Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ hoa dâm bụt ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO THAM DỰ CUỘC THI TRI THỨC TRẺ VÌ GIÁO DỤC

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH ANTHOCYANIN TỪ HOA DÂM BỤT ỨNG DỤNG LÀM GIẤY CHỈ THỊ AN TOÀN TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC Nhóm nghiên cứu ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh DS. Vũ Thị Thu Thùy Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội Địa chỉ liên hệ thuylinhdhd@gmail.com DT 0977663687

HÀ NỘI – 2016

1

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................... 3 1.1.

1.2.

1.3.

Cây hoa dâm bụt .......................................................................................... 3 1.1.1.

Tên gọi và phân loại ...........................................................................3

1.1.2.

Mô tả thực vật ......................................................................................3

1.1.3.

Phân bố.................................................................................................4

1.1.4.

Thành phần hóa học ............................................................................4

1.1.5.

Công dụng ............................................................................................4

Anthocyanin ................................................................................................. 5 1.2.1.

Giới thiệu .............................................................................................5

1.2.2.

Cấu trúc hóa học ..................................................................................5

1.2.3.

Tính chất hóa lý của Anthocyanin .....................................................8

1.2.4.

Vai trò của Anthocyanin trong một số lĩnh vực ..............................10

Tổng quan chất chỉ thị ................................................................................ 12

1.4. Kỹ thuật đo quang phổ vi sai...…………………………………………….14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 15 2.1.

Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 15

2.2.

Nguyên vật liệu – thiết bị ........................................................................... 15

2.3.

2.2.1.

Nguyên vật liệu .................................................................................15

2.2.2.

Thiết bị .......................................................................................... 16

Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 17

2

2.4.

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 17 2.4.1.

Quy trình phân tích............................................................................17

2.4.2.

Sơ đồ quá trình nghiên cứu ...............................................................21

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................. 22 3.1. Khảo sát điều kiện chiết Anthocyanin…………………………… 22

3.2.

3.1.1.

Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu ...................................................24

3.1.2.

Tính hàm lượng Anthocyanin trong dịch chiết…………………… 24

Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu của Anthocyanin………………... 27

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Anthocyanin tại các pH đến λmax.. 30 3.4. Xác định khoảng đổi màu của chất chỉ thị Anthocyanin .............................31 3.5.

Ứng dụng của Anthocyanin ....................................................................... 33 3.5.1. Ứng dụng dịch chiết làm chỉ thị màu trong chuẩn độ acid-base ..... 33 3.5.2. Nghiên cứu làm giấy chỉ thị để phát hiện nhanh pH môi trường

35

3.5.3. Ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc .......................................... 40 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 41 4.1.

Kết luận ...................................................................................................... 41

4.2.

Kiến nghị .................................................................................................... 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 43 PHỤ LỤC .................................................................................................. 47 Phụ lục 1: Độ hấp thụ của Anthocyanin tại các dung môi chiết suất khác nhau Phụ lục 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu Anthocyanin

47

……………. 48

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu

Tiếng anh

Tiếng việt

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

UV-VIS

Ultraviolet visible

Phổ tử ngoại-Khả kiến

RSD(%) Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích

w/w

Weight/weight

Khối lượng/khối lượng

pH

Potential of hydrogen

Cya

Cyanidin

Antho

Anthocyanin

THCS

Trung học cơ sở

THPT

Trung học phổ thông

CTM

Chỉ thị màu

BHA

2-tert-butyl-4-hidroxyanisol

4

DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng

Trang

Bảng 1.1. Cấu trúc cơ bản của các chất trong nhóm Anthocyanin

7

Bảng 1.2. Một số chất chỉ thị thường dùng trong chuẩn độ acid – base

13

Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm

25

Bảng 3.2. Kết quả thực nghiệm hàm lượng dịch chiết Anthocyanin

26

Bảng 3.3. Kết quả so màu

32

Bảng 3.4. Khoảng đổi màu của Anthocyanin

32

Bảng 3.5. Kết quả xác định nồng độ NaOH bằng H2C2O4 0,1000N

33

Bảng 3.6. Bảng khảo sát nồng độ Anthocyanin tẩm vào giấy chỉ thị

35

5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản aglycon của Anthocyanin

6

Hình 1.2. Sự phụ thuộc cấu trúc Anthocyanin vào pH

9

Hình 2.1. Hoa dâm bụt

15

Hình 2.2. Phổ hấp thụ Anthocyanin tại pH=1 và pH=4,5

18

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu

21

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của Anthocyanin

22

Hình 3.2. Sơ đồ tiến hành xử lý mẫu

23

Hình 3.3. Độ hấp thụ Anthocyanin theo hệ dung môi C2H5OH – H2O khác nhau

24

Hình 3.4. Màu của Anthocyanin tại các pH=1 đến pH=14

29

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến λmax

30

Hình 3.6. Sự thay đổi cấu trúc Anthocyanin vào pH

31

Hình 3.7. Màu của Anthocyanin tại pH=5 đến pH=7,5

32

Hình 3.8. Chuẩn độ NaOH bằng H2C2O4 0,1000N

34

Hình 3.9. Kết quả khảo sát nồng độ Anthocyanin tẩm vào giấy

36

6

Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến độ nhạy của giấy chỉ thị Anhocyanin trong môi trường pH khác nhau

37

Hình 3.11. Quy trình làm giấy chỉ thị

38

Hình 3.12. Màu của giấy chỉ thị Anthocyanin theo pH

39

Hình 3.13. . Sự đổi màu của giấy chỉ thị trên một số thuốc có tính acid, base

40

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, chất màu tự nhiên đang ngày càng được quan tâm, bởi nó là chất tạo màu không độc hại, thân thiện với môi trường và được ứng dụng rộng rãi cho nhiều ngành công nghiệp. Anthocyanin là họ màu rất phổ biến, tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và được tìm thấy trong một số loại rau, hoa, quả, hạt, có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, đài hoa Hibiscus, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ. Trong số đó, Hibiscus Rosa-Sinensis (Cây hoa dâm bụt) là nguyên liệu có hàm lượng Anthocyanin khá cao.

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy Anthocyanin trong Hibiscus không những tạo màu tốt mà còn có tác dụng tốt đối với sức khoẻ con người và động vật. Vì thế, nó được sử dụng rộng rãi để làm thuốc, màu thực phẩm, các sản phẩm sử dụng trong gia đình hay dùng làm thức ăn chăn nuôi gia súc.

