00

B

tích lâu. Nên chúng tôi không lựa chọn amoxicillin làm nội chuẩn.

- Hình 3.3: Píc của LEVET bị kéo đuôi và píc của IS thấp. Nên chúng tôi không

A

lựa chọn atenolol làm nội chuẩn.

H

Ó

- Hình 3.4: Píc của LEVET và IS cân đối, tách tốt, nền sạch. Nên chúng tôi lựa

Í-

chọn paracetamol làm chuẩn nội để tiến hành nghiên cứu tiếp.

-L

3.1.1.4. Lựa chọn pha động và tốc độ dòng

ÁN

Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi bước đầu lựa chọn pha động gồm 2 thành

TO

phần chính: acetonitril và dung dịch đệm KH2PO4 0,05M pH = 6,8.

ÀN

Đệm KH2PO4 được pha như sau: Cân 6,8 g KH2PO4 hòa tan trong 1 lít nước,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

75

D

IỄ N

Đ

điều chỉnh về pH 6,8 ± 0,05 bằng dung dịch KOH. Để lựa chọn được hệ pha động phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát lần lượt các

hệ sắc ký: Sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) ổn định ở nhiệt độ 40ºC, tốc độ dòng 1,5 mL, bước sóng 210 nm, thể tích tiêm 50 µL và pha động có tỷ lệ 2 thành phần CAN, dung dịch đệm KH2PO4 thay đổi trong khoảng từ 15 : 85 đến 4 : 96 (tt/tt). Kết quả như sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 31

- Tỷ lệ acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (15:85): Thời gian lưu của 2 píc ngắn. Píc của LEVET và IS đều cân đối, không kéo đuôi tuy nhiên 2 píc lại dính sát

N

nhau (hình 3.5).

H

Ơ

mAU 210nm,4nm (1.00)

N

350

.Q

250

TP

200 150

ẠO

100

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

50

G

0

-100 -150 0.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

min

TR ẦN

1.0

H Ư

N

-50

Hình 3.5. SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 15 : 85 (tt/tt)

10 00

B

-Tỷ lệ acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (6:94): Píc của LEVET và IS tách tốt, píc cân đối, không kéo đuôi. Thời gian lưu của các pic hợp lý (hình 3.6).

Ó

A

/7.673

mAU 210nm,4nm (1.00)

/9.121

H

125

-L

Í-

100

50

25

0

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

75

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

300

-25 0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

min

Hình 3.6. SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET với pha động: acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 6 : 94 (tt/tt) - Tỷ lệ acetonitril : dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (4:96): Píc của LEVET và IS

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 32

tách tốt, píc cao, cân đối, không kéo đuôi. Tuy nhiên thời gian lưu quá dài.

H

Ơ

/16.544

100

N U Y

N

75

.Q

50

TP

25

ẠO

-25 5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

G

2.5

min

N

0.0

H Ư

Hình 3.7. SKĐ phân tích mẫu chuẩn LEVET

TR ẦN

với pha động: acetonitril - dung dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 4 : 96 (tt/tt) Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký phân tích LEVET trong HT bằng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) với hệ pha động: acetonitril – dung

10 00

B

dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 6 : 94.

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện tách chiết Levetiracetam

A

Tiến hành xử lý mẫu bằng các phương pháp tủa protein và chiết lỏng - lỏng thu

H

Ó

được kết quả như sau:

Í-

- Tủa protein bằng acetonitril: Píc của LEVET thấp, không cân đối, dễ lẫn với píc

/3.059 /3.347

mAU 200nm,4nm (1.00) 175 150 125

50 25 0

/8.729

Levetiracetam/6.617

75

/7.633

100

/5.549

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

tạp (hình 3.8)

IỄ N D

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

0

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

125

/13.612

mAU 210nm,4nm (1.00)

-25 0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0 min

Hình 3.8. SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng ACN.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 33

- Tủa protein bằng acid percloric: Nền mẫu nhiều tạp, pic LEVET không tách khỏi các thành phần tạp trong mẫu (hình 3.9)

N

mAU 200nm4nm (1.00)

Ơ

1750

H

1500

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

U Y .Q TP

/8.501

8.0

min

G

Hình 3.9. SKĐ mẫu HT sau khi tủa protein bằng acid HClO4.

