NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM HỖN DỊCH CHỨA PHỨC HỢP LIPID AMPHOTERICIN B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

DƢƠNG THỊ THUẤN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM HỖN DỊCH CHỨA PHỨC HỢP LIPID AMPHOTERICIN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI, 2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

N

hơ

n

DƢƠNG THỊ THUẤN

D

ạy

Kè

m

Q uy

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM HỖN DỊCH CHỨA PHỨC HỢP LIPID AMPHOTERICIN B

m /+

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

MÃ SỐ 60720402

oo

gl

e.

co

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

G

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Hải Yến PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ

HÀ NỘI, 2016

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến : TS. Trần Thị Hải Yến PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ Là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Nhờ sự giúp đỡ quí báu đó mà tôi đã hoàn thành được các

hơ

n

mục tiêu của đề tài đặt ra.

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật

Q uy

N

viên của bộ môn Bào chế-Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm.

m

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn quan

Kè

tâm khích lệ giúp tôi hoàn thành luận văn.

Học viên

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Hà Nội, tháng 4 năm 2016

Dương Thị Thuấn

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 2 1.1. Amphotericin B ............................................................................................. 2 1.1.1.Công thức hóa học................................................................................. 2 1.1.2. Đặc tính lý hóa ..................................................................................... 2

n

1.1.3. Tác dụng dược lý.................................................................................. 3

hơ

1.1.4. Dược động học ..................................................................................... 3

N

1.1.5. Chỉ định ................................................................................................ 3

Q uy

1.1.6. Tác dụng không mong muốn (thường gặp).......................................... 4 1.1.7. Liều dùng ............................................................................................. 4

m

1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường ................................. 5

Kè

1.2. Phức hợp phospholipid chứa amphotericin B ............................................ 5

ạy

1.2.1. Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid amphotericin B ........... 5 1.2.2. Tá dược tạo phức .................................................................................. 6

m /+

D

1.2.3. Độ ổn định ............................................................................................ 8 1.2.4. Ưu, nhược điểm.................................................................................... 9

co

1.2.5. Bào chế phức hợp lipid chứa AMB ...................................................10

e.

1.2.6. Phương pháp đánh giá cấu trúc của phức hợp lipid ...........................12

gl

1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB ..............................................18

oo

1.4. Lợi ích của phƣơng pháp bào chế tạo phức hợp với lipid .......................19

G

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................22 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu ............22 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................23 2.2.1. Phương pháp bào chế phức hợp lipid AMB ......................................23 2.2.2. Phương pháp chứng minh phức hợp lipid AMB................................24 2.2.3. Phương pháp đánh giá hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB .............27 2.2.4. Phương pháp đánh giá thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB ......................................................................................................................28

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Chƣơng 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .........................................................29 3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng AMB..............................................29 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí ......................................29 3.1.2. Độ đặc hiệu ........................................................................................29 3.1.3. Tính tuyến tính ...................................................................................30 3.1.4. Độ lặp lại ............................................................................................31

n

3.2. Nghiên cứu xây dựng công thức bào chế phức hợp lipid AMB ..............32

hơ

3.2.1. Khảo sát môi trường phân tán ...........................................................32

N

3.2.2. Khảo sát dung môi hòa tan dược chất ................................................35

Q uy

3.2.3. Khảo sát tỉ lệ dược chất/lipid .............................................................36 3.2.4. Khảo sát biện pháp bốc hơi dung môi................................................37

m

3.2.5. Khảo sát phương pháp làm giảm KTTP ............................................39

Kè

3.2.6. So sánh mẫu bào chế với chế phẩm thương mại Ampholip ..............44

ạy

3.3. Kết quả chứng minh phức hợp lipid AMB ...............................................46 3.3.1. Phân tích nhiệt vi sai ..........................................................................46

m /+

D

3.3.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) ..............................................................47 3.3.3. Hình thái của tiểu phân ......................................................................48

co

3.3.4. Phổ nhiễu xạ tia X ..............................................................................50

e.

3.4. Đề xuất qui trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid

gl

AMB 5mg/ml.......................................................................................................53

oo

3.5. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid

G

AMB 5mg/ml.......................................................................................................56 Chƣơng 4. BÀN LUẬN ......................................................................................58 4.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng ........................................................58 4.2. Xây dựng công thức và qui trình bào chế phức hợp................................58 4.2.1. Sử dụng tá dược HSPC và DSPG ......................................................58 4.2.2. Về môi trường phân tán ....................................................................59 4.2.3. Về dung môi hòa tan dược chất .........................................................59 4.2.4. Về phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân ...............................60

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

4.2.5. Về biện pháp bốc hơi dung môi .........................................................61 4.2.6. Về qui trình bào chế phức hợp lipid AMB ........................................61 4.3. Phương pháp chứng minh phức hợp .....................................................62 4.3.1. Phương pháp quét nhiệt vi sai ............................................................62 4.3.2. Phương pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử ................................62 4.3.3. Phương pháp phổ IR ..........................................................................63

n

4.3.4. Phương pháp phổ nhiễu xạ tia X ........................................................63

hơ

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................................64

N

TÀI LIỆU THAM KHẢO

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

PHỤ LỤC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. So sánh ưu nhược điểm giữa liposome và phức hợp lipid AMB ....................9 Bảng 2.2. Nguyên liệu........................................................................................................22 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí ........................................29 Bảng 3.4. Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak.................................30 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại ................................................................................31

hơ

n

Bảng 3.6. Thành phần công thức khảo sát môi trường phân tán.....................................32 Bảng 3.7. Phân bố KTTP của các mẫu sau 2 chu kỳ đồng nhất .....................................34

Q uy

N

Bảng 3.8. Thành phần công thức khảo sát dung môi hòa tan AMB...............................36 Bảng 3.9. Thành phần công thức khảo sát tỉ lệ dược chất/lipid ......................................37

m

Bảng 3.10. KTTP và phân bố KTTP của hai biện pháp bốc hơi dung môi ...................38

Kè

Bảng 3.11. KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT6 và CT10 .........................................39 Bảng 3.12. Đặc tính của phức hợp sau khi làm giảm KTTP bằng phương pháp đồng

ạy

nhất hóa tốc độ cao .............................................................................................................41

D

Bảng 3.13. KTTP làm nhỏ bằng phương pháp siêu âm .................................................42

m /+

Bảng 3.14. KTTP và phân bố KTTP sau khi đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng ....................................................................................................................................43

co

Bảng 3.15. KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế và chế phẩm Ampholip ..........45

e.

Bảng 3.16. pH và hàm lượng của mẫu bào chế và chế phẩm Ampholip .......................46

oo

gl

Bảng 3.17. Số sóng của gốc (RO)2PO2- trong phân tử lipid của các mẫu.......................47 Bảng 3.18. Đỉnh nhiễu xạ của các mẫu đo .......................................................................50

G

Bảng 3.19 . Chất lượng thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB (n=3) ............56 Bảng 3.20. Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml .....................................................................................................................57

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB ........................................... 6 Hình 1.2. Phân tử HSPC và DSPG ........................................................................ 7 Hình 1.3. Cấu trúc của màng phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha..........14 Hình 1.4. Biểu đồ tượng trưng cho các pha phospholipid và phổ 31P-NMR tương

n

ứng. a: pha phospholipid kép; b: pha phospholipid lục giác; c: pha xảy ra sự

hơ

chuyển động đẳng hướng .....................................................................................15

N

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của tamoxifen (A), phospholipid (B), hỗn hợp

Q uy

vật lý (C) và phức hợp lipid tamoxifen (D) .........................................................16 Hình 1.6. Phổ nhiễu xạ tia X của vinorelbine (A), phospholipid (B), hỗn hợp vật

m

lý (C) và mẫu phức hợp lipid vinorelbine (D) .....................................................17

Kè

Hình 1.7. Phổ nhiễu xạ của rifampicin (A), hỗn hợp vật lý (B), phospholipid

ạy

(C), phức hợp lipid rifampicin (D) .......................................................................17 Hình 1.8. Nồng độ AMB tìm thấy trong các mẫu xét nghiệm tử thi. ..................19

m /+

D

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak ..............................................................................................................................31

co

Hình 3.10. Hỗn dịch phức hợp lipid AMB ở nồng độ 50 mol %.........................34

e.

Hình 3.11. Hỗn dịch phức hợp lipid AMB ở nồng độ 100 mol % .......................34

gl

Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu nhóm I và II ......35

oo

Hình 3.13. Mẫu CT10.1 và CT10.2 sau khi đồng nhất hóa lần 2 ........................38

G

Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn KTTP của mẫu CT6 và CT10 qua các lần đồng nhất ..............................................................................................................................40

Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT6 ..................40 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT10 ................40 Hình 3.17. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau đồng nhất tốc độ 4.000vòng/phút.....................................................................................................41 Hình 3.18. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau siêu âm 50Hz/50W ................42

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 3.19. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau đồng nhất 2 chu kỳ kết hợp đùn ..............................................................................................................................44 Hình 3.20. Mẫu bào chế và mẫu Ampholip .........................................................45 Hình 3.21. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế và Ampholip.....45 Hình 3.22. Phổ đồ DSC của các mẫu HSPC, DSPG, AMB, mẫu liposome AMB 5 mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 25 mol% và 100 mol%. ...............................46

n

Hình 3.23. Phổ hồng ngoại của của các mẫu đo ..................................................48

hơ

Hình 3.24. Hình thái của các mẫu quan sát dưới KHV điện tử truyền qua .........49

N

Hình 3.25. Phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu AMB (a), hỗn hợp vật lý (b), mẫu

Q uy

trắng (c), liposome AMB 5mol% (d), phức hợp lipid AMB100mol% (e) .........52 Hình 3.26. Sơ đồ bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

5mg/ml .................................................................................................................56

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt

1

AMB

Amphotericin B

2

DMPC

α – Dimyristoylphosphatidylcholin

3

DMPG

1- α-Dimyristoylphosphatidylglycerol

4

DMSO

Dimethyl sufoxide

5

DSPG

Distearoylphosphatidylglycerol

6

DSC

7

HSPC

8

KTTP

Kích thước tiểu phân

9

KHV

Kính hiển vi

10

LTT

Lọc tiếp tuyến

11

NSX

Nhà sản xuất

hơ

ạy

Kè

m

soy phosphatidylcholine)

P-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân phospho đồng vị 31 (Phosphorus –31 Nuclear magnetic Resonance ) Tinh khiết hóa học

TKHH

14

TKPT

Tinh khiết phân tích

15

TLTK

Tài liệu tham khảo

oo

gl

e.

co

13

G

Q uy

N

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated

D

31

Nhiệt quét vi sai (Differential Scanning Calorimetry)

m /+

12

Từ/cụm từ đầy đủ

n

TT

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm nấm mà đặc biệt là nhiễm nấm hệ thống mà một trong những nguyên nhân gây ra tử vong ở những người suy giảm miễn dịch như bệnh nhân ung thư, bệnh nhân AIDS, bệnh nhân ghép tạng. Amphotericin B (AMB) là một trong các kháng sinh polyen hiệu quả nhất cho việc điều trị nhiễm nấm hệ thống ở người. Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là hầu như không tan trong nước

n

nên sinh khả dụng thấp. Do không tan trong nước nên muốn bào chế thuốc tiêm

hơ

phải sử dụng biện pháp đặc biệt. Vì vậy, nghiên cứu bào chế chế thuốc tiêm

N

amphotericin B giúp giảm độc tính trên thận và tăng hiệu quả điều trị của thuốc

Q uy

là vấn đề cấp thiết.

Tế bào nấm là một loại tế bào ưa lipid (có ái lực cao với lipid). Dựa vào

m

đặc tính này, các nhà bào chế đã nghiên cứu một hệ mang dược chất có bản chất

Kè

là lipid với mong muốn đưa thuốc đến đích tác dụng là các tế bào nấm nhằm

D

gồm liposome, phức hợp lipid.

ạy

giảm độc tính và tăng hiệu quả điều trị. Các hệ lipid mang dược chất này bao

m /+

Các nghiên cứu trong nước về phức hợp lipid-AMB trước đây chưa đánh giá được cấu trúc của nó. Vì vậy, để góp phần ứng dụng phức hợp lipid làm chất mang

co

cho dược chất trị nấm có độc tính cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

e.

”Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid

gl

amphotericin B ” nhằm mục tiêu :

oo

- Xây dựng được công thức và qui trình bào chế phức hợp lipid AMB.

G

- Bào chế và đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của thuốc tiêm hỗn

dịch chứa phức hợp lipid AMB.

1

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Amphotericin B

Q uy

N

hơ

n

1.1.1.Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17.

Kè

m

Khối lượng phân tử: 924,08 [6].

ạy

1.1.2. Đặc tính lý hóa

D

 Lý tính:

m /+

- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [1],[7].

- Độ tan: thực tế không tan trong nước, hòa tan trong dimethyl sulphoxide và

co

trong propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong

e.

methanol, thực tế không tan trong cồn [6].

gl

 Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm

oo

amin và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:

G

- Tính lưỡng tính và lưỡng thân [1].

- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung dịch kiềm [1].

- Dung dịch amphotericin B trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [1].

2

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.1.3. Tác dụng dƣợc lý Amphotericin B (AMB) là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng, làm rò rỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài cuối cùng làm chết tế bào. Đồng thời, AMB cũng gắn với sterol (chủ yếu là cholesterol) trên màng tế bào của người gây độc tính cho người [2].

Trên mặt lâm sàng, amphotericin B có tác dụng kìm nấm đối với một số loại

n

nấm như Absidia spp. , Aspergillus spp. , Basidiobolus spp. , Blastomyces

hơ

dermatitidis , Candida spp. , Coccidioides immitis , Conidiobolus spp. ,

N

Cryptococcus neoformans , Histoplasma capsulatum , Mucor spp. ,

Q uy

Paracoccidioides brasiliensis , Rhizopus spp. , Rhodotorula spp. , và Sporothrix

m

schenckii [2].

Kè

1.1.4. Dƣợc động học - Hấp thu: AMB hấp thu kém qua đường tiêu hóa, chủ yếu được tiêm truyền tĩnh

ạy

mạch để điều trị nhiễm nấm hệ thống, chỉ dùng đường uống để điều trị nhiễm

D

nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng.

m /+

- Phân bố: AMB liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể nhưng chỉ một lượng nhỏ vào dịch não tủy. Nửa đời của thuốc trong huyết

co

tương khoảng 24h, khi dùng thời gian dài, nửa đời cuối cùng có thể tới 15 ngày.

e.

Chi tiết về sự phân bố trong các mô vẫn chưa được biết.

gl

- Chuyển hóa: chưa được làm rõ.

oo

- Thải trừ: AMB bài tiết rất chậm qua thận, với 2 – 5% liều đã dùng bài tiết dưới

G

dạng hoạt tính sinh học. Sau khi ngừng điều trị, vẫn có thể tìm thấy thuốc trong nước tiểu ít nhất sau 7 tuần. Có thể do vậy mà amphotericin có nguy cơ gây độc cao với thận. Không loại được AMB ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách máu [2].

1.1.5. Chỉ định - Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans ở miệng và đường tiêu hóa.

3

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Thuốc tiêm tĩnh mạch amphotericin B thông thường dùng điều trị nhiễm khuẩn nấm

hệ

thống

nặng

do

nấm

Aspergillus,

Blastomyces,

Candida,

Coccidioidesimmitis, Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.

- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid:được chỉ định cho những trường hợp đã được điều trị bằng AMB thông thường mà bị thất bại hoặc những trường hợp

hơ

1.1.6. Tác dụng không mong muốn (thƣờng gặp) - Phản ứng chung: Rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp.

n

mà amphotericin B thông thường có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [2].

Q uy

N

- Máu: Thiếu máu đẳng sắc, kích thước hồng cầu bình thường và hồi phục được.

- Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn.

m

- Chuyển hóa: Rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết.

ạy

1.1.7. Liều dùng Đường tiêm tĩnh mạch:

Kè

- Tiết niệu: Giảm chức năng thận kèm theo tăng creatinin và urê huyết [2].

m /+

D

- AMB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách

co

1 ngày.

gl

mg/kg/ngày.

e.

- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4

oo

- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.

G

Đường uống:

- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.

- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.

- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [2].

4

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trƣờng Theo tài liệu [16],[18], [24], hiện nay có các chế phẩm thương mại khác nhau của AMB trên thị trường có sử dụng chất mang lipid dưới đây. Chúng khác nhau về hình thái, kích thước tiểu phân,chất mang và hàm lượng dược chất: - AmBisome® (nghiên cứu sản xuất bởi công ty dược phẩm Nexstar) có cấu trúc dạng liposome một lớp. Chất mang là HSPC, DSPG, cholesterol. Kích thước tiểu phân 80nm. Dạng bào chế: bột đông khô.

n

- AmphocilTM (nghiên cứu và sản xuất bởi Zodiac Laboratory), Amphotec®

hơ

(nghiên cứu và sản xuất bởi Liposome Technology Inc. ) có cấu trúc phức hợp

N

có hình đĩa, chất mang lipid, cholesterol sulfat. Kích thước tiểu phân 0,12-0,14

Q uy

µm. Dạng bào chế: bột đông khô.