Ngoài ra, đặc tính đặc biệt của chất màu Anthocyanin là thay đổi màu theo pH môi trường. Do đó, Anthocyanin hoàn toàn có thể dùng làm chất chỉ thị để xác định nhanh môi trường pH. Vai trò làm giấy chỉ thị chính là sự tiện dụng của nó. Chỉ cần một mẩu giấy nhỏ hay lượng nhỏ, ta có thể biết dung dịch đang sử dụng có tính acid hay base và độ mạnh yếu của tính acid/base( một cách tương đối) dựa vào sự thay đổi đậm nhạt của màu sắc. Hiện nay, những chất chỉ thị tổng hợp như chỉ thị vạn năng, methyl da cam, phenolphtalein… có nhiều hàng giả, hàng nhái và có xuất xứ không rõ ràng nên ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu và thí nghiệm. Do vậy, nghiên cứu sử dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị là việc làm cần thiết nhằm phát triển hơn nữa các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu phát triển bền vững đang được đặt ra cấp bách hiện nay. Tuy nhiên, ứng dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị an toàn, “thông minh” trong hóa học phân tích và phân tích thực phẩm cho đến nay vẫn chưa được đề

2

cập một cách đầy đủ, hệ thống. Đây cũng là hướng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đó là: “Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ hoa dâm bụt ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học.”

Mục tiêu của đề tài là: 1. Khảo sát được điều kiện chiết tách Anthocyanin từ Hoa dâm bụt 2. Nghiên cứu được ứng dụng của Anthocyanin làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Cây hoa dâm bụt 1.1.1. Tên gọi và phân loại [18] a. Tên gọi - Tên gọi Tên khoa học: Hibiscus rosa-sinensis L - Tên khác Rose – mallow, chinese hibiscus, chinese rose.

- Tên tiếng anh: Roselle.

- Tên thường gọi: Bông bụt, Bụp. b. Phân loại Theo phân loại thực vật học, cây Hoa dâm bụt được sắp xếp theo trình tự: Giới (kingdom)

: Thực vật (Plantae)

(Không được xếp hạng)

: Cây hạt kín (Angiosperm)

Ngành

: Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp

: Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Bộ (order )

: Bông Malvales

Họ (family)

: Bông (Malvaceae)

Chi (genus)

: Dâm bụt (Hibiscus)

Loài (species)

: Hibiscus

Tên khoa học

: Hibiscus rosa sinensis.

1.1.2. Mô tả thực vật Cây hoa dâm bụt thuộc loại cây bụi lớn, cao 4 - 5m; cành nhánh dày đặc, mọc sát gốc, thường dùng làm cảnh.

Rễ cây hình trụ dài 5-15 cm và đường kính 2 cm, màu trắng tới màu nâu nhạt, bẻ gãy thấy như xơ, thớ. Rễ có vị ngọt và có chất nhầy [18]

4

Lá có hình bầu dục, nhọn đầu, tròn gốc, mép có răng to, có chất nhầy…[18, 23] Quanh năm có hoa Tràng gồm 5 cánh hoa, màu đỏ và đường kính khoảng 3 inch, lớn xếp xoắn sát đè lên nhau. Nhị nhiều tập hợp trên một trụ dài thẳng hay hơi cong. Thực tế, ngày nay, hoa có rất nhiều màu như vàng, tím cà, hồng, trắng… Có một đặc điểm là hoa rất nhanh tàn, mỗi hoa sẽ chỉ kéo dài một hoặc hai ngày [13] Quả là một quả nang tròn dài khoảng 3 cm, rất khó hình thành [18] 1.1.2. Phân bố Hibiscus rosa-sinensis có nguồn gốc nhiệt đới châu Á (Trung Quốc). Cây Hoa dâm bụt có ở khắp nơi trên thế giới nhưng được tập trung nhiều nhất ở các vùng nhiệt đới [12, 17] Ở Việt Nam, Hibiscus rosa-sinensis được trồng ở khắp nơi, đặc biệt ở miền Nam nước ta. Hiện nay, dâm bụt có nhiều giống, rất phong phú, đa dạng về hình thái và màu sắc.

1.1.3. Thành phần hóa học Hoa dâm bụt rất giàu polyphenol, flavonoid và anthocyanins [23] Lá và thân cây có chứa β-sitosterol, stigmasterol, taraxeryl acetate và ba hợp chất cyclopropane và các dẫn xuất của họ [18] Hoa dâm bụt chứa cyanidin diglucoside, flavonoid và vitamin, thiamine, riboflavin, niacin và axit ascorbic (Ghani, 2003). Quercetin-3-diglucoside, 3,7diglucoside, cyanidin-3,5-diglucoside và cyanidin-3-sophoroside-5 glucoside đã được phân lập từ hoa vàng; tất cả hợp chất ở trên và kaempferol3xylosylglucoside đã được phân lập từ nhụy hoa (Rastogi & Mehrotra, 1993) [18] 1.1.4. Công dụng a. Trong ngành dược

5

Lá, hoa và rễ của cây hoa dâm bụt đã được biết đến là có tính chất như kích thích tình dục, rong kinh, tránh thai, thuốc nhuận tràng,… [12] Ngoài ra, cây hoa dâm bụt còn có hoạt tính kháng nấm và một trong những thành phần của nó đã được tìm thấy khả năng chống lại tế bào ung thư ở người trong nhiều giai đoạn phân chia tế bào. Mặt khác, nó có khả năng cung cấp hợp chất có hoạt tính sinh học hoạt động như chất chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch và có khả năng ngăn chặn sự gia tăng của tế bào ác tính [20, 24] b. Công dụng đối với cảnh quan Hiện nay, cây hoa dâm bụt có khoảng 100 loại được sử dụng trang trí. Hoa có nhiều màu sắc phong phú như: trắng, đỏ, vàng, xanh, xám, cam, tím, nâu, hồng, xanh lá cây, tím,… [15, 17] Cây phù hợp trồng làm hàng rào quanh khuôn viên vườn, viền lối đi hoặc viền trong các khuôn viên đô thị. Ngoài ra, chúng ta cũng có thể trồng cây trong chậu cảnh để trang trí ban công, sân thượng hoặc đặt bàn trang trí nội thất.

1.2. Anthocyanin 1.2.1. Giới thiệu Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm các chất màu tự nhiên flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật. Thuật ngữ Anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là xanh. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, Anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các màu trung gian khác [11, 19] 1.2.2. Cấu trúc hóa học Anthocyanin là những glycosid do gốc đường kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin). Các Anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là

6

anthocyanidin hay aglycon. Mỗi Anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15-20 lần. Aglycon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả như sau:

R1 OH B

O+

OH

3

7

A 5

3

R2

OH OH

Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản aglycon của Anthocyanin Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí 3 và 5 còn vị trí 7 rất ít. Phân tử Anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycosid, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycosid. Sự khác biệt giữa chúng là số lượng các nhóm hydroxy hóa, bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc của chúng. Đến nay có những báo cáo của hơn 500 Anthocyanin khác nhau và 23 Anthocyanidin [5, 22] Các aglycon của Anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là −H, −OH hoặc −OCH3.