H Ư

N

- Chiết bằng cloroform: Píc của LEVET tách tốt, píc cân đối, píc tạp ít, đáp ứng

25

/6.561

/5.804

H

Ó

0

/5.096

/2.911 /3.230

A

5

/5.442

10

10 00

15

B

20

/8.651 /8.928

mAU 200nm4nm (1.00)

Levetiracetam/7.389

TR ẦN

được yêu cầu của nghiên cứu (hình 3.10)

-L

Í-

-5

0.0

2.5

5.0

7.5

min

ÁN

Hình 3.10. SKĐ mẫu HT sau khi chiết lỏng – lỏng với cloroform.

TO

Qua quá trình khảo sát, nhận thấy khi chiết mẫu HT bằng cloroform, LEVET được tách tốt, lượng tạp ít và píc của LEVET trên SKĐ đáp ứng được yêu cầu của

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

1.0

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

-250 0.0

/9.050

/7.082

0

ẠO

250

/5.340 /5.523 /5.848 /6.107

/3.134 /3.210

500

Levetiracetam/7.617

/2.912

750

/6.490

1000

/3.296 /3.500

N

1250

D

IỄ N

Đ

ÀN

nghiên cứu do vậy, chúng tôi lựa chọn quy trình này để xử lý các mẫu HT. 3.1.3. Quy trình phân tích Levetiracetam trong huyết tƣơng Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được phương pháp HPLC phân tích LEVET trong các mẫu huyết tương như sau: * Quy trình xử lý mẫu: Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng. Lấy 1 mL HT, thêm 50 µL dung dịch IS. Lắc xoáy. Thêm 0,25 mL dung dịch NH4OH 0,1N.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 34

Lắc xoáy. Thêm 5 mL cloroform. Lắc cơ học 5 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 3 mL lớp dung môi phía dưới. Bay hơi dung môi dưới dòng khí N2 ở

N

40ºC thu lấy cắn. Hòa tan cắn trong 0,5 mL pha động. Tiêm sắc ký.

H

Ơ

* Điều kiện sắc ký:

N

+ Cột Phenomenex, C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm. Nhiệt độ cột 40oC.

TP

.Q

+ Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút.

ẠO

+ Bước sóng phát hiện: 210 nm.

G

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

+ Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.

H Ư

N

3.2.1. Tính chọn lọc - đặc hiệu

Tiến hành phân tích các mẫu HT trắng, mẫu HT có chuẩn nội và các mẫu HT

TR ẦN

chứa chuẩn LEVET bằng phương pháp HPLC đã xây dựng ở trên theo nội dung và phương pháp nghiên cứu trình bày mục 2.3.3.1.

Hình 3.11: SKĐ mẫu HT trắng

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

Kết quả thu được được như sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

+ Pha động: acetonitril – dung dịch đệm phosphat pH 6,8 tỷ lệ 6:94 (tt/tt).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Hình 3.12: SKĐ mẫu HT trắng có chuẩn nội paracetamol

ÁN

Hình 3.13: SKĐ mẫu chuẩn LEVET nồng độ 0,25 µg/mL có IS

TO

Nhận xét:

D

IỄ N

Đ

ÀN

- Hình 3.11: Trên SKĐ, trong khoảng thời gian từ 7 - 10 phút mẫu HT trắng

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

TP

.Q

U Y

N

H

Ơ

N

35

không xuất hiện píc.

- Hình 3.12: Trên SKĐ xuất hiện 1 píc chuẩn nội có tR khoảng 7,6 phút.

- Hình 3.13: Trên SKĐ mẫu chuẩn LEVET chuẩn nồng độ 0,25 µg/mL trong khoảng thời gian từ 7 - 10 phút xuất hiện 1 píc có thời gian lưu khoảng 7,6 phút (tương ứng với píc IS) và 1 píc có tR khoảng 9,1 phút.

Kết quả phân tích cho thấy, píc của LEVET cân đối, rõ nét và tách hoàn toàn với

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 36

píc của IS, không có píc tạp. Không có đáp ứng của píc tạp trong mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của LEVET (9,1 phút) và IS (7,6 phút). Do vậy,

N

phương pháp đặc hiệu và chọn lọc đối với LEVET.