- Abelcet® (nghiên cứu và sản xuất bởi The Liposome Company Ltd) có cấu

m

trúc là phức hợp dạng chuỗi, KTTP từ 1,6 µm đến 11µm và Ampholip (thuốc

Kè

generic, sản suất bởi Bharat serums and vaccines Limited Ambernath, Ấn Độ)

ạy

có cùng chất mang là DMPC, DMPG với tỉ lệ DMPC:DMPG = 7:3, tỉ số mol

D

AMB/phospholipid là 1:1. Dạng bào chế: hỗn dịch tiêm.

m /+

1.2. Phức hợp phospholipid chứa amphotericin B 1.2.1. Nguyên lý hình thành phức hợp phospholipid amphotericin B

co

Phân tử Amphotericin B có tính lưỡng thân, một đầu chứa nhiều nhóm

e.

hydroxyl thân nước, một đầu là một chuỗi hydro carbon chứa nhiều nối đôi đơn

gl

luân phiên thân dầu. Trong môi trường nước và ở điều kiện thích hợp, khi tỉ lệ

oo

%mol AMB/phospholipid dưới 25%, AMB sẽ liên kết giới hạn ở dạng monomer

G

với phospholipid tạo thành liposome. Nhưng ở tỉ lệ %mol AMB/phospholipid từ 25% đến 100%, AMB sẽ liên kết với phospholipid để tạo thành cấu trúc dạng chuỗi.

Bằng các phương pháp quan sát thích hợp, các nhà nghiên cứu đã suy đoán rằng, khi tỉ lệ %mol AMB/phospholipid tăng quá 25%, AMB đủ khả năng phá vỡ màng phospholipid kép và chen vào màng làm phá vỡ cấu trúc liposome.

Mặt khác, AMB làm cố định phospholipid bằng cách đan xen vào lớp phospholipid kiểu ngón tay đan vào nhau. Phần polyen thân dầu của phân tử

5

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

AMB liên kết với chuỗi hydrocarbon của lipid, phần thân nước chứa các nhóm hydroxyl hướng về phía lõi, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về nhóm amin của phân tử AMB, hình thành một hình trụ tròn. Các hình trụ tròn xếp cạnh nhau

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

hình thành phức hợp lipid AMB có hình dải ruy băng [12].

Hình 1.1. Cấu trúc giả định của phức hợp lipid AMB [22]

e.

co

1.2.2. Tá dƣợc tạo phức Phospholipid sử dụng để chế tạo phức hợp lipid bao gồm:

gl

phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylethanolamin

oo

(PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidic acid (PA),

G

sphingomyelin (SPM), có thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp. Các phospholipid có thể là phospholipid tự nhiên hoặc chiết xuất từ tự nhiên như từ trứng, đậu nành. Đại diện tốt nhất là phospholipid Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) và Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) sử dụng hỗn hợp và tốt nhất là ở tỉ lệ mol DMPC:DMPG=7:3. Các phospholipid bão hòa như là hydrogenate soy phosphatidylcholin có thể sử dụng [12]. Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen

6

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hóa (HSPC)cũng được dùng phối hợp với Distearoyl Phosphatidyl Glycerol (DSPG) và tốt nhất ở tỉ lệ mol HSPC:DSPG=7:3 [4].

hơ

n

Hình 1.2. Phân tử HSPC và DSPG

N

HSPC có các ưu điểm sau: bền về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu

Q uy

nành chưa hydrogen hóa do hạn chế được các quá trình peroxyd hóa gốc acid béo chưa no, do đó giúp màng lipid bền vững hơn, hạn chế hỏng màng gây rò rỉ

m

dược chất [3], [25].

Kè

DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của phức hợp lipid AMB theo cơ chế sau: ở pH trung tính, DSPG có một nhóm phosphat bị ion hóa

ạy

do đó, phân tử tích điện âm. Khi AMB đượcphân tán trong dung môi được acid

m /+

D

hóa, các proton trong môi trường sẽ có xu hướng chuyển giao cho các nhóm amin của amphotericin B. Kết quả là các phân tử AMB sẽ tích điện dương. Do

co

đó sự tích điện trái dấu, các phân tử thu hút nhau, các nhóm tích điện trái dấu của

e.

chúng tạo thành một cặp ion. Như vậy, sự hấp dẫn phân tử giữa AMB và phân tử

gl

DSPG được tăng lên rất nhiều. Các chuỗi hydrocarbon béo của các phospholipid

oo

bị thu hút bởi tương tác kỵ nước vào chuỗi dài của liên kết đôi không có nhóm

G

thế của polyene [29].

Việc lựa chọn phospholipid cho thành phần của phức hợp lipid AMB là

rất quan trọng, ảnh hưởng đến các đặc tính của phức hợp. Vì vậy, việc lựa chọn phải căn cứ trên các đặc điểm sau: -Mức

độ

bão

hòa

của

lipid:

phospholipid

không

bão

hòa

(như

phosphatidylcholin lòng đỏ trứng, phosphatydylglycerol,…) dễ bị peroxyd hóa dẫn đến hỏng màng, rò rỉ dược chất. Vì vậy, phospholipid bão hòa (như

7

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

dipalmytoyl phosphatidylcholin, dipalmitidyl phosphatidic,…) được sử dụng nhiều hơn [3],[29].

-Nhiệt độ chuyển pha (TC): liên quan đến hiện tượng chuyển pha của phospholipid. Ở dưới nhiệt độ chảy, phospholipid ở trạng thái gel có cấu trúc bền chặt, khó thấm, còn ở trên nhiệt độ chuyển pha, phospholipid chuyển sang trạng thái lỏng với cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo [3].

- Độ tinh khiết: tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng mà yêu cầu nguyên

hơ

n

liệu có độ tinh khiết khác nhau.

Q uy

N

1.2.3. Độ ổn định Tá dược tạo phức là phospholipid nên phức hợp lipid cũng có đặc tính về

độ ổn định như liposome là kém bền cả về mặt vật lý và hóa học trong quá trình

m

bảo quản [3].

Kè

+ Về hóa học: phospholipid là hợp chất dễ bị oxy hóa và thủy phân. Quá trình oxy hóa tăng nhanh do sự tác động của các yếu tố như pH môi trường, nhiệt độ,

ạy

nồng độ đệm, ion kim loại, sự tích điện của lớp phospholipid kép…Sự oxy hóa

D

xảy ra mạnh nhất ở các phospholipid không no và cũng có thể xảy ra ở

m /+

phospholipid no nếu ở nhiệt độ cao. Bảo quản ở nhiệt độ thấp, bảo vệ tránh ánh sáng và oxy môi trường được cho là sẽ làm chậm quá trình oxy hóa. Ngoài ra, có

co

thể cho thêm các chất chống oxy hóa (α-tocoferol, BHA, BHT…), sử dụng

e.

EDTA tạo phức loại trừ ion kim loại, dùng khí trơ như nitơ trong quá trình bào

oo

gl

chế cũng làm giảm đáng kể quá trình oxy hóa [3],[26]. + Về vật lý: sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số

G

PDI, sự tích điện bề mặt. Trong quá trình bảo quản, có thể xảy ra sự kết tụ của các tiểu phân phức hợp lipid. Nếu sử dụng phospholipid có nhiệt độ chảy thấp để bào chế phức hợp thì có thể xảy ra hiện tượng chuyển pha (từ pha gel có cấu trúc bền chặt sang pha lỏng có dạng liên kết lỏng lẻo) trong quá trình bảo quản.

Ngoài ra, tính thấm của phức hợp lipid cũng giống như liposome phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loại phospholipid, hàm lượng và tính chất của dược chất cũng như

8

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

điều kiện bảo quản. Bảo quản ở nhiệt độ thấp làm cho phospholipid ổn định hơn do đó kéo dài được tuổi thọ của chế phẩm [3].

1.2.4. Ƣu, nhƣợc điểm Bảng 1.1. So sánh ưu nhược điểm giữa liposome và phức hợp lipid AMB ƯU, NHƯỢC ĐIỂM

Liposome

Phức hợp

TLTK

Có

Có

[34]

ƢU ĐIỂM

hơ

hợp sinh học cao do có tá dược là

n

Là hệ vận chuyển thuốc có tính tương

phospholipid

Q uy

N

Làm giảm độc tính của thuốc, tăng hiệu quả điều trị do làm thay đổi phân bố sinh học của dược chất có độc tính cao (giảm

Có

[3]

Có

Có

[3]

Thấp

Cao

[11],

(<9%)

(25-100%)

[22]

m

Có

Kè

phân bố ở cơ quan lành, tăng phân bố ở cơ quan bệnh)

ạy

Dược chất được bảo vệ tránh tác động của

D

ngoại môi trong quá trình bảo quản, đặc

Tỉ lệ dược chất

co

sinh học của cơ thể

m /+

biệt là trong quá trình dẫn thuốc tới đích

gl

e.

(%mol dược chất/lipid)

oo

Tương đương

G

Hiệu quả điều trị

[11]

liposome

Khả năng giảm độc tính trên thận

Có

Cao hơn liposome

[11]

NHƢỢC ĐIỂM Chỉ thích hợp với qui mô phòng thí

Có

nghiệm, rất khó để sản xuất qui mô lớn

9

Có

[3], [32]

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người

Có

Có

[7]

Có

Có

[3]

sử dụng và môi trường Độ ổn định thấp, kém ổn định về mặt vật lý và hóa học. Tá dược là phospholipid dễ bị ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, vi sinh của môi trường do đó tuổi thọ ngắn.

n

liposome

[11]

(< 11 µm)

1.2.5. Bào chế phức hợp lipid chứa AMB

m

1.2.5.1. Tạo phức hợp lipid chứa AMB thô

Q uy

N

(< 300nm)

hơ

Nhỏ

Kích thước tiểu phân

To hơn

Kè

Phức hợp lipid chứa AMB được bào chế bằng các qui trình giống với các qui trình bào chế liposome. Tùy thuộc vào tỉ lệ mol dược chất/lipid mà tạo ra

ạy

liposome hay tạo ra phức hợp lipid chứa tỉ lệ AMB cao. Phương pháp bào chế

m /+

D

được đề cập đến là phương pháp hydrat hóa film, phương pháp thay đổi dung môi (tiêm polyol), phương pháp siêu âm, đông khô [11].

co

Với phương pháp hydrat hóa film, dược chất được hòa tan trong dung môi

e.

như là DMSO hoặc methanol. Lipid (tốt nhất là DMPC:DMPG ở tỉ lệ 7:3) được

gl

hòa tan trong dung môi hữu cơ như là methylen chlorid, sau đó phối hợp dung

oo

dịch lipid vào dung dịch thuốc. Cất quay dưới áp suất giảm để bốc hơi dung môi,

G

kết quả tạo thành màng film dược chất-lipid. Hydrat hóa film bằng dung dịch đệm phosphat (PBS) hoặc muối, đệm glycin để tạo phức hợp lipid AMB. 1.2.5.2. Đồng nhất và giảm kích thƣớc phức hợp Mục đích của quá trình này là tạo ra phức hợp có kích thước nhỏ đồng đều và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lí, cải thiện hình thức cho chế phẩm.

10

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Có bốn phương pháp để đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân phức hợp lipid là đùn ép qua màng, siêu âm, đồng nhất hóa và đồng nhất hóa kết hợp đùn qua màng [11]. Đùn ép Hỗn dịch phức hợp lipid được đùn ép qua màng polycarbonat có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân gần với kích thước của lỗ màng. Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch

n

phức hợp lipid được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, sắp xếp đồng trục,

hơ

kích thước xác định, ở áp suất vừa phải và với số lần thích hợp. Khi đó các tiểu

N

phân có kích thước lớn hơn kích thích lỗ màng sẽ được làm nhỏ khi đi qua màng,

Q uy

còn các tiểu phân kích nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng, do đó thu được hỗn dịch phức hợp có kích thước đồng nhất. Ưu điểm của

m

phương pháp này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ [19],[27].

Kè

Siêu âm

ạy

Siêu âm là một trong những phương pháp phổ biến để làm giảm kích

D

thước tiểu phân. Các tiểu phân phức hợp lipid có đường kính nhỏ hơn 11µm có

m /+

thể được tạo ra nhờ siêu âm. Trong các thông số kỹ thuật thì tần số và năng lượng là hai trong số các thông số quan trọng của siêu âm. Siêu âm tần số thấp

co

có thể làm giảm kích thước tiểu phân nhanh hơn trong khoảng kích thước mong

e.

muốn. Thời gian ngắn sử dụng năng lượng siêu âm mạnh có hiệu quả hơn so với

gl

thời gian dài sử dụng năng lượng siêu âm yếu.

oo

Nhược điểm của phương pháp: có hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá

G

trình siêu âm và giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm, hiệu suất nạp thuốc giảm do rò rỉ được chất trong quá trình siêu âm. So với phương pháp đùn ép, phương pháp siêu âm tiến hành trong thời gian ngắn hơn nhưng không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ [19],[25],[27]. Đồng nhất hóa áp suất cao Nguyên tắc của phương pháp là nén hỗn dịch qua một khe hẹp có kích thước xác định trong thiết bị đồng nhất hóa ở áp suất khoảng 200 bar. Nén tuần

11

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hoàn nhiều vòng cho đến khi thu được kích thước mong muốn, trung bình từ 46µm [3], [11]. Ưu điểm của phương pháp là dễ áp dụng nhưng nhược điểm là cấu trúc dễ bị phá vỡ dưới áp suất cao [3]. Đồng nhất hóa bằng nghiền tốc độ cao Tiểu phân được nghiền đến khi tạo được kích thước mong muốn, khi mà 90% tiểu phân có kích thước đường kính dưới 10µm, tốt nhất là từ 4-6 µm. Các

n

tiểu phân được nghiền một lần hoặc nhiều lần qua máy, tùy thuộc vào kích thước

hơ

và độ đồng nhất mong muốn. Thiết bị nghiền tốt nhất là máy xay keo Grifford

N

Wood. Nếu cần thiết thì các tiểu phân bé hơn hoặc lớn hơn được loại bỏ bằng lọc

Q uy

tiếp tuyến [11].

Đồng nhất hóa bằng nghiền tốc độ cao kết hợp đùn qua màng

m

Để có tiểu phân với kích thước nhỏ hơn, sau khi đồng nhất hóa bằng

Kè

phương pháp nghiền keo, các tiểu phân phức hợp lipid được lọc tiếp tuyến với

ạy

màng lọc có kích cỡ lỗ lọc 5 µm. Dịch lọc tiếp tục được đùn qua màng

D

polycarbonat có kích cỡ lỗ lọc 3 µm hoặc 1,2 µm [11].

m /+

Ưu điểm của phương pháp kết hợp nghiền tốc độ cao và đùn qua màng là nhất cao [11].

co

vừa tạo được kích thước tiểu phân có kích thước mong muốn vừa có độ đồng

e.

1.2.6. Phƣơng pháp đánh giá cấu trúc của phức hợp lipid

gl

Các phương pháp để mô tả cấu trúc phức hợp lipid chứa AMB bao gồm

oo

chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử, phân tích nhiệt quét vi sai (DSC), đo phổ

G

cộng hưởng từ hạt nhân phospho đồng vị 31 (31P-NMR), nhiễu xạ tia X, đo thể tích bắt giữ, ly tâm gradient tỉ trọng[11], [13].

Trong các nghiên cứu về phức hợp lipid với dược chất khác, nhiều tác giả cũng đã sử dụng các phương pháp nhiễu xạ tia X, phương pháp phổ hồng ngoại IR, phương pháp DSC, phương pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử để chứng minh sự tạo thành phức hợp [14], [21], [30], [31].

12

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.2.6.1. Phƣơng pháp chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử Mục đích của phương pháp này là để quan sát hình thái của phức hợp cũng như chứng minh phương pháp bào chế đã tạo ra phức hợp lipid AMB chứ không phải là liposome [11].

Có hai phương pháp chụp khác nhau: phương pháp khắc lạnh (Freezeetching) và khắc nóng (heat-etching). Nhưng nguyên lí chung là: Mẫu được làm lạnh đột ngột trong ni-tơ lỏng hoặc propanol lỏng, sau đó bẻ gãy cấu trúc, lộ diện

n

cấu trúc không gian của mặt cắt gãy. Với phương pháp khắc lạnh: mặt cắt gãy

hơ

được in hình lên platin carbon, hình sao chép lại rồi được quan sát dưới kính

N

hiển vi điện tử. Với phương pháp khắc nóng: mặt cắt gãy được gia nhiệt để nước

Q uy

đá thăng hoa, lộ diện rõ hơn cấu trúc không gian của mẫu cần quan sát. Soi mẫu dưới kính hiển vi điện tử [9].

m

Nghiên cứu về phức hợp lipid rifampicin, Singh C. và cộng sự (2014) đã

Kè

dùng phương pháp chụp kính hiển vi điện tử gia nhiệt (Hot stage microscopy) để

ạy

quan sát cấu trúc của rifampicin trong phức hợp so sánh với rifampicin tự do.

D

Kết quả cho thấy rifampicin trong phức hợp ở dạng vô định hình khác với dạng

m /+

tinh thể của dược chất ban đầu [30].

1.2.6.2. Phƣơng pháp phân tích nhiệt quét vi sai

co

Mục đích của phương pháp là để chứng minh không có lipid tiền chuyển

e.

pha và chuyển pha [11].

gl

Nguyên lí của phương pháp:

oo

Bình thường, màng phospholipid ở trạng thái gel với sự sắp xếp trật tự của

G

các phân tử phospholipid. Khi gia nhiệt, màng phospholipid kép chuyển từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng với sự sắp xếp lộn xộn của các phân tử lipid, làm ảnh hưởng tới lực tương tác Van der Waals giữa các chuỗi hydrocarbon, làm tăng sự linh động của màng lipid. Khi dược chất liên kết chặt chẽ vào trong lớp phospholipid, cụ thể là phần thân dầu của phân tử AMB liên kết với chuỗi hydrocarbon của lipid, phần thân nước chứa các nhóm hydroxyl hướng về phía lõi, gốc phosphat của phân tử lipid hướng về nhóm amin của phân tử AMB, làm

13

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

tăng sự chặt chẽ của cấu trúc màng phospholipid kép do đó làm thay đổi lớn nhiệt chuyển pha [10].

b. Pha tinh thể lỏng

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

a. Pha gel

e.

co

Hình 1.3. Cấu trúc của màng phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha [10]

gl

Trong nghiên cứu phức hợp lipid vinorelbine (VB) của Li Y. và cộng sự

oo

(2013), để chứng minh sự tạo thành phức hợp, tác giả dùng phương pháp phân

G

tích nhiệt vi sai cho các mẫu dược chất VB, phospholipid là lecithin chiết xuất từ lòng đỏ trứng (Lipoid E80®) , hỗn hợp vật lý và mẫu phức hợp lipid VB. Kết quả cho thấy phổ nhiệt vi sai của phức hợp lipid VB không có peak nhiệt chuyển pha của phospholipid chứng tỏ phospholipid đã chuyển sang thể vô định hình [21].