7

Bảng 1.1. Cấu trúc cơ bản của các chất trong nhóm Anthocyanin

Cấu trúc cơ bản

Anthocyanidin

R3′

R4′

R5′

R3

Aurantinidin

−H

−OH

−H

−OH

−OH −OH

−OH

Cyanidin

−OH

−OH

−H

−OH

−OH

−H

−OH

Delphinidin

−OH

−OH −OH −OH

−OH

−H

−OH

−OCH3 −OH −OH −OH −OCH3 −H

−OH

Europinidin

R5

R6

R7

Luteolinidin

−OH

−OH

−H

−H

−OH

−H

−OH

Pelargonidin

−H

−OH

−H

−OH

−OH

−H

−OH

Malvidin

−OCH3 −OH −OCH3 −OH

−OH

−H

−OH

Peonidin

−OCH3 −OH

−OH

−OH

−H

−OH

−OH −OCH3 −OH

−OH

−H

−OH

−OH

−H −OCH3

Petunidin

Rosinidin

−OH

−OCH3 −OH

−H

−H

−OH

8

1.2.3. Tính chất hóa lý của Anthocyanin Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH…[5, 7] Màu sắc Anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác,… Nhưng chủ yếu phụ thuộc vào pH môi trường. Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm. Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ. Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [5, 22] Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường [5]: -

Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin có màu đỏ.

-

Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ.

-

Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base Cacbinol hay base

Chalcon không màu.

-

Ở pH = 6 – 7 chúng ở dạng Anion quinoid có màu tím.

-

Ở pH = 7 - 8 lại về dạng base Quinoidal Anhydro màu xanh.

9

Hình 1.2. Sự phụ thuộc cấu trúc Anthocyanin vào pH. Màu sắc của Anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharid. Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể phá hủy và mất màu [5] Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong vùng nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 – 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các Anthocyanin. Chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ Anthocyanin thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [5] Tóm lại, trong môi trường acid, các Anthocyanin là những base và có thể tạo muối bền vững với acid. Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với base.

Như vậy chúng có tính chất lưỡng tính (amphote). Muối với acid thì có màu đỏ, còn muối với kiềm thì có màu xanh [5]

10

1.2.3. Vai trò của Anthocyanin trong một số lĩnh vực a. Trong đời sống Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, Anthocyanin được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% w/w), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy hóa tổng hợp BHA. Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, Anthocyanin còn được sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và khá an toàn.

Ví dụ: dịch chiết Anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [28] b. Trong Y học Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ), các anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng [18].

Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng Anthocyanin có tác dụng tốt trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu, hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Nhờ đó, Anthocyanin giúp bảo vệ màng dạ dày chống lại các tổn thương do sự oxy hóa, làm ngưng lại giai đoạn đầu của ung thư dạ dày, ung thư ruột, ruột kết. Hơn nữa, các nghiên cứu còn cho thấy Anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường. Khả năng chữa bệnh của Anthocyanin vẫn

11

đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học. Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [12, 28] Anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ [16, 26] c. Trong phân tích hóa học Tại các trường THCS, THPT, việc sử dụng giấy chỉ thị vạn năng, các chỉ thị acid-base cho các thí nghiệm rất nhiều để kiểm chứng tính chất acid hay base trong hóa học, chuẩn độ, pha chế... là phổ biến. Để tăng hứng thú cho học sinh với môn hóa học, các thầy cô giáo đã tự làm các thí nghiệm “hóa học vui” bằng cách sử dụng dịch chiết trong nước của một số loài hoa, rau, củ, quả như hoa dâm bụt, hoa bách nhật, lá của bắp cải tím, rau lang, củ khoai tím, cánh hoa của hoa phong lữ, cây anh túc, quả của cây việt quất, phần thân rễ của cây đại hoàng… để xem sự đổi màu của dịch chiết trong các môi trường pH khác nhau.

Giấy chỉ thị màu “tự chế” này chứa Anthocyanin - chất bị đổi thành màu đỏ trong môi trường dung dịch acid và chuyển thành màu xanh trong môi trường dung dịch base, đặc điểm này tương tự như giấy chỉ thị vạn năng trong phòng thí nghiệm. Vì vậy, việc tự tạo chỉ thị màu là giải pháp hay giúp giáo viên thực hiện tốt kế hoạch dạy học, giúp học sinh nhận thấy hóa học gần gũi với đời sống và tạo tâm lý vui thích khi học bài. Ứng dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị an toàn, “thông minh” trong hóa học phân tích và phân tích thực phẩm cho đến nay vẫn chưa được đề cập một

12

cách đầy đủ, hệ thống. Nghiên cứu của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam), Anthocyanin được ứng dụng làm chất chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm. Hay nghiên cứu của Đại học Bách Khoa Đà Nẵng cũng cho thấy rằng Anthocyanin cũng được ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích thực phẩm và hóa học [12, 22] 1.3.

Tổng quan chất chỉ thị [2] Chất chỉ thị màu (CTM) là là những chất có màu sắc thay đổi theo sự biến

đổi pH của dung dịch. Chúng thường là những chất hữu cơ có tính acid base, trong đó dạng acid và dạng base liên hợp có màu khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của chúng. Khi pH của dung dịch biến đổi, cấu trúc phân tử của chúng bị biến đổi theo, dẫn đến màu thay đổi.

Nếu kí hiệu dạng acid của chất chỉ thị là HInd, dạng base liên hợp với nó là Ind-, trong dung dịch có cân bằng sau: Khi cho CTM vào nước thì cân bằng được thiết lập : HInd + H2O

H3O+ + Ind-

(1)

Nếu cân bằng (CB) dịch chuyển về phía phải () dung dịch có màu của dạng base (Ind- ).

Nếu cân bằng (CB) dịch chuyển về phía trái () dung dịch có màu của dạng acid (Hind).

Nếu một trong một hệ có hai chất có màu khác nhau thì việc quan sát bằng mắt chỉ cho phép ta nhận được màu của một chất khi nồng độ của nó ít nhất gấp 10 lần nồng độ chất kia. Như vậy : Khi

[ HInd ] ≥ 10, màu của chất chỉ thị là màu của HInd [ Ind  ]

13

Khi

[ HInd ] 1 ≤ , màu của chất chỉ thị là màu của anion Ind– .  [ Ind ] 10

Bảng 1.2. Một số chất chỉ thị thường dùng trong chuẩn độ acid – base Màu chỉ thị trong

Khoảng pH đổi

Màu chỉ thị trong

môi trường acid

màu chỉ thị

môi trường kiềm

Metyl da cam

Đỏ da cam

3,1 – 4,4

Vàng

Phenolphtalein

Không màu

8,0 – 10,0

Tím đỏ (hồng)

Giấy quỳ

Đỏ

5-8

Xanh

Đỏ trung tính

Đỏ

6,8 - 8

Vàng gạch

Metyl đỏ

Đỏ

4,4 - 6,2

Vàng

vàng Alizarin

Vàng

10,1 - 12

Tím

Đỏ phenol

Vàng

6,4 - 8

Đỏ

Thymolphtalein

Không màu

9,3 – 10,5

Xanh

Chỉ thị

Cơ chế ứng dụng Anthocyanin làm giấy chỉ thị Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể đến màu sắc của Anthocyanin. Màu sắc của Anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH. Sự thay đổi cấu trúc của Anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần tính chất hóa học.