Đƣờng

Đƣờng

(µg/mL)

chuẩn 1

chuẩn 2

chuẩn 3

S1

0,25

98,4

100,7

S2

0,5

103,4

98,4

S3

1,0

98,4

101,5

S4

2,5

101,7

S5

5,0

103,8

S6

10,0

99,3

S7

17,5

S8

25,0

chuẩn 5

102,3

102,0

98,3

95,0

97,3

102,5

100,6

98,3

101,8

96,6

101,7

97,3

102,3

100,3

96,8

101,2

98,3

102,1

96,9

97,1

96,8

96,4

100,1

103,4

101,5

98,0

100,3

103,2

105,4

102,1

Đ

G

N

TR ẦN

B

10 00

Ó

ẠO

chuẩn 4

98,6

A = 0,1292 A = 0,1342 A = 0,1301 A = 0,1316 A = 0,1300

Í-

-L

(y = Ax + B)

ÁN

Đƣờng

H

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

hồi quy

Đƣờng

H Ư

Đƣờng

A

đô

Phƣơng trình

TP

Độ đúng (%)

Nồ ng̣ Mẫu

.Q

Bảng 3.1.Độ đúng của các mẫu thuộc các đường chuẩn

B = 0,0010 B= -0,0038 B = 0,0043 B = 0,0024 B = 0,0022 r = 0,9995

r = 0,9998

r = 0,9993

r = 0,9994

r = 0,9996

TO

Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng nồng độ từ 0,25 đến 25,0 µg/mL có sự

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

đã xây dựng ở mục 3.1.3, chúng tôi thu được kết quả như sau:

N

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.2, xử lý mẫu theo quy trình xử lý mẫu

H

Ơ

3.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính

D

IỄ N

Đ

ÀN

tương quan tuyến tính giữa nồng độ LEVET và tỷ lệ diện tích píc LEVET/IS với hệ

số tương quan xấp xỉ bằng 1. Nồng độ LEVET xác định từ đường chuẩn so với giá

trị lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép (85,0% - 115,0%) theo qui định của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

3.2.3. Giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ) Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.3, kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.2.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 37

Độ đúng so với nồng độ thực (%) 92,5

2

0,032

0,239

95,0

3

0,037

0,282

112,1

4

0,037

0,277

110,2

5

0,035

0,263

6

0,036

0,267

H N

106,4

ẠO Đ

CV (%)

103,5 7,8

N

G

Kết quả thẩm định cho thấy giá trị nồng độ LEVET xác định từ đường chuẩn so

H Ư

với nồng độ thực có trong mẫu nằm trong khoảng từ 80 - 120% và CV < 20% đáp

TR ẦN

ứng yêu cầu giới hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

Như vậy mẫu chuẩn chứa LEVET có nồng độ 0,25 µg/mL đáp ứng yêu cầu

10 00

B

LLOQ về độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích trong dịch sinh học.

3.2.4. Độ đúng - Độ chính xác

A

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.4, kết quả thu như sau:

H

Ó

Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày MQC ( 12,5 µg/mL)

HQC ( 20,0 µg/mL)

-L

Í-

LQC ( 0,75µg/mL)

2 3

0,091 0,091

0,752 0,744

100,6 99,6

1,549 1,642

12,943 103,9 13,722 110,1

2,361 2,430

19,741 99,0 20,319 101,9

4 5

0,090 0,088

0,742 0,722

99,3 96,6

1,572 1,440

13,134 105,4 12,031 96,6

2,436 2,342

20,363 102,2 19,582 98,2

6 0,093 Trung bình

0,764 0,747

102,2 99,9

1,567

13,095 105,1 13,049 104,7

2,283

19,082 19,827

95,7 99,5

1,9

1,9

2,4

2,4

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

STT LEVET/ Nồng độ Độ LEVET/ Nồng độ Độ LEVET Nồng độ Độ đúng đúng đúng IS (µg/mL) IS (µg/mL) /IS (µg/mL) (%) (%) (%) 1 0,092 0,755 101,0 1,599 13,367 107,3 2,377 19,874 99,7