1.2.6.3. Phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân 31P-NMR Mục đích của phương pháp là để chứng minh đặc tính bị bất động của phospholipid kép khi liên kết chặt chẽ với các phân tử dược chất [11].

14

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nguyên lí của phương pháp: Phospholipid khi ở dạng lipid kép thì có tính chất đối xứng trục, do đó phổ cộng hưởng từ hạt nhân 31P-NMR doãng rộng bất đối xứng và có vai doãng về phía trường thấp. Khi ở dạng phospholipid lục giác, trật tự hai chiều của cấu trúc lipid hình trụ cũng có đối xứng trục nhưng với sự thay đổi không đẳng hướng hóa học khác, sự thay đổi đó gây nên phổ hẹp hơn về phía trường thấp với vai ở trường cao. Ở các dạng khác của phospholipid như là micell

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

thì xuất hiện phổ đối xứng trung tâm do sự di chuyển đẳng hướng [23], [8].

co

Hình 1.4. Biểu đồ tượng trưng cho các pha phospholipid và phổ 31P-NMR tương

gl

e.

ứng. a: pha phospholipid kép; b: pha phospholipid lục giác; c: pha xảy ra sự chuyển động đẳng hướng [8].

oo

1.2.6.4. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại IR

G

Mục đích của phương pháp là để chỉ ra sự tương tác của phân tử dược

chất với phân tử phospholipid trong phức hợp.

Nguyên lí của phương pháp: Dựa trên nguyên lí tạo thành phức hợp, khi tỉ lệ mol AMB:lipid là 1:1, các gốc phosphat trong phân tử phospholipid hướng về nhóm amin của phân tử AMB tạo sự tương tác liên phân tử [12] làm mất các đỉnh hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức trong phân tử phospholipid hoặc dược chất.

15

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Khi nghiên cứu về phức hợp lipid tamoxifen, Jena S.K. và cộng sự (2014) đã dùng phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi (FTIR) để chứng minh sự tạo thành phức hợp. Trong phổ đồ hấp thụ hồng ngoại (hình 1.5), mẫu phức hợp lipid tamoxifen không xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của tamoxifen chứng

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

tỏ tamoxifen đã tương tác chặt chẽ với phospholipid để tạo thành phức hợp [14].

m /+

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hồng ngoại của tamoxifen (A), phospholipid (B), hỗn hợp vật lý (C) và phức hợp lipid tamoxifen (D)[14]

co

Tương tự, Singh D. và cộng sự (2012) đã mô tả đặc tính của phức hợp

e.

lipid quercetin bằng phổ hấp thụ hồng ngoại và chỉ ra sự tương tác giữa nhóm

gl

hydroxyl và nhóm ceton của quercetin với nhóm phân cực của phospholipid là

oo

phosphatidylcholin chiết xuất từ đậu tương (Lipoid S-80) làm thay đổi peak hấp

G

thụ của quercetin [31].

1.2.6.5. Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X Mục đích của phương pháp là để chứng minh sự chuyển dạng thù hình của dược chất hoặc phospholipid hoặc để chỉ ra sự liên kết chặt chẽ giữa dược chất với phospholipid khi tạo thành phức hợp [21].

Li Y. và cộng sự (2013) khi chụp phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu dược chất, phospholipid Lipoid E80®, hỗn hợp vật lý, phức hợp lipid vinorelbine cho

16

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

thấy rằng: ở phổ nhiễu xạ của phospholipid và hỗn hợp vật lý có đỉnh nhiễu xạ của phospholipid nhưng đỉnh nhiễu xạ đó biến mất ở phức hợp phospholipid vinorelbine. Điều đó chứng tỏ rằng đã xảy ra sự liên kết chặt chẽ giữa dược chất

N

hơ

n

vinorelbine và phospholipid làm mất đỉnh nhiễu xạ của phospholipid [21].

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

Hình 1.6. Phổ nhiễu xạ tia X của vinorelbine (A), phospholipid (B), hỗn hợp vật lý (C) và mẫu phức hợp lipid vinorelbine (D)[21] Singh C. và cộng sự (2014) sau khi bào chế phức hợp lipid rifampicin từ Lipoid S-75 và rifampicin theo tỉ lệ mol 1:1 đã chứng minh sự tạo thành phức hợp bằng đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu rifampicin, hỗn hợp vật lý, phospholipid Lipoid S-75 và mẫu phức hợp lipid rifampicin. Trên giản đồ nhiễu xạ, mẫu phức hợp không thấy đỉnh nhiễu xạ của firampicin và phospholipid. Điều đó chứng tỏ rifampicin đã liên kết chặt chẽ với phospholipid để tạo thành phức hợp (hình 1.7) [30].

Hình 1.7. Phổ nhiễu xạ của rifampicin (A), hỗn hợp vật lý (B), (C), phức hợp lipid rifampicin (D)[30].

17

phospholipid

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

1.3. Một số nghiên cứu về phức hợp lipid AMB Nghiên cứu ở nƣớc ngoài Janoff và cộng sự (2002) đã tiến hành bào chế phức hợp lipid AMB bằng phương pháp hydrat hóa film. Dung môi hòa tan dược chất được sử dụng là DMSO hoặc methanol. Lipid sử dụng là DMPC và DMPG với tỉ lệ mol cho kết quả tốt nhất là 7:3. Dung dịch hydrat hóa film là đệm phosphat, hoặc dung dịch muối hoặc dung dịch đệm glycine. Bằng phương pháp này, tỉ lệ phần trăm mol

n

dược chất/lipid để tạo phức hợp là từ 6-50%, tốt nhất là từ 30-50%. Với tỉ lệ

hơ

dược chất/lipid đó thì phức hợp lipid AMB tạo ra về căn bản là không có

N

liposome. Nghĩa là không có quá 10% khối lượng liposome mà tốt nhất là không

Q uy

có quá 3% liposome [11]. Để làm giảm kích thước tiểu phân, tác giả dùng máy nghiền keo để nghiền nhỏ tiểu phân trong khoảng 30 phút. Để chọn lựa các tiểu

m

phân trong khoảng tối ưu, tác giả dùng phương pháp lọc tiếp tuyến với hai cỡ lỗ

Kè

lọc khác nhau, lần đầu lọc với màng tiếp tuyến có kích cỡ lỗ lọc 5 µm, dịch lọc

ạy

lại tiếp tục lọc qua màng lọc tiếp tuyến có kích cỡ 2 µm.

D

Larabi và cộng sự (2004) đã bào chế phức hợp lipid chứa AMB bằng

m /+

phương pháp bốc hơi dung môi pha đảo. AMB được hòa tan trong methanol sau đó cho vào dung dịch lipid (DMPC:DMPG ở các tỉ lệ khác nhau) đã hòa tan

co

trong dung môi hữu cơ. Thêm nước tinh khiết và khuấy từ ở nhiệt độ phòng. Cô

e.

áp suất giảm loại dung môi thu được phức hợp lipid. Tỉ lệ mol các thành phần

gl

AMB:DMPC:DMPG = 7:3:5 tương tự như thành phần của Abelcet. Soi kính

oo

hiển vi điện tử cho thấy cấu trúc hình đĩa mỏng [20].

G

Janoff và cộng sự cũng đã nghiên cứu về cấu trúc của phức hợp lipid có tỉ lệ

mol DMPC:DMPG = 7:3 cố định nhưng thay đổi tỉ lệ mol AMB trên tổng số lipid khác nhau. Kết quả cho thấy với tỉ lệ mol AMB <5%, cấu trúc pha gel của phospholipid ở 20oC sẽ bị sang pha tinh thể lỏng ở nhiệt độ 25oC. Nhưng với tỉ lệ mol AMB 25% và 50%, phức hợp lipid không có nhiệt chuyển pha ở 40oC [13].

Các nghiên cứu trong nƣớc

18

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nguyễn Thị Mỹ (2014) đã nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa AMB có tỉ lệ mol HSPC và DSPG là 7:3, môi trường phân tán là đệm phosphat pH 7,4, tỉ lệ dược chất/tổng số mol lipid là 25% cho hiệu suất nạp dược chất cao (87,06%), kích thước tiểu phân là 648,3nm; phân bố kích thước tiểu phân tương đối đồng đều (PDI=0,363) [4].

Tuy nhiên nghiên cứu trên chưa chỉ ra sự khác nhau về cấu trúc giữa liposome AMB và phức hợp lipid AMB.

n

Chưa có nghiên cứu nào trong nước về dạng bào chế thuốc tiêm hỗn dịch

hơ

chứa phức hợp lipid AMB được công bố.

N

1.4. Lợi ích của phƣơng pháp bào chế tạo phức hợp với lipid

Q uy

- Giảm độc tính của dược chất

Phức hợp lipid AMB là dạng đầu tiên trong các công thức bào chế của

m

AMB dựa trên lipid nhằm giảm độc tính mà không làm giảm hiệu quả điều trị.

Kè

Nhờ sự liên kết chặt chẽ giữa AMB và hệ lipid mang dược chất mà làm thay đổi

ạy

đặc tính dược động học và sự phân bố tới mô của AMB. Độc tính của AMB bị

D

hạn chế bởi sự phân bố một cách đặc biệt tới đích tác dụng là vùng nhiễm nấm

m /+

co e. gl

G

oo

Nồng độ AMB trong mô (µg/g)

nội tạng sâu như gan, lách, phổi.

Hình 1.8. Nồng độ AMB tìm thấy trong các mẫu xét nghiệm tử thi [22].

19

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nghiên cứu nồng độ AMB phân bố tới các mô trong cơ thể người bằng xét nghiệm tử thi của các bệnh nhân có nhiễm nấm cơ hội: - Nhóm 1: gồm 3 bệnh nhân dùng phức hợp lipid AMB. Trong đó 1 bệnh nhân dùng 3 liều ở mức 5,3mg/kg/ngày, 2 bệnh nhân dùng liều tích lũy AMB là 1200mg và 1500mg.

- Nhóm 2: gồm 3 bệnh nhân dùng liposome AMB với liều tích lũy AMB là 820-3428mg.

n

- Nhóm 3: gồm 8 bệnh nhân dùng AMB qui ước với liều tích lũy là từ

hơ

206-2688mg.

N

Kết quả cho thấy rằng: so với AMB qui ước, AMB trong phức hợp lipid

Q uy

có nồng độ cao hơn ở phổi (trung bình là 17 lần), gan (2 lần) và lách (9 lần), đồng thời cao gấp 14 lần nồng độ AMB ở phổi của dạng bào chế dựa trên lipid

m

khác (liposome). Khả năng làm giảm độc tính trên thận của phức hợp lipid AMB

Kè

nhiều hơn so với dạng AMB qui ước đã mang lại sự an toàn cho bệnh nhân có

ạy

chức năng thận suy yếu. Điều này cho phép sử dụng phức hợp lipid AMB với

Tamoxifen

m /+

- Tăng sinh khả dụng

D

liều cao hơn do đó tăng hiệu quả điều trị [22]. thuộc

nhóm

II

trong

hệ

thống

phân

loại

BCS

co

(Biopharmaceutics Classification System), khó tan, lại bị chuyển hóa bởi enzym

e.

đường ruột nên sinh khả dụng đường uống thấp. Để cải thiện sinh khả dụng

gl

đường uống, Jena S.K. và cộng sự (2014) đã bào chế dạng phức hợp lipid

oo

tamoxifen (phospholipid là Phospholipon®80H) nhằm tăng độ tan của dược chất

G

trong dạ dày, vì vậy tăng sinh khả dụng đường uống. Thử nghiệm độ tan trong môi trường acid pH 1,2, môi trường đệm phosphat pH 6,8 và môi trường nước cất. Kết quả cho thấy phức hợp lipid tamoxifen tan tốt hơn tamoxifen tự do trong môi trường acid pH 1,2 nhưng không cao hơn trong môi trường pH 6,8. Trong môi trường nước cất, phức hợp lipid tamoxifen có độ tan cao gấp 3 lần so với tamoxifen tự do. So sánh sinh khả dụng đường uống giữa tamoxifen và phức hợp lipid tamoxifen cho thấy dạng phức hợp có sinh khả dụng cao hơn thể hiện ở

20

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

diện tích dưới đường cong của phức hợp lipid tamoxifen (24,19µg.h/ml) trong 72 giờ cao hơn tamoxifen (8,31µg.h/ml), nồng độ đỉnh (Cmax) của phức hợp lipid tamoxifen cao gấp 2 lần so với tamoxifen. Mặt khác thời gian bán thải (t 1/2) của phức hợp (22,47 giờ) dài hơn so với của tamoxifen (13,93 giờ) [14].

Singh C. và cộng sự (2014) nghiên cứu sinh khả dụng đường uống của phức hợp lipid-rifampicin so sánh với rifampicin tự do bằng cách xác định nồng độ dược chất trong huyết tương chuột cống sau khi uống 48 giờ. Kết quả cho

hơ

n

thấy phức hợp lipid-rifampicin có nồng độ đỉnh (54,3µg/ml) cao hơn rifampicin (48,5µg/ml). Thời gian đạt nồng độ đỉnh của phức hợp là 6 giờ trong khi của

Q uy

N

rifampicin tự do là 4 giờ. Sinh khả dụng tương đối của phức hợp lipid rifampicin so với rifampicin tự do là 319%. Sinh khả dụng của phức hợp tăng có thể là do

m

phospholipid làm tăng mức độ và tốc độ hấp thu dược chất qua niêm mạc ruột [30].

Kè

- Giảm kích ứng nơi tiêm thuốc

Li Y. và cộng sự (2013) đã bào chế nhũ tương tiêm chứa phức hợp lipid

ạy

vinorelbine. Để đánh giá khả năng gây kích ứng nơi tiêm thuốc khi tiêm tĩnh

D

mạch, tác giả đã tiêm vào tĩnh mạch tai thỏ 3 mẫu khác nhau bao gồm nước

m /+

muối sinh lý, Navelbine® (vinorelbine tartrat trong nước cất) và nhũ tương tiêm chứa phức hợp lipid vinorelbine. Kết quả là xuất hiện kích ứng mạnh khi tiêm

co

Navelbine® bao gồm các dấu hiệu ứ máu, phù, chai cứng. Ngược lại, nhũ tương

e.

tiêm chứa phức hợp lipid vinorelbine chỉ xuất hiện những kích ứng nhẹ. Sau khi

oo

gl

tiêm bắp, không thấy dấu hiệu hoại tử nơi tiêm thuốc hoặc quanh mô tiêm đối với nước muối sinh lí và thuốc tiêm nhũ tương chứa phức hợp lipid vinorelbine.

G

Tuy nhiên lại xuất hiện kích ứng nặng như sưng phồng, căng cứng, bạc màu da khi tiêm Navelbine® [21].

21

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: phức hợp lipid AMB - Nguyên liệu: Bảng 2.2. Nguyên liệu Tên nguyên liệu

STT

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Trung Quốc

USP

Merck

TKPT

Amphotericin B

2

Acetonitril

3

Acid hydrochlorid đặc

Trung Quốc

4

Chloroform

Trung Quốc

NSX

5

Distearoyl phosphatidylglycerol

Lipoid – Đức

NSX

6

Dinatri EDTA

Trung Quốc

TKHH

7

Dimethyl sufoxide

Jansen – Đức

NSX

8

Ethanol

Trung Quốc

TKHH

9

Hydrogenated soy phosphatidylcholine

Lipoid – Đức

NSX

10

Isopropanol

Trung Quốc

TKHH

11

Kali dihydrophosphat

Trung Quốc

TKHH

12

Methanol

Trung Quốc

TKHH

13

Methanol

J.C Baker

TKPT

14

Natri hydroxyd

Trung quốc

TKHH

15

Nước cất pha tiêm

Việt Nam

DĐVN

Ấn độ

NSX

NSX

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

1

Thuốc đối chiếu: Ampholip Số lô: A01615014

G 16

Ngày sản xuất: 10/2015 Hạn dùng: 09/2017

-Phƣơng tiện nghiên cứu: + Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000 ml (Buchi – Đức).

22

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

+ Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Mastersizer 3000 (Malvern, Anh). + Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Chemstation 1260 (Agilent, Mỹ) + Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex-c5 (Avestin – Canada). + Máy đồng nhất hóa tốc độ cao 1000X (UNI-DRIVE, Đức) + Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ). + Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone 50 kD, diện tích lọc 28 cm2 (Spectrumlab, Mỹ).

n

+ Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H.

N

+ Máy đo pH InoLab

hơ

+ Máy siêu âm cầm tay UP200Ht (Hielsch, Đức)

Q uy

+ Máy phân tích nhiệt vi sai DSC 60 (SHIMADZU, Nhật) + Máy nhiễu xạ tia X D8 Advance (Brucker, Đức)

m

+ Kính hiển vi điện tử JSM-5410LV (Jeol, Nhật).

ạy

+ Cân phân tích Satorius BP121S

Kè

+ Máy đo phổ hồng ngoại FTIR-1S (SHIMADZU, Nhật)

D

+ Tủ sấy, tủ lạnh

m /+

+ Các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính, nút cao su, nắp nhôm.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

co

2.2.1. Phƣơng pháp bào chế phức hợp lipid AMB

e.