Anthocyanin giống như một chất chỉ thị tự nhiên, có màu hồng hay đỏ ở pH thấp, màu tím ở pH trung gian và màu xanh ở pH cao [7]

14

1.4. Kỹ thuật đo quang phổ vi sai Trong kiểm nghiểm các dạng thuốc bào chế, trước tiên phải qua công đoạn chiết hoạt chất ra khỏi tá dược. Dịch chiết khó tránh khỏi mang theo tạp chất.

Tạp chất này có thể gây sai số cho quá trình định lượng bằng phương pháp đo quang. Để loại trừ sai số này, người ta thường sử dụng kỹ thuật đo quang vi sai: Trên phổ của chất nghiên cứu, chọn 2 bước sóng λ1 và λ2, ở đó hiệu số độ hấp thụ ∆A là lớn nhất.

A  A1  A 2 Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau và đo độ hấp thụ A ở 2 bước sóng.

Khảo sát khoảng nồng độ tuân theo định luật Lambert – Beer của ∆A, vẽ đồ thị quan hệ ∆A-C. Đo độ hấp thụ A của chất thử ở 2 bước sóng trên.

Ngoài ra, chất màu anthocyanin thay đổi theo pH. Tại pH = 1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu.

Vì vậy, Phương pháp Vi sai theo pH để loại hết ảnh hưởng của các chất

không phải Anthocyanin.

15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.

Đối tượng nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp chiết tách

Anthocyanin từ Hoa dâm bụt, ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học. Đối tượng mẫu phân tích là Anthocyanin và đối tượng nghiên cứu là Hoa dâm bụt. Các mẫu phân tích được lấy trên địa bàn thành phố Hà Nội (Bãi bồi Sông Hồng).

Hình 2.1. Hoa dâm bụt 2.2. Nguyên vật liệu – thiết bị 2.2.1. Nguyên vật liệu - Nước cất 2 lần.

- Cồn 99o.

- Bột muối Nabicar-NH 100g (Công ty cổ phần dược phẩm và vật tư y tế Nhân Hòa).

16

- Vitamin C, lọ 100 viên (Công ty cổ phần dược phẩm Đại Uy).

Các hóa chất đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (RA) của - Sodium hydroxide (Merck) - Acid phosphorid (Trung Quốc).

- Sodium dihydrophosphate (Trung Quốc).

- Sodium hydrophosphate (Trung Quốc).

- Potassium hydrophosphate (Trung Quốc).

- Potassium dihydrophosphate(Trung Quốc).

- Potassium hydroxide (Merck).

- Chỉ thị Phenolphtalein.

2.2.2. Thiết bị - Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01 g.

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g.

- Máy đo pH Meter 744.

- Máy lắc siêu âm Elma (Germany).

- Máy ly tâm HermLe Z383K. - Bình định mức 10 mL, 25 mL, 50 mL. - Tủ sấy - Cốc có mỏ.

- Pipet các loại.

- Bình nón.

- Ống ly tâm 10 mL, có nắp kín.

- Bình nón, ống nghiệm.

- Phễu lọc, giấy lọc.

17

2.3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát được điều kiện chiết tách Anthocyanin từ Hoa dâm bụt - Nghiên cứu được ứng dụng của Anthocyanin làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học.

2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Quy trình phân tích - Nguyên liệu là Hoa dâm bụt đã loại bỏ nhụy hoa.

- Rửa sạch, để khô.

- Nghiền nguyên liệu.

- Cân nguyên liệu và tiến hành chiết Anthocyanin, sau đó lưu trữ dịch chiết Anthocyanin.

- Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp quang phổ vi sai.

- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu Anthocyanin cũng như sự thay đổi cấu trúc phân tử của nó, chúng tôi xác định λmax của mỗi dung dịch pH khác nhau.

- Làm giấy chỉ thị bằng cách ngâm tẩm giấy lọc trong dịch chiết ở thời gian và nồng độ phù hợp.

- Ứng dụng dịch chiết và giấy chỉ thị Anthocyanin phát hiện nhanh pH môi trường.

Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp Vi sai Nguyên tắc: chất màu Anthocyanin thay đổi theo pH. Tại pH=1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu.

18

Hình 2.2. Phổ hấp thụ Anthocyanin tại pH=1 và pH=4,5

19

Nhìn vào hình ta thấy bước sóng cực đại của pH=1 là cao nhất còn ở pH=4,5 thì gần như bằng 0.

Vì vậy, theo lý thuyết, tại pH=4,5 sẽ không màu, nhưng thực tế ta vẫn thấy có màu hồng nhạt. Điều đó chứng tỏ trong quá trình chiết tách vẫn có sự cạnh tranh giữa các chất màu và một lượng chất màu khác cũng được chiết ra. Tuy nhiên, chỉ có Anthocyanin mới có tính chất biến đổi màu theo pH nên ta sẽ chỉnh pH để đánh giá hàm lượng Anthocyanin.

Phương pháp Vi sai chọn đo quang tại 2 điểm là bước sóng cực đại và 700 nm đã tạo ra một nền trừ để loại hết ảnh hưởng của các chất không phải Anthocyanin. Đo mật độ quang của mẫu tại pH=1 và pH=4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm.

Dựa trên công thức của định luật Lambert-Beer

A   .l.C

(1)

Trong đó: A: mật độ quang hoặc độ hấp thụ.

C: Nồng độ chất nghiên cứu (mol/l). l: là bề dày của dung dịch (cm). : hệ số hấp thụ mol.

Nếu nồng độ C tính theo phần trăm (kl/tt) và l tính theo centimet thì: A = E1cm1% .l.C Trong đó: E1cm1% là hệ số hấp thụ riêng.

Nồng độ Anthocyanin sẽ được tính theo công thức:

C

A n a    .l V M .V

20

Do vậy, lượng Anthocyanin theo công thức:

A.M .K .V .103 a  .l

(2)

Trong đó: A = (Amax,pH=1 – A700nm,pH=1) - (Amax,pH= 4,5 – A700nm,pH= 4,5). a: Lượng Anthocyanin (mg).

M: Khối lượng phân tử của Anthocyanin (g/mol) l: Chiều dày cuvet (cm).

K: Độ pha loãng.

V: Thể tích dịch chiết (l). Độ ẩm của Hoa dâm bụt được tính theo công thức: w=

m1  m2 100% m1

Trong đó: m1: Khối lượng trước khi sấy. m2: Khối lượng sau khi sấy.