CV (%)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

4,3

4,3

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

TP

104,9

Trung bình (%)

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

Nồng độ xác định từ đƣờng chuẩn (µg/mL) 0,232

STT

Ơ

1

Tỷ lệ diện tích píc LEVET/IS 0,031

.Q

Bảng 3.2. Kết quả xác định giá trị LLOQ

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 38

Độ lặp lại Độ đúng

(%)

(CV%)

(%)

(CV%)

(%)

96,4

3,7

96,4

7,3

97,5

Ơ

Độ lặp lại (CV%) 2,6

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

G

(1,9% - 7,3%). Như vậy, phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu về độ đúng và

H Ư

N

độ chính xác của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học trong ngày và

TR ẦN

khác ngày.

3.2.5. Tỷ lệ thu hồi

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.5, kết quả thu được như sau:

10 00

B

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của LEVET LQC (0,75 µg/mL)

STT

A

2

20020

Mẫu DM

27937

325934

463683

528470

763246

27985

335104

462522

458520

763918

19771

28545

340850

464772

518652

763454

17922

28683

329801

464434

523040

762903

5

18665

29055

328657

462007

534157

766737

6

19360

28672

320428

459651

525389

760931

Trung bình

19169

28480

330129

462845

514705

763532

CV (%)

4,0

1,5

2,2

0,4

5,4

0,2

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

19273

ÀN Đ

HQC (20,0 µg/mL)

Mẫu HT Mẫu DM Mẫu HT Mẫu DM Mẫu HT

1 3

IỄ N

MQC (12,5 µg/mL)

Tỷ lệ thu hồi

53,4%

56,6%

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Độ đúng

H

Độ lặp lại

Các mẫu QC đều có độ đúng nằm trong giới hạn 85% - 115% và CV (%) < 15%

4

D

Độ đúng

ẠO

(n = 3)

µg/mL)

.Q

Khác ngày

µg/mL)

TP

Độ lặp lại

µg/mL)

Mẫu HQC(20,0

N

Độ đúng,

Mẫu MQC(12,5

U Y

Mẫu LQC(0,75

N

Bảng 3.4.Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày

53,5%

Kết quả thẩm định cho thấy, ở cả 3 nồng độ tỷ lệ thu hồi của LEVET là tương đối cao từ 53,4 - 56,6 % và có độ lặp lại tốt, giá trị CV < 15 % (0,2 % - 5,4 %).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 39

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của IS

218815

3029922

3

218289

2919341

4

198338

2888753

5

212205

2879483

6

208349

Trung bình

210973

N

1,86

12,0%

H Ư

N

Tỷ lệ thu hồi

Kết quả thực nghiệm cho thấy, tỷ lệ thu hồi của IS khá thấp, chỉ 12,0 % tuy nhiên

TR ẦN

hiệu suất chiết khá lặp lại (CV < 5%), đồng thời tỷ số diện tích pic LEVET/IS lặp lại, độ đúng – độ chính xác của phương pháp đạt yêu cầu (mục 3.2.4). Do vậy,

B

phương pháp xử lý mẫu đáp ứng yêu cầu chiết tách LEVET và IS trong HT.

10 00

3.2.6. Độ ổn định của hoạt chất trong HT 3.2.6.1. Độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn.

Ó

A

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu đượckết quả như sau:

-L

Í-

H

Bảng 3.7. Kết quả độ ổn định dung dịch IS làm việc thời gian ngắn Diện tích píc ban đầu (mAu.s) Diện tích píc sau 6 giờ (mAu.s) 2765312

2769663

2

2766447

2766072

3

2766280

2768165

Trung bình

2766013

2767967

0,02

0,07

TO ÀN Đ IỄ N

Độ ổn định IS làm việc thời gian ngắn

ÁN

Mẫu

CV (%) Độ lệch (%)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

.Q

TP ẠO

2935621

3,57

1

D

2956859

G

CV (%)

Ơ

2

H

Trong dung môi 2939368

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1

Trong huyết tƣơng 209840

N

Diện tích píc IS (mAu.s)

STT

0,1

Kết quả nồng độ LEVET sau 6 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng có độ lệch là 0,1% so với ban đầu, giá trị CV = 0,1% đều đáp ứng các yêu cầu độ lệch dưới 2% và CV

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 40

không quá 2%. Mẫu chuẩn nội ổn định trong 6 giờ khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.

