HHPT2 - PHẦN THỨ BA - CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH

PHẦN THỨ BA – CÁC PHƢƠNG PHÁP TÁCH Trong phân tích hóa học, một vấn đề đặt ra khi xác định chất phân tích trong một số đối tƣợng mẫu phức tạp là: - Ảnh hƣởng của môi trƣờng mẫu;

- Hàm lƣợng chất phân tích quá nhỏ; - Nhiều chất có tính chất hóa học và vật lý khá giống nhau,...  Khó

+ Định lƣợng chính xác;

+ Định lƣợng riêng từng chất;  Cần

+ Tách loại tạp chất và làm giàu chất phân tích; + Sử dụng một kỹ thuật gọi là sắc ký để tách các chất ra

khỏi nhau để định lƣợng; Do đó, trong phần này chúng ta chỉ đề cập đến hai phƣơng pháp là: - Các phƣơng pháp tách sắc ký; - Các phƣơng pháp chiết.

1

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.1. Lịch sử phát triển

- Năm 1903, M. C. Txvet đã tiền hành tách các chất có tính chất giống nhau là -chlorophyl, -chlorophyl, -xatophyl, -xatophyl,... thành các giải màu khác nhau và Txvet gọi là “Chromatography”.

+ “Chroma”: màu và “Graphy”: ghi.

- Năm 1931, Vinterstin và Ledere đã tách đƣợc carotin; - Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký giấy và đƣa ra lý

thuyết đĩa để giải thích các quá trình sắc ký. Đồng thời nghiên cứu tách ancaloit từ các cây thuốc để bào chế dƣợc phẩm; - Từ năm 1952, những máy sắc ký ra đời cũng nhƣ ngành máy tích và hàng loạt các kỹ thuật mới phát triển: GC-MS, LC-MS.

2

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.2. Quá trình tách sắc ký và định nghĩa

a. Quá trình tách sắc ký Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi chất phân tích lần lƣợt ra khỏi cột.

Hình 1.1. Quá trình tách sắc ký 3

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH

4

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.2. Quá trình tách sắc ký và định nghĩa

b. Định nghĩa Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu

chất phân tích – gọi là pha tĩnh. Một pha di chuyển qua pha tĩnh – gọi là pha động. Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Quá trình sắc ký khác cơ bản với các quá trình tách khác ở 2 điểm: - Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần; - Pha động đi qua pha tĩnh.

5

Ví dụ: Tiến hành sắc ký cột cao C: Cao C tiến hành sắc ký cột silica gel

pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm • Khối lượng cao C: 45 g • Khối lượng silica gel: 700 g • Đường kính cột: 7 cm • Dung môi ổn định cột: petroleum ether. Lọ hứng 100 mL 6

KẾT QUẢ PHÂN ĐOẠN 3 Chất 1

- Tinh thể hình kim - Vết tròn màu tím chuyển sang nâu - m= 3,17 g - Rf = 0,45 - PE:Ea= 8:2 Kết luận: Hỗn hợp của stigmasterol và spinasterol tỉ lệ mol lần lượt là 1:3 7

29 28 21 12 18 1 2

11 19 10

22 23

13 17 16 9

HO 3 4 5 6

8 7

26

24

20

25 27

Proton của khung

14 15

Spinasterol

Proton số 3

8

KẾT QUẢ PHÂN ĐOẠN 3 Chất 2 CHAH2

- Không có tinh thể - Có mùi thơm - Vết tròn màu hồng - m = (2 mg) - Rf = 0,57 - PE:Ea=1:1 Kết luận: Safrol (GC-MS) 9

GC - MS CHẤT 2 Chương trình nhiệt độ giữ 1 phút

60 C Tăng 3C/ph

giữ 2 phút

giữ 25 phút

200 280C Tăng 20C/ph C

Kết quả GC–MS 5-allylbenzo[d][1,3]dioxole (safrol) - CTPT: C10H10O2.

- M = 132 g/mol.