Từ đó tính được hàm lượng Anthocyanin theo phần trăm: % Anthocyanin toàn phần (w/w) =

a 100% m(100  w)

Trong đó: a: Lượng Anthocyanin tính được theo công thức (2) (mg) m: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g). w: Độ ẩm của Hoa dâm bụt (%)

(3)

21

2.4.2. Sơ đồ quá trình nghiên cứu Nguyên liệu

Xác định λmax của Xây dựng quy trình xử lý mẫu

dịch chiết

Lựa chọn dung môi chiết

Dịch chiết

Tính hàm lượng của Anthocyanin trong dịch chiết. Ảnh hưởng của pH đến màu và λmax của dịch chiết Xác định khoảng đổi màu của Anthocyanin Ứng dụng làm chỉ thị phát hiện nhanh pH

Chất chỉ thị

Giấy chỉ thị Ứng dụng giấy chỉ thị phát hiện nhanh một số thuốc có tính acid, base Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu

22

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện chiết Anthocyanin Xác định bước sóng cực đại của Anthocyanin Để xác định bước sóng cực đại khi phân tích Anthocyanin chúng tôi chọn máy quang phổ UV-VIS. Quét phổ dịch chiết Anthocyanin trong khoảng 400 – 800 nm, chọn cực đại hấp thụ cho Anthocyanin và thu được kết quả như sau:

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của Anthocyanin Anthocyanin chiết được từ Hoa dâm bụt có cực đại hấp thụ tại 520 nm. Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo được độ nhạy của phương pháp khi phân tích Anthocyanin nên chọn bước sóng phát hiện tại λ = 520 nm.

Dựa vào tính chất Anthocyanin tan trong nước nên lựa chọn dung môi chiết Anthocyanin là nước. Tuy nhiên, khi chiết thu được hàm lượng Anthocyanin rất thấp.

Do đó, để tăng khả năng hòa tan Anthocyanin và tham khảo một số bài báo [6, 24], chúng tôi đã sử dụng thêm Ethanol vào dung môi chiết. Ethanol vừa có tính phân cực tốt, giá thành rẻ rất thích hợp để sử dụng. Và

23

ethanol/nước là hệ dung môi thường dùng trong chiết xuất các hợp chất hữu cơ phân cực vừa an toàn vừa hiệu quả [10] Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là hoa dâm bụt gồm các bước sau: Nguyên liệu rửa, để khô Nghiền

7mL dung môi

2 g mẫu sau khi đồng nhất vào ống ly tâm 10 mL Lắc siêu âm 15 - 20 phút ở nhiệt độ phòng.

Ngâm ở nhiệt độ phòng trong 120 phút.

Ly tâm 10 phút, tốc độ 4000 vòng/phút.

Gạn lấy phần dịch trong, lọc qua giấy lọc Dịch chiết Anthocyanin Hình 3.2. Sơ đồ tiến hành xử lý mẫu

24

3.1.1. Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu Khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ nền mẫu bằng cách ngâm mẫu ở nhiệt độ phòng với thời gian 120 phút, bằng hỗn hợp dung môi C2H5OH H2O với các tỷ lệ (v/v) như sau: 80:20; 60:40; 40:60, 20:80, 0:100. Kết quả thu được:

Hình 3.3. Độ hấp thụ Anthocyanin theo hệ dung môi C2H5OH – H2O khác nhau Trong cùng một điều kiện khảo sát, tỷ lệ dung môi có ảnh hưởng đến hiệu suất Anthocyanin được chiết. Theo kết quả thu được thì tỷ lệ dung môi C2H5OH - H2O (20:80, v/v) cho dịch chiết màu đậm nhất và độ hấp thụ quang lớn nhất. Vì vậy, tỷ lệ dung môi này được sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp.

3.1.2. Tính hàm lượng Anthocyanin trong dịch chiết Xác định lượng Anthocyanin theo công thức: % Anthocyanin toàn phần (w/w) = Trong đó:

a 100% m(100  w)

25

A.M .K .V .103 a: Lượng Anthocyanin (mg) tính theo công thức: a   .l

A = (Amax,pH=1 – A700nm,pH=1) - (Amax,pH= 4,5 – A700nm,pH= 4,5).

M: Khối lượng phân tử của Anthocyanin (g/mol). (M=449,2 g/mol). l: Chiều dày cuvet (cm).

K: Độ pha loãng.

V: Thể tích dịch chiết (l). : hệ số hấp thụ mol ( = 26900).

-

Thực hiện chiết Anthocyanin đồng thời 6 mẫu với mỗi mẫu khoảng 10g

hoa dâm bụt trong 35 ml hệ dung môi C2H5OH - H2O (20:80, v/v).

-

Pha dung dịch (KCl-HCl) và dung dịch (CH3COONa-HCl) có pH=4,5.

-

Cho chính xác 2,00 ml dung dịch dịch chiết trong bình định mức 50,0 ml.

Thêm dung dịch đệm vừa đủ đến vạch.

-

Tiến hành đo quang tại 2 bước sóng 520nm và 700nm Xác định độ ẩm: Đồng nhất mẫu, lấy khoảng 1,0000 (g) mẫu vào đĩa petri

sấy ở 800C đến khối lượng không đổi. Tính độ ẩm của Hoa dâm bụt.

Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm Khối lượng trước Sấy (g)

Khối lượng sau khi Sấy (g)

Độ ẩm (%)

1,0001

0,8772

12,29

1,0005

0,8782

12,22

1,0003

0,8816

11,87

Trung bình Độ ẩm trung bình của Hoa dâm bụt là 12,13%

12,13

26

Bảng 3.2. Kết quả thực nghiệm hàm lượng dịch chiết Anthocyanin Mật độ quang STT

520nm

Hàm lượng 700nm

A

anthocyanin (mg/ g nguyên liệu)

pH=1

pH=4,5

pH=1

pH=4,5

1

0,739

0,096

0,024

0,006

0,625

1,039

2

0,744

0,102

0,033

0,006

0,615

1,023

3

0,755

0,114

0,023

0,005

0,623

1,036

4

0,749

0,104

0,022

0,004

0,627

1,043

5

0,733

0,103

0,025

0,005

0,600

1,014

6

0,762

0,123

0,025

0,004

0,618

1,027

Trung bình

1,030

n

Độ lệch chuẩn: SD 

 (x  x ) i

i 1

n 1

2

 0,010

Độ lệch chuản tương dối: RSD(%) = Độ tin cậy:



t.SD n



SD 100% x

2,48.0,0099 6

= 0,96%

 0,01

Vậy hàm lượng Anthocyanin trong hoa dâm bụt được biểu diễn là: 1,030 ± 0,01 (mg/ g nguyên liệu).