3.2.6.2. Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn.

N

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu được kết quả như sau:

Diện tích píc ban đầu

H

1059836

2

1068545

1060875

3

1065794

Trung bình

1066321

TP

.Q

1064623

ẠO

1061663

Đ

1060791

G

0,2

Độ lệch (%)

0,1

H Ư

N

- 0,5

Kết quả sau 4 giờ bảo quản ở nhiệt độ phòng nồng độ LEVET trong mẫu có độ

TR ẦN

lệch là -0,5% so với ban đầu, giá trị CV = 0,1% đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 2% và CV ≤ 2%. Mẫu chuẩn gốc ổn định trong vòng 4 giờ khi bảo quản ở nhiệt độ phòng.

10 00

B

3.2.6.3. Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian dài.

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu được kết quả như sau:

Ó

A

Bảng 3.9. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ 2ºC -8ºC

Í-

H

Mẫu

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

1 2 3 Trung bình CV (%) Độ lệch (%)

Ban đầu 499,5 499,8 499,8 499,7 0,03

Nồng độ LEVET (µg/mL) Sau 8 ngày Sau 17 ngày 492,2 491,7 492,4 491,7 492,0 492,0 492,2 491,8 0,04 0,04 -1,5 -1,6

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Diện tích píc sau 4 giờ

1

CV (%)

IỄ N D

N

Độ ổn định LEVET gốc thời gian ngắn

Mẫu

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Ơ

Bảng 3.8. Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc thời gian ngắn

Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ 2ºC - 8ºC có độ lệch so với nồng độ ban đầu là -1,5% sau 8 ngày và -1,6% sau 17 ngày đều đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 2% và CV ≤ 2%. Mẫu chuẩn gốc ổn định sau 17 ngày bảo quản ở nhiệt độ 2ºC - 8ºC.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 41

3.2.6.4. Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu được kết quả như sau:

N

Bảng 3.10. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

22198

228395

0,097

0,719

585512

2

21768

211880

0,103

0,760

580,805 210225

3

20895

216523

0,097

0,714

591059

4

22297

224055

0,100

0,736

571065

5

22435

221877

0,101

0,748

573349

6 20931 Trung bình

209522

0,100

0,739 0,736

CV (%)

2,4

H

2,733

20,409

2,763

20,634

213441

2,769

20,682

213937

2,669

19,935

212556

2,697

20,145

589287 218816 Trung bình

2,693

20,113 20,319

H Ư

N

G

Đ

ẠO

214265

LEVET Nồng độ /IS (µg/mL)

CV (%)

1,5

B

Sau ba chu kỳ đông rã

10 00

Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL)

Số

23646

2

22325

203092

3

22484

4

H

Ó

IS

A

1

LEVET Nồng độ LEVET Nồng độ LEVET IS /IS (µg/mL) /IS (µg/mL) 211643 0,112 0,702 591181 197998 2,986 19,127

TT LEVET

0,690

612944

207162

2,959

18,954

199644

0,113

0,707

585454

202485

2,891

18,522

22938

209281

0,110

0,688

604216

205370

2,942

18,847

5 20878 Trung bình

186423

0,112

0,703 0,698

584436 196683 Trung bình

2,971

19,035 18,897

TO

ÁN

-L

Í-

0,110

ÀN Đ IỄ N

Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL)

Độ lệch so với ban đầu

1,2 -5,1%

CV (%) Độ lệch so với ban đầu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

1

CV (%)

D

IS

U Y

IS

.Q

LEVET Nồng độ LEVET /IS (µg/mL)

LEVET

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

TT

Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL)

N

Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL)

TP

Số

Ơ

Ban đầu

1,2 -7,0%

Kết quả sau 3 chu kỳ đông - rã đông, nồng độ LEVET trong mẫu LQC, HQC có độ lệch so với nồng độ ban đầu lần lượt là -5,1% (CV = 1,2%) và -7,0 % (CV = 1,2%), đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 15% và CV ≤ 15%. Mẫu HT ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 42

3.2.6.5 Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài.