2.2.1.1. Bào chế phức hợp lipid AMB

gl

Phức hợp lipid AMB được bào chế bằng phương pháp thay đổi dung môi

oo

Hòa tan AMB trong dung môi hữu cơ đã được acid hóa đến pH khoảng

G

0,5-1 bằng dung dịch HCl 2,5N trong cùng dung môi hữu cơ, siêu âm cho tan hoàn toàn, được dung dịch 1. Cân và hòa tan bằng siêu âm HSPC, DSPG với tỉ lệ HSPC : DSPG = 7:3 trong hỗn hợp CHCl3:dung môi hòa tan dược chất (1:1), được dung dịch 2. Phối hợp dung dịch 2 vào dung dịch 1, siêu âm để thu được dung dịch đồng nhất 3. Bơm chậm dung dịch 3 vào dung dịch NaCl 0,9% đã gia nhiệt từ 60oC đến 70oC, tốc độ bơm 0,8ml/phút. Chọn kim tiêm có đường kính 0,4mm. Quá trình tiêm mẫu có kết hợp khuấy từ tốc độ chậm và duy trì nhiệt độ

23

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

của hỗn hợp trong khoảng nhiệt độ trên cho đến khi phối hợp hết dung dịch 3.

Bốc hơi dung môi cho đến khi loại hết dung môi.

Hỗn dịch thu được tiếp tục đem làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.2.

2.2.1.2. Phƣơng pháp làm giảm kích thƣớc tiểu phân Phức hợp lipid AMB sau khi bào chế được đồng nhất hóa để làm giảm kích thước tiểu phân bằng các phương pháp sau :

n

- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao trên máy EmulsiFlex-c5 : hỗn dịch

hơ

được đồng nhất nhiều chu kỳ ở áp suất 5000 psi.

N

- Phương pháp đồng nhất hóa tốc độ cao trên máy Uni-drive. Hỗn dịch được

Q uy

đồng nhất hóa ở các mức 15.000 vòng/phút và 4.000 vòng/phút.

- Phương pháp siêu âm trên máy siêu âm cầm tay UP200Ht : hỗn dịch được siêu

m

âm 30 giây rồi nghỉ 30 giây. Tần số và công suất ở hai mức khác nhau là

Kè

80Hz/60W và 50Hz/50W.

ạy

- Phương pháp kết hợp giữa đồng nhất hóa áp suất cao với đùn qua màng. Hỗn

D

dịch sau khi đồng nhất trên máy đồng nhất hóa áp suất cao ở áp suất 5000 psi

m /+

một số chu kì thích hợp rồi tiếp tục đùn qua màng lọc PTFE kích cỡ lỗ lọc 5 µm và màng lọc polycarbonat kích cỡ 0,8 µm với số lần thích hợp.

co

2.2.2. Phƣơng pháp chứng minh phức hợp lipid AMB

e.

2.2.2.1. Phƣơng pháp quét nhiệt vi sai (DSC)

gl

- Mục đích: đánh giá cấu trúc gel của phức hợp lipid.

oo

- Thiết bị : máy phân tích nhiệt vi sai DSC 60 (SHIMADZU, Nhật)

G

- Mẫu phân tích : + Mẫu phân tích gồm mẫu nguyên liệu AMB, HSPC, DSPG, mẫu

liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 25mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol%. + Các mẫu liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 25mol% và phức hợp lipid AMB 100mol% được bào chế chế bằng phương pháp thay đổi dung môi theo mục 2.2.1.1 (chỉ khác về tỉ lệ mol dược chất/lipid lần lượt là 5mol%,

24

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

25mol% và 100mol%) rồi được làm khô theo qui trình sau: Hút khoảng 20ml hỗn dịch mỗi mẫu phân tích (mẫu liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 25mol%, phức hợp lipid AMB 100mol%), cho vào các đĩa thủy tinh khác nhau.

Tiến hành bốc hơi đến khô trong tủ sấy chân không trong vòng 48 giờ, nhiệt độ 40oC, áp suất 0,05atm.

- Tiến hành phân tích mẫu : Lấy khoảng 5-10mg mẫu phân tích cho vào đĩa 250oC với tốc độ tăng nhiệt 5oC/phút, lưu lượng nitơ 40µl/phút.

hơ

2.2.2.2. Phƣơng pháp chụp kính hiển vi điện tử đông lạnh

n

nhôm, hàn kín, đưa vào buồng máy. Tiến hành quét nhiệt từ nhiệt độ phòng đến

N

- Mục đích : Quan sát hình thái cấu trúc phức hợp lipid AMB.

Q uy

- Thiết bị : kính hiển vi điện tử quét JSM-5410LV (Jeol, Nhật).

- Mẫu phân tích : Mẫu phân tích gồm mẫu phức hợp lipid AMB 25mol%, mẫu

m

phức hợp lipid AMB 50mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol%. Các mẫu

Kè

được bào chế chế bằng phương pháp thay đổi dung môi theo mục 2.2.1.1, chỉ

ạy

khác về tỉ lệ mol dược chất/lipid lần lượt là 25mol%, 50mol% và 100mol%.

D

- Tiến hành :

m /+

+ Hút một lượng nhỏ hỗn dịch phức hợp lipid AMB (khoảng 0,5 ml mẫu nghiên cứu) vào xi-lanh.

co

+ Bơm hỗn dịch vào lỗ của đế mẫu (bơm hơi gồ lên so với miệng lỗ,

e.

không để tràn ra ngoài).

oo

đế lạnh.

gl

+ Nhúng giá đỡ mẫu vào ni-tơ lỏng, không nhúng ngập, chờ 5-10 giây cho

G

+ Bơm vài giọt hỗn dịch chồng lên miệng lỗ rồi nhúng ngập vào ni-tơ

lỏng ngay sao cho hỗn dịch đông cứng tạo khối gồ lên hẳn so với miệng lỗ, chờ 5-10 giây. + Tiến hành đưa mẫu vào khoang chứa mẫu, bẻ lạnh, gia nhiệt để nước đá thăng hoa, mạ phủ vàng và soi trên kính hiển vi điện tử quét.

2.2.2.3. Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)

25

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Mục đích: để đánh giá tương tác giữa các nhóm amin (NH2) của AMB với gốc phosphat của lipid.

- Thiết bị: máy đo phổ hồng ngoại FTIR-1S (SHIMADZU, Nhật) - Mẫu phân tích : Mẫu phân tích gồm mẫu HSPC, DSPG, hỗn hợp vật lý, mẫu liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol%. Mẫu hỗn hợp vật lý gồm dược chất AMB, HSPC, DSPG với khối lượng theo công thức bào chế phức hợp lipid AMB 100mol%. Các mẫu liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid

n

AMB 100mol% được chuẩn bị giống mục 2.2.2.1.

hơ

- Tiến hành phân tích mẫu : Lấy khoảng 5-10mg mẫu phân tích, trộn đều và

FTIR-1S. 2.2.2.4 Phƣơng pháp đo phổ nhiễu xạ tia X

Q uy

N

nghiền mịn với KBr, ép thành viên mỏng rồi đo trên máy đo phổ hồng ngoại

m

- Mục đích: để xem sự biến đổi cấu trúc khi tạo thành phức hợp do sự tương tác

Kè

giữa các phân tử AMB với các phân tử phospholipid.

ạy

- Thiết bị: máy chiếu tia X D8 Advance (BRUCKER, Đức)

D

- Mẫu phân tích : Mẫu phân tích gồm mẫu AMB, hỗn hợp vật lý, mẫu trắng, mẫu

m /+

liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100mol%. Mẫu hỗn hợp vật lý gồm dược chất AMB, HSPC, DSPG, natri clorid với khối lượng theo công

co

thức bào chế phức hợp lipid AMB 100mol%. Các mẫu trắng (mẫu giống công

e.

thức bào chế phức hợp lipid AMB 100mol% nhưng không có dược chất AMB),

gl

liposome AMB 5mol%, phức hợp lipid AMB 100mol% được chuẩn bị giống

oo

mục 2.2.2.1.

G

- Tiến hành phân tích mẫu : Lấy khoảng 5-10mg mẫu đã làm khô, cho vào đĩa đồng của thiết bị chiếu tia X. Góc quét từ 5 o - 60 o , tốc độ quét 2 o /phút, nhiệt độ phòng.

26

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 2.2.3.1. Đánh giá hình thức - Bằng cảm quan, hỗn dịch thuốc tiêm chứa phức hợp lipid AMB phải là hỗn dịch màu vàng sáng, không có tinh thể kết tủa, để lâu có thể sa lắng nhưng phân tán lại đồng nhất khi lắc nhẹ.

2.2.3.2 Đánh giá kích thƣớc tiểu phân bằng phƣơng pháp nhiễu xạ ánh sáng động - Mục đích: Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP) qua các thông số về kích

n

thước trung bình theo thể tích (D[4;3]) và 90% tiểu phân có kích thước dưới kích

hơ

thước yêu cầu (Dv(90)), đánh giá phân bố KTTP thông qua chỉ số “span”.

N

- Thiết bị: Máy Mastersizer 3000.

Q uy

- Tiến hành: Cho khoảng 400ml nước siêu lọc vào cốc có mỏ 500ml. Đặt cốc vào máy đo Mastersizer 3000. Nhỏ hỗn dịch phức hợp lipid AMB vào cốc có mỏ cho

m

đến khi độ đục đạt khoảng 20%.

Kè

2.2.3.3. Định lƣợng AMB trong hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

ạy

Phƣơng pháp: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

D

Điều kiện sắc kí

m /+

- Cột sắc kí: cột Cosmosil 5C18 – MS - II, kích thước cột 250 × 4,6 mm; đường kính hạt nhồi 5 µm.

co

- Pha động: hỗn hợp Methanol : Acetonitril (ACN) và dinatri EDTA 0,002

e.

M (pH 5,0) với tỷ lệ 50:30: 20 về thể tích (v/v).

gl

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

oo

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

G

- Detector UV, bước sóng 405 nm.

Pha mẫu chuẩn và mẫu thử Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,005g AMB hòa tan bằng dung môi DMSO trong bình định mức 10ml, bổ sung DMSO đến thể tích vừa đủ, thu được dung dịch gốc có nồng độ 500µg/ml. Hút chính xác 1ml dung dịch thu được, cho vào bình định mức 20ml,

27

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 25µg/ml. Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.

Mẫu thử: Hút chính xác 1 ml mẫu thử, hòa tan bằng DMSO trong bình định mức 10 ml, bổ sung DMSO đến vạch. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên, pha loãng bằng methanol trong bình định mức 20 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Lọc mẫu qua

hơ

Hàm lượng AMB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

n

màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.

Q uy

N

Trong đó:

Ct: nồng độ AMB trong hỗn dịch phức hợp lipid (mg/ml).

m

St: diện tích peak mẫu thử (mAU.s)

Kè

Sc: diện tích peak mẫu chuẩn (mAU.s) mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg).

D

Kt: hệ số pha loãng mẫu thử.

ạy

Vc: thể tích pha mẫu chuẩn (Vc=10ml)

m /+

Kc: hệ số pha loãng mẫu chuẩn

co

Hiệu suất qui trình được tính toán bằng công thức :

e.

Q%=

gl

2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

oo

Ngoài các phương pháp đánh giá phức hợp lipid AMB như hình thức,

G

kích thước tiểu phân, hàm lượng AMB, thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB còn đánh giá các chỉ tiêu như pH, giới hạn thể tích.

- Phương pháp xác định pH hỗn dịch : Theo DĐVN IV - Phương pháp thử giới hạn thể tích thuốc tiêm : Theo DĐVN IV

28

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Chƣơng 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng AMB 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí - Chuẩn bị dung dịch AMB chuẩn có nồng độ khoảng 25µg/ml.

- Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc kí với điều kiện sắc kí như mô tả ở mục 2.2.3.3, theo dõi thời gian lưu (tR) và diện tích peak. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.3

n

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí Thời gian lưu (phút)

Diện tích peak (mAU.s)

1

7,584

2

7,564

3

7,682

4

7,663

5

7,448

6

7,592

̅

7,589

SD

0,083

110,2

1,10

1,6

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

STT

6862,1 7087,1 7043,2 6858,2 6929,7

e.

Nhận xét :

6815,1

co

RSD (%)

6912,6

oo

gl

Điều kiện sắc kí cho kết quả có độ lặp lại cao về thời gian lưu, diện tích peak với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, chứng tỏ hệ thống sắc kí

G

trên đảm bảo tính thích hợp cho phép định lượng AMB. 3.1.2. Độ đặc hiệu - Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ AMB tương đương nhau (mục 2.2.3.3).

- Chuẩn bị mẫu trắng là phức hợp lipid trắng có thành phần HSPC và DSPG giống mẫu thử và được pha loãng giống mẫu thử.

29

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Mẫu dung môi là mẫu chỉ có dung môi pha dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử, không có phức lipid trắng và cũng không có dược chất AMB. - Tiêm mẫu dung môi, mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử qua cột sắc kí, đánh giá peak sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ.

- Kết quả cho thấy: xuất hiện peak cân xứng, có thời gian lưu (t R) 7,5 phút trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không xuất hiện peak ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng và mẫu dung môi (phụ lục 3, 4). Chứng tỏ phương

n

pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất AMB có thời gian lưu 7,5 phút với điều kiện

hơ

sắc kí trình bày ở mục 2.2.3.3.

N

3.1.3. Tính tuyến tính

Q uy

- Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích peak của AMB bằng cách pha một một dãy dung dịch chuẩn AMB có nồng độ 10, 15, 20,

m

25, 30, 35 µg/ml.

Kè

- Tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak của từng nồng độ dung

ạy

dịch AMB chuẩn.

D

- Kết quả diện tích peak của các dung dịch AMB chuẩn được thể hiện ở bảng

m /+

3.4, sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak được thể hiện ở hình 3.9.

Nồng độ AMB (µg/ml)

Diện tích peak (mAU.s)

10

2950,6

15

4378,3

3

20

5717,1

G

Bảng 3.4. Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak

4

25

6815,1

5

30

8222,2

6

35

9502,9

e.

oo

2

gl

1

co

STT

30

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

y = 259,3x + 428,3 R² = 0,999

0

10

20

30

N

hơ

Nồng độ (µg/ml)

40

n

Diện tích peak (mAU.s)

Tƣơng quan nồng độ và diện tích peak

Q uy

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak Nhận xét: Kết quả trên cho thấy trong khoảng nồng độ AMB đã khảo sát, có sự

m

phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích peak và nồng độ với hệ số tương

Kè

quan R2 = 0,999.

ạy

3.1.4. Độ lặp lại

- Tiến hành định lượng 6 lần với một mẫu chế phẩm thử, mỗi lần định lượng

m /+

D

tiêm mẫu 3 lần và lấy diện tích peak trung bình.

- Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.5.

co

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại

4434,7

2

4544,6

3

4568,1

4

4512,3

5

4446,5

6

4501,8

̅

4501,3

SD

52,7

RSD (%)

1,2

gl

1

oo G

Diện tích peak (mAU.s)

e.

STT

31

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Nhận xét: Phương pháp có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn tương đối < 2%.

Kết luận: Phương pháp định lượng AMB bằng HPLC có tính thích hợp, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại cao. Do vậy, có thể ứng dụng phương pháp này để định lượng AMB trong chế phẩm phức hợp lipid AMB. 3.2. Nghiên cứu xây dựng công thức bào chế phức hợp lipid AMB Theo nghiên cứu trước [4], công thức bào chế phức hợp lipid AMB chứa

n

tỉ lệ dược chất/tổng lipid đạt 25mol%, tỉ lệ tá dược HSPC:DSPG= 7:3, dung môi

hơ

hòa tan dược chất là DMSO, môi trường phân tán là đệm phosphat pH 7,4.

N

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng tỉ lệ dược chất/lipid được tăng

Q uy

dần từ 25 mol% đến 100mol% nhằm tăng hiệu suất mang thuốc.

3.2.1. Khảo sát môi trƣờng phân tán

m

3.2.1.1. Bố trí thí nghiệm

Kè

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của môi trường phân tán và tỉ lệ dược

ạy

chất/lipid đến đặc tính của phức hợp lipid AMB bằng cách cố định dung môi hòa

D

tan dược chất thay đổi môi trường phân tán khác nhau (mẫu nhóm I, nhóm II và

m /+

nhóm III) như ở bảng 3.6. Ở đây, môi trường phân tán được nghiên cứu là đệm phosphat và dung dịch natri clorid 0,9%, dung môi hòa tan dược chất là

co

methanol. Nhưng ở nghiên cứu [4] đã có sử dụng môi trường phân tán là đệm

e.

phosphat pH 7,4, dung môi hòa tan là DMSO, tỉ lệ dược chất/lipid là 25mol%

gl

nên chúng tôi tiếp nghiên cứu với tỉ lệ dược chất/lipid lớn hơn để so sánh.

oo

Tiến hành bào chế các mẫu theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.1.1, sử dụng biện

G

pháp làm giảm KTTP theo mô tả ở mục 2.2.1.2.

Bảng 3.6. Thành phần công thức khảo sát môi trường phân tán

Nhóm

Mẫu CT1

Dung môi hòa tan dược chất

Môi trường phân tán Dung dịch đệm

Methanol

phosphat pH = 7,4

I CT2

Dung dịch đệm

Methanol

32

AMB/lipid (mol%) 25 50

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

phosphat pH = 7,4 CT3

Dung dịch đệm

Methanol

100

phosphat pH = 7,4 Methanol

Dung dịch NaCl 0,9%

25

CT5

Methanol

Dung dịch NaCl 0,9%

50

CT6

Methanol

Dung dịch NaCl 0,9%

100

CT7

DMSO

Dung dịch đệm

CT8

III

25

hơ

phosphat pH = 7,4

n

II

CT4

Dung dịch đệm

DMSO

50

N

phosphat pH = 7,4 Dung dịch đệm

Q uy

CT9

DMSO

100

Kè

m

phosphat pH = 7,4

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

3.2.1.2. Kết quả Về hình thức cảm quan: Với môi trường phân tán là đệm phosphat pH = 7,4 (Mẫu nhóm I và nhóm III) - Các mẫu nhóm III (CT7, CT8, CT9): trong quá trình bào chế tạo ra nhiều bọt, hỗn dịch ngay sau khi bào chế có hiện tượng kết tủa dưới đáy cốc. Các mẫu này bị loại bỏ không tiếp tục nghiên cứu.