27

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu anthocyanin Cách tiến hành - Pha dung dịch đệm phosphat có pH từ pH=1 đến pH= 14 [1]  Đệm pH=1: Hòa tan 0,895 g dinatri hydrophosphat khan (TT) và 0,340 g kali dihydrophosphat (TT) trong nước vừa đủ 100 ml. Điều chỉnh pH bằng acid phosphoric (TT).  Đệm pH=2: Hòa tan 0,895 g dinatri hydrophosphat khan (TT) và 0,340 g kali dihydrophosphat (TT) trong nước vừa đủ 100 ml. Điều chỉnh pH bằng acid phosphoric (TT).  Đệm pH=3: Hòa tan 1,2 g natri dihydrophosphat khan (TT) trong nước, điều chỉnh pH bằng dung dịch acid phosphoric (TT) và thêm nước đến vạch vừa đủ 100 ml.  Đệm pH=4: Hòa tan 6,80 g kali dihydro phosphat (TT) trong nước vừa đủ 100 ml, điều chỉnh pH bằng natri hydroxyd 10 M (TT).  Đệm pH=5: Hòa tan 0,272 g kali dihydro phosphat (TT) trong 80 ml nước. Điều chỉnh pH bằng dung dịch kali hydroxyd 1 M (TT) và nước vừa đủ 100 ml.  Đệm pH=6: Hòa tan 0,68 g natri dihydrophosphat (TT) trong nước vừa đủ 100 ml và điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxyd 10 M (TT).  Đệm pH=7: Hòa tan 0,518 g dinatri hydrophosphat khan (TT) và 0,365 g natri dihydrophosphat monohydrat (TT) trong 95 ml nước, chỉnh pH bằng acid phosphoric (TT) và thêm nước vừa đủ 100 ml.  Đệm pH=8: Hòa tan 13,61 g kali dihydrophosphat (TT) trong nước, điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxyd 10 M (TT), thêm nước vừa đủ 100 ml.

28

 Đệm pH=9: Hòa tan 1,74 g kali dihydrophosphat (TT) trong 80 ml nước, điều chỉnh pH bằng dung dịch kali hydroxyd 1 M (TT), thêm nước vừa đủ 100 ml.  Đệm pH=10 – pH=14: Hòa tan 1,74 g kali dihydrophosphat (TT) trong 80 ml nước, điều chỉnh pH bằng dung dịch kali hydroxyd 1 M (TT), thêm nước vừa đủ 100 ml.

- Sau đó lấy 2,0 ml dịch chiết Antho vào 6,0ml dung dịch pH đã pha ở trên.

- Kết quả khảo sát sự thay đổi màu của dung dịch tại 14 khoảng pH khác nhau.

Bảng 3.3. Màu của dung dịch Anthocyanin tại các pH khác nhau Dung dịch

pH=1

pH=2

pH=3

pH=4

pH=5

Màu

Đỏ

Đỏ

Đỏ

Đỏ hồng

Đỏ hồng

Dung dịch

pH=6

pH=7

pH=8

pH=9

Màu

Hồng nhạt

Hồng tím

Hồng tím

Hồng xanh

Dung dịch

pH=10

pH=11

pH=12

pH=13

pH=14

Màu

Xanh nhạt

Xanh nhạt

Xanh

Xanh

Xanh

29

Hình 3.4. Màu của Anthocyanin tại các pH=1 đến pH=14 Như vậy màu của Anthocyanin thay đổi khi pH môi trường chuyển từ acid sang base và giống như các chất chỉ thị acid-base khác (Phenolphtalein, metyl đỏ và metyl da cam). Chứng tỏ Anthocyanin có khả năng làm chất chỉ thị pH môi trường.

30

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Anthocyanin tại các pH đến λmax Cách tiến hành - Sau đó lấy 0,5 ml dịch chiết Anthocyanin cho vào 6,0 ml dung dịch pH đã pha ở trên (0,08%, v/v).

- Quét phổ các dung dịch trong khoảng 400 – 800 nm, các hỗn hợp dung dịch vừa pha.

- Kết quả được biểu diễn như trong hình:

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến λmax Khi pH tăng từ 1-13, giá trị λmax thay đổi và có xu hướng tăng lên Điều này được giải thích như sau: Trong dung dịch acid, Anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ. Khi pH tăng dần, có sự tấn công của nước vào vòng pyran C, Anthocyanon chuyển dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu. Đây chính là quá trình hydrat hóa, yếu tố chính tạo nên sự

31

đổi màu của dung dịch. Trong dung dịch base, có sự dịch chuyển của H+ từ nhóm -OH trên vòng B, Anthocyanin chuyển sang dạng anion có màu xanh.

Hình 3.6. Sự thay đổi cấu trúc Anthocyanin vào pH Khi pH môi trường càng cao, ion H+ trong nhóm -OH còn lại bị phân huỷ và khi ấy điện tử không còn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp thụ trở thành đỏ hơn. Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch cho màu tím.

3.4.

Xác định khoảng đổi màu của chất chỉ thị Anthocyanin Tiến hành đo pH tại thời điểm khi dung dịch bắt đầu chuyển từ đỏ sang màu

tím xanh, để xác định khoảng pH đổi màu. Để khẳng định lại khoảng đổi màu của Anthocyanin, chúng tôi tiến hành xác định khoảng đổi màu bằng phương pháp so màu.

- Pha dãy dung dịch đệm phosphat có pH là: 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 trong các ống nghiệm.

- Lấy 0,5 ml dịch chiết Anthocyanin cho vào 8 ml dung dịch pH đã pha ở trên.

32

- Kết quả thể hiện như trong hình.

Hình 3.7. Màu của Anthocyanin tại pH = 5 đến pH=7,5 Bảng 3.3. Kết quả so màu pH=5

pH=5,5

pH=6

pH=6,5

pH=7

pH=7,5

Hồng

Hồng

Hồng tím

Hồng tím

Xanh nhạt

Xanh nhạt

Từ kết quả nghiên cứu đã xác định được khoảng đổi màu (màu hồng sang màu xanh) của chất chỉ thị Anthocyanin nằm trong khoảng pH= 5,5 ÷ 7,5. Như vậy khoảng đổi màu của chất màu Anthocyanin khá hẹp và quá trình thay đổi màu rất rõ đây cũng là một trong những yêu cầu cần thiết cho một chất chỉ thị.

Bảng 3.4. Khoảng đổi màu của Anthocyanin Chất chỉ thị

Khoảng pH

Khoảng đổi màu

Anthocyanin

5,5 – 7,5

Hồng sang xanh

33

3.5.

Ứng dụng của Anthocyanin

3.5.1. Ứng dụng dịch chiết làm chỉ thị màu trong chuẩn độ acid-base Chúng tôi tiến hành xác định nồng độ NaOH bằng dung dịch chuẩn H2C2O4 0,1000 N bằng phương pháp chuẩn độ acid – base.

Nguyên tắc:

2 NaOH + H2C2O4 -> Na2C2O4 + 2 H2O

Nồng độ đương lượng dung dịch NaOH được tính theo công thức:

N NaOH 

VC 2 H 2O 4 .NC 2 H 2O 4 VNaOH

- Cho dung dịch NaOH cần chuẩn độ vào buret.

- Dùng pipet lấ y chính xác 10,00 ml dung dich ̣ H2C2O4 0,1000 N cho vào biǹ h nón:  Bình nón 1: Thêm vào 1-2 gio ̣t chỉ thi ̣ Phenolphtalein rồ i chuẩ n đô ̣ bằ ng dung dich ̣ NaOH đế n khi dung dich ̣ trong bình nón có màu hồ ng nhạt.  Bình nón 2: Thêm vào 1-2 gio ̣t chỉ thi ̣ Anthocyanin rồ i chuẩ n đô ̣ bằ ng dung dich ̣ NaOH đế n khi dung dich ̣ trong bình nón chuyển từ hồng sang tím.