Chất ra khỏi cột

O O

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

c. Phân loại theo hệ pha PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ SẮC KÝ LỎNG (LC)

SẮC KÝ KHÍ (GC)

SK K–R

SK ĐDMQ

SK K–L SK PB L–L

HPLC SK R–L

SK L/mỏng

SK Phẳng SK Giấy

Hình 1.1. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký

11

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

c. Phân loại theo cơ chế tách Cơ chế tách nói lên bản chất liên kết của các chất phân tích với pha tĩnh, không cần phân biệt về hệ pha, có 04 loại cơ chế tách chính:

SK Hấp phụ

SK Phân bố

SK ion

SK Rây PT

 Sắc ký hấp phụ (SKHP):

Chất phân tích đƣợc phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ tƣơng tác phân tử (lực van-der-van) thông qua các trung tâm hấp phụ.

12

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký phân bố lỏng-lỏng (L-L): - Phân biệt giữa sắc ký phân bố L-L và sự phân bố thông thƣờng là ở chỗ:

+ Sự phân bố L-L còn gọi là sắc ký chiết;

+ Sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào 2 pha không xét tới trạng thái của nó.

- Sự khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố L-L và SKHP:

+ Sắc ký phân bố L-L có đƣờng đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phƣơng pháp có độ nhạy cao; + Pha tĩnh không đƣợc bền vững, hiện tƣợng trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.

13

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký Ion (Trao đổi ion) - Pha tĩnh là chất rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các ion của chất phân tích trong pha động;

- Lực liên kết giữa ion chất phân tích và pha tĩnh là liên kết tĩnh điên, phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kính Hydrat hóa của ion chất phân tích.

14

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

 Sắc ký rây phân tử - Pha tĩnh là chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đƣờng đi trong lòng chất rắn – mao quản có kích thƣớc cỡ phân tử.

- Các phân tử chất phân tích thấm vào chất rắn đó ở mức độ khác nhau tùy theo kích thƣớc của chúng.

- Các phân tử có kích thƣớc lớn không đi sâu vào pha tĩnh sẽ rửa

giải nhanh; có kích thƣớc bé đi sâu vào pha tĩnh sẽ rửa giải chậm.

- Thời gian lƣu của các chất tỉ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử của chúng 15

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

c. Phân loại theo cách hình thành sắc đồ - Phân tích tiền lƣu

- Phân tích thế đẩy

- Phân tích rửa giải

16

17

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.4. Các lực liên kết trong hệ sắc ký

Trong hệ sắc ký có 3 thành phần chủ yếu: Chất phân tích

Pha tĩnh (PhT)

Pha động (PhĐ)

 Chất phân tích tại sao lại lƣu giữ trên PhT ?  Tại sao chất phân tích đã giữ trên PhT rồi lai đi vào PhĐ ?

 Tƣơng tác giữa 3 thành phần này nhƣ thế nào mà các chất phân tích phân bố vào PhT ở mức độ khác nhau ?

Nhƣ vậy để trả lời câu hỏi này chính là do bản chất của các thành phần trong hệ sắc ký và các lực liên kết khác nhau.

18

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.4. Các lực liên kết trong hệ sắc ký

a. Lực liên kết ion - Trên PhT, xét phân tử R–SO3H R–SO3H  R–SO3– + H+

;

Trung tâm hoạt động ion.

R–SO3– + M+  R–SO3M

Chất phân tích

 Tƣơng tác này là tƣơng tác tĩnh điện – gọi là liên kết ion.

- Tƣơng tự trong PhĐ cũng tồn tại các trung tâm hoạt động ion

 Tƣơng tác với chất phân tích và PhĐ; - PhT có các trung tâm cation thì lƣu giữ anion và ngƣợc lại.

- Các phƣơng pháp sắc ký thƣờng gặp có tham gia liên kết ion đƣợc gọi là “Sắc ký ion”, “Sắc ký cặp ion”.