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu được kết quả như bảng sau:

N

Bảng 3.11. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài.

H

LEVET /IS

Nồng độ (µg/mL)

2,733

20,409

2,763

20,634

22198 228395

0,097

0,719

585512

214265

2

21768 211880

0,103

0,760

580805

210225

3

20895 216523

0,097

0,714

591059

213441

2,769

20,682

4

22297 224055

0,100

0,736

571065

213937

Đ

2,669

19,935

5

22435 221877

0,101

0,748

573349

212556

2,697

20,145

6 20931 209522 Trung bình

0,100

0,739 0,736

589287 218816 Trung bình

2,693

20,113 20,319

CV (%)

2,4

H Ư

N

G

ẠO

TP

1

CV (%)

1,5

Sau 62 ngày

Số

B

2

21274 185716

0,115

0,701

548511 174814

3,138

19,785

3

Í-

10 00

1

LEVET Nồng độ LEVET IS /IS (µg/mL) 20439 173761 0,118 0,720 570072 183642 22155 185616

0,119

0,731

580840 183778

3,161

19,929

4

21127 178172

0,119

0,726

582881 186846

3,120

19,671

5

21517 177583

0,121

0,743

581375 184749

3,147

19,843

6 22017 185259 Trung bình

0,119

0,728 0,725

582680 186715 Trung bình

3,121

19,678 19,747

IS

ÀN

TO

ÁN

H

Ó

A

LEVET

Đ IỄ N

Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL)

-L

TT

Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL)

CV (%)

D

IS

Độ lệch so với ban đầu

1,9 -1,5%

LEVET /IS 3,104

Nồng độ (µg/mL) 19,574

CV (%) Độ lệch so với ban đầu (%)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

LEVET Nồng độ LEVET /IS (µg/mL)

IS

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

LEVET

N

TT

Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL)

U Y

Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL)

.Q

Số

Ơ

Ban đầu

0,7 -2,8%

Kết quả sau khi bảo quản ở nhiệt độ -35 ± 5oC, nồng độ LEVET trong mẫu LQC, HQC có độ lệch so với nồng độ ban đầu lần lượt là -1,5 % (CV = 1,9%) và -2,8 % (CV = 0,7%), đáp ứng yêu cầu độ lệch ≤ 15% và CV ≤ 15%. Mẫu HT ổn định sau 62 ngày khi bảo quản ở nhiệt độ -35 ± 5oC.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 43

3.2.6.6. Độ ổn định của mẫu HT sau xử lý (trong Autosampler).

Tiến hành phân tích theo mục 2.3.3.6, thu được kết quả như sau:

N

Bảng 3.12. Kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương sau xử lý

0,760

580805

210,25

2,763

20,634

20,895

216523

0,097

0,714

591059

213441

2,769

20,682

4

22297

224055

0,100

0,736

571065

213937

2,669

19,935

5

22435

221877

0,101

0,748

573349

212556

2,697

20,145

6

20931

209522 TB

0,100

0,739 0,736

589287

218816 TB

2,693

20,113 20,319

CV (%)

G

N

H Ư

2,4

CV (%)

1,5

Sau 32 giờ/ nhiệt độ phòng

B

Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL) STT

Nồng độ (µg/mL)

LEVET

IS

0,097

0,753

584146

214100

2,728

20,489

216070

0,102

0,791

578168

207554

2,786

20,918

218740

0,095

0,739

588199

213208

2,759

20,717

229753

0,099

0,768

562661

211291

2,663

19,998

22154

222198

0,100

0,774

600396

222857

2,694

20,232

6 20881 Trung bình

210842

0,099

0,769 0,766

579512 219167 Trung bình

2,644

19,857 20,369

1

22344

230618

2

22030

3

20768

4

22713

5

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

IS

10 00 LEVET /IS

LEVET

ÀN Đ

Độ lệch so với ban đầu

IỄ N

Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL)

2,4 4,1%

LEVET Nồng độ /IS (µg/mL)

CV (%) Độ lệch so với ban đầu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

3

CV (%)