- Chuẩ n đô ̣ 3 lầ n lấ y kế t quả trung bình.

Bảng 3.5. Kết quả xác định nồng độ NaOH bằng H2C2O4 0,1000N Chỉ thị

Kết quả

Bình 1 (Phenolphtalein)

Bình 2 (Anthocyanin)

V NaOH (ml)

NNaOH (N)

V NaOH (ml)

NNaOH (N)

Lần 1

4,80

0,21

4,70

0,21

Lần 2

4,75

0,21

4,65

0,22

Lần 3

4,90

0,20

4,80

0,21

Trung bình

4,82

0,21

4,73

0,21

34

Chất chỉ thị Anthocyanin cho kết quả tương tự với chất chỉ thị Phenolphtalein. Qua quan sát, tôi thấy màu nhanh chóng được biến đổi từ màu đỏ sang tím xanh.

Hình 3.8. Chuẩn độ NaOH bằng H2C2O4 0.1000N

35

3.5.2. Nghiên cứu làm giấy chỉ thị để phát hiện nhanh pH môi trường a.

Xác định nồng độ tẩm giấy chỉ thị Pha loãng dịch chiết Anthocyanin bằng dung môi chiết C2H5OH: H2O

(20:80, v/v) theo tỷ lệ như trong bảng: Bảng 3.6. Bảng khảo sát nồng độ Anthocyanin tẩm vào giấy chỉ thị STT

Tỷ lệ Antho: Dung

Nồng độ Anthocyanin trong

môi (v/v)

dung dịch (mg/l)

1

20:80

0,52

2

40:60

1,04

3

50:50

1,30

4

60:40

1,56

5

80:20

2,08

6

100:0

2,60

Sau đó tiến hành tẩm dung dịch vào giấy lọc để xác định độ nhạy của giấy chỉ thị. Giấy sau khi ngâm được sấy khô. Kết quả được như sau:

36

Môi trường acid (pH=2)

Môi trường trung tính (pH=7)

Môi trường base (pH=12)

Hình 3.9. Kết quả khảo sát nồng độ Anthocyanin tẩm vào giấy

37

Kết quả cho thấy khi chất màu được tẩm lên giấy chỉ thị quá nhiều hay quá ít đều không cho màu rõ nhất. Vì vậy, nồng độ pha loãng (2,08 mg/l) này được sử dụng để làm giấy chỉ thị trong các nghiên cứu tiếp. b. Xác định thời gian tẩm dịch màu lên giấy Thời gian ngâm tẩm dịch màu lên giấy có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định điều kiện làm giấy chỉ thị. Các mốc thời gian ngâm giấy thí nghiệm là: 1; 30; 60; 90; 120; 150 giây. Giấy sau khi ngâm tẩm dịch màu được sấy khô ở nhiệt độ 400C trong 1 giờ. Kết quả phát hiện pH của giấy được thể hiện dưới: Môi trường acid (pH=2)

Môi trường trung tính (pH=7)

38

Môi trường base (pH=12)

Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến độ nhạy của giấy chỉ thị Anthocyanin trong môi trường pH khác nhau Qua bảng kết quả thí nghiệm ta thấy thời gian tẩm dịch ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả phát hiện pH của giấy chỉ thị. Nếu thời gian ít hơn 120 giây thì khi tăng thời gian ngâm cũng tăng độ nhạy của giấy. Tuy nhiên khi tăng đến 150 giây thì sự phát hiện bắt đầu giảm. Do vậy, thời gian ngâm tẩm giấy được chọn là 120 giây.

Sau khi khảo sát, chúng tôi tiến hành làm giấy chỉ thị pH bằng dịch chiết Anthocyanin theo quy trình như sau: Giấy lọc rửa sạch bằng nước cất

40oC Sấy 30 phút

Tẩm dịch chiết Antho trong 120 giây

40oC Sấy 60 phút

Hình 3.11. Quy trình làm giấy chỉ thị Kết quả thu được như sau:

Giấy chỉ thị

39

Hình 3.12. Màu của giấy chỉ thị Anthocyanin theo pH

40

3.5.3. Ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc Sau khi tiến hành theo quy trình ở hình 3.1, thu được giấy chỉ thị có màu tím (môi trường trung tính). Khi nhúng giấy chỉ thị Anthocyanin vào các môi trường acid, base, màu tím của giấy sẽ nhanh chóng chuyển sang màu đỏ hoặc màu xanh. Nhờ vào sự đổi màu nhanh trong các môi trường pH khác nhau, giấy chỉ thị Anthocyanin sẽ sử dụng để phát hiện nhanh trong một số dược phẩm có tính acid, base.

Tiến hành thử nghiệm trên 2 chế phẩm thuốc viên nén Vitamin C 50 mg và thuốc bột Nabica.  Dung dịch 1 (Viên nén Vitamin C 50 mg): Hòa tan 1,0 g chế phẩm Acid ascobic trong nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 20 ml bằng cùng dung môi [1]  Dung dịch 2 (Thuốc bột Nabica): Hòa tan 5,0 g chế phẩm trong 90 ml nước không có carbon dioxyd (TT) và pha loãng thành 100,0 ml bằng cùng dung môi [1] - Cho giấy chỉ thị Anthocyanin vào 2 dung dịch.

Hình 3.13. Sự đổi màu của giấy chỉ thị trên một số thuốc có tính acid, base Kết luận: Giấy chỉ thị Anthocyanin sẽ đổi màu nhanh trong một số dược phẩm có tính acid, base.

41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích khảo sát điều kiện chiết tách anthocyanin từ hoa dâm bụt, ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học, chúng tôi thu được kết quả như sau: - Xây dựng được điều kiện chiết tách Anthocyanin từ hoa dâm bụt: Mẫu được chiết bằng C2H5OH – H2O (20:80, v/v), lắc siêu âm, ngâm 120 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm, định mức, lọc.

- Nghiên cứu được ứng dụng của Anthocyanin làm chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học. + Màu của Anthocyanin thay đổi theo pH môi trường, khi pH thay đổi từ môi trường acid sang base, màu của Anthocyanin đổi từ đỏ sang xanh, tương ứng với bước sóng hấp thụ cực đại λmax = 500 - 596 nm. + Ứng dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị màu an toàn trong phân tích hóa học có khoảng pH đổi màu là 5,5-7,5. + Ứng dụng làm giấy chỉ thị màu để xác định nhanh pH trong phân tích hóa học, sấy giấy lọc 40oC trong 30 phút, ngâm tẩm giấy chỉ thị trong 120 giây sau đó sấy ở 40oC trong 60 phút.

4.2. Kiến nghị Nghiên cứu này chỉ thực hiện trên Hoa dâm bụt. Ngoài ra trong thiên nhiên, có rất nhiều loài thực vật chứa Anthocyanin mà nghiên cứu chưa đề cập tới. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, tìm ra các loại thực vật có hàm lượng Anthocyanin cao.