- Các mẫu nhóm I (các mẫu CT1, CT2, CT3): Càng tăng tỉ lệ dược chất/lipid thì hỗn dịch tạo ra màu càng sẫm. Mẫu CT2 và CT3 sau 1 ngày bảo quản ở tủ mát 2-8oC thì đã lắng AMB tự do dưới đáy lọ.

Với môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9% (mẫu nhóm II) - Màu sắc của tất cả các mẫu tạo ra có màu vàng sáng. Khi tăng tỉ lệ dược chất/lipid lên thì màu có đậm lên nhưng vẫn giữ nguyên màu vàng tươi, không bị sẫm màu giống các mẫu nhóm I. Bảo quản các mẫu nhóm II trong tủ mát từ 28oC sau 1 ngày không thấy tủa AMB dưới đáy lọ.

So sánh màu sắc của các mẫu có môi trường phân tán là đệm phosphat (nhóm I) với màu sắc của các mẫu có môi trường phân tán là dung dịch natri clorid (nhóm II) cho thấy: màu sắc không có sự khác biệt ở tỉ lệ mol 25% (mẫu CT1 và CT4) nhưng lại khác nhau rõ rệt ở tỉ lệ mol 50% (mẫu CT2 và CT5 ở hình 3.10) và 100% (mẫu CT3 và CT6 ở hình 3.11). Ở tỉ lệ 50 mol% và 100 33

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

hơ

n

mol%, các mẫu có môi trường phân tán là dung dịch đệm pH 7,4 có màu sắc vàng sẫm, xấu hơn so với các mẫu có môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9%.

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

Hình 3.10. Hỗn dịch phức hợp lipid AMB ở nồng độ 50 mol %

m /+

Hình 3.11. Hỗn dịch phức hợp lipid AMB ở nồng độ 100 mol % Về phân bố kích thƣớc tiểu phân

co

KTTP và phân bố KTTP của phức hợp lipid AMB sau 2 chu kỳ đồng nhất

e.

hóa ở áp suất cao 5000psi được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.12.

gl

Bảng 3.7. Phân bố KTTP của các mẫu sau 2 chu kỳ đồng nhất

G

oo

Nhóm

I

II

Mẫu

Span

D[4;3]

Dv(90)

(µm)

(µm)

pH hỗn dịch

CT1

0,934

16,3

24,3

7,15

CT2

2,123

2,64

0,889

7,27

CT3

2,111

1,07

1,07

7,14

CT4

1,216

49,9

81,1

7,54

CT5

1,39

12,7

18,9

7,42

CT6

4,391

18,7

32,2

7,33

34

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

90 80

5

Dv(90) (µm)

Span 4.5 4

70

3.5

60

3

50

2.5 40

Span

2

30

Dv(90) (µm)

1.5 1

10

0.5 CT3

CT4

CT5

CT6

Q uy

CT2

hơ

0

CT1

N

0

n

20

Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu nhóm I và II

m

Nhận xét:

Kè

Kết quả cho thấy kích thước của phức hợp lipid AMB sau 2 chu kỳ đồng nhất

ạy

tương đối lớn, hầu hết trên 1µm. Riêng CT2 và CT3 có kích thước dưới 1µm, nhỏ hơn KTTP tương ứng của CT5 và CT6. Hơn nữa cảm quan của CT2 và CT3 xấu,

m /+

D

sẫm màu chứng tỏ AMB trong mẫu CT2 và CT3 không tạo phức với phospholipid mà hầu hết đều ở dạng tiểu phân tự do.

co

Kết luận:

Mẫu có môi trường phân tán là đệm phosphat pH 7,4 chỉ ở tỉ lệ mol 25% là

e.

cho hình thức cảm quan đẹp, phân bố kích thước đồng đều sau đồng nhất hóa lần 2.

gl

Mẫu có môi trường phân tán là dung dịch NaCl 0,9% có cảm quan đẹp ở

oo

tất cả các tỉ lệ mol dược chất/lipid, phân bố kích thước khá đồng đều.

G

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn môi trường phân tán là dung dịch NaCl 0,9%

để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Với dung môi là methanol, KTTP sau đồng nhất hóa vẫn cao nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các dung môi khác trong nhóm alcol.

3.2.2. Khảo sát dung môi hòa tan dƣợc chất 3.2.2.1. Bố trí thí nghiệm Để khảo sát ảnh hưởng của dung môi hòa tan dược chất đến đặc tính của phức hợp lipid AMB bằng cách cố định tỉ lệ dược chất và môi trường phân tán là 35

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

dung dịch NaCl 0,9% nhưng thay đổi các dung môi khác nhau trong nhóm alcol (bảng 3.8). Các dung môi được acid hóa đến pH = 0,5-1,0 bằng dung dịch HCl 2,5N trong alcol tương ứng.

Bảng 3.8. Thành phần công thức khảo sát dung môi hòa tan AMB Dung môi hòa tan

Mẫu

Môi trường phân tán

dược chất

AMB/lipid (mol%)

Methanol

Dung dịch NaCl 0,9%

100

CT10

Ethanol

Dung dịch NaCl 0,9%

100

CT11

Isopropanol

Dung dịch NaCl 0,9%

n

CT6

hơ

100

N

3.2.2.2. Kết quả

Q uy

Về hình thức cảm quan

Mẫu CT11 cảm quan xấu, màu vàng sẫm ngã sang đỏ. Mẫu CT6 và CT10

m

cho màu sắc vàng tươi, CT10 có màu vàng tươi sáng hơn so với CT6.

Kè

Về kích thƣớc tiểu phân không đo kích thước tiểu phân.

ạy

Mẫu CT11 cảm quan xấu như đã mô tả ở trên nên loại bỏ khỏi thí nghiệm,

D

Các mẫu CT6 và CT10 tiến hành làm đồng nhất KTTP ở áp suất cao theo

m /+

phương pháp ở mục 2.2.1.2, số chu kì là 5. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.11, hình 3.14, hình 3.15, hình 3.16 (Mục 3.2.5.1).

co

Kết quả cho thấy, mẫu CT10 có KTTP và phân bố KTTP đều nhỏ hơn

gl

Kết luận:

e.

mẫu CT6 qua cả 4 chu kỳ đồng nhất. Chu kỳ thứ 5 đều có dấu hiệu kết tụ.

oo

KTTP của mẫu dùng dung môi methanol (mẫu CT6) sau 4 lần đồng nhất

G

vẫn lớn hơn 20 µm. KTTP của mẫu dùng dung môi ethanol (mẫu CT10) sau đồng nhất lần 2 nhỏ dưới 15 µm phù hợp với kích thước của tiểu phân trong thuốc tiêm hỗn dịch.

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dung môi là ethanol để làm các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.3. Khảo sát tỉ lệ dƣợc chất/lipid Bố trí thí nghiệm Sau khi lựa chọn được môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9%, dung môi hòa tan dược chất là ethanol, chúng tôi tiếp tục khảo sát về đặc tính 36

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

của phức hợp lipid AMB ở các tỉ lệ dược chất/lipid khác nhau theo bố trí thí nghiệm ở bảng 3.9 dưới đây.

Bảng 3.9. Thành phần công thức khảo sát tỉ lệ dược chất/lipid Dung môi hòa

Mẫu

AMB/lipid

Môi trường phân tán

tan dược chất

(mol%)

Ethanol

Dung dịch NaCl 0,9%

100

CT12

Ethanol

Dung dịch NaCl 0,9%

50

CT13

Ethanol

Dung dịch NaCl 0,9%

25

Về cảm quan

Q uy

Các mẫu đều có màu vàng sáng, cảm quan đẹp.

N

hơ

n

CT10

Về hình thái tiểu phân

m

Các mẫu ở tỉ lệ dược chất 25 mol% (CT13) và mẫu 50 mol% mẫu ( CT12)

Kè

chụp ảnh qua KHV điện tử theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.2 cho kết quả là

ạy

xuất hiện sản phẩm phụ là các liposome với tỉ lệ khá lớn (hình 3.24.a và hình

D

3.24.b). Mẫu tỉ lệ dược chất/lipid là 100 mol% có tiểu phân tạo ra là những sợi

m /+

đan vào nhau và không thấy xuất hiện các sản phẩm phụ khác (hình 3.24.c).

Kết luận

co

Từ các kết quả thu được ở trên, chúng tôi chọn ra mẫu CT10 (dung môi

e.

hòa tan dược chất là ethanol, môi trường phân tán là dung dịch NaCl 0,9%, tỉ lệ

gl

dược chất/lipid là 100 mol%) là mẫu có cảm quan đẹp, tỉ lệ dược chất/lipid cao,

oo

tiểu phân tạo ra không phải là liposome, kích thước tiểu phân nhỏ hơn 15µm để

G

nghiên cứu tiếp theo.

3.2.4. Khảo sát biện pháp bốc hơi dung môi Bào chế hai mẫu có thành phần giống CT10 với tỉ lệ dược chất/lipid là 100 mol%, sử dụng dung môi ethanol để hòa tan dược chất, môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9%, khác nhau phương pháp bốc hơi dung môi trong qui trình bào chế.

37

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Bốc hơi bằng khuấy từ ở điều kiện nhiệt độ phòng, thời gian bốc hơi 48h (Mẫu CT10.1) - Bốc hơi áp suất giảm trong máy cất quay ở điều kiện áp suất 0,085atm, nhiệt độ 42oC, thời gian 2h (Mẫu CT10.2).

Về cảm quan: Cả hai mẫu đều cho hỗn dịch mịn, màu vàng sáng. Cảm quan đẹp. Sau khi đồng nhất hóa và bảo quản trong tủ lạnh 2 -8oC sau hai ngày không thấy sa lắng.

n

Sau 1 tuần có hiện tượng sa lắng nhưng chỉ cần lắc nhẹ thì hỗn dịch lại phân tán

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

đồng nhất trở lại.

m /+

Hình 3.13. Mẫu CT10.1 và CT10.2 sau khi đồng nhất hóa lần 2 Về kích thƣớc tiểu phân và hiệu suất qui trình

co

Kích thước tiểu phân và hiệu suất của hai mẫu CT10.1 và mẫu CT10.2 được thể

e.

hiện ở bảng 3.10.

oo

gl

Bảng 3.10. KTTP và phân bố KTTP của hai biện pháp bốc hơi dung môi D[4;3]

Dv(90)

(µm)

(µm)

CT10.1 0,88±0,1

7,9±0,5

11,5±1,0

7,41±0,03

41,3 ± 1,0

CT10.2 0,84±0,1 9,33±0,5 13,4±1,0

7,39±0,03

47,4 ± 0,5

Span

G

Mẫu

pH hỗn dịch

Hiệu suất qui trình (%)

Nhận xét: - Cả hai mẫu CT10.1 và CT10.2 sau khi đồng nhất hóa lần 2 đều cho KTTP dưới 15 µm với phân bố KTTP tương đối hẹp, Span dưới 1. KTTP của mẫu CT10.1 sau khi đồng nhất hóa lần 2 có KTTP nhỏ hơn so với mẫu CT10.2.

38

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Mẫu CT10.2 có hiệu suất qui trình cao hơn mẫu CT10.1.

3.2.5. Khảo sát phƣơng pháp làm giảm KTTP Phức hợp lipid AMB sau khi bào chế có KTTP khá lớn, khoảng 60 ±5µm. Để làm giảm KTTP đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm hỗn dịch, chúng tôi tiến hành khảo sát các phương pháp làm giảm KTTP như trình bày ở mục 2.2.1.2.

3.2.5.1. Phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao Bào chế hai mẫu phức hợp lipid AMB có tỉ lệ dược chất/lipid 100 mol%,

n

sử dụng môi trường phân tán là dung dịch NaCl 0,9% gồm mẫu sử dụng dung

hơ

môi hòa tan dược chất là methanol (mẫu CT6) và mẫu sử dụng dung môi hòa tan

N

dược chất là ethanol (mẫu CT10).

Q uy

Tiến hành làm giảm kích thước tiểu phân bằng các phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao 5000 psi, số chu kỳ là 5. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.11,

m

hình 3.14, hình 3.15, hình 3.16.

Dv[4;3]

21,8

18,7

21,8

23,1

31,3

32,2

29,8

26,9

57,5

oo

gl

e.

Dv[90] (µm)

Dv[4;3] (µm)

1,303 1,356 0,879 1,111 1,039 39,4

14,0

7,9

12,5

10,2

65,3

19,6

11,5

19,7

15,6

G

Mẫu

4

33,1

(µm)

span

3

1,476 5,031 4,391 6,417 6,640

m /+

CT6

2

co

Mẫu

1

D

span

0

ạy

Lần đồng nhất

Kè

Bảng 3.11. KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT6 và CT10

CT10

Dv[90] (µm)

Ghi chú Sau đồng nhất hóa lần 5, mẫu có cảm quan xấu, có xu hướng kết tụ.

Sau đồng nhất hóa lần 5, mẫu có cảm quan xấu, có xu hướng

39

kết tụ

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

70

Dv(90)

60 50 40

CT6

30

CT10

20 10

Lần đồng Lần 0 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 nhất Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn KTTP của mẫu CT6 và CT10 qua các lần đồng nhất

70

Q uy

N

hơ

n

0

7

Dv(90)

Span

6

m

60

5

Kè

50 40

1

m /+

10 0

Lần 1

0

Lần 2

Lần 3

Lần 4

co

Lần 0

Span

2

D

20

Dv(90)

3

ạy

30

4

Lần đồng nhất

e.

Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT6 70

1.6

Span

gl

Dv(90)

1.4

oo

60

1.2

G

50

1

40 30 20

0.8

Dv(90)

0.6

Span

0.4

10

0.2

0

0 Lần 0

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của mẫu CT10

40

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Từ số liệu ở bảng 3.11, hình 3.14, hình 3.15, hình 3.16 cho thấy: - KTTP của phức hợp mẫu CT6 được làm giảm dần qua các chu kỳ. Nhưng chỉ số phân bố KTTP lại tăng dần. Ở chu kỳ thứ 2 cho kết quả tốt nhất.

- Ngược lại, mẫu CT10 có KTTP và chỉ số phân bố KTTP lại dao động qua các chu kỳ nhưng tối ưu nhất ở chu kỳ thứ 2 cả về KTTP lẫn phân bố KTTP. - Cả hai mẫu CT6 và CT10 đều bị biến đổi cấu trúc hỗn dịch sau 5 chu kỳ, có biểu hiện tách lớp hoặc hỗn dịch không đồng nhất.

3.2.5.2. Phương pháp đồng nhất hóa tốc độ cao

hơ

n

Mẫu CT10 sau khi đồng nhất trên máy khuấy tốc độ cao Uni-drive ở mức 15.000 vòng/phút thì lớp trên của hỗn dịch tạo bọt và không tan sau 4 ngày lưu

Q uy

N

mẫu. Sau khi đồng nhất ở mức tốc độ 4.000 vòng/phút, hỗn dịch vẫn ổn định.

Kết quả đo KTTP và phân bố KTTP được trình bày ở bảng 3.12.

Bảng 3.12. Đặc tính của phức hợp sau khi làm giảm KTTP bằng phương

Kè

m

pháp đồng nhất hóa tốc độ cao Span

m /+

5 phút

4.000 v/phút

Dv(90)

(µm)

(µm)

1,808

26,9

50,8

1,481

15,9

27,2

1,390

14,5

24,7

D

Trước đồng nhất Sau đồng nhất

D[4;3]

ạy

Thời điểm

co

10 phút

2

e.

60 50

1.5

oo

40

Span

gl

Dv (90)

30

G

20 10

0

1

Dv(90)

0.5

Span

0 Trước đồng nhất

Sau đồng nhất 5 phút

Sau đồng nhất 10 phút

Hình 3.17. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau đồng nhất tốc độ 4.000vòng/phút Nhận xét: Mẫu sau khi đồng nhất hóa tốc độ 4.000 vòng/phút thì KTTP giảm đi đáng kể, mức độ giảm sau đồng nhất 5 phút và 10 phút không khác nhau nhiều và kích

41

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

thước đều trên 24 µm. Tuy nhiên, kích thước tiểu phân của hai mẫu sau khi đồng nhất hóa phân bố đều, chỉ số span thấp (<1,5).

3.2.5.3. Phương pháp siêu âm Mẫu CT10 được làm giảm kích thước tiểu phân bằng siêu âm với hai mức tần số và công suất khác nhau là 80HZ/60W và 50Hz/50W. Ở mức tần số 80Hz và công suất 60W, sau khi siêu âm 5 giây thì hỗn dịch bị biến đổi cấu trúc, tạo nhiều bọt nổi giống như ở phương pháp đồng nhất hóa

n

bằng tốc độ cao ở mức 14.000 vòng/phút.

hơ

Ở mức tần số 50Hz và công suất 50W, KTTP và phân bố KTTP được thể

N

hiện ở bảng 3.13 và hình 3.18.

Q uy

Bảng 3.13. KTTP làm nhỏ bằng phương pháp siêu âm

Trước siêu âm

Dv(90)

(µm)

(µm)

26,9

50,8

Sau siêu âm

30 giây

15,431

3,49

10,5

50Hz/50W

60 giây

ạy

Kè

1,808

D[4;3]

m

Span

Thời điểm

2,94

9,15

60

Dv(90)

14 12 10

gl

30

16Span

e.