D

H

0,103

2

.Q

211880

22198

IS

TP

21768

1

LEVET

U Y

585512

LEVET Nồng độ /IS (µg/mL) 214265 2,733 20,409

ẠO

Nồng độ (µg/mL) 0,719

IS

Đ

228395

LEVET /IS 0,097

LEVET

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Mẫu HQC (≈ 20,0 µg/mL)

N

Mẫu LQC (≈ 0,75 µg/mL)

STT

Ơ

Ban đầu

2,0 0,2%

Nồng độ LEVET sau khi xử lý và bảo quản ở autosample sau 31 giờ sai khác không quá 15% (4,1% và 0,2%) so với nồng độ định lượng ban đầu và giá trị CV đều nhỏ hơn 15% (2,4% và 2,0%). Mẫu HT ổn định sau khi xử lý và bảo quản 31 giờ trong autosampler.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 44

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

H

Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận:

Ơ

N

4.1. KẾT LUẬN

.Q

ngƣời với các điều kiện nhƣ sau:

TP

- Quy trình xử lý mẫu:

ẠO

Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng. Lấy 1 mL HT, thêm 50 µL dung

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

dịch IS. Lắc xoáy. Thêm 0,25 mL dung dịch NH4OH 0,1 N. Lắc xoáy. Thêm 5 mL

G

cloroform. Lắc cơ học 5 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 3 mL lớp trong 0,5 mL pha động. Tiêm sắc ký.

TR ẦN

- Điều kiện sắc ký:

H Ư

N

dung môi. Bốc hơi dung môi dưới dòng khí N2 ở 40ºC thu lấy cắn. Hòa tan cắn

+ Cột Phenomenex, C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm. Nhiệt độ cột 40 oC

B

+ Pha động: acetonitril – dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (6:94)

10 00

+ Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút.

A

+ Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.

Ó

2. Đã tiến hành thẩm định phƣơng pháp định lƣợng LEVET với các chỉ tiêu:

Í-

H

Độ đặc hiệu - chọn lọc, đường chuẩn, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng

-L

dưới, độ đúng - độ lặp lại, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định và kết quả:

ÁN

- Phương pháp có độ đặc hiệu - chọn lọc với LEVET.

TO

- Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa đáp ứng phân tích và nồng độ

D

IỄ N

Đ

ÀN

LEVET trong khoảng nồng độ khảo sát với r > 0,999. Khoảng tuyến tính từ 0,25

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

1. Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp phân tích levetiracetam trong huyết tƣơng

- 25,0µg/mL. - Giới hạn định lượng dưới: LLOQ = 0,25 µg/mL. - Phương pháp có độ đúng tốt (95,7 - 107,3%), độ lặp lại với giá trị CV% ≤ 15%. Đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ lặp lại trong ngày và khác ngày.

- Tỷ lệ thu hồi của LEVET tương đối cao (53,4 - 56,6 %). Độ lặp lại tốt (CV < 15 %). Phương pháp xử lý mẫu đáp ứng yêu cầu chiết tách LEVET trong HT.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 45

- Phương pháp đáp ứng được yêu cầu về độ ổn định của hoạt chất trong huyết tương.

N

Phương pháp đáp ứng được yêu cầu của phương pháp phân tích các chất trong

H

Ơ

dịch sinh học theo tiêu chuẩn của US - FDA.

N

4.2. KIẾN NGHỊ

TP

.Q

- Ứng dụng phương pháp phân tích này để định lượng LEVET trong HT NTN trong các nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH của các chế phẩm chứa LEVET

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

trên thị trường.

G

Đ

- Ứng dụng phương pháp phân tích này để định lượng LEVET trong HT bệnh

N

nhân động kinh sử dụng LEVET kéo dài để điều chỉnh liều hợp lý, đạt hiệu quả

H Ư

điều trị tối ưu.

TR ẦN

- Tiến hành nghiên cứu định lượng đồng thời LEVET trong HT của bệnh nhân

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

sử dụng các thuốc chống động kinh phối hợp.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Sau khi thực hiện đề tài, chúng tôi có một số kiến nghị sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

N

H

Ơ

N

TÀI LIỆU THAM KHẢO

U Y

Tiếng Việt:

TP

học, tr.325 - 329.

ẠO

2. Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt Nam, tr. 887 - 888.

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

3. Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV, tr.125 - 126.