42

Ngày nay, hóa chất bị lạm dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm tiêu dùng gây nguy hiểm đến sức khỏe của người tiêu dùng như hàn the, asen… có tính chất acid, base. Do đó, giấy chỉ thị Anthocyanin có thể phát hiện ra sản phẩm có chứa một số chất độc hại này trong các loại thịt, cá tươi, nem, giò chả, bánh... và cả những sản phẩm khô. Nên ứng dụng Anthocyanin càng cần thiết và ngày càng quan trọng hơn trong đời sống. Vì vậy cần nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực này.

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

2. Bộ y tế (2007), Hóa phân tích - tập 1 - Phân tích hóa học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

3. Bộ y tế (2007), Hóa phân tích - tập 2 - Phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

4. Bộ y tế (2010), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội 5. Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Quỳnh, Nguyễn Thị Lan, và cộng sự (2004), "Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai", Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 3(7), 47-54.

6. Đinh Thị Thúy Hương (2014), Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC, Luận văn Thạc sỹ, Trường đại học Dược Hà Nội.

7. Nguyễn Thị Lan, Lê Thị Lạc Quyên (2006), "Nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung môi đến khả năng chiết tách chất màu Anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu Hội An", Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, Đại Học Đà Nẵng, 44, 7176.

8. Lê Việt Ngân (2015), Xác định một số hợp chất nhóm trong rau củ bằng phương pháp HPLC, Kiểm nghiệm thuốc – độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội.

9. Phạm Thị Thanh Nhàn, Nguyễn Hữu Cường và Lê Trần Bình (2011), "Tách chiết và phân tích hàm lượng Anthocyanin trong các mẫu thực vật khác nhau", Tạp chí Sinh Học, 33(4), 79-85.

44

Tiáşżng anh 10. Ali Ă&#x2013;zmen (2010), " Cytotoxicity of Hibiscus rosa-sinensis fl ower extract", Caryologia, Vol. 63, no. 2, pp.157-161 11. Arullappan1 Sangeetha, Muhamad2 Shamsul and Zakaria3 Zubaidah (2013), " Cytotoxic Activity of the Leaf and Stem Extracts of Hibiscus rosa sinensis (Malvaceae) against Leukaemic Cell Line (K-562) ", Tropical Journal of Pharmaceutical Research October 2013; 12 (5), pp.743-746 12. Cretu G.C, Morlock G.E (1 March 2014), "Analysis of anthocyanins in powdered berry extracts by planar chromatography linked with bioassay and mass spectrometry", Food Chemistry, 146, pp.104-112.

13. Devil P. Suganya Devi1, M. Saravanakumar1 and S. Mohandas (2012), "The effects of temperature and pH on stability of anthocyanins from red sorghum (Sorghum bicolor) bran", African Journal of Food Science, Vol. 6(24) pp. 567-573.

14. Dreiseitel A., P.S. G. Korte, A. Oehme, et al. (2009), "Berry anthocyanins and their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B", Pharmacol Res, 59(5), pp.306-311.

15. Fossen T., M. Andersen (2000), "Anthocyanins from tubers and shoots of the purple potato, Solanum tuberosum", J. Ilort Sci. Biotech, 75, pp.360-363 16. Gilman Edward F. (1999), "Hibiscus rosa-sinensis ", univercity of Florida, cooperitive extension service, Instutite of food and agricultural sciences.

17.

Izadi Zeinab, Zarei Hossein (2014), " Evaluation of Propagation of

Chinese Hibiscus (Hibiscus rosa-sinensis) through Stenting Method in Response to Different IBA Concentrations and Rootstocks", American Journal of Plant Sciences.

45

18. Meena1Anil Kumar , Devendra Patidar2 and R. K. Singh1 (2014), " Ameliorative Effect of Hibiscus rosa sinensis on Phenylhydrazine Induced Haematotoxicity", nternational Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technology.

19. Kumar Anil and Ashatha Singh (2012), "Review on Hibiscus rosa sinensis", Pharmacy College, Itaura, Chandeshwar, Azamgarh, Uttar Pradesh, India, pp. 534-538.

20. Lila M.A (2004), "Anthocyanins and Human Health: An In Vitro Investigative Approach", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 5, pp.306313.

21. Marco P.H, Scarminio I.S (2007), "Q-mode curve resolution of UV–vis spectra for structural transformation studies of anthocyanins in acidic solutions", Analytica Chimica Acta, 583, 138-146.

22. Ovando A.C., Pacheco-Hernández M.L, Páez-Hernández M.E, et al.

(2009), "Chemical studies of anthocyanins: A review", Food Chemistry, 113, pp.859 - 871.

23. Shabana S, Syed Muzammil M, Parsana S (2013), " Silver Nano Scaffold Formation by Flowers of Hibiscus Rosa Sinensis ", International Journal of Herbal Medicine, pp.169-174.

24. Truong

V.D,

Deighton

N,

Thompson

R.T,

et

al.

(2010),

"Characterization of Anthocyanins and Anthocyanidins in Purple-Fleshed Sweetpotatoes by HPLC-DAD/ESI-MS/MS", J. Agric. Food Chem, 58, pp.404410.

46

25. William Dr, Welch C, "ChineseHibiscus, Hibiscus Rosa Sinensis", Texas Cooperative Extension, The Texas A&M University System, College Station, Texas.

26. Wilkerson Dr. Don C, Johnson Dr. Wm. M (2014), "Tropical Hibiscus (Hibiscus rosa-sinensis) For Galveston County and the Texas Upper Gulf Coast", AgriLife Extension Texas A&M system.

27. Wu X (2005), "Identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States: Vegetables, nuts, and grains", J Agric Food Chem, 53(8), pp.3101-3113.

28. Xu Z, Howard L.R (2012), "Analysis Methods of Anthocvanins", Analysis of Antioxidant-RichPhytochemicals, 5, pp.945-978.

29. Zhang Z, Kou X, Fugal K, et al. (2004), "Comparison of HPLC Methods for Determination of Anthocyanins and Anthocyanidins in Bilberry Extracts", J. Agric. Food Chem, 52, pp.688 - 691.

47

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Độ hấp thụ của Anthocyanin tại các dung môi chiết suất khác nhau C2H5OH – H2O (0:100 ,v/v)

C2H5OH – H2O (20:80, v/v)

C2H5OH – H2O (40:60, v/v)

C2H5OH – H2O (50:50, v/v)

C2H5OH – H2O (60:40, v/v)

C2H5OH – H2O (80:20, v/v)

48

Phụ lục 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu Anthocyanin pH=1

pH=2

λmax=500 nm

λmax=501 nm

pH=3

pH=4

λmax=513 nm

λmax= 534nm

49

pH=5

pH=6

位max= 543 nm

位max= 557nm

pH=7

pH=8

位max=559

位max=562

50

pH=9

pH=10

位max=571

位max= 574 nm

pH=11

pH=12

位max= 577 nm

位max= 583nm

51

pH=13

pH=14

λmax=596 nm

Không tìm được peak