40

18

co

50

m /+

D

16,194

oo

8

G

20

6

Dv(90) Span

4

10

2

0

0 Trước siêu âm

Siêu âm 30 giây

Siêu âm 60 giây

Hình 3.18. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau siêu âm 50Hz/50W Nhận xét:

42

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Sau khi siêu âm 30 giây và 60 giây ở tần số 50Hz công suất 50W, kích thước tiểu phân được làm nhỏ đi đáng kể. Tuy nhiên sự phân bố kích thước càng không đồng đều thể hiện ở chỉ số span rất lớn (> 15) và tăng theo thời gian siêu âm.

3.2.5.4. Phương pháp kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao và đùn qua màng.

Trong 3 phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân ở trên, phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao (5000 psi) cho kết quả tốt nhất về KTTP và phân bố KTTP. Tuy nhiên KTTP cho dạng bào chế hỗn dịch tiêm tĩnh mạch là còn lớn nên

n

chúng tôi tiếp tục làm giảm KTTP bằng cách kết hợp với đùn qua màng.

hơ

Mẫu tỉ lệ mol dược chất/lipid 100 mol%, dung môi hòa tan dược chất là

N

ethanol, môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9% được đồng nhất hóa

Q uy

bằng áp suất cao 2 chu kỳ, sau đó đùn qua màng PTFE kích cỡ lỗ lọc 5 µm, tiếp tục đùn qua màng polycarbonat (PLC) có kích cỡ lỗ lọc 0,8 µm bằng thiết bị đùn cầm

m

tay mini-extruder. Khảo sát số lần đùn qua mỗi loại màng và kết quả được thể hiện

Kè

ở bảng 3.14 và hình 3.19.

ạy

Bảng 3.14. KTTP và phân bố KTTP sau khi đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng Dv(90)

(µm)

(µm)

0,844

9,33

13,4

15

1,689

4,03

7,59

20

20

1,835

3,71

7,37

20

30

7,820

2,72

5,66

20

80

5,289

1,24

3,55

0

100

1,838

1,29

2,46

màng Qua

màng

PTFE 5µm

PLC 0,8µm

Trước đùn

co

Qua

m /+

Dv[4;3]

G

D

Số lần đùn

oo

15

gl

e.

(sau đồng nhất 2 chu kỳ)

Span

43

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

16 Dv(90)

9 Span 13.4

14

Dv(90) (µm)

8

7.820

7

Span

12

6

10

5.289

7.59

8

5

7.37

4

5.66

6

3

4

3.55

1.689 0.844

2

1.838 2 2.46

1.385

0 Đùn 15-15 Đùn 20-20 Đùn 20-30 Đùn 20-80 Đùn 0-100

hơ

Trước đùn

n

0

1

N

Hình 3.19. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP sau đồng nhất 2 chu kỳ kết hợp đùn

Q uy

Nhận xét:

Từ số liệu trên cho thấy sau khi đùn qua màng lọc polycarbonat 0,8 µm

Kè

m

100 lần, KTTP giảm tốt nhất so với các lần đùn khác. KTTP và phân bố KTTP của mẫu đùn 0-100 là tốt nhất.

ạy

Kết luận:

D

Trong 4 phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân, phương pháp đồng

m /+

nhất hóa áp suất cao (5000 psi) kết hợp đùn qua màng polycarbonat 0,8 µm 100

lần cho kết quả tốt nhất về KTTP và phân bố KTTP. Vì vậy, chúng tôi chọn phương

e.

nghiên cứu.

co

pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn qua màng để làm giảm KTTP cho mẫu

gl

3.2.6. So sánh mẫu bào chế với chế phẩm thƣơng mại Ampholip

oo

3.2.6.1. Hình thức cảm quan

G

Cả hai mẫu Ampholip và mẫu bào chế đều có màu vàng tươi. Bảo quản ở

tủ lạnh 2-8oC trong thời gian lâu cả hai mẫu đều có hiện tượng sa lắng nhưng khi lắc nhẹ lên thì phân tán lại đồng nhất (hình 3.20).

44

hơ

Hình 3.20. Mẫu bào chế và mẫu Ampholip

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.2.6.2. KTTP và phân bố KTTP

N

So sánh KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế (sau khi đồng nhất hóa

Q uy

2 chu kỳ rồi đùn qua màng polycarbonat 0,8 µm 100 lần) với chế phẩm thương mại Ampholip sau bảo quản cho kết quả ở bảng 3.15, hình 3.21 và phụ lục 10.

m

Bảng 3.15. KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế và chế phẩm Ampholip Span

D[4;3] (µm)

Dv(90) (µm)

Ampholip sau 6 tháng bảo

8,07±0,15

1,74±0,05

3,59±0,14

1,29±0,05

2,46±0,20

Mẫu bào chế

ạy

D

quản ở điều kiện 2-8oC

Kè

Mẫu

m /+

1,84±0,12

Nhận xét: Mẫu bào chế có KTTP và phân bố KTTP nhỏ hơn Ampholip sau 6

e.

4

co

tháng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 2-8oC.

gl

3.5

8.066 3.59

3

Dv(90) Span

oo

2.5

2.46

G

2

1.5 1.838

1 0.5 0 Ampholip sau bảo quản

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Mẫu bào chế

Hình 3.21. Biểu đồ KTTP và phân bố KTTP của mẫu bào chế và Ampholip Nhận xét: So với chế phẩm thương mại Ampholip sau bảo quản, mẫu bào chế có KTTP và phân bố KTTP nhỏ hơn Ampholip.

45

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

3.2.6.3. pH và hàm lượng Tiến hành đo pH và định lượng hàm lượng AMB trong chế phẩm Ampholip theo phương pháp trình bày ở mục 2.2.3.3. Kết quả được so sánh với mẫu bào chế.

Bảng 3.16. pH và hàm lượng của mẫu bào chế và chế phẩm Ampholip pH

Hàm lượng (mg/ml)

Mẫu bào chế

7,4±0,1

4,944±0,208

Ampholip sau bảo quản

7,2±0,1

4,956±0,119

n

Mẫu

nhãn.

Q uy

3.3. Kết quả chứng minh phức hợp lipid AMB

N

hơ

Nhận xét: Cả hai mẫu đều có hàm lượng lớn hơn 90% so với hàm lượng ghi trên

3.3.1. Phân tích nhiệt vi sai

m

Tiến hành quét nhiệt vi sai của các mẫu nguyên liệu AMB, HSPC, DSPG,

Kè

liposome AMB (thành phần gồm AMB, HSPC, DSPG, môi trường phân tán là

ạy

dung dịch NaCl 0,9%, tỉ lệ mol dược chất/lipid là 5%), phức hợp lipid AMB ở tỉ lệ 25 mol% và phức hợp lipid AMB ở tỉ lệ 100 mol % theo phương pháp mô tả ở

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

mục 2.2.2.1. Kết quả được thể hiện ở hình 3.22 và phụ lục 11, 12, 13, 14,15.

Hình 3.22. Phổ đồ DSC của các mẫu HSPC, DSPG, AMB, mẫu liposome AMB 5 mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 25 mol% và 100 mol%.

Nhận xét: Kết quả ở hình 3.22 và phụ lục 11, 12, 13, 14,15 cho thấy trên phổ đồ của tá dược HSPC có nhiệt chuyển pha ở khoảng 70oC và DSPG có nhiệt chuyển pha ở khoảng 55oC. Nguyên liệu AMB có nhiệt phân hủy ở khoảng 145oC.

46

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Liposome AMB 5 mol% có peak nhiệt chuyển pha cũng ở khoảng 67oC. Mẫu phức hợp lipid AMB 25 mol% có nhiệt chuyển pha ở khoảng 73 oC nhưng enthalpy giảm đi đáng kể. Mẫu phức hợp lipid tỉ lệ 100 mol% hầu như không còn peak nhiệt chuyển pha của phospholipid. Điều này cho thấy mẫu bào chế 25 mol% vẫn còn tồn tại màng phospholipid kép hay liposome nên vẫn xuất hiện nhiệt chuyển pha. Trong phức hợp lipid ở tỉ lệ 100 mol%, nhiệt chuyển pha hầu như không còn, chứng tỏ không tồn tại màng phospholipid kép hay nói cách khác

n

hầu như không tồn tại liposome trong sản phẩm cuối cùng. Phức hợp lipid AMB

Q uy

3.3.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)

N

phospholipid chuyển pha dù nhiệt độ có tăng cao.

hơ

với sự liên kết chặt chẽ giữa dược chất với lipid ở tỉ lệ mol 1:1 đã ngăn cản

Tiến hành đo phổ IR của các mẫu HSPC, DSPG, mẫu trắng, hỗn hợp vật

m

lý, mẫu liposome AMB 5mol%, mẫu phức hợp lipid AMB 100 mol% theo

Kè

phương pháp ở mục 2.2.2.3.

ạy

Theo Pretsch E. và cộng sự [28], phổ IR của gốc phosphat dạng (RO)2PO2- nằm ở khoảng số sóng từ 1285-1120 cm-1 và khoảng 1120-1050 cm-1.

m /+

D

Phổ đồ được thể hiện ở phụ lục 16,17,18,19,20,21. Số sóng dao động của gốc phosphat (RO)2PO2- trong phân tử lipid của các mẫu phân tích được trình

co

bày ở bảng 3.17.

Số sóng 1

Số sóng 2

(cm-1)

(cm-1)

HSPC

1253,73

1091,71

G

Bảng 3.17. Số sóng của gốc (RO)2PO2- trong phân tử lipid của các mẫu

DSPG

1253,73

1093,64

Hỗn hợp vật lý

1251,80

1093,64

Mẫu trắng

1230,58

1089,78

Liposome AMB 5 mol%

1234,44

1093,64

Phức hợp lipid AMB 100 mol%

1273,02

Peak dịch chuyển và biến

oo

gl

e.

Mẫu

dạng

47

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

co

m /+

Hình 3.23. Phổ hồng ngoại của của các mẫu đo Trong dữ liệu ở bảng 3.17 và hình 3.23, các mẫu đều có dao động đặc

gl

e.

trưng của gốc phosphat trong phân tử lipid. Riêng mẫu lipid AMB 100 mol%

oo

dao động ở lân cận số sóng 1090 bị dịch chuyển, peak hấp thụ biến dạng chứng tỏ gốc phosphat của các phân tử lipid đã liên kết chặt chẽ với nhóm NH 2 trong

G

phân tử AMB để tạo phức. Mẫu liposome AMB 5mol% do phân tử lipid chưa liên kết hết với AMB nên vẫn còn gốc phosphat tự do, vì vậy đều xuất hiện phổ của gốc phosphat trong (RO)2PO2- ở cả hai số sóng 1234 cm-1 và 1093 cm-1.

3.3.3. Hình thái của tiểu phân Chụp hình thái tiểu phân của các mẫu phức hợp lipid AMB 100 mol% (CT10), 50 mol% (CT12) và 25mol% (CT13) dưới kính hiển vi điện tử quét theo phương pháp như mô tả ở mục 2.2.2.2. Kết quả được thể hiện ở hình 3.24.

48

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

a. Hình thái tiểu phân mẫu phức hợp lipid AMB 25mol% (CT13)

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

b. Hình thái tiểu phân mẫu phức hợp lipid AMB 50 mol% (CT12)

c. Hình thái tiểu phân của mẫu phức hợp lipid AMB 100 mol% (CT10) Hình 3.24. Hình thái của các mẫu quan sát dưới KHV điện tử quét Nhận xét : Kết quả chụp hình thái của của các mẫu cho thấy mẫu 25mol% (CT13) và mẫu 50 mol% (CT12) có tạo ra sản phẩm chứa các tiểu phân hình cầu là các

49

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

liposome, mẫu 100 mol% (CT10) có tiểu phân có cấu trúc chuỗi đan vào nhau, không thấy xuất hiện sản phẩm phụ liposome.

3.3.4. Phổ nhiễu xạ tia X Tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu AMB, hỗn hợp vật lý, mẫu trắng, mẫu liposome AMB 5mol% và phức hợp lipid AMB 100mol% theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.4. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.18, hình 3.25.

Bảng 3.18. Đỉnh nhiễu xạ của các mẫu đo

hợp

17,4o

20,5o

21,8o

21,5o

có

có

có

có

không

có

có

có

có

có

vật lý không không không không

Liposome

không không không không

31,8o

45,3o

không

không

không

có

có

có

có

có

có

có

có

có

có

có

không

có

có

có

ạy D

AMB

m /+

5mol% Phức

27,3o

Kè

Mẫu trắng

Natri clorid

Q uy

Hỗn

14o

m

AMB

Phospholipid

hơ

AMB nguyên liệu

n

Các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng

N

Mẫu đo

hợp không không không không

co

lipid AMB

gl

e.

100 mol%

oo

Trên phổ nhiễu xạ tia X, AMB có các đỉnh nhiễu xạ với cường độ mạnh ở

G

14o ; 17,4o ; 20,5o ; 21,8o.

Hỗn hợp vật lý có các đỉnh nhiễu xạ ở 14 o ; 17,4o ; 20,5o ; 21,8o của AMB,

đỉnh nhiễu xạ ở 21,5o của phospholipid, các đỉnh ở 27,3o ; 31,8o ; 45,3o của natri clorid.

Mẫu trắng có đỉnh nhiễu xạ của phospholipid ở 21,5o và của natri clorid ở 27,3o ; 31,8o; 45,3o.

50

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Liposome AMB 5mol% có đỉnh nhiễu xạ của phospholipid ở 21,5o chứng tỏ còn lipid tự do chưa liên kết hết với AMB. Ngoài ra còn có đỉnh nhiễu xạ của natri clorid trong pha phân tán ở 27,3o ; 31,8o; 45,3o.

Phức hợp lipid AMB các đỉnh nhiễu xạ của AMB và của phospholipid mất đi hoàn toàn, chỉ còn lại các đỉnh nhiễu xạ của natri clorid trong pha phân tán ở 27,3o ; 31,8o; 45,3o. Điều đó chứng tỏ rằng AMB đã tạo phức hoàn toàn với phospholipid, còn

hơ

n

natri clorid thì không tạo phức.

Faculty of Chemistry, HUS, VNU, D8 ADVANCE-Bruker - AMB

N

2000 1900

Q uy

1800 1700 1600

a

1500

d=6.369

1400 1300

1100

d=4.182

1000

m

d=4.119

Lin (Cps)

1200

900

Kè

400

ạy

300 200 100 0 20

30

D

10

d=2.928

d=3.905

500

d=3.500

d=4.301

600

d=4.861

d=7.789

d=5.871

700

d=5.174

800

40

50

2-Theta - Scale

m /+

File: ThuanDHDuoc AMB.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 5.000 ° - End: 50.000 ° - Step: 0.030 ° - Step time: 0.3 s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 4 s - 2-Theta: 5.000 ° - Theta: 2.500 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: 0.00 ° - X:

Faculty of Chemistry, HUS, VNU, D8 ADVANCE-Bruker - Hon hop vat ly 1

gl

e.

400

d=1.995

co

500

oo

d=3.123

d=3.260

d=4.270 d=4.159 d=4.099

100

d=3.397

b d=5.150

G

200

d=6.324

Lin (Cps)

300

0 10

20

30

40

2-Theta - Scale File: ThuanDHDuoc HHVL1.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 10.000 ° - End: 49.990 ° - Step: 0.030 ° - Step time: 0.3 s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 10 s - 2-Theta: 10.000 ° - Theta: 5.000 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: 0.00 00-005-0628 (*) - Halite, syn - NaCl - Y: 11.79 % - d x by: 1. - WL: 1.5406 - Cubic - a 5.64020 - b 5.64020 - c 5.64020 - alpha 90.000 - beta 90.000 - gamma 90.000 - Face-centered - Fm-3m (225) - 4 - 179.425 - I/Ic PDF 4.4

51

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Faculty of Chemistry, HUS, VNU, D8 ADVANCE-Bruker - Mau trang

1500 1400 1300 1200

d=2.822

1100 1000

d=1.996

Lin (Cps)

900 800

c

700 600 500

d=4.126

300 200

d=3.262

400

100 0 10

20

30

40

2-Theta - Scale

hơ

n

File: ThuanDHDuoc Mautrang.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 10.000 ° - End: 49.990 ° - Step: 0.030 ° - Step time: 0.3 s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 10 s - 2-Theta: 10.000 ° - Theta: 5.000 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: 0.

00-005-0628 (*) - Halite, syn - NaCl - Y: 100.00 % - d x by: 1. - WL: 1.5406 - Cubic - a 5.64020 - b 5.64020 - c 5.64020 - alpha 90.000 - beta 90.000 - gamma 90.000 - Face-centered - Fm-3m (225) - 4 - 179.425 - I/Ic PDF 4.

N Q uy

500

m

300

d=2.826

Kè

Lin (Cps)

400

d=1.996

Faculty of Chemistry, HUS, VNU, D8 ADVANCE-Bruker - Liposome AMB 5%

600

ạy

d

D

100

d=3.264

d=4.128

200

m /+

0 10

20

30

40

2-Theta - Scale

co

File: ThuanDHDuoc LiposomeAMB 5%.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 10.000 ° - End: 49.990 ° - Step: 0.030 ° - Step time: 0.3 s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 13 s - 2-Theta: 10.000 ° - Theta: 5.000 ° - Chi: 0.00 ° 00-005-0628 (*) - Halite, syn - NaCl - Y: 36.27 % - d x by: 1. - WL: 1.5406 - Cubic - a 5.64020 - b 5.64020 - c 5.64020 - alpha 90.000 - beta 90.000 - gamma 90.000 - Face-centered - Fm-3m (225) - 4 - 179.425 - I/Ic PDF 4.4

Faculty of Chemistry, HUS, VNU, D8 ADVANCE-Bruker - AMB-L 100%

e.

1500 1400

1200

1000

800 700

e

G

Lin (Cps)

900

oo

1100

d=2.821

gl

1300

600 500

d=1.995

400

d=3.258

300 200 100 0 10

20

30

40

50

2-Theta - Scale File: AMB-L 100%.raw - Type: 2Th/Th locked - Start: 1.000 ° - End: 49.990 ° - Step: 0.030 ° - Step time: 0.3 s - Temp.: 25 °C (Room) - Time Started: 13 s - 2-Theta: 1.000 ° - Theta: 0.500 ° - Chi: 0.00 ° - Phi: 0.00 ° - X: 0.0 m 00-005-0628 (*) - Halite, syn - NaCl - Y: 32.53 % - d x by: 1. - WL: 1.5406 - Cubic - a 5.64020 - b 5.64020 - c 5.64020 - alpha 90.000 - beta 90.000 - gamma 90.000 - Face-centered - Fm-3m (225) - 4 - 179.425 - I/Ic PDF 4.4

Hình 3.25. Phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu AMB (a), hỗn hợp vật lý (b), mẫu trắng (c), liposome AMB 5mol% (d), phức hợp lipid AMB100mol% (e)

52

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Kết luận : Từ kết quả chứng minh trên, chúng tôi kết luận rằng: chỉ có mẫu có tỉ lệ dược chất 100 mol% là tạo ra phức hợp lipid AMB ở điều kiện và phương pháp nghiên cứu đã trình bày ở trên.

Vì vậy, chúng tôi chọn mẫu có tỉ lệ dược chất/lipid là 100 mol%, dung môi hòa tan dược chất là ethanol, môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9% để bào chế phức hợp lipid AMB. Phức hợp lipid AMB được làm giảm

n

KTTP bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất 5000psi qua 2 chu kỳ kết hợp

hơ

đùn qua màng polycarbonat 0,8 µm 100 lần.

N

3.4. Đề xuất qui trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid

Q uy

AMB 5mg/ml

Từ các kết quả khảo sát trên, chúng tôi chọn công thức bào chế cho 1 mẻ

Kè

m

74ml thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml như sau: Amphotericin B

0,3700g 0,2138g

Distearoylphosphatidylglycerol

0,0937g

D

ạy

Hydrogenated soy phosphatidylcholin

74ml

Hỗn hợp dung môi chlorofrom : ethanol (1 :1)

40ml

m /+

Dung dịch natri clorid 0,9%

co

Ethanol đã acid hóa đến pH 0,5-1,0

240ml

e.

Qui trình bào chế:

gl

Bước 1 : Chuẩn bị

oo

Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ, xử lý chai lọ thủy tinh :

G

- Các dụng cụ pha chế, chai, lọ thủy tinh đựng mẫu được rửa sạch, tráng nước cất và sấy ở 320oC trong 20 phút.

- Pha dung dịch natri clorid 0,9%, lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,2 µm. Đóng vào chai thủy tinh.

- Hấp tiệt khuẩn cột lọc tiếp tuyến cùng các ống dẫn, chai đựng dung dịch natri clorid 0,9% ở 121oC trong thời gian 15 phút.

Chuẩn bị cơ sở thiết bị :

53

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

- Buồng chứa của máy nén áp suất cao, máy đồng nhất hóa được rửa sạch với cồn 70o. Tiếp tục rửa lại bằng nước cất pha tiêm.

- Phòng vô khuẩn được lau sạch trần tường, sàn, bàn và các thiết bị bên trong bằng nước, sau đó lau lại bằng cồn 70o.

- Chuyển toàn bộ các thiết bị, dụng cụ đã sấy và hấp tiệt khuẩn vào phòng vô khuẩn.

- Tiệt khuẩn lại các thiết bị, dụng cụ không hấp tiệt khuẩn bằng tia UV trong tủ

n

an toàn sinh học cấp II trong 1 giờ trước khi bắt đầu giai đoạn tiếp theo.

hơ

Bước 2 : Bào chế hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB

N

- Hòa tan HSPC và DSPG vào hỗn hợp dung môi chloroform : ethanol =1:1

Q uy

(v/v), được dung dịch 1.

- Hòa tan AMB vào ethanol (EtOH) đã acid hóa đến pH = 0,5-1,0, được dung

m

dịch 2.

Kè

- Phối hợp dung dịch 1 vào dung dịch 2 được dung dịch 3.

ạy

- Lọc dung dịch 3 qua màng PTFE có kích cỡ lỗ lọc 0,2 µm.

D

- Tiêm chậm dung dịch 3 vào dung dịch natri clorid 0,9% đã gia nhiệt đến 60-

m /+

65oC, tốc độ tiêm mẫu 0,8ml/phút, kim tiêm có đường kính 0,4mm. Trong quá trình tiêm mẫu có khuấy từ và duy trì nhiệt độ 60-65oC cho đến khi tiêm hết

co

mẫu. Thao tác thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp II.

e.

- Bốc hơi dung môi bằng cất quay áp suất giảm trong vòng 2h với thông số nhiệt

gl

độ 42oC, áp suất 0,085 atm.

oo

- Đồng nhất hóa KTTP bằng phương pháp kết hợp nén dưới áp suất 5000psi qua

G

2 chu kỳ và đùn polycarbonat 0,8µm 100 lần.

- Lọc tiếp tuyến cô đặc thể tích đến khi đạt hàm lượng yêu cầu.

- Đóng lọ, đậy nút, nắp nhôm, dán nhãn.

- Kiểm tra chất lượng thành phẩm.

- Bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8oC. Tránh ánh sáng.

Qui trình bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml được mô tả bằng sơ đồ dưới đây (hình 3.26).

54

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hòa tan HSPC, DSPG vào hỗn hợp (CHCl3,EtOH)

Hòa tan AMB vào EtOH Phối hợp

hơ

N

Khuấy từ duy trì nhiệt độ từ 60-65oC. Tốc độ tiêm 0,8ml/phút Đường kính kim tiêm 0,4mm

m

Q uy

Tiêm chậm vào dd NaCl 0,9%

n

Lọc qua màng PTFE 0,2µm

ạy

Kè

Bốc hơi dung môi

Số chu kì: 2 Áp suất: 5000psi

Đùn qua màng polycarbonat 0,8 µm

Số lần đùn: 100 lần

Lọc tiếp tuyến, điều chỉnh về thể tích thích hợp

Kiểm tra bán thành phẩm (pH, hàm lượng)

m /+

D

Đồng nhất hóa bằng phương pháp nén dưới áp suất cao

G

oo

gl

e.

co

Thiết bị cất quay chân không to: 42oC Áp suất = 0,085 atm Thời gian = 2h

Lọ, nút cao su, nắp nhôm đã tiệt khuẩn, nhãn

Đóng lọ, đậy nút, nắp, dán nhãn Kiểm tra thành phẩm Bảo quản to: 2-8oC Tránh ánh sáng

55

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Hình 3.26. Sơ đồ bào chế thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml 3.5. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml Sau khi bào chế 3 mẻ thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml ở qui mô phòng thí nghiệm theo công thức và qui trình ở mục 3.4 và đánh giá các chỉ tiêu theo mục 2.2.3. Kết quả đánh giá được thể hiện ở bảng 3.19.

Chỉ tiêu

STT

Kết quả đánh giá

Hỗn dịch màu vàng sáng, không có tinh thể

N

Hình thức cảm quan

Q uy

1

hơ

n

Bảng 3.19 . Chất lượng thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB (n=3)

kết tủa, để lâu có sa lắng tiểu phân nhưng

m

phân tán lại đồng nhất khi lắc nhẹ. pH

7,4 ±0,1

3

Thể tích (ml)

10,05

4

KTTPTB theo thể tích 1,29 ±0,05

ạy

Kè

2

m /+

D

(µm) Dv(90) (µm)

2,46 ±0,2

6

Chỉ số đa phân tán Span 1,84±0,12

7

Hàm

co

5

AMB

4,944 ±0,208

e.

lượng

gl

(mg/ml)

oo

Kết quả cho thấy công thức và qui trình bào chế cho sản phẩm đạt hàm lượng

G

dược chất 5mg/ml, kích thước tiểu phân dưới 5µm, phân bố kích thước tiểu phân hẹp (span <2), hình thức cảm quan đẹp. Do vậy chúng tôi đề xuất tiêu chuẩn cơ sở cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB như ở bảng 3.20.

56

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Bảng 3.20. Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất cho thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml Chỉ tiêu

STT 1

Yêu cầu

Hình thức cảm quan

Hỗn dịch màu vàng sáng, không có tinh thể kết tủa, để lâu có thể sa lắng tiểu phân nhưng

pH

7,2-8,0 [33]

3

Thể tích (ml)

10 + 10%

4

90%

Sau bào chế

KTTP

Sau bảo quản < 5 µm

Phân

Sau bào chế

bố

Sau bảo quản < 9

Q uy

Trên sắc kí đồ, dung dịch thử phải cho peak

ạy

Định tính AMB

m

<2

KTTP 6

N

< 4 µm

Kè

5

hơ

2

n

phân tán lại đồng nhất khi lắc nhẹ.

D

có cùng thời gian lưu với dung dịch AMB

Định lượng AMB toàn Hàm lượng AMB toàn phần phải chứa từ 90-

gl

Độ vô khuẩn

oo

8

e.

phần

Nội độc tố vi khuẩn

G

9

co

7

m /+

chuẩn.

120% so với hàm lượng AMB ghi trên nhãn [33].

Phải vô khuẩn [33].

Chế phẩm phải không được chứa nhiều hơn 5 đơn vị nội độc tố/mg AMB [33].

57

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Chƣơng 4. BÀN LUẬN 4.1. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng AMB là một kháng sinh chống nấm nên phương pháp để định lượng AMB được ghi trong các Dược điển là phương pháp vi sinh. Phương pháp này dùng để xác định hoạt lực kháng sinh AMB trong chế phẩm. Tuy nhiên phương pháp này tốn thời gian và đòi hỏi hệ thống cơ sở vật chất phải đạt yêu cầu về cấp độ sạch, dụng cụ, hóa chất sử dụng phải được tiệt trùng. Do vậy, chúng tôi tiến

n

hành định lượng AMB trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC nhằm xác định

hơ

nhanh hàm lượng AMB trong hỗn dịch phức hợp. Kết quả thu được có độ chính

N

xác cao, tiết kiệm chi phí.

Q uy

Việc sử dụng muối dinatri EDTA trong pha động nhằm làm giảm thời gian lưu của AMB so với việc không sử dụng, do đó làm giảm được chi phí và

m

thời gian đánh giá [5]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nồng

Kè

độ dinatri EDTA là 0,002M, giảm 10 lần so với nghiên cứu trước [5] và sử dụng

ạy

methanol làm thành phần chính trong pha động. Do vậy, thời gian lưu 7,5 phút,

m /+

định lượng tăng lên.

D

dài hơn so với nghiên cứu trước [5] khoảng 1,2 phút nhưng độ nhạy của phép 4.2. Xây dựng công thức và qui trình bào chế phức hợp

co

4.2.1. Sử dụng tá dược HSPC và DSPG

e.

Chất mang dược chất được sử dụng trong nghiên cứu này là HSPC và

gl

DSPG với tỉ lệ 7:3 được xem là tỉ lệ tối ưu để tạo ra phức hợp có phân bố kích

oo

thước tiểu phân đồng đều và cho hình thức cảm quan đẹp [4]. Chúng tôi tiếp tục

G

chọn tỉ lệ HSPC : DSPG (7:3) để nghiên cứu với tỉ lệ dược chất tăng dần lên để tạo ra phức hợp lipid AMB có hiệu quả điều trị cao và độc tính thấp [12]. Mặt khác HSPC có ưu điểm là bền về mặt hóa học do hạn chế được phản ứng peroxid hóa nên giúp phức hợp lipid AMB bền vững hơn, giảm sự rò rỉ dược chất ở dạng tự do [3], [24]. Độ dài mạch carbon của HSPC và DSPG là 18, không giống với độ dài mạch carbon của DMPC và DMPG (14) sử dụng trong chế phẩm Abelcet và

58

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Ampholip. Nếu có điều kiện về kinh phí, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu bào chế phức hợp lipid AMB với hai loại tá dược DMPC và DMPG. 4.2.2. Về môi trƣờng phân tán Trong công thức bào chế chúng tôi đã khảo sát hai môi trường phân tán là dung dịch đệm phosphat pH 7,4 và dung dịch muối sinh lí natri clorid 0,9%. Hai môi trường phân tán này có khả năng tương hợp sinh học cao lại giúp cho hỗn dịch phức hợp lipid AMB ổn định [11].

n

Kết quả cho thấy, với dung dịch đệm phosphat pH 7,4 cho hình thức cảm

hơ

quan của hỗn dịch màu vàng sẫm, xấu hơn so với khi sử dụng dung dịch muối

N

NaCl 0,9%. Màu vàng sẫm đó có thể là do AMB không được nạp vào lipid để

Q uy

tạo thành phức hợp lipid AMB nên sau bảo quản 1 ngày xuất hiện AMB kết tủa 4.2.3. Về dung môi hòa tan dƣợc chất

m

dưới đáy lọ.

Kè

AMB rất ít tan trong các dung môi. Do vậy, mục tiêu đầu tiên là phải tìm

ạy

ra dung môi hòa tan dược chất để bào chế phức hợp nhằm giảm lượng dung môi

D

cần sử dụng, giảm kinh phí và ô nhiễm môi sinh.

m /+

Khi sử dụng dung môi DMSO, sau khi phối hợp dung dịch lipid vào dung dịch dược chất đã tạo ra đám bọt nổi trên bề mặt dung dịch hỗn hợp. Mặt khác,

co

trong quá trình tiêm mẫu đã xảy ra hiện tượng kết tủa AMB tự do dưới đáy cốc

e.

và hiện tượng này hiện rõ trong khi bốc hơi dung môi. Điều này có thể do sự

gl

tương kị trong quá trình bào chế giữa DMSO với một hoặc nhiều thành phần còn

oo

lại trong công thức.

G

Methanol với lượng sử dụng trong công thức hòa tan tốt AMB. Nhưng khi

so sánh hình thức cảm quan của sản phẩm tạo ra so với dùng ethanol thì mẫu dùng ethanol có hình thức đẹp hơn, màu vàng sáng hơn và KTTP sau đồng nhất hóa phân bố đều hơn. Điều này có thể do nhiệt độ sôi của methanol là 64,7 oC nhưng nhiệt độ khi tiêm mẫu là từ 60-70oC nên ảnh hưởng đến tỉ lệ các pha do đó làm cấu trúc của phức hợp và khả năng bắt dược chất của lipid thay đổi. Nhiệt độ sôi của ethanol là 78,4oC nên ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ tiêm mẫu.

59

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Isopropanol nhiệt độ sôi là 82,6oC nhưng khả năng hòa tan AMB kém nên khi phối hợp các pha làm thay đổi độ tan của AMB trong hỗn hợp do đó ảnh hưởng đến hình thức sản phẩm.

4.2.4. Về phƣơng pháp làm giảm kích thƣớc tiểu phân Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân của phức hợp về cơ bản là không khác so với phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân của liposome.

Tuy nhiên, do cấu trúc của phức hợp lipid AMB khác với cấu trúc của liposome

n

nên ảnh hưởng của các phương pháp đó lên KTTP cũng khác nhau.

hơ

Khi đồng nhất KTTP bằng siêu âm ở công suất lớn (80Hz/60W) hoặc

N

bằng máy khuấy tốc độ cao 14.000 vòng/phút thì phức hợp bị vỡ. Điều này có

Q uy

thể là do lực tác động mạnh làm phá vỡ liên kết giữa chuỗi hydrocarbon của lipid với phần polyen thân dầu của AMB giống như giả thuyết của Janoff và cộng sự

m

về cơ chế hình thành phức hợp [12]. Việc sử dụng siêu âm và máy khuấy tốc độ

Kè

cao có nhược điểm nữa là có thể gây nhả tạp vào chế phẩm, khó áp dụng khi

ạy

nâng qui mô bào chế.

D

Khi làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp đồng nhất hóa áp

m /+

suất cao ở 5000psi, sau chu kỳ đồng nhất thứ 2, nếu tăng số chu kỳ lên thì chỉ số phân bố KTTP không giảm nhiều, thậm chí còn tăng trong một số mẫu. Kích

co

thước tiểu phân cũng không giảm so với chu kỳ thứ 2. Vì vậy chúng tôi chọn 2

e.

chu kỳ đồng nhất để bào chế sản phẩm, vừa đảm bảo kích thước và phân bố

gl

KTTP tối ưu, hình thức cảm quan đẹp lại tiết kiệm được chi phí. Việc sử dụng

oo

khí nén ni-tơ để đồng nhất vừa không bị nhiễm tạp vừa tăng độ ổn định do loại

G

oxy hòa tan ra khỏi chế phẩm.

Tuy nhiên, KTTP sau đồng nhất hóa áp suất cao 2 chu kỳ vẫn chưa đạt

kích thước tiểu phân tối ưu cho thuốc tiêm tĩnh mạch nên chúng tôi phối hợp với phương pháp đùn qua màng polycarbonat 0,8µm. Việc đùn qua màng nhiều lần ngoài lý do cấu trúc chặt chẽ của phức hợp lipid AMB còn có thêm nguyên nhân chúng tôi chưa tìm được màng lọc polycarbonat có kích cỡ lỗ lọc thích hợp cho việc làm giảm KTTP của phức hợp.

60

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

KTTP của phức hợp sau bào chế và trong quá trình bảo quản là khác nhau do các tiểu phân có xu hướng tụ lại để giảm năng lượng bề mặt. Điều này được kiểm chứng khi chúng tôi đo KTTP của chế phẩm thương mại Ampholip trong quá trình bảo quản và sau khi lọc lại qua màng lọc gắn sẵn trong kim tiêm kèm theo chế phẩm (phụ lục 10). Trong bào chế thuốc tiêm tĩnh mạch, cần lưu ý rằng các vi mao mạch có đường kính khoảng 10-12m hay nhỏ hơn như các vi mao mạch phổi (khoảng 7m). Vì vậy, cần bào chế thuốc tiêm hỗn dịch có KTTP < 5

n

m, đồng thời kiểm soát được tỉ lệ tiểu phân có kích thước từ 5-7m trong quá trình

hơ

bảo quản. Trước khi sử dụng chế phẩm, để tránh tai biến tắc mạch, chế phẩm cần

N

được lọc qua màng có kích cỡ lỗ lọc 5µm gắn sẵn trong kim tiêm.

Q uy

4.2.5. Về biện pháp bốc hơi dung môi

Biện pháp bốc hơi dung môi bằng khuấy từ ở điều kiện thường có hạn chế

m

là thời gian kéo dài (48h cho 74ml chế phẩm). Khoảng thời gian này dài gấp 24

Kè

lần so với thời gian của biện pháp bốc hơi bằng cất quay áp suất giảm. Mặt khác

D

phân hủy bởi ánh sáng.

ạy

phải luôn đảm bảo tránh ánh sáng trong quá trình bốc hơi dung môi vì AMB bị

m /+

Biện pháp bốc hơi bằng cất quay áp suất giảm ngoài ưu điểm là thời gian ngắn (2h) còn có thể tăng cở lô mẽ lớn hơn.

co

4.2.6. Về qui trình bào chế phức hợp lipid AMB

e.

Qui trình bào chế phức hợp lipid AMB về cơ bản là giống với qui trình

gl

bào chế liposome, chỉ khác là sử dụng tỉ lệ mol% dược chất/lipid cao hơn.

oo

Phương pháp chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp thay đổi

G

dung môi hay còn gọi là phương pháp tiêm polyol. Do qui trình bào chế giống nhau nên phức hợp tạo ra có thể lẫn một tỉ lệ nào đó liposome. Theo như nghiên cứu của Janoff và cộng sự [11], thì tỉ lệ tạo ra liposome là dưới 10%, tỉ lệ dược chất càng cao thì tỉ lệ liposome tạo thành càng thấp. Tuy nhiên, theo kết quả của phương pháp chụp kính hiển vi điện tử, phổ IR, phổ nhiễu xạ tia X có thể khẳng định tạp liposome trong chế phẩm phức hợp lipid AMB 100 mol% là không đáng kể.

61

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Trong nghiên cứu này, khác với liposome AMB, chúng tôi không đánh giá hiệu suất nạp vì ở phức hợp dược chất liên kết với phospholipid theo tỉ lệ 1 :1 và chỉ có ở tỉ lệ 1 :1 mới tạo được phức hợp. Do vậy, chúng tôi chỉ đánh giá hiệu suất qui trình.

Hiệu suất qui trình trong nghiên cứu này là chưa cao (trên 41%) do khi bốc hơi dung môi, phức hợp lipid AMB được tạo ra và bám trên thành cốc hoặc bình cầu. Dung môi bay hơi càng chậm thì phức bám trên thành bình càng dày,

n

hao hụt càng lớn. Vì vậy, sản phẩm bốc hơi bằng khuấy từ có hiệu suất qui trình

hơ

(41,3±1,0 %) thấp hơn sản phẩm bốc hơi bằng cất quay (47,4±0,5%). Mặt khác,

N

cỡ mẻ bào chế càng nhỏ (74ml) thì tỉ lệ hao hụt của sản phẩm càng lớn.

Q uy

Thuốc tiêm hỗn dịch phải đảm bảo vô khuẩn nhưng lại không được tiệt trùng công đoạn cuối nên đòi hỏi phải kiểm soát nghiêm ngặt về môi trường pha

m

chế, thiết bị pha chế cũng như qui trình vệ sinh cá nhân trước khi vào phòng pha

Kè

chế, qui trình xử lý bao bì trước khi đưa vào đóng gói.

ạy

4.3. Phƣơng pháp chứng minh phức hợp

Vì phương pháp bào chế, thành phần dược chất, tá dược, phương pháp

D

làm nhỏ KTTP của phức hợp lipid AMB về cơ bản là giống với liposome AMB,

m /+

chỉ khác về tỉ lệ dược chất/lipid. Do đó, chúng tôi phải sử dụng các phương pháp vật lý để chứng minh sự khác nhau giữa phức hợp lipid AMB và liposome AMB.

co

4.3.1. Phƣơng pháp quét nhiệt vi sai

e.

Phương pháp này đã chỉ ra sự khác nhau về cấu trúc giữa liposome và

gl

phức hợp thể hiện ở phổ đồ nhiệt chuyển pha ở hình 3.22. Liposome 5 mol% có

oo

peak nhiệt chuyển pha lớn ở nhiệt độ 67oC. Phức hợp lipid AMB 100 mol% peak

G

nhiệt chuyển pha không mất hẳn nhưng peak doãng và có biên độ thấp, không đáng kể so với mẫu 5 mol% và 25 mol% (Phụ lục 14). Điều này có thể là do sau khi bào chế, ngoài tạo ra phức hợp thì chế phẩm vẫn còn lẫn một tỉ lệ rất nhỏ liposome theo như nghiên cứu của Janoff và cộng sự [11].

4.3.2. Phƣơng pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử Hình thái của phức hợp quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JSM5410LV với kỹ thuật đông lạnh đột ngột là hình chuỗi và phù hợp những nghiên cứu trước đây [11],[16], [20], [22] về phức hợp lipid AMB. 62

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

4.3.3. Phƣơng pháp phổ IR Phổ IR đã chứng tỏ rằng gốc phosphat trong phân tử lipid đã kết hợp chặt chẽ với với nhóm NH2 trong phân tử AMB. Điều này cũng phù hợp với nguyên lí tạo thành phức hợp là do phân tử AMB chen vào cấu trúc liposome của phospholipid theo tỉ lệ 1 :1, phần thân nước của AMB hướng về phía lõi, phần thân dầu hướng về chuỗi hydro carbon của lipid, gốc phosphat của lipid hướng về nhóm NH2 của phân tử AMB, làm phá vỡ cấu trúc liposome để hình thành phức hợp có hình dải ruy băng [12].

hơ

n

Kết quả phổ IR cũng phù hợp với các nghiên cứu của Jena S. K. và cộng sự (2014) [14], Singh D. và cộng sự (2012) [31] về chứng minh đặc tính phức

N

hợp phospholipid.

Q uy

4.3.4. Phƣơng pháp phổ nhiễu xạ tia X

Phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu nghiên cứu đã chứng minh được sự tạo

m

thành phức hợp lipid AMB làm mất các đỉnh nhiễu xạ của AMB và của

Kè

phospholipid. Kết quả này cũng phù hợp với những nghiên cứu về phức hợp

ạy

phospholipid với các dược chất khác của Li Y. và cộng sự (2013) [21], Singh C. và cộng sự [30].

D

Như vậy, bằng các phương pháp vật lý như : DSC, phổ hồng ngoại, phổ

m /+

nhiễu xạ tia X, chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử, có thể kết luận rằng phức hợp lipid AMB được tạo ra là khác với liposome AMB cả về hình thái lẫn cấu trúc.

co

Hình thái của phức hợp là hình chuỗi, cấu trúc là những phân tử phospholipid

e.

lipid liên kết với phân tử AMB theo tỉ lệ 1 :1 để tạo ra phức hợp.

gl

Ngoài ra, có thể sử dụng thêm các phương pháp khác để đánh giá cấu trúc

oo

của phức hợp lipid như phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

31

P-NMR .

G

Tuy nhiên, trong điều kiện ở Việt Nam chưa thể áp dụng được phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân sử dụng mẫu rắn (solid NMR), mà chỉ có phương pháp đo mẫu lỏng. Nếu sử dụng dung môi hòa tan phức hợp để đo phổ đồng nghĩa với việc cấu trúc của phức hợp lipid cũng bị phá vỡ.

63

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận : Nghiên cứu đã đạt được những kết quả sau : 1. Đã xây dựng được công thức bào chế phức hợp lipid AMB sử dụng hai tá dược là HSPC và DSPG với tỉ lệ là 7 :3, môi trường phân tán là dung dịch natri clorid 0,9%, dung môi hòa tan dược chất là ethanol, tỉ lệ dược chất/lipid là 100 mol%. Phương pháp bào chế phức hợp được sử dụng là thay đổi dung môi.

n

Phức hợp tạo ra có kích thước < 5µm với chỉ số phân bố tiểu phân span <2. Hình

hơ

thái cấu trúc của phức hợp lipid AMB là khác với liposome AMB qua kết quả

N

phân tích của các phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét, phương pháp

Q uy

phân tích nhiệt vi sai, phương pháp phổ IR và phương pháp nhiễu xạ tia X. 2. Đã bào chế và đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng của thuốc tiêm

m

hỗn dịch chứa phức hợp lipid AMB 5mg/ml như hình thức, KTTP và phân bố

D

Đề xuất :

ạy

thuốc tiêm ở dạng bào chế này.

Kè

KTTP, thể tích, hàm lượng AMB. Qua đó, đề xuất một số chỉ tiêu chất lượng cho

m /+

- Cải thiện biện pháp làm giảm KTTP của phức hợp lipid AMB. - Tiếp tục theo dõi độ ổn định của thuốc tiêm hỗn dịch chứa phức hợp lipid

G

oo

gl

e.

co

AMB 5mg/ml.

64

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 1. Bộ môn Hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Hóa dược tập 2, NXB Y học, tr. 195-196.

2. Dược thư Quốc gia Việt Nam – Bộ Y tế (2002), NXB Y học, Tr.146 – 148.

3. Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2013), Kỹ thuật nano và liposome ứng dụng trong dược phẩm và mỹ phẩm, NXB Y học.

n

4. Nguyễn Thị Mỹ (2014), “Nghiên cứu bào chế phức hợp lipid chứa

hơ

Amphotericin B”, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội.

N

5. Ngô Thị Bích Phượng (2013), “Nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B

Q uy

bằng phương pháp bốc hơi pha đảo”, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường đại

m

học Dược Hà Nội.

ạy

6. British Pharmacopeia 2009.

Kè

Tài liệu tiếng Anh:

D

7. Chang H.I (2012), “Clinical development of liposome-based drugs:

m /+

fromulation, characterization and therapeutic efficacy”, Int J Nanomedicine, 7, pp.49-60.

co

8. Cullis et al. (1978), “Polymorphic phase behaviour of lipid mixtures as

e.

detected by 31P-NMR”, Biochimica et Biophysica Acta, 507, pp.207-218.

gl

9. Deamer et al.(1970), “Lamellar and hexagonal lipid phases visualized by free-

oo

etching”, Biochimia et Biophysica Acta, 219, pp.47-60.

G

10. Demetzos Costas (2008), “Differential Scanning Calorimetry (DSC): A tool to study the thermal behavior of lipid bilayers and liposomal stability”, Journal of Liposome research, 18(3), pp.159-173.

11. Janoff et al. (2002), Methods of preparing low-toxicity drug-lipid complexes, United states patent, No US 6406713 B1.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

12. Janoff A.S, et al. (1993), "Amphotericin B Lipid Complex (Ablc™): A Molecular Rationale for the Attenuation of Amphotericin B Related Toxicities", Journal of Liposome Research, 3(3), pp. 451-471.

13. Janoff A.S, et al. (1988), "Unusual lipid structures selectively reduce the toxicity of amphotericin B", Proceedings of the National Academy of Sciences, 85(16), pp. 6122-6126.

14. Jena S.K. et al (2014), Develop of tamoxifen-phospholipid complex: Novel

n

approach for improving solubility and bioavailability, International Journal of

hơ

pharmaceutics, 473, pp. 1-9.

N

15. Gruner Sol M. et al., (1985), “Novel multilayered lipid vesicles: Comparison

Q uy

of physical characteristics of multilamellar liposome and stable plurilamellar vesicles”, Biochemistry, 24, pp. 2833-2834.

m

16. Karl V.C. and David A.S. (2004), “Comparative efficacies of four AMB

Kè

formulations-Fugizone, Amphotec (Amphocil), AmBisome, and Abelcet-against

ạy

Systemic Murine Aspergillosis”, Antimicrob Agents Chemother, 48(3), pp.1047-

D

1050.

m /+

17. Kosuke Sh., Masaaki O., Takemoto Koji, et al. (2010), “ Temperaturedependent transfer of amphotericin B from liposomal membrane of AmBisome

co

to fungal cell membrane”, Journal of controlled release, 141(2), pp. 208-215.

e.

18. Larabi M., et al. (2006), “An Original Lipid Complex System for

gl

Amphotericin B”, Liposome Technology, 2, pp. 93-110.

oo

19. Lapinski Monique M, Castro-Forero Angelines, Greiner Aaron J, et al.

G

(2007), “Comparison of liposome formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore”, Langmuir, 23(23), pp.11677-11683.

20. Larabi M., et al. (2004), “New lipid formulation of amphotericin B: spectral and microscopic analysis”, Biochimica et Biophysica Acta 1664, p.p 172–181.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

21. Li Y. et al (2013), Development of intravenous lipid emulsion of vinorelbine based on drug-phospholipid complex technique, International Jounal of Pharmaceutics, 454, pp. 472-477.

22. Martino R. (2004), “Efficacy, safety and cost-effectiveness of AMB Lipid Complex (ABLC): a review of the literatue”, Current Medical research and opinion, 20(4), pp.485-504.

23. Maxwell P. Westerman et al.(1998), “Phase changes in membrane lipids in

n

sickle red cell shed-vesicles and sickle red cells”, American Journal of

hơ

Hematology, 58, pp.177-182.

N

24. Megan T., Gang R.,Robert O.R. (2008), “Nanodisks derived from

Q uy

Amphotericin B lipid complex”, Journal of pharmaceutical sciences, 97, pp.4425-4432.

m

25. Michael J. Hope, Rajiv Nayar, Lawrence D. Mayer, Pieter R. Cullis (1993),

Kè

“Reduction of liposome size and preparation of unilamellar vesicles by extrusion

ạy

techniques”, Liposome technology, 1(8), pp. 124-138.

D

26. Mustafa Grit, Daan J.A. Crommelin (1992), “The effect of aging on the

m /+

physical stability of liposome dispersions”, Chemistry and Physics of Lipids, 62, pp.113-122.

co

27. Peter W., (2004), “Preparation of vesicle (liposome)”, Encyclopedia of

e.

nanoscience and nanotechnology, 9(1), pp. 43-79.

gl

28. Pretsch E., Buhlmann P., Affolter C. (2000), Structure Determination of

oo

Organic Compounds, Springer.

G

29. Richard T.Proffitt, Arcadia; Jill Adler-Moore, Altadena; Su-Ming Chiang, Canoga Park, all of Calif (1999), “Amphotericin B liposome preparation”, United State Patent, patent number: 5965156.

30. Singh C. et al (2014), Novel rifampicin-phospholipid complex for tubercular therapy: Synthesis, physicochemical characterization and in-vivo evaluation, International Journal of pharmaceutics 460, pp. 220-227.

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

31. Singh D. et al (2012), Quercetin-phospholipid complex: An amorphous pharmaceutical system in herbal drug delivery, Current drug discovery technologies, 9, pp. 17-24.

32. Storm G.Crommelin Daan JA (1998), “Liposomes: quo vadis?”, Pharmaceutical science & technology today, 1(1), pp 19-31.

33. USP 36, 2013.

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

carriers”, Nature reviews drug discovery, 4(2), pp. 145-160.

n

34. Vladimir T. P (2005), “Recent advances with liposomes as pharmaceutical

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

PHỤ LỤC

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 1. Sắc kí đồ mẫu dung môi

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Phụ lục 2. Sắc kí đồ mẫu trắng

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 3. Sắc kí đồ của mẫu dung dịch chuẩn AMB 25µg/ml

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Phụ lục 4. Sắc kí đồ của mẫu thử trƣớc lọc tiếp tuyến

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 5. Sắc kí đồ hỗn dịch phức hợp AMB 5mg/ml sau lọc tiếp tuyến

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Phụ lục 6. Đồ thị phân bố KTTP mẫu CT6 sau đồng nhất hóa lần 2

G

oo

Phụ lục 7. Đồ thị phân bố KTTP mẫu CT10.1 sau đồng nhất hóa lần 2

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

co

N

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

Phụ lục 9. Đồ thị phân bố KTTP mẫu bào chế

hơ

n

Phụ lục 8. Đồ thị phân bố KTTP mẫu CT10.2 sau đồng nhất hóa lần 2

Phụ lục 10.

G

oo

gl

e.

a. Đồ thị phân bố KTTP mẫu Ampholip trong quá trình bảo quản

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

b. Đồ thị phân bố KTTP mẫu Ampholip sau lọc qua màng gắn trong

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Kè

m

Q uy

Phụ lục 11. Phổ đồ phân tích nhiệt vi sai của DSPG

N

hơ

n

kim tiêm

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 12. Phổ đồ phân tích nhiệt vi sai mẫu HSPC

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

Phụ lục 13. Phổ đồ phân tích nhiệt vi sai mẫu liposome AMB 5 mol%

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 14. Phổ đồ DSC mẫu phức hợp lipid AMB 100 mol%

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

Phụ lục 15. Phổ đồ phân tích nhiệt vi sai mẫu phức hợp lipid AMB 25%

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

G

oo

gl

e.

co

m /+

D

ạy

Phụ lục 17. Phổ IR của mẫu DSPG

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 16. Phổ IR của mẫu HSPC

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 18. Phổ IR của mẫu trắng HSPC:DSPG= 7:3

G

oo

gl

e.

co

m /+

Phụ lục 19. Phổ IR của mẫu hỗn hợp vật lý HSPC:DSPG:AMB = 7:3:10

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

D

ạy

Kè

m

Q uy

N

hơ

n

Phụ lục 20. Phổ IR của mẫu liposome AMB 5 mol%

G

oo

gl

e.

co

m /+

Phụ lục 21. Phổ IR của mẫu phức hợp lipid AMB 100 mol%