G

4. Bộ Y tế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Dược lý học, tập 1, Nhà

H Ư

N

xuất bản Y học, tr. 117 - 121.

5. Bộ Y tế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Hóa phân tích, tập 2, Nhà

TR ẦN

xuất bản Y học, tr. 123 - 141, tr. 168 - 200.

6. Bộ Y tế (2010), Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/

B

tương đương sinh học trong đăng ký thuốc, Thông tư số 08/2010/TT-BYT.

10 00

7. Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 84 - 104.

Í-

Tiếng Anh:

H

Ó

A

8. Lê Quang Cường (2005), Động kinh, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

-L

9. Aidan Neligan, Sander J.M. (2011), The incidence and prevanlence of

ÁN

epilepsy - Chapter 1, UCL Institute of Neurology, London.

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

10. Australian Government - Departmant of Health and Ageing, Therapeutic

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

.Q

1. Bộ Y tế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2010), Bệnh học, Nhà xuất bản Y

Goods Admistration (2004): Regulatory Guidelines for Prescription medicines, Appendix 15 - Biopharmaceutic studies.

11. Dong M., Ahuja S. (2005), Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC, United Kingdom, p. 19 - 45.

12. International League Against Epilepsy (2006), “Guideline for the management of epilepsy in the elderly”, Actaneurol, pp. 106-116.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

13. Jain

DS, Subbaiah

“Determination

of

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

G, Sanyal

M, Pal

levetiracetam

in

U, Shrivastav human

PS.

plasma

(2006),

by

liquid

N

chromatography/electrospray tandem mass spectrometry and its application

H

Ơ

to bioequivalence studies”, Rapid Commun Mass Spectrom. 20(17):2539 -

N

2547.

TP

.Q

of levetiracetam in human plasma with minimal sample pretreatment”,

ẠO

Journal of Chromatography B, volume 819, issue 1, pages 197 – 200.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

15. Karakevich Y., Lobrutto R. (2007), HPLC for Pharmaceutical Scientists,

G

Đ

Wiley & Sons. p.139 - p.188, p.75 - p.132.

H Ư

N

16. Madhira V N S Ramprasad, B. SyamaSundar (2004), “Development and validation of high performance liquid chromatographic Method for the

TR ẦN

Determination of Levetiracetam in Human Plasma by Electospray Ionization - Mass Spectrometry”, International Journal of Scientific &

B

Engineering Research, Volume 5, Issue 3.

10 00

17. Nation Institute for Health and Clinical Excellence (2012), The epilepsies: the diagnosis and management of the epilepsies in adults and children in

Ó

A

primary and secondary care - NICE clinical guidelices 137.

Í-

H

18. PDR Netword (2007), Physicians Desk Reference 61st ed., Thomson PDR

-L

Publisher, Montvale, NJ., p. 3314

ÁN

19. Riley C., Rosanske T. (1996), Development and Validication of Analytical

TO

Methods, Elsevier Science Ltd., pp. 3 - 99, 249 - 282.

D

IỄ N

Đ

ÀN

20. U.S Department of Heath and Human Services, Food and Drug

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

14. Jens Martens-Lobenhoffer, Stefanie M. Bode-Böger (2005), “Determination

Administrion, Center for Drug evaluation and Research (2001): Guidance for industry - Bioanalytical Method Validation.

21. United State Pharmacopeia (2012), USP 35/ NF 30, volume 3, pp. 3659 3662.

22. Vincenzo Pucci, Francesca Bugamelli, Roberto Mandrioli, Anna Ferranti, Ernst Kenndler, Maria Augusta Ragg (2004), “High-performance liquid

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Chromatographic determination of levetiracetam in human plasma: Comparison of Different sample clean-up Procedures”, Biomedical

N

Chromatography 18: 37-44.

Website:

TP

.Q

24. http://vinapharm.com.vn

ẠO

25. http://www.ema.europa.eu/docs/enGB/document_library/Scientificguidelin

D

IỄ N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L

Í-

H

Ó

A

10 00

B

TR ẦN

H Ư

N

G

Đ

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

e/2011/08/WC500109686.pdf

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

N

H

Ơ

23. World Health Organization(2001), Epilepsy, 165 (168), pp. 3-79.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial