NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Thị Hải Yến 2. DS. Đào Thị Thùy Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến DS. Đào Thị Thùy Dung Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.

Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận.

Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Ngô Thị Bích Phượng

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................. 2 1.1.

Amphotericin B .................................................................................. 2

1.1.1.

Công thức hóa học .......................................................................... 2

1.1.2.

Đặc tính lý hóa ................................................................................ 2

1.1.3.

Tác dụng dược lý ............................................................................ 3

1.1.4.

Dược động học ................................................................................ 3

1.1.5.

Chỉ định........................................................................................... 3

1.1.6.

Tác dụng không mong muốn.......................................................... 4

1.1.7.

Liều dùng ........................................................................................ 4

1.1.8.

Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường .......................... 4

1.2.

Liposome ............................................................................................ 5

1.2.1.

Khái niệm ........................................................................................ 5

1.2.2.

Thành phần ..................................................................................... 5

1.2.3.

Ưu nhược điểm ............................................................................... 8

1.2.3.1. Ưu điểm ....................................................................................... 8 1.2.3.2. Nhược điểm.................................................................................. 8 1.2.4.

1.3.

Độ ổn định ....................................................................................... 9 Bào chế liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo .................. 10

1.3.1.

Tạo liposome thô ........................................................................... 10

1.3.2.

Giảm kích thước tiểu phân liposome ........................................... 11

1.3.3.

Phương pháp tinh chế liposome ................................................... 13

1.4.

Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B ............................ 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 17 2.1.

Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu .. 17

2.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................ 18

2.3.

Phương pháp nghiên cứu................................................................. 18

2.3.1. Phương pháp xác định độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau ........................................................ 18 2.3.2.

Phương pháp bào chế liposome AMB.......................................... 18

2.3.3.

Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB ....... 20

2.3.3.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, phân bố KTTP liposome .................................................................................................. 20 2.3.3.2. Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển pha của lớp màng lipid..……….. ............................................... Error! Bookmark not defined.

2.3.3.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa ......................... 21 2.3.3.3.1. Phương pháp định lượng AMB trong liposome ................... 21 2.3.3.3.2. Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa ................... 23 2.3.3.4. Tính ổn định của liposome AMB ............................................... 23 2.4.

Điều kiện thí nghiệm ........................................................................ 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 24 3.1.

Thẩm định phương pháp định lượng AMB .................................... 24

3.1.1.

Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí................................ 24

3.1.2.

Độ đặc hiệu ................................................................................... 24

3.1.3.

Tính tuyến tính ............................................................................. 25

3.1.4.

Độ lặp lại ....................................................................................... 26

3.1.5.

Giới hạn phát hiện ........................................................................ 26

3.2. Độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau….. ......................................................................................................... 27 3.3.

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome AMB ............................................................ 28 3.3.1.

Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 28

3.3.2.

Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB.............................. 28

3.3.2.1. Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB ......... 28 3.3.2.2. Hiệu suất liposome hóa .............................................................. 32 3.3.2.3. Tính ổn định của liposome AMB ............................................... 34 3.4.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc tính của liposome .......................................................................................... 37

3.5.

Bàn luận ........................................................................................... 39

3.5.1.

Về phương pháp định lượng AMB .............................................. 39

3.5.2.

Về phương pháp bào chế .............................................................. 39

3.5.3.

Về phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa ...................... 40

3.5.4.

Về xây dựng công thức ................................................................. 41

3.5.5.

Về độ ổn định của liposome AMB................................................ 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT

Viết tắt

Từ/ cụm từ đầy đủ

1

AMB

Amphotericin B

2

Chol

Cholesterol

3

DĐVN

Dược điển Việt Nam

4

DMPC

α-Dimyristoylphosphatidylcholin

5

DMPG

l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol

6

DSC

Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry)

7

DSPC

Distearoylphophatidylcholin

8

DSPG

Distearoylphosphatidylglycerol

9

EDTA

Ethylendiamin tetraacetic acid

10

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography)

11

HSPC

Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholine)

12

IC50

Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory concentrations)

13

KTTP

Kích thước tiểu phân

14

N/D

Nước/dầu

15

NSX

Nhà sản xuất

16

PDI

Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

17

RBCPR

Chỉ số giải phóng kali ra khỏi tế bào hồng cầu (red blood cell potassium release)

18

SPC

Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholine)

19

TEM

Kinh hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope)

20

TKHH

Tinh khiết hóa học

21

USP

United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu

Tên bảng biểu

Trang

Bảng 1.1

Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường

4

Bảng 2.1

Nguyên liệu

17

Bảng 3.1

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí

24

Bảng 3.2

Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak

25

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí

27

Bảng 3.4

Thành phần các công thức bào chế liposome AMB

28

Bảng 3.5

KTTP và phân bố KTTP của các mẫu liposome AMB

29

Bảng 3.6

Hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome AMB

32

Bảng 3.7

KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các

34

mẫu sau 1 tuần bảo quản Bảng 3.8

Thành phần công thức của mẫu liposome A553 và A554

37

Bảng 3.9

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong

37

công thức đến các đặc tính của liposome AMB

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu

Tên hình vẽ, đồ thị

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc của liposome

5

Hình 1.2

Dạng tồn tại của các chất lưỡng tính khi phân tán trong môi

6

trường nước Hình 1.3

Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha

7

Hình 1.4

Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo

11

Hình 1.5

Cơ chế giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn ép

16

(extrusion) Hình 2.1

Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome

20

AMB Hình 3.1

Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích

26

peak Hình 3.2

Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế

29

Hình 3.3

Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB

30

Hình 3.4

Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome

30

nhóm A Hình 3.5

Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome

30

nhóm B Hình 3.6

Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome

33

Hình 3.7

Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu liposome sau 1

35

tuần bảo quản Hình 3.8

Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các

36

mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản Hình 3.9

Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu có tỷ lệ

38

% mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau

38

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, ngày càng có nhiều dạng thuốc mới ra đời với những tính năng vượt trội hơn so với các dạng thuốc quy ước. Trong đó, liposome được đánh giá là một hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao, có khả năng vận chuyển thuốc hướng đích tách dụng, tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của thuốc. Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ dược phẩm và đang được đầu tư nghiên cứu rất nhiều ở các nước trên thế giới và ở Việt Nam. Amphotericin B là một dược chất thân dầu, có tác dụng kháng nấm, được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên, thuốc có độc tính cao do tính chọn lọc giữa tế bào nấm và tế bào cơ thể người thấp, vì vậy việc sử dụng còn hạn chế. Đã có rất nhiều hướng nghiên cứu nhằm giảm độc tính của thuốc, trong đó sử dụng liposome làm chất mang đang là một hướng đi đầy triển vọng. Để góp phần ứng dụng liposome làm chất mang làm giảm độc tính của thuốc, đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo” nhằm mục tiêu: + Bào chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. + Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome amphotericin B.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.

Amphotericin B

1.1.1. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C47H73NO17.

Khối lượng phân tử: 924,08. pKa: 5,5; 10 [2].

1.1.2. Đặc tính lý hóa • Lý tính: - Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam.

- Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid (30 – 40 mg/ml) và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2 – 4 mg/ml), rất khó tan trong methanol [2].

• Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau: - Tính lưỡng tính.

- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung dịch kiềm.

- Dung dịch 0,0005 % trong methanol ở vùng sóng từ 300-450 nm có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,570,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [2].

3

1.1.3. Tác dụng dược lý - AMB là kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng tế bào nấm làm thay đổi tính thấm của màng tế bào và làm giải phóng các thành phần bên trong ra ngoài môi trường. AMB cũng gắn vào sterol bào chất ở người (cholesterol) gây độc tính cho cơ thể.

- AMB có tác dụng kìm nấm đối với một số loại nấm như: Absidia spp, Aspergillus spp, Basidiobolus spp, Blastomyces dermatitidis, Candida spp... Nồng độ ức chế tối thiểu đối với các loại nấm này là 0,03 – 1 mcg/ml.

- Thuốc không có tác dụng đối với virus, vi khuẩn và ricketsia [3].

1.1.4. Dược động học - AMB hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa, chủ yếu dùng đường tiêm truyền tĩnh mạch để điều trị nhiễm nấm nặng toàn thân, chỉ dùng đường uống để điều trị nhiễm nấm đường tiêu hóa và niêm mạc miệng.

- AMB liên kết với protein ở mức cao. Thuốc phân bố rộng rãi trong cơ thể.

- AMB bài tiết rất chậm qua thận, 2-5 % liều dùng bài tiết dưới dạng hoạt tính sinh học. AMB có nguy cơ gây độc cao với thận, không loại được thuốc ra khỏi cơ thể bằng thẩm tách máu [3].

1.1.5. Chỉ định - Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans ở miệng và đường tiêu hóa.

- Tiêm tĩnh mạch AMB dùng điều trị nhiễm nấm toàn thân nặng do nhiễm Aspergillus,

Blastomyces,

Candida,

Coccidioidesimmitis,

Cryptococcus,

Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.

- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã điều trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc sau điều trị ung thư bằng hóa chất.

- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại bằng AMB thông thường hoặc trường hợp AMB có thể gây độc cho thận hoặc gây suy thận [3].

4

1.1.6. Tác dụng không mong muốn -

Phản ứng chung: sốt, rét run, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.

-

Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.

-

Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan, tim, giảm K và

+

Mg2+ huyết… [3].

1.1.7. Liều dùng Đường tiêm tĩnh mạch: AMB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1

-

mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày.

AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4

-

mg/kg/ngày.

Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.

-

Đường uống: -

Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.

+ Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày. + Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [3].

1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường Bảng 1.1. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường TT

1

Tên chế

Hàm

phẩm

lượng

Fungizone

50 mg

Thành phần

phức hợp AMB với natri

Dạng cấu

Dạng bào

trúc

chế

micel

bột đông

deoxycholat 2

3

Abelcet Amphotec

khô

100mg/

DMPC:DMPG:AMB

phức hợp

hỗn dịch

20ml

(tỷ lệ mol 7:3:10)

lipid

50 mg,

phức hợp AMB với

phức hợp

bột đông

100 mg

cholesteryl sulfate

lipid

khô

5

(tỷ lệ mol 1:1) 4

Ambisome

50 mg

HSPC:DSPG:Chol:AMB

liposome

(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4) 1.2.

bột đông khô

Liposome

1.2.1. Khái niệm Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1].

Hình 1.1. Cấu trúc của liposome 1.2.2. Thành phần Phospholipid Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân liposome, là những phân tử lưỡng tính vừa thân dầu vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với các nhóm phân cực và các acid béo. Nhóm phân cực có thể tích điện dương, âm hoặc không tích điện, các acid béo có thể no hoặc không no. Các phospholipid có khả năng tự đóng vòng để tạo thành liposome khi chúng được trộn lẫn với môi trường nước, đầu phân cực sẽ hướng ra ngoài tương tác với môi trường nước, chuỗi acid béo sẽ quay vào trong, tạo ra lớp lipid kép [4]. Các phospholid này có chỉ số packing parameter (PP) xấp xỉ 1, trong khi các chất diện hoạt khác có chỉ số PP >>1

6

hoặc <<1 chỉ có khả năng tạo thành dạng cấu trúc micel hoặc micel đảo khi phân tán trong môi trường nước [8]: Packing parameter = Trong đó: V: là thể tích chiếm chỗ của nhóm thân dầu. a: là diện tích bề mặt bao quanh nhóm thân nước tại bề mặt phân cách pha giữa nước và không khí.

Lc: là chiều dài của nhóm thân dầu.

Hình 1.2. Dạng tồn tại của các chất diện hoạt khi phân tán trong môi trường nước Lớp màng lipip kép được tạo thành khi tăng nhiệt độ lên trên nhiệt độ chuyển pha Tc của lipip, là nhiệt độ mà tại đó phân tử lipid chuyển từ trạng thái gel sang trạng thái tinh thể lỏng (liquid crystalline). Tc của lipid phụ thuộc vào chiều dài và mức độ no của chuỗi acid béo cũng như đặc điểm của nhóm phân cực. Lớp lipid kép trở nên linh động và dễ thấm tại và trên Tc làm giải phóng các thành phần bên trong ra ngoài môi trường [5]. Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh lí, do đó nên sử dụng các phospholipid có Tc > 37 ºC [4].

7

Cholesterol Cholesterol và các dẫn chất được sử dụng trong bào chế liposome với vai trò làm tăng tính cứng và giảm tính thấm của lớp màng lipip đối với các chất mang [18].

Màng phospholipid kép tồn tại ở 2 trạng thái: trạng thái gel và trạng thái tinh thể lỏng. Ở trạng thái gel, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình trans (hình 1.3), diện tích không gian giữa các phân tử phospholipid nhỏ nhất, độ dày của màng lipid kép cao nhất, chuyển động quay của phân tử hạn chế ở mức tối đa. Ở trạng thái tinh thể lỏng, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình gauche (hình 1.3), diện tích không gian giữa các phân tử lớn hơn, màng lipid kép lỏng lẻo hơn, chuyển động quay nội phân tử và giữa các phân tử diễn ra mạnh hơn. Quá trình chuyển trạng thái của lớp màng lipid khi không có cholesterol diễn ra trong khoảng nhiệt độ hẹp. Sự có mặt của cholesterol làm nới rộng khoảng chuyển pha, giảm enthalpy chuyển pha, giảm diện tích không gian giữa các phân tử, giảm chuyển động quay của các hydrocacbon, làm cho các phân tử phospholipid sắp xếp một cách có trật tự và tạo thành một lớp màng lipid kép cứng chắc hơn [13].

Hình 1.3. Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha Cholesterol còn giúp làm tăng tính ổn định của liposome trong các dịch sinh học như huyết tương. Liposome không chứa cholesterol sẽ tương tác nhanh với các protein trong huyết tương như albumin, transferin, macrogloburin. Các protein này

8

có xu hướng lôi các phân tử phospholipid ra khỏi cấu trúc màng lipid, làm phá vỡ lớp màng kép. Sự có mặt của cholesterol làm giảm tương tác này [18].

Ngoài phospholipid và cholesterol, các chất diện hoạt, các chất tích điện cho lớp màng lipid… cũng được sử dụng trong bào chế liposome.

1.2.3. Ưu nhược điểm 1.2.3.1. Ưu điểm Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học như tính thấm, tính đẳng trương... Do đó đây được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [22].

Do đặc điểm cấu trúc mà liposome có thể mang được cả dược chất thân dầu và thân nước. Dược chất thân nước được bao trong nhân nước, còn dược chất thân dầu được gắn kết trên lớp màng lipid kép [22].

Dược chất được bảo vệ khỏi tác động của các yếu tố bất lợi bên ngoài môi trường, do đó hạn chế được tác động bất lợi của đường dùng thuốc đến tác dụng của thuốc, như ảnh hưởng của các enzym phân hủy thuốc [22].

Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng bào chế liposome, AMB liên kết bền chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol, làm giảm khả năng liên kết với chol trên màng tế bào người dẫn đến giảm độc tính của thuốc. Chỉ khi thuốc phân bố đến các tổ chức viêm nhiễm do ái lực của AMB với ergosterol cao hơn với chol làm giải phóng AMB ra khỏi lớp màng lipid, hình thành phức hợp AMB - ergosterol trên màng tế bào nấm và phát huy tác dụng của thuốc [19].

Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome, do đó làm thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [22], [25].

1.2.3.2. Nhược điểm Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng hiện liposome vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do có một số nhược điểm sau: Chất lượng nguyên liệu: các phospholipid sử dụng đa số được tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên

9

liệu. Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình oxy hóa phospholipid [21]. Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng cũng như môi trường [25]. Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí và hóa học [21].

Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [21].

Hiện vẫn chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm liposome. Ví dụ như: hội chứng tay chân (“hand and foot” syndrome) không xuất hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài [21].

1.2.4. Độ ổn định Liposome được coi là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lí, hóa học và sinh học. Sự thay đổi đặc tính lí hóa của liposome có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế cũng như trong quá trình bảo quản.

Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của liposome là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy phân liên kết ester của phospholipid tạo ra các lysophospholid. Có thể dùng các kĩ thuật sắc kí khác nhau để đánh giá mức độ tinh khiết, định tính, định lượng lipid trong liposome [5].

Về mặt vật lí: sự thay đổi đặc tính vật lí của liposome do quá trình thấm thuốc qua màng và do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra hiện tượng kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản. Trạng thái vật lí của liposome có thể được đánh giá thông qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [5]. Thế Zeta cho biết mức độ tích điện trên bề mặt tiểu phân liposome. Nếu tiểu phân tích điện lớn thì lực đẩy tĩnh điện mạnh, các tiểu phân cách xa nhau và hạn chế quá trình kết tụ tiểu phân. Sự tích điện càng gần không thì chuyển động Brown càng nhanh làm cho các tiểu phân va chạm và kết tập, hệ keo kém ổn định [6].

10

Kĩ thuật đông khô được sử dụng để tăng độ ổn định của liposome trong quá trình bảo quản. Một mặt, quá trình này giúp loại nước khỏi hỗn dịch liposome làm giảm quá trình thủy phân phospholipid, mặt khác nó làm chậm quá trình biến đổi vật lí và hóa học của dạng bào chế do sản phẩm tồn tại ở trạng thái rắn bền vững hơn [5]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quá trình đông khô không ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của thuốc [25].

1.3.

Bào chế liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo

1.3.1. Tạo liposome thô Liposome được tạo ra bằng phương pháp bốc hơi pha đảo nhờ quá trình trung gian tạo micel đảo. Phospholipid, cholesterol và các chất tan trong dầu được hòa tan bằng dung môi hữu cơ thích hợp, sau đó đem cất quay để loại bỏ dung môi.

Hòa tan trở lại hỗn hợp các thành phần bằng một dung môi không hỗn hòa với nước. Để tạo micel đảo, thêm pha nước và siêu âm trong khoảng thời gian thích hợp cho đến khi tạo thành hệ phân tán một pha đồng nhất. Các micel đảo có cấu trúc gồm lớp phospholipid đơn lớp bao quang nhân nước. Bốc hơi từ từ dưới áp suất giảm để loại dung môi hữu cơ, khi đó các micel sát nhập vào nhau, hệ chuyển sang trạng thái gel. Tiếp tục quá tình bốc hơi dung môi, khi đạt tới điểm giới hạn, trạng thái gel bị bẻ gẫy, các micel bị phá vỡ và phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid kép và hình thành liposome.

Pha dầu có thể sử dụng các loại dung môi khác nhau như: diethyl ether, isopropyl ether, halothane hoặc trifloro tricloro ethane để hòa tan các phospholipid.

Trường hợp phospholipid có độ tan thấp trong các dung môi trên, có thể thêm một tỷ lệ nhỏ chloroform hoặc methanol để tăng độ tan. Nồng độ phospholipid sử dụng thường từ 10 – 100 mmol/ml hỗn dịch sản phẩm. Khi sử dụng nồng độ lipid thấp hoặc hỗn hợp lipid không chứa cholesterol thì quá trình tạo trạng thái gel và bẻ gẫy các micel đảo để hình thành liposome sẽ không xảy ra.

11

Hình 1.4. Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các tiểu phân liposome chứa 1 thể tích khoang nước lớn và do đó tăng hiệu suất gắn thuốc đối với các dược chất tan trong nước. Phương pháp này rất phù hợp để bào chế các tiểu phân liposome mang các chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước lớn như albumin, các phosphatase kiềm, ferritin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là tạo ra các liposome có kích thước lớn, không đồng nhất và có sự phơi nhiễm với dung môi hữu cơ [23].

1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lí, cải thiện hình thức cho chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng đường tiêm tĩnh mạch [23].

Hơn nữa, KTTP là một trong những yếu tố quyết định tỷ lệ liposome bị bắt giữ bởi hệ thống đại thực bào (RES), quá trình opsonin hóa liposome có kích thước nhỏ (< 100 nm) diễn ra chậm hơn các liposome có kích thước lớn (> 100 nm). Các liposome có kích thước nhỏ có thể dễ dàng đi qua các khe kẽ trên màng tế bào vào

12

trong bào tương và phát huy tác dụng tại tế bào đích. Như vậy, KTTP ảnh hưởng tới hiệu quả điều trị của dạng thuốc [17].

Hai phương pháp chính hay được sử dụng để làm giảm KTTP là siêu âm (sonication) và đùn ép qua màng (extrution): Với phương pháp siêu âm, liposome được làm nhỏ nhờ năng lượng của sóng siêu âm, thu được các tiểu phân kích thước nhỏ và tương đối đồng nhất. Nhược điểm của phương pháp: gây hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm và giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm. So với phương pháp đùn ép, phương pháp siêu âm tiến hành trong thời gian ngắn hơn nhưng không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ [11], [24].

Với phương pháp đùn ép, hỗn dịch liposome được đùn ép qua màng polycarbonat có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch liposome đơn lớp, kích thước gần với kích thước của lỗ màng. Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch liposome được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, sắp xếp đồng trục, kích thước xác định, ở áp suất vừa phải, nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển pha Tc của phospholipid và với số lần thích hợp. Khi đó các tiểu phân có kích thước lớn hơn kích thích lỗ màng sẽ được làm nhỏ khi đi qua qua màng, còn các tiểu phân kích nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng, do đó thu được hỗn dịch liposome có kích thước đồng nhất. Ưu điểm của phương pháp này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ [11], [24].

Hình 1.5. Cơ chế giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn ép (extrusion)

13

1.3.3. Phương pháp tinh chế liposome Mục đích của quá trình tinh chế liposome là loại bỏ các thành phần không được gắn vào liposome và các chất tẩy rửa sử dụng trong quá trình bào chế [23].

Với dược chất tan trong nước: Lọc qua gel (gel filtration) Phương pháp cho phép phân tách các chất dựa trên sự khác nhau về khối lượng phân tử và kích thước tiểu phân dựa trên nguyên lí: môi trường lọc gel được chứa trong cột lọc, cho hệ pha động và mẫu chảy qua cột. Khi đó các phân tử kích thước nhỏ thẩm thấu vào trong các hạt chứa trong cột và lưu lại trong cột lâu hơn, còn những phân tử, tiểu phân có kích thước lớn không thẩm thấu được vào trong các hạt, theo pha động chảy ra khỏi cột. Như vậy, liposome không đi vào các hạt và bị rửa giải trước các phân tử dược chất không gắn vào liposome [23].

Ly tâm (centrifugation) Có 3 kiểu ly tâm được ứng dụng để tinh chế liposome: ly tâm vi phân, ly tâm theo gradient tỷ trọng và ly tâm có sử dụng các lưới lọc phân tử. Điều kiện li tâm tối ưu phụ thuộc vào loại lipid, loại liposome, hệ đệm và nhiệt độ [23].

Với các dược chất tan trong dầu: Dược chất tan trong dầu khi tách khỏi lớp màng lipid kép sẽ tồn tại dưới dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình. Để tách loại các tinh thể dược chất ra khỏi liposome có thể li tâm hỗn dịch trong 10 – 30 giây ở tốc độ cao, khi đó những tinh thể dược chất bị lắng xuống. Phương pháp này yêu cầu đánh giá lại nồng độ phospholipid sau quá trình li tâm để khẳng định liposome không bị lắng xuống trong quá trình li tâm. Ngoài ra, có thể đùn ép hỗn dịch liposome qua màng polycacbonat có kích thước lỗ lọc dưới 100 nm để loại tinh thể dược chất, khi đó chỉ có liposome có tính chất mềm dẻo đi qua màng lọc còn tinh thể dược chất thì không. Nhược điểm của phương pháp là sử dụng lực nén lớn trong quá trình đùn ép làm tăng sự tách pha của dược chất ra khỏi lớp màng lipid kép [23].

14

1.4.

Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B Pleumchitt Rojanapanthu cùng cộng sự đã nghiên cứu đặc tính lý hóa của

liposome amphotericin B bào chế từ phosphatidylcholin (PC), cholesterol bằng phương pháp bốc hơi pha đảo, sử dụng tỷ lệ diethylether: dung dịch NaCl 0,9 % là 3:1 v/v, siêu âm trong 5 phút ở 7 ºC, bốc hơi ở 25 ºC để loại ether. Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng kĩ thuật thẩm tích qua màng thẩm tích (molecular cutoff 12000 dalton), môi trường thẩm tích là dung dịch NaCl 0,9 %, ở 30 ºC, có khuấy từ.

Kết quả cho thấy, liposome chứa 2 % mol AMB trên tổng lượng lipid cho hiệu suất gắn thuốc cao nhất (khoảng 95%), KTTP trong khoảng 1307 – 1451 nm với tỷ lệ PC: chol là 1:1. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, khi tăng tỷ lệ % về số mol AMB/tổng lượng lipip trên 3 % thì hiệu suất liposome hóa giảm, do độ tan hạn chế của AMB trong diethyl ether (< 0,01 mg/ml) [15].

S.P. Shah và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB dạng bột xông hít dùng điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở phổi bằng phương pháp bốc hơi pha đảo sử dụng hỗn hợp ethyl acetat và ethanol làm pha dung môi hữu cơ, pha nước là dung dịch đệm Tris 0,01 M pH 6,5 chứa 1 mM EDTA. Liposome tạo ra được đùn ép qua màng polycarbonat 2 µm, ở nhiệt độ 60ºC, loại dược chất không được gắn vào liposome bằng phương pháp li tâm với lực li tâm là 4,38 × 103 g trong 90 giây. Sử dụng HSPC, chol và phosphatidylglycerol đậu nành (7:3:0,5) hoặc stearylamin (1:1:0,1) để tạo liposome AMB tích điện âm (AMB 1) hoặc dương (AMB 2), đông khô liposome bằng cách sử dụng các chất tạo khung khác nhau, sau đó sử dụng Sorbolac 400 và Pharmatose 325M đã rây qua rây 500 để làm tá dược độn tạo dạng liposome bột xông hít. Kết quả khảo sát các điều kiện thí nghiệm cho thấy với tỷ lệ ethyl acetat: ethanol là 1:1, tỷ lệ pha nước: pha dung môi hữu cơ là 1:5 tạo ra các liposome có đặc tính tốt nhất với kích thước 1,8 ± 0,2 µm (AMB 1) và 2,0 ± 0,3 µm (AMB 2), hiệu suất gắn thuốc 95,8 ± 1,5 % (AMB 1) và 87,9 ± 1,3 (AMB 2). Trong các chất tạo khung đã khảo sát, sucrose được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo với tỷ lệ tối ưu lipid: sucrose là 1:5, sản phẩm sau khi tạo dạng bột xông hít thì hiệu

15

suất gắn dược chất là 22,5 ± 2,2 % (AMB 1) và 16,8 ± 2,2 % (AMB 2). Liposome AMB tạo ra bảo quản ở 2-8 ºC có tuổi thọ trên 1 năm [16].

Deepak Singodia cùng cộng sự nghiên cứu bào chế liposome AMB sử dụng phosphatidylglycerol, chol và DMPC (F - 1a) hoặc SPC (F - 2a) bằng phương pháp pha loãng ethanol như sau: AMB hòa tan trong dimethyl acetamid được acid hóa bằng dung dịch HCl 0,1 %, trộn lẫn với dung dịch lipid hòa tan trong ethanol rồi tiêm nhanh vào 1 thể tích lớn dung dịch dextrose 5 % để thu được liposome AMB. Kết quả cho thấy các liposome bào chế bằng phương pháp này có KTTP khoảng 100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV và hiệu suất gắn thuốc trên 95 % đối với tất cả các mẫu, khả năng giải phóng dược chất in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công thức hầu như không có sự khác biệt so với chế phẩm Ambisome [20].

A. Manosroi cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB với nguyên liệu là HSPC, chol và các phospholipid tích điện: dicetylphosphat (-), stearylamine (+) với các tỷ lệ 1:1:0, 7:2:0, 7:2:1 (-), 7:2:1 (+), ở nồng độ 0,05 mg AMB/mg lipid bằng phương pháp hydrat hóa màng film, sử dụng kĩ thuật siêu âm để đồng nhất hóa và giảm KTTP, sử dụng phân tích nhiệt vi sai để đánh giá mức độ ổn định của liposome. Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng phương pháp li tâm với lực li tâm là 50000 g (ở 4 ºC), trong 1h. Kết quả thu được các liposome có KTTP từ 115 – 364 nm, hiệu suất liposome hóa trên 85 % với tất cả các mẫu, trong đó mẫu 7:2:1 (+) AMB cho hiệu suất gắn thuốc cao nhất và ổn định nhất [12].

Maryam Iman cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB sử dụng 1,2 – distigmasterylhemisuccinoyl – sn – 3 – phosphocholin (DSHemsPC), là một loại lipid mới, được tổng hợp từ 2 phân tử stigmasterol (là sterol ở tế bào thực vật) liên kết với acid succinic và glycerolphosphocholin. Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DSHemPC, DMPC, DMPG ở các pH khác nhau (7,4 ; 6,5; 5,5) đến đặc tính vật lí, khả năng giải phóng ion kali ra khỏi tế bào hồng cầu (RBCPR), hoạt tính kháng nấm in vitro, kháng hắc nhiệt da (Leishmania major), đồng thời so sánh với 2 chế phẩm hiện có trên thị trường là Ambisome và Fungizone nhằm xác định khả năng sử dụng sterol thực vật thay thế chol trong bào chế liposome. Kết quả

16

nghiên cứu cho thấy hầu hết các công thức đều có các đặc tính tương đương với Ambisome: KTTP khoảng 100 nm, phân bố kích thước hẹp, giá trị RBCPR, IC50 tương đương hoặc nhỏ hơn khi sử dụng Ambisome, hoạt tính kháng nấm in vitro và kháng hắc nhiệt da gần như tương đương với Ambisome và Fungizone, liều tiêm tĩnh mạch tối đa của các công thức dưới 10 mg/kg. Tuy nhiên, ở tỷ lệ DSHemsPC/DMPC/DMPG/AMB là 1,25/5,0/1,5/1,0 pH 5,5 cho kết quả tốt hơn cả và tương đương với Ambisome, liều tiêm tĩnh mạch có thể lên tới 60 mg/kg, điều đó cho thấy có thể sử dụng sterol thực vật thay thế chol động vật nhằm giảm giá thành của sản phẩm từ đó cho phép sử dụng một cách rộng rãi chế phẩm dạng liposome AMB [10].

Tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào về liposome AMB đã công bố.

17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: liposome AMB. - Nguyên liệu: Bảng 2.1. Nguyên liệu TT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

1

Amphotericin B

Trung Quốc

USP

2

Cholesterol

Trung Quốc

NSX

3

Phosphatidylcholin đậu nành

Avanti polar Lipids –

NSX

(soy phosphatidylcholine)

Mỹ

4

Chloroform

Labscan – Thái Lan

NSX

5

Methanol

Trung Quốc

TKHH

6

Methanol dùng cho HPLC

Baker - Mỹ

NSX

7

Acetonitril dùng cho HPLC

Baker – Mỹ

NSX

8

Natri EDTA

Trung Quốc

NSX

9

Nước tinh khiết

Việt Nam

DĐVN

10

Dinatri hydrophosphat

Trung Quốc

TKHH

11

Kali dihydrophosphat

Trung Quốc

TKHH

- Phương tiện nghiên cứu: + Hệ thống cất quay Rovapor R – 210 (Buchi – Đức), bình cầu NS 29/32, dung tích 1000 ml (Buchi – Đức). + Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh). + Thiết bị liposome extruder (Eastern Scientific – Mỹ). + Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Aligent. + Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H. + Kính hiển vi điển tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản). + Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kĩ thuật, các dụng cụ thủy tinh.

18

2.2.

Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AMB trong liposome.

- Khảo sát độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau.

- Lựa chọn các thông số kĩ thuật bào chế liposome AMB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo.

- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức đến các đặc tính của liposome AMB. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp xác định độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau - Tiến hành khảo sát độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat có pH lần lượt là 3, 4, 5, 6, và 7,4.

- Cân một lượng dư AMB (khoảng 0,1 g AMB), cho vào bình nón có nắp đậy dung tích 250 ml, thêm khoảng 100 ml môi trường khảo sát, khuấy từ liên tục trong 24 h, ở nhiệt độ phòng (khoảng 25 ºC).

- Sau 24 h, hút khoảng 5 ml dịch, đem li tâm ở tốc độ 12 000 v/p, nhiệt độ phòng, trong 30 phút để loại phần AMB không tan. Lấy phần dịch phía trên, đem lọc qua màng celulose acetat 0,45 µm.

- Tiến hành xác định nồng độ của AMB trong từng môi trường bằng phương pháp HPLC với các điều kiện đã mô tả ở mục 2.3.3.3.1, thu được diện tích peak tương ứng Si. - Xác định nồng độ AMB (Ci) trong từng môi trường bằng phương pháp so sánh diện tích peak với dung dịch AMB chuẩn pha trong dung môi thử có nồng độ Co, diện tích peak S0 xác định: Ci =

× Co.

2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB Nghiên cứu đã tiến hành lựa chọn phương pháp bốc hơi pha đảo để bào chế liposome AMB.

19

Quy trình bào chế liposome AMB như sau: Cân và hòa tan AMB trong 50 ml methanol (0,2 mg AMB/ml methanol).

Cân và hòa tan SPC, chol trong 15 ml chloroform.

Phối hợp 2 dung dịch trên, khuấy trộn để thu được dung dịch đồng nhất.

Chuyển dung dịch lipid vào bình cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay. Tiến hành cất quay ở điều kiện nhiệt độ 40 – 41 ºC, tốc độ quay 150 vòng/phút (v/p). Hệ thống cất quay được hút chân không, điều chỉnh áp suất để dung môi bay hơi từ từ.

Sau 30 phút hút chân không, dung môi bay hơi hết, tiếp tục cất quay 3 giờ để loại dung môi một cách hoàn toàn.

Hòa tan trở lại hỗn hợp lipid và AMB bằng 30 ml diethyl ether. Chuyển hỗn hợp sang bình định mức dung tích 100 ml có nắp đậy, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat. Siêu âm liên tục trong bể siêu âm (có làm lạnh) trong 15 phút, nhiệt độ: 10 - 20 ºC tạo nhũ tương N/D. Cho nhũ tương vào bình cất quay của hệ thống cất quay. Tiến hành cất quay dưới áp suất giảm để loại diethyl ether với điều kiện: tốc độ quay của bình cầu 100 v/p, ở nhiệt độ phòng, điều chỉnh áp suất để quá trình bốc hơi dung môi diễn ra một cách từ từ. Sau 15 phút, diethyl ether bay hơi hoàn toàn, hệ chuyển sang trạng thái gel. Tiếp tục bốc hơi dung môi, sau 10 phút trạng thái gel bị phá vỡ và tạo thành liposome. Cất quay thêm 1h để loại hoàn toàn dung môi hữu cơ.

Hỗn dịch liposome thu được đem đùn ép qua màng polycarbonat với kích thước lỗ màng lần lượt là 400 – 200 – 100 nm (mỗi loại màng đùn qua 29 lần), ở nhiệt độ 50 ºC, thu được hỗn dịch liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất.

Liposome AMB được đóng trong lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy bạc và bảo quản ở 2 – 8 ºC. Quy trình bào chế được trình bày trong sơ đồ sau:

20

SPC, Chol, AMB

Hòa tan lipid/chloroform, AMB/methanol Cất quay tạo lớp màng film lipid

Nhiệt độ: 40 - 41 ºC. Tốc độ: 150 v/p

Diethyl ether

Tái hòa tan lớp màng lipid

Đệm phosphat

Siêu âm tạo nhũ tương N/D

Thời gian: 15 phút.

Nhiệt độ: 10 – 20 ºC

Cất quay loại dung môi

Nhiệt độ phòng.

Tốc độ: 100 v/p

Hỗn dịch liposome thô

Đùn ép qua màng polycarbonat

Nhiệt độ: 50 ºC

Đóng gói, bảo quản Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome AMB 2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB 2.3.3.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, phân bố KTTP liposome - Về hình thức: liposome AMB sau khi đùn ép phải là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, không có lặng cặn tinh thể, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát bằng mắt thường.

- Về hình thái liposome: sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để quan sát đặc điểm về hình thái bên ngoài, kích thước và phân bố kích thước của liposome.

21

- Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), phân bố KTTP bằng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá Zetasizer ZS 90: lấy một lượng nhỏ mẫu liposome AMB sau khi đùn qua màng polycacbonat, đem pha loãng 100 lần bằng nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm, tiến hành đo KTTP. Thiết bị cũng cho giá trị về chỉ số đa phân tán PDI của hệ.

- Đánh giá kết quả: Zaverage, PDI (đánh giá phân bố KTTP theo intensity). Trong đó, chỉ số Zaverage (đơn vị đo “d.nm”: số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ và dùng để so sánh về kích thước giữa các mẫu liposome khác nhau. Khi PDI lớn (> 0,5) thì chỉ số Zaverage không có ý nghĩa, khi đó dựa vào vị trí của các peak trên đồ thị phân bố KTTP để so sánh kích thước giữa các mẫu.

2.3.3.2. Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển pha của lớp màng lipid Sử dụng kỹ thuật phân tích nhiệt vi sai (DSC) để xác định nhiệt độ chuyển pha của lớp màng lipid nhằm đánh giá sự tương tác lí hóa của SPC, chol và AMB trong cấu trúc liposome: + Liposome đem li tâm ở tốc độ 12000 v/p, trong 45 phút, ở 5 ºC, loại bỏ phần dịch phía trên, hỗn dịch liposome đặc đem đặt trong bình hút ẩm, áp suất thường, trong 5 ngày để loại nước. + Cân khoảng 2 – 5 mg liposome đã mất nước, đặt trong pan nhôm có thể tích 40 µL, hàn nắp pan nhôm. + Quét nhiệt trong khoảng từ 0 – 250 ºC, tốc độ gia nhiệt 5 ºC/phút. + Tiến hành phân tích đối với các mẫu: SPC, chol và liposome AMB có tỷ lệ các thành phần khác nhau để đánh giá ảnh hưởng của AMB, chol đối với nhiệt độ chuyển pha (Tc) của SPC. 2.3.3.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa 2.3.3.3.1. Phương pháp định lượng AMB trong liposome Xác định hàm lượng AMB trong liposome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [7]: Điều kiện sắc kí

22

-

Cột sắc kí: cột Cosmosil 5C18 – MS - II, kích thước cột 250 × 4,6 mm; đường kính hạt nhồi 5 µm.

-

Pha động: hỗn hợp acetonitril (ACN) và natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) với tỷ lệ 40: 60 về thể tích (v/v).

-

Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

-

Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

-

Detector UV, bước sóng 405 nm.

Pha mẫu chuẩn và mẫu thử Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,005 g AMB hòa tan bằng methanol trong bình định mức 100ml, bổ sung methanol đến vạch, thu được dung dịch gốc có nồng độ 50 µg/ml. Hút chính xác một thể tích xác định dung dịch gốc, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi ACN: natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) tỷ lệ 60:40 v/v, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp. Lọc dung dịch qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.

Mẫu thử: Hút chính xác 0,5 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol: chloroform tỷ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi ACN: natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) tỷ lệ 60:40 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch. Lọc mẫu qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.

Hàm lượng AMB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

CT = Trong đó: CT : nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome (mg/ml).

St: diện tích peak mẫu thử (mAU.s) Sc: diện tích peak mẫu chuẩn (mAU.s) mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg).

23

k: hệ số pha loãng.

2.3.3.3.2. Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa Định lượng AMB toàn phần: nồng độ AMB trong hỗn dịch liposome thô.

Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch liposome thô, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.3.3.1. Tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak là S1. Định lượng AMB gắn trong lớp lipid của liposome: để đánh giá được lượng AMB gắn trong lớp lipid cần loại bỏ phần AMB tự do. AMB tự do không tan trong nước sẽ kết tủa và bị loại đi trong quá trình đùn ép qua màng polycacbonat có kích thước lỗ màng lần lượt là 400 – 200 – 100 nm. Hút chính xác 0,5 ml hỗn dịch liposome sau khi đùn ép, pha loãng mẫu như mô tả ở mục 2.3.3.3.1. Tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak là S2.

Hiệu suất liposome hóa được xác định bằng công thức: H % =

× 100%.

2.3.3.4. Tính ổn định của liposome AMB Đánh giá KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất liposome hóa khi bảo quản ở 2 – 8 ºC sau 1 tuần.

2.4.

Điều kiện thí nghiệm AMB bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và

đánh giá cần tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.

24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng AMB 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí - Chuẩn bị dung dịch AMB chuẩn có nồng độ khoảng 20 µg/ml.

- Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc kí với điều kiện sắc kí như mô tả ở mục 2.3.3.3.1, theo dõi thời gian lưu (tR), diện tích peak (Speak). Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí Thời gian lưu (tR)

Diện tích peak (Spic)

(phút)

(mAU.s)

1

6,289

2054,48

2

6,293

2063,90

3

6,324

2063,23

4

6,363

2059,59

5

6,387

2055,74

6

6,411

2041,70

6,344

2056,44

SD

0,05

8,16

RSD %

0,79

0,39

STT

Nhận xét: Điều kiện sắc kí cho kết quả có độ lặp lại cao về thời gian lưu, diện tích peak với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2 %, chứng tỏ hệ thống sắc kí trên đảm bảo tính thích hợp cho phép định lượng AMB. 3.1.2. Độ đặc hiệu - Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ AMB tương đương nhau (mục 2.3.3.3.1).

- Chuẩn bị mẫu trắng là liposome trắng có thành phần SPC và chol tương tự mẫu thử và được pha loãng giống mẫu thử.

- Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng qua cột sắc kí, đánh giá peak sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ.

25

Kết quả cho thấy: xuất hiện peak cân xứng, có thời gian lưu (tR) 6,3 phút trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không xuất hiện peak ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng (phụ lục 1). Chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất AMB có thời gian lưu trung bình 6,3 phút với điều kiện sắc kí trình bày ở mục 2.3.3.3.1.

3.1.3. Tính tuyến tính - Pha dãy dung dịch AMB chuẩn có nồng độ lần lượt là 10, 15, 20, 25, 30, 35 µg/ml.

- Tiến hành tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích peak của từng nồng độ dung dịch AMB chuẩn.

- Kết quả diện tích peak của các dung dịch AMB chuẩn được thể hiện ở bảng 3.2, sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak được thể hiện ở hình 3.1.

Bảng 3.2. Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak STT

Nồng độ AMB (µg/ml)

Diện tích peak (mAU.s)

1

10

898,73

2

15

1440,59

3

20

1936,00

4

25

2451,70

5

30

2952,27

6

35

3502,187

26

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ AMB với diện tích peak trong khoảng nồng độ từ 10 – 35 µg/ml với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1.

3.1.4. Độ lặp lại - Tiến hành định lượng 6 lần với một mẫu thử, mỗi lần định lượng tiêm mẫu 3 lần và lấy diện tích peak trung bình.

- Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3.

Nhận xét: Phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối < 2 %.

3.1.5. Giới hạn phát hiện - Tiến hành pha một dãy dung dịch AMB chuẩn có nồng độ thấp: 1; 0,5; 0,1; 0,05 µg/ml.

- Tiêm lần lượt từng mẫu chuẩn có nồng độ giảm dần vào hệ thống sắc kí, quan sát sự có mặt của peak có thời gian lưu 6,3 phút trên sắc kí đồ.

- Kết quả cho thấy: ở nồng độ 0,1 µg/ml vẫn thấy xuất hiện peak trên sắc kí đồ, còn ở nồng độ 0,05 µg/ml không thấy xuất hiện peak với thời gian lưu 6,3 phút trên sắc kí đồ. Như vậy, phương pháp có khả năng phát hiện dược chất ở khoảng nồng độ từ 0,1 µg/ml trở lên.

27

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí STT

Diện tích peak (mAU.s)

1

1524,43

2

1552,8

3

1566,3

4

1572,26

5

1552,38

6

1545 1552,2

SD

16,87

RSD %

1,08

Kết luận: Phương pháp định lượng AMB bằng HPLC có tính thích hợp, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại cao. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này để định lượng AMB trong chế phẩm liposome.

3.2. Độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau Kết quả xác định độ tan bão hòa AMB trong các môi trường đệm phosphat pH 3, 4, 5, 6 và 7,4 bằng phương pháp HPLC cho thấy: không xuất hiện peak của AMB có thời gian lưu trung bình 6,3 phút trên sắc kí đồ. Chứng tỏ, độ tan bão hòa của AMB trong các môi trường này nhỏ hơn giới hạn phát hiện (0,1 µg/ml) của phương pháp định lượng.

Như vậy, AMB tự do nếu có trong hỗn dịch liposome sẽ tồn tại chủ yếu dưới dạng kết tủa, hầu như không tồn tại ở dạng phân tử hòa tan.

Kết quả thử nghiệm độ tan bão hòa của AMB trong các môi trường đệm trên cũng cho thấy việc sử dụng túi thẩm tích (chỉ cho các phân tử kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ màng thẩm thấu qua) rất khó để loại hết AMB tự do tồn tại ở dạng kết tủa trong hỗn dịch liposome và để định lượng được nồng độ AMB tự do tồn tại ở dạng phân tử hòa tan trong môi trường hydrat hóa đòi hỏi các phương pháp định lượng có độ nhạy cao hơn như sắc kí khối phổ hay sắc kí khí.

28

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome AMB 3.3.1. Bố trí thí nghiệm Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược và pH môi trường hydrat hóa đến một số đặc tính của liposome AMB bằng cách cố định tỷ lệ % mol dược chất/ tổng lượng lipid là 2 %, thay đổi tỷ lệ mol SPC: chol và pH môi trường hydrat hóa.

Các thành phần công thức được mô tả ở bảng 3.4.

Tiến hành bào chế các công thức theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.2.

Bảng 3.4. Thành phần các công thức bào chế liposome AMB Công thức

SPC

Chol

(µmol) (µmol)

SPC: Chol

AMB

% mol AMB/

pH môi trường

(tỷ lệ mol)

(µmol)

tổng lipid

hydrat hóa

A552

250

250

5:5

10

2

7,4

A642

300

200

6:4

10

2

7,4

A732

350

150

7:3

10

2

7,4

A822

400

100

8:2

10

2

7,4

A912

450

50

9:1

10

2

7,4

B552

250

250

5:5

10

2

4,0

B642

300

200

6:4

10

2

4,0

B732

350

150

7:3

10

2

4,0

B822

400

100

8:2

10

2

4,0

B912

450

50

9:1

10

2

4,0

Trong đó, các công thức nhóm A sử dụng môi trường đệm phosphat pH 7,4, công thức nhóm B sử dụng môi trường đệm phosphat pH 4,0 làm môi trường hydrat hóa.

3.3.2. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB 3.3.2.1. Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB - Về hình thức cảm quan: các công thức sau khi bào chế đều thu được hỗn dịch màu vàng đục, không quan sát thấy các tinh thể dược chất và các tiểu phân có kích thước lớn (hình 3.2). Sau bảo quản 1 ngày ở 2 – 8 ºC không thấy hiện tượng lắng cặn.

29

Trước khi đùn

Sau khi đùn

Hình 3.2. Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế - Quan sát hình ảnh chụp TEM cho thấy, các tiểu phân có cấu trúc hình cầu, đơn hoặc đa lớp, phân bố KTTP tương đối đồng nhất (Phụ lục 2).

- KTTP, phân bố KTTP được trình bày trong bảng 3.5 và đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu được thể hiện ở hình 3.3, 3.4, 3.5.

Bảng 3.5. KTTP và phân bố KTTP của các mẫu liposome AMB Công

Zaverage

thức

(d.nm)

A552

273,3

A642

PDI

Peak 1

Peak 2

Peak 3

% peak

% peak

% peak

(d.nm)

(d.nm)

(d.nm)

1

2

3

0,324

466,3

0

0

100

0

0

253,2

0,284

192,6

706,1

0

56,5

43,5

0

A732

246,5

0,249

313,1

5007

0

98,9

1,1

0

A822

200,4

0,23

205,0

1885

4282

89,9

6,3

3,8

A912

167,3

0,24

200,2

4215

0

96,2

3,8

0

B552

246,1

0,262

345,3

0

0

100

0

0

B642

168,7

0,247

174,2

4485

0

93,9

6,1

0

B732

166,4

0,232

184,7

4502

0

95,6

4,4

0

B822

159,8

0,177

201,8

0

0

100

0

0

B912

143,7

0,140

153,6

5117

0

98,9

1,1

0

30

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome nhóm A

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome nhóm B

31

Nhận xét: Từ các kết quả thu được ở trên cho thấy với cùng một tỷ lệ dược chất/tổng lượng lipid sử dụng thì: + Các mẫu liposome thu được có KTTP nhỏ từ 143,7 – 273,3 nm, khoảng kích thước này lớn hơn nhiều so kích thước của lỗ màng polycarbonat, phân bố KTTP của các mẫu tương đối đồng nhất (PDI < 0,3) trừ công thức A552. + KTTP của các mẫu liposome nhóm A sử dụng đệm phosphat pH 7,4 làm môi trường hydrat hóa có xu hướng cao hơn KTTP của các mẫu liposome nhóm B sử dụng đệm phosphat pH 4,0 làm môi trường hydrat hóa. + Khi tăng tỷ lệ SPC, giảm tỷ lệ chol thì hỗn dịch liposome thu được có KTTP nhỏ hơn và đồng nhất hơn (giá trị PDI có xu hướng giảm).

Nguyên nhân của hiện tượng trên là do: Sự có mặt của cholesterol làm cho lớp màng lipip kép trở nên cứng chắc hơn, giảm tính linh động của lớp màng lipid khiến cho các tiểu phân liposome khó đi qua màng polycarbonat trong quá trình đùn ép giảm KTTP. Điều này còn dẫn đến việc khi tăng tỷ lệ cholesterol thì lực nén tác động để đẩy hỗn dịch liposome qua màng polycacbonat tăng, làm giảm tính chất nguyên vẹn của lớp màng lọc. Thêm vào đó, sự có mặt của kết tủa AMB trong hỗn dịch cũng cản trở quá trình đùn do làm bít tắc các lỗ màng và ảnh hưởng đến kết quả đo.

Kết quả phân tích DSC các mẫu liposome A552 và A912 có tỷ lệ chol khác nhau cho thấy không còn xuất hiện peak nhiệt độ chuyển pha của SPC trên phổ DSC (phụ lục 4). Chứng tỏ sự có mặt của dược chất trong lớp màng lipid kép làm mất nhiệt độ chuyển pha (Tc) của SPC. Hiện tượng này là do các phân tử AMB xen vào lớp màng lipid kép và lấp đầy khoảng trống không gian giữa các phân tử phospholipd, làm cản trở quá trình quay chuyển dạng cấu trúc không gian của mạch hydrocarbon của phân tử phospholipid, khi đó lớp màng lipid kép tồn tại ở 1 trạng thái duy nhất trong suốt quá trình gia nhiệt, trạng thái này được gọi là trạng thái tinh thể lỏng sắp xếp một cách có trật tự Lo(ordered liquid - crystalline phase) [13]. Kết

32

quả cũng cho thấy khi có mặt AMB trên lớp màng lipid thì sự tồn tại trạng thái Lo không phụ thuộc vào nồng độ cholesterol.

Do có sự tồn tại ở lớp màng lipid ở trạng thái Lo nên dù có tăng nhiệt độ lên 50 ºC trong quá trình đùn thì vẫn không làm cho lớp màng lipid linh động, mềm dẻo hơn để có thể thu được các hỗn dịch liposome có kích thước đồng nhất.

3.3.2.2. Hiệu suất liposome hóa Hiệu suất liposome hóa được đánh giá theo phương pháp trình bày ở mục 2.3.3.3.

Kết quả đánh giá được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.6.

Bảng 3.6. Hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome AMB Công thức

SPC: Chol

% mol AMB/

pH môi trường

Hiệu suất

(tỷ lệ mol)

tổng lipid

phân tán

liposome hóa

A552

5:5

2

7,4

77,65

A642

6:4

2

7,4

77,05

A732

7:3

2

7,4

75,4

A822

8:2

2

7,4

73,7

A912

9:1

2

7,4

71,7

B552

5:5

2

4,0

67,7

B642

6:4

2

4,0

60,8

B732

7:3

2

4,0

59,0

B822

8:2

2

4,0

57,9

B912

9:1

2

4,0

50,02

33

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome Nhận xét: Các mẫu liposome thu được có hiệu suất liposome hóa cao từ 50 – 77,65 %, trong đó mẫu cho hiệu suất cao nhất là công thức A552 (hiệu suất liposome hóa đạt 77,65 %).

Khi giảm tỷ lệ cholesterol thì hiệu suất lipsome hóa giảm. Nguyên nhân là do cholesterol tương tác với nhóm thân dầu của phân tử phospholipid làm cho các phân tử này liên kết bền chặt hơn, do đó tăng khả năng gắn giữ các phân tử AMB trong quá trình phá vỡ cấu trúc micel đảo để hình thành tiểu phân liposome (quá trình đảo pha) [15]. Hơn nữa do đặc điểm cấu trúc của AMB làm cho phân tử này có ái lực cao với các sterol (ergosterol, cholesterol) và tạo thành phức hợp liên kết giữa AMB – sterol. Do đó, khi tăng tỷ lệ chol trong lớp màng lipid làm tăng ái lực của AMB với lớp màng lipid và làm tăng hiệu suất liposome hóa.

Kết quả trên cũng cho thấy có sự tương quan giữa hiệu suất liposome hóa và KTTP liposome. Các mẫu có hiệu suất liposome hóa cao có xu hướng có KTTP cao hơn các mẫu có hiệu suất thấp, nguyên nhân là do sự có mặt của AMB trên lớp màng lipid làm tăng KTTP của hỗn dịch liposome. pH môi trường phân tán ảnh hưởng đến hiệu suất liposome hóa: ở pH trung tính AMB có xu hướng trung hòa về điện: nhóm carboxyl có xu hướng tách loại

34

proton và tích điện âm, trong khi nhóm amin lại có xu hướng nhận proton và tích điện dương. Còn khi ở môi trường acid (pH < pka của AMB) thì nhóm amin của phân tử AMB có xu hướng nhận proton từ môi trường trở nên tích điện dương, phân tử có tính phân cực hơn [9]. Trong khi đó phân tử SPC (pka 1,0 và 13,9) có xu hướng trung hòa về điện trong một khoảng pH rộng giữa 2 pka của phân tử [14]. Do vậy, ở môi trường pH acid 4,0 AMB có xu hướng tích điện dương, xuất hiện lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử AMB làm tách loại AMB ra khỏi lớp màng lipid kép, dẫn tới hiệu suất liposome hóa giảm so với sử dụng môi trường pH trung tính 7,4.

3.3.2.3. Tính ổn định của liposome AMB Các mẫu liposome được bảo quản ở điều kiện 2 – 8 ºC, sau 1 tuần đánh giá lại các chỉ tiêu KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa: - Về KTTP: lắc đều hỗn dịch liposome, lấy 1 lượng nhỏ mẫu đem pha loãng 100 lần bằng nước tinh khiết đã lọc qua màng celulose acetat 0,2 µm và đo KTTP theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.3.1. Kết quả đo được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.7.

- Về hiệu suất liposome hóa: lọc loại kết tủa AMB tự do có kích thước lớn xuất hiện trong quá trình bảo quản qua màng polycarbonat có kích thước lỗ lọc 100 nm. Xác định hàm lượng AMB trong hỗn dịch liposome sau khi lọc và tính hiệu suất liposome hóa theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.3.3. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.8.

Bảng 3.7. KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 1 tuần bảo quản Công thức

Z average

PDI

(d.nm)

Hiệu suất

Mức độ thay đổi

liposome hóa

hiệu suất liposome

(%)

hóa (%)

A552

273,3

0,324

77,65

100

A552 1 tuần

273,5

0,377

77,2

99,4

A642

253,2

0,284

77,05

100

A642 1 tuần

259,0

0,292

76,0

98,6

35

A732

245,6

0,249

75,4

100

A732 1 tuần

253,2

0,284

73,1

96,9

A822

200,4

0,23

73,7

100

A822 1 tuần

214,1

0,263

70,5

95,6

A912

167,3

0,24

70,7

100

A912 1tuần

203,1

0,250

67,0

94,7

B552

246,1

0,262

67,7

100

B552 1 tuần

249,5

0,270

67,5

99,7

B642

168,7

0,247

60,8

100

B642 1 tuần

172,7

0,282

60,1

98,8

B732

166,4

0,232

59,0

100

B732 1 tuần

170,1

0,230

56,7

96,1

B822

159,8

0,177

57,9

100

B822 1 tuần

168,4

0,202

54,5

94,1

B912

143,7

0,140

50,02

100

B 912 1 tuần

146,2

0,183

45,5

91

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản

36

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản Nhận xét: Về hình thức: sau 1 tuần bảo quản không thấy có sự kết tụ của các tiểu phân kích thước lớn lắng xuống đáy lọ.

Về KTTP và phân bố KTTP: sau 1 tuần bảo quản KTTP và giá trị PDI của các mẫu liposome có xu hướng tăng, cho thấy có hiện tượng kết tụ tiểu phân để tạo thành các tiểu phân có kích thước lớn hơn.

Về hiệu suất liposome hóa: sau 1 tuần bảo quản hiệu suất liposome hóa ở các mẫu có xu hướng giảm, điều đó cho thấy có AMB có xu hướng tách khỏi lớp màng lipid, tạo thành kết tủa và bị loại đi khi lọc qua màng polycarbonat. Tuy nhiên, hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ chol cao (A552 và B552) giảm đi không đáng kể (< 1 %), còn các mẫu có tỷ lệ chol thấp (A912 và B912) thì hiệu suất liposome hóa giảm đi nhiều (5 % và 9 %) sau 1 tuần bảo quản.

Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược và pH môi trường hydrat hóa đến các đặc tính của liposome, nghiên cứu tiến hành lựa chọn công thức A552 có KTTP

37

tương đối nhỏ và đồng nhất (KTTP 273,3 nm, PDI 0,324), hiệu suất liposome hóa cao (77,65 %), tính ổn định cao sau 1 tuần bảo quản cho các khảo sát tiếp theo.

3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc tính của liposome Nghiên cứu tiến hành lựa chọn công thức có tỷ lệ SPC: chol là 5:5, môi trường phân tán là dung dịch đệm phosphate pH 7,4 và tăng tỷ lệ % mol dược chất/ tổng lượng lipid lên 3 % (CT A553) và 4 % (CT A554) để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc tính của liposome AMB. Thành phần công thức của các mẫu A553, A554 được trình bày ở bảng 3.8, tiến hành bào chế theo quy trình được mô tả ở mục 2.3.2. Kết quả đánh giá KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome trên và so sánh với công thức A552 được trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.9, hình 3.10.

Bảng 3.8. Thành phần công thức của mẫu liposome A553 và A554 Công

SPC

Chol

SPC: chol (tỷ

AMB

% mol AMB/tổng

thức

(µmol)

(µmol)

lệ mol)

(µmol)

lipid

A552

250

250

5:5

10

2

A553

166,5

166,5

5:5

10

3

A554

125

125

5:5

10

4

Bảng 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến các đặc tính của liposome AMB Công thức

Zaverage (d.nm)

PDI

Hiệu suất liposome hóa (%)

A552

273,3

0,324

77,65

A553

288,0

0,262

89,5

A554

220,5

0,261

60,8

38

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lipid khác nhau

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau Nhận xét : Khi tăng tỷ lệ % mol dược chất/ tổng lượng lipid thì giá trị PDI giảm, hỗn dịch liposome thu được đồng nhất hơn. Nguyên nhân là do nồng độ lipid/ml hỗn dịch liposome giảm làm giảm lực nén và làm cho quá trình đùn ép giảm KTTP dễ dàng hơn.

39

Kết quả cũng cho thấy có sự tương quan tỷ lệ thuận giữa KTTP và hiệu suất liposome hóa: công thức A553 có hiệu suất liposome hóa và KTTP cao hơn cả.

Khi tăng tỷ lệ % mol dược chất/ tổng lượng lipid lên 4 % thì hiệu suất liposome hóa giảm, chứng tỏ lượng lipid không còn đủ lớn để mang dược chất.

Như vậy, công thức A553 được coi là công thức cho kết quả tốt nhất trong nhóm các mẫu liposome đã khảo sát.

3.5. Bàn luận 3.5.1. Về phương pháp định lượng AMB Trong các dược điển dùng phương pháp vi sinh để định lượng AMB. Phương pháp này cho biết hoạt lực của AMB trong chế phẩm, tuy nhiên thời gian đánh giá và điều kiện cơ sở vật chất không cho phép tiến hành xác định hàm lượng AMB trong liposome theo phương pháp này. Phương pháp định lượng AMB bằng phương pháp HPLC cho phép xác định nhanh hàm lượng AMB trong liposome và kết quả thu được có độ chính xác cao, do loại được ảnh hưởng của các thành phần tá dược (SPC và chol) đến kết quả đo.

Trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử đều thấy xuất hiện peak phụ có thời gian lưu khoảng 5,7 phút (phụ lục 1).

Việc sử dụng muối natri EDTA trong thành phần pha động làm giảm thời gian lưu của AMB so với việc không sử dụng, do đó giảm thiểu được chi phí và thời gian đánh giá [7].

3.5.2. Về phương pháp bào chế Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp bốc hơi pha đảo để bào chế liposome AMB. So với phương pháp hydrat hóa màng film thì phương pháp này có nhược điểm là quy trình bảo chế phức tạp hơn, trải qua nhiều giai đoạn hơn và có sự phơi nhiễm dung môi hữu cơ trong chế phẩm. Tuy nhiên trong quá trình thử nghiệm để lựa chọn phương pháp bào chế, khi tiến hành bào chế liposome AMB phương pháp hydrat hóa màng film nhận thấy quá trình hydrat kéo dài và không bóc tách được hoàn toàn lớp màng film trên thành bình. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể giải thích là do sự có mặt của AMB làm tăng tính sơ nước của lớp màng lipid và

40

theo kết quả phân tích DSC cho thấy AMB ảnh hưởng đến sự chuyển pha của lớp màng lipid.

Với phương pháp bốc hơi pha đảo, giai đoạn tạo nhũ tương N/D và giai đoạn đảo pha được coi là quan trọng nhất, ảnh hưởng đến các đặc tính (KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa) của liposome.

Với giai đoạn tạo nhũ tương N/D: đây là giai đoạn ảnh hưởng trực tiếp đến KTTP và phân bố KTTP hỗn dịch liposome thu được. Nghiên cứu đã sử dụng diethyl ether làm pha dung môi hữu cơ. Dung môi này không hỗn hòa với nước, do đó khi trộn lẫn với dung môi nước là dung dịch đệm phosphat sẽ thu được hệ phân tán 2 pha, cần sử dụng năng lượng siêu âm để tạo hệ phân tán 1 pha và thu được nhũ tương dạng N/D ổn định. Quá trình siêu âm nên sử dụng thiết bị có năng lượng siêu âm không quá lớn do khi sử dụng năng lượng siêu âm lớn sẽ làm cho AMB tách ra khỏi liên kết với phân tử phospholid và kết tủa trong hệ, làm giảm hiệu suất liposome hóa.

Với giai đoạn đảo pha: quá trình bốc hơi dung môi để hình thành trạng thái gel cần tiến hành một cách từ từ, tránh làm xuất hiện bọt khí trong giai đoạn này.

Khi có hiện tượng xuất hiện bọt khí cần tăng áp suất trong bình ngay lập tức. Bọt khí ảnh hưởng trực tiếp đến giai đoạn bẻ gãy pha gel và sát nhập các lớp lipid đơn thành các lớp lipid kép, hình thành nên liposome. Nồng độ lipid sử dụng cũng ảnh hưởng đến giai đoạn này [23]. Qua nghiên cứu cho thấy khi giảm nồng độ lipip thì giai đoạn đảo pha có xu hướng kéo dài hơn.

3.5.3. Về phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa Hiện nay, phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa đối với nhóm dược chất thân dầu vẫn là vấn đề còn nhiều tranh cãi. Các nghiên cứu về liposome AMB trên thế giới sử dụng các phương pháp khác nhau để đánh giá hiệu suất liposome hóa (mục 1.4).

Kết quả thử nghiệm độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau cho thấy: trong môi trường hydrat hóa pH 4,0 và 7,4, AMB tự do nếu có sẽ tồn tại chủ yếu ở dạng kết tủa. Kết tủa này có thể được loại đi bằng

41

phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc qua màng polycarbonat có kích thước lỗ màng nhỏ hơn 100nm.

Với phương pháp ly tâm: hỗn dịch liposome sau khi giảm kích thước bằng phương pháp đùn ép (extrusion) đem li tâm ở tốc độ thấp, trong thời gian ngắn.

Quan sát sản phẩm sau li tâm cho thấy có một tỷ lệ lớn liposome kích thước lớn lắng xuống đáy ống li tâm cùng với kết tủa AMB tự do. Qua kiểm tra sơ bộ KTTP hỗn dịch liposome ở phía trên ống li tâm thấy giá trị Zaverage và PDI giảm đi nhiều so với trước li tâm. Như vậy, nếu sử dụng phương pháp này thì kết quả thu được mắc sai số lớn.

Do vậy, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng cách lọc loại kết tủa AMB tự do trong hỗn dịch qua màng polycacbonat kích thước lỗ màng 100 nm, cho phép đánh giá khá chính xác hiệu suất liposome hóa của các mẫu.

3.5.4. Về xây dựng công thức Thành phần chính của lớp màng lipid kép là SPC và chol, trong đó SPC đóng vài trò chính trong việc hình thành tiểu phân liposome và tạo lớp màng mang dược chất. Chol bản thân nó không cấu tạo nên liposome nhưng là thành phần quan trọng quyết định đến độ bền vững và khả năng mang dược chất của liposome.

AMB có ái lực cao đối với chol do đó khi tăng tỷ lệ chol làm tăng hiệu suất mang thuốc, nhưng nếu tỷ lệ chol quá lớn sẽ xảy ra hiện tượng cạnh tranh về vị trí liên kết giữa AMB và chol trên lớp màng lipid, làm giảm hiệu suất liposome hóa.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần SPC: chol, pH môi trường phân tán và tỷ lệ dược chất trong công thức cho thấy công thức có tỷ lệ SPC: chol là 5:5, môi trường phân tán là đệm phosphate pH 7,4 và 3 % mol dược chất/tổng lượng lipid cho hiệu suất liposome hóa cao (89,5 %), KTTP là 288 nm, phân bố KTTP tương đối hẹp (PDI = 0,262).

Cần có thêm nghiên cứu để xác định rõ hơn ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về công thức đến các đặc tính của liposome và tối ưu hóa công thức bào chế liposome AMB.

42

3.5.5. Về độ ổn định của liposome AMB Qua 1 tuần bảo quản liposome AMB trong điều kiện lạnh, tránh ánh sáng cho thấy có sự kết tụ tiểu phân tạo ra các tiểu phân có kích thước lớn hơn và có hiện tượng giải phóng dược chất ra khỏi lớp màng lipid trong quá trình bảo quản.

Cần có thêm các nghiên cứu để tăng độ ổn định của liposome: tiến hành đông khô liposome, thay đổi đặc tính bề mặt của lớp màng lipid, sử dụng thêm các chất chống oxy hóa…

43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: -

Nghiên cứu đã lựa chọn được các thông số kĩ thuật để bào chế liposome AMB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo.

-

Tỷ lệ thành phần tá dược, pH môi trường hydrat hóa và tỷ lệ dược chất trong công thức ảnh hưởng đến các đặc tính của liposome AMB: + Tăng tỷ lệ chol trong thành phần công thức làm tăng KTTP, giảm mức độ đồng nhất của mẫu liposome, tăng hiệu suất liposome hóa và tăng tính ổn định của liposome. + Có sự tương quan tỷ lệ thuận giữa hiệu suất liposome hóa và KTTP trung bình của các mẫu liposome. + Môi trường đệm phosphat pH 7,4 cho hiệu suất liposome hóa cao hơn môi trường đệm phosphat pH 4,0. + Tăng tỷ lệ dược chất trong công thức bào chế làm thay đổi các đặc tính của liposome AMB.

-

Nghiên cứu đã bào chế được liposome AMB với tỷ lệ SPC: chol là 5:5, môi trường hydrat hóa là đệm phosphat pH 7,4, tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid là 3 % cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI <0,3) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng 90 %).

Đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố thuộc về công thức bào chế đến các đặc tính của liposome AMB nhằm xây dựng công thức tối ưu để bào chế liposome AMB.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt 1. Bộ môn Bào chế - Trường đại học Dược Hà Nội (2008), Kỹ thuật bào chế và sinh dược học các dạng thuốc, tập 2, NXB Y học, tr. 224.

2. Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, tr. 195-196.

3. Bộ Y Tế (2002), Dược thư Việt Nam, NXB Y học, tr. 146 - 148.

Tiếng Anh 4. Adler-Moore Jill, Proffitt Richard T (2002), "AmBisome: liposomal formulation, structure, mechanism of action and pre-clinical experience", Journal of antimicrobial chemotherapy, 49(suppl 1), pp. 21-30.

5. Demetzos Costas (2008), "Differential Scanning Calorimetry (DSC): A tool to study the thermal behavior of lipid bilayers and liposomal stability", Journal of liposome research, 18(3), pp. 159-173.

6. Du Plessis J, Ramachandran C, Weiner N, et al. (1996), "The influence of lipid composition and lamellarity of liposomes on the physical stability of liposomes upon storage", International journal of pharmaceutics, 127(2), pp. 273-278.

7. Eldem T, Arican-Cellat N (2000), "High-performance liquid chromatographic determination of amphotericin B in a liposomal pharmaceutical product and validation of the assay", Journal of chromatographic science, 38(8), pp. 338-344.

8. Florence Alexander Taylor, Attwood David, Attwood D (2011), Physicochemical principles of pharmacy, Pharmaceutical Pr, pp. 204 - 206.

9. Gagoś Mariusz, Hereć Monika, Arczewska Marta, et al. (2008), "Anomalously high aggregation level of the polyene antibiotic amphotericin B in acidic medium: implications for the biological action", Biophysical chemistry, 136(1), pp. 44-49.

10. Iman Maryam, Huang Zhaohua, Szoka Francis C, et al. (2011), "Characterization of the colloidal properties,< i> in vitro</i> antifungal activity, antileishmanial activity and toxicity in mice of a distigmasterylhemisuccinoyl-

glycero-phosphocholine liposome-intercalated amphotericin B", International journal of pharmaceutics, 408(1), pp. 163-172.

11. Lapinski Monique M, Castro-Forero Angelines, Greiner Aaron J, et al. (2007), "Comparison of liposomes formed by sonication and extrusion: rotational and translational diffusion of an embedded chromophore", Langmuir, 23(23), pp.

11677-11683.

12. Manosroi A, Kongkaneramit L, Manosroi J (2004), "Characterization of amphotericin B liposome formulations", Drug development and industrial pharmacy, 30(5), pp. 535-543.

13. McMullen Todd PW, Lewis Ruthven NAH, McElhaney Ronald N (2004), "Cholesterolâ&#x20AC;&#x201C;phospholipid interactions, the liquid-ordered phase and lipid rafts in model and biological membranes", Current opinion in colloid & interface science, 8(6), pp. 459-468.

14. Pasenkiewicz-Gierula Marta, Takaoka Yuji, Miyagawa Hiroo, et al. (1999), "Charge pairing of headgroups in phosphatidylcholine membranes: a molecular dynamics simulation study", Biophysical journal, 76(3), pp. 1228-1240.

15. Rojanapanthu Pleumchitt, Sarisuta Narong, Chaturon Korakot, et al. (2003), "Physicochemical properties of amphotericin B liposomes prepared by reversephase evaporation method", Drug development and industrial pharmacy, 29(1), pp. 31-37.

16. Shah SP, Misra Ambikanandan (2004), "Development of liposomal amphotericin B dry powder inhaler formulation", Drug delivery, 11(4), pp. 247253.

17. Sharma Amarnath, Sharma Uma S (1997), "Liposomes in drug delivery: progress and limitations", International journal of pharmaceutics, 154(2), pp.

123-140.

18 .Shashi Kant, Satinder Kumar, Bharat Prashar (2012), "A complete review on liposomes", International research journal of pharmacy, 3(7), pp. 10 - 16.

19. Shimizu Kosuke, Osada Masaaki, Takemoto Koji, et al. (2010), "Temperaturedependent transfer of amphotericin B from liposomal membrane of AmBisome to fungal cell membrane", Journal of controlled release, 141(2), pp. 208-215.

20. Singodia Deepak, Verma Ashwni, Khare Prashant, et al. (2012), "Investigations on feasibility of in situ development of amphotericin B liposomes for industrial applications", Journal of liposome research, 22(1), pp. 8-17.

21. Storm Gert, Crommelin Daan JA (1998), "Liposomes: quo vadis?", Pharmaceutical science & technology today, 1(1), pp. 19-31.

22. Torchilin Vladimir P (2005), "Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers", Nature reviews drug discovery, 4(2), pp. 145-160.

23. Torchilin Vladimir P, Weissig Volkmar (2003), Liposomes: a practical approach, Oxford University Press, pp. 26-28, 35-37, 59-60.

24. Walde Peter (2004), "Preparation of vesicles (liposomes)", Encyclopedia of nanoscience and nanotechnology, 9(1), pp. 43-79.

25. Yeh Ming-Kung, Cheng Ming-Yen (2012), "Clinically-Proven Liposome-Based Drug Delivery: Formulation, Characterization and Therapeutic Efficacy", Open access scientific reports, 1(3), pp. 1 - 8.

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Sắc kí đồ

Mẫu AMB chuẩn nồng độ 10 µg/ml

Mẫu liposome trắng

Mẫu liposome AMB A552 mới bào chế

Mẫu liposome AMB A552 sau 1 tuần bảo quản

Phụ lục 2. Hình ảnh chụp TEM mẫu liposome A822

Phụ Lục 3. Đồ thị phân bố kích thước tiểu phân

Công thức A552

Công thức A642

Công thức A732

Công thức A822

Công thức A912

Công thức B552

Công thức B642

Công thức B732

Công thức B822

Công thức B912

Công thức A553

Công thức A554

Phụ lục 4. Phổ DSC

Mẫu SPC nguyên liệu

Mẫu AMB và chol nguyên liệu

Màng lipid của mẫu liposome A552 và A912 đã làm khô