19

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.4. Các lực liên kết trong hệ sắc ký

b. Lực phân cực - Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động và các phân tử trên pha tĩnh có các trung tâm phân cực

 Các trung tâm này liên kết với nhau bằng lực liên kết phân cực.

- Sự phân cực và sự chênh lệch về độ phân cực này thƣờng là nhỏ.

Nhƣng nó cũng là yếu tố quan trong về độ bền liên kết khác nhau

 Sự phân chia trong các phép tách sắc ký. c. Lực Van-de-van (lực phân tán) - Lực này bản chất điện, tuy nhiên không có cực điện trong hệ; - Do tƣơng tác phân tán của các phân tử chứa mạnh hydro cacbon. 20

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.1. Khái niệm chung 1.1.4. Các lực liên kết trong hệ sắc ký

d. Lực tƣơng tác đặc biệt - Lực tƣơng tác đặc biệt là do tạo bởi các liên kết hydro và liên kết cho nhận;

- Sự hình thành liên kết hydro thƣờng xảy ra với các nguyên tố có độ âm điện cao nhƣ O, N, F,...; - Năng lƣợng liên kết giảm dần theo thứ tự sau:

F -- H -- F > O -- H -- O > N -- H -- N > C -- H -- C

21

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.1. Hệ số phân bố

- Cấu tử A phân bố giữa 2 pha động – tĩnh, khi cân bằng thiết lập, AS  AM

S: pha tĩnh;

M: pha động

 Hệ số phân bố giữa 2 pha (KD): KD = [AS] / [AM]

Trong đó, [AS], [AM] là nồng độ cấu tử A trong pha tĩnh và pha động.

- Cân bằng trong sắc ký là cân bằng động (*), có dạng cân bằng sau: + Cân bằng Lỏng – Lỏng (L – L); + Cân bằng Lỏng – Khí (L – K);

+ Cân bằng Lỏng – Rắn (L – R)

+ Cân bằng Rắn – Khí (R – K);

Xét ở đĩa thứ n có sự phân bố A ở 2 pha, nhƣng do pha động di chuyển nên A lại đi xuống đĩa n+1 và xuất hiện cân bằng mới (*).

22

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng Xác định KD

- Để xác định KD thì cân bằng phải thiết lập nhanh, vì vậy  + Pha tĩnh phải mỏng + Hệ số khuếch tán của A trong pha tĩnh lớn;

+ Hệ số khuếch tán của A trong pha động nhỏ; - Xác định KD bằng phƣơng pháp tĩnh, tức là đo nổng độ của A trong pha động và pha tĩnh sau khi cân bằng nhƣ sau:

Trong đó, M là lƣợng A ban đầu (g); M1 là lƣợng A còn lại sau tiếp xúc (g); V là thể tích pha động (mL); m là lƣợng chất hấp phụ (g).

23

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.2. Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của A và KD

- Gọi fA là phần thời gian của chất A ở pha động, ta có:

Chia tử và mẫu cho [A]m . Vm: Trong đó, k’A là hệ số dung tích

- Tốc độ tuyến tính của A trong pha động: uA = u . fA = u / (1 + k’A) Trong đó, u là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s)  KDA hay k’A càng lớn thì chất A di chuyển càng chậm và ngƣợc lại.

24

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.3. Thời gian lưu (tRA) và thời gian lưu hiệu chỉnh (t’RA)

- tRA: là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào đầu cột tời khi píc đạt giá trị cực đại.

Trong đó, L là chiều dài cột (cm).

- tm là thời gian A không lƣu giữ trên cột (thời gian chết): tm = L / u 

- tRA’: là thời gian không tính đến thời gian chết, tức là: tRA’ = tRA - tm = tm . kA’  25

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.4. Thể tích lưu (VRA) và thể tích lưu hiệu chỉnh (V’RA)

- VRA: là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột tời khi píc đạt giá trị cực đại.

Gọi F là tốc độ chảy của pha động (mL/phút), VRA và Vm đƣợc tính

nhƣ sau: VRA = tRA . F và Vm = tm . F 

VRA = Vm (1 + k’)

- V’RA: là thể tích lƣu đã loại đi thể tích trống của cột.

 V’RA = VRA - Vm = Vm . k’ = KDA . Vs - Thể tích lƣu riêng (Vg): là thể tích đặc trƣng riêng cho A, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa A trong một đơn vị thể tích pha tĩnh  Vg = V’RA / Vs = KDA.

26

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.5. Hệ số tách () – gọi là hệ số lưu giữ tương đối

-  đặc trƣng cho khả năng tách 2 chất A và B bằng phƣơng pháp sắc ký. Đƣợc xác định qua công thức sau:  = KDA / KDB = k’A / k’B

- Điều kiện để tách A và B là   1.  Hệ số phân bố của A và B giữa pha tĩnh và động phải khác nhau.

- Tỷ số hai hệ số phân bố cũng chính bằng tỷ số thể tích lƣu riêng

hay tỷ số thời gian lƣu riêng của A và B. Vậy có thể xác định:  = KDA / KDB = k’A / k’B = t’RA / t’RB = V’RA / V’RB

27

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng

S (h)

1.2.6. Sắc đồ

- Sắc đồ là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo

(độ hấp thu quang, độ dẫn, tần số xung,...) liên quan đến nồng

t (V)

độ chất phân tích vào thời gian.

- Tín hiệu này đƣợc gọi là “Pic” sắc ký.

Hình ???. Sắc đồ hệ một cấu tử A

- WA (bề rộng chân pic) là thời gian (thể tích mà tại đó píc đạt cực đại).

28

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.7. Đĩa lý thuyết (n) và cách xác định n bằng thực nghiệm

- n là một phần của cột mà ở đó cân bằng phân bố A từ pha động vào pha tĩnh và ngƣợc lại đƣợc thiết lập.

- Theo Martin và Synge cân bằng đƣợc thiết lập nhanh chóng, tức

thời. Tuy nhiên:

S (hay h)

+ Không giải thích đƣợc hiện tƣợng giãn

tRA, VRA

rộng của vùng mẫu;

W1/2

+ Pic sắc ký không cân đối.

h/2

- Xác định n: + Giả sử píc tuân theo hàm Gauss;

+ Gọi  là độ lệch chuẩn của t (hay V)   1/

-2 to

+2 WA

t (hay V)

Hình ???. Xác định n từ thực nghiệm

29

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.7. Đĩa lý thuyết (n) và cách xác định n bằng thực nghiệm

+ Đối với cột sắc ký, khi n càng lớn thì pic càng hẹp  tRA  n - Mặt khác, ta có: W = 4  hay  = W / 4.

Vậy, số đĩa lý thuyết đƣợc xác định nhƣ sau:

Nếu n càng lớn độ phân giải càng tốt.

- Xác định H (chiều cao đĩa lý thuyết): H=L/n Nếu H càng nhỏ số đĩa lý thuyết càng lớn, độ phân giải càng tốt.

30

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.2. Các đại lƣợng đặc trƣng 1.2.8. Độ phân giải, cách làm tăng độ phân giải

- Độ phân giải (R): R nói lên khả năng tách các cấu tử ra khỏi nhau trong một quá trình tách sắc ký. R đƣợc xác định nhƣ sau: R = 2(tRB – tRA) / (WA + WB) = 2 tR / (WA + WB)

Có thể dùng VR thay cho tR  + R càng lớn khả năng tách càng tốt; + Khi R = 1, tách khoảng 95%, tức là còn 2,5% A trong B và 2,5% B

trong A; khi R = 1,5 tách khoảng 99,8%.

- Cách làm tăng R: + Thay đổi cấu trúc của cột: tăng L; kích hạt nhồi nhỏ, giảm  cột,... + Dựa vào vận hành: tối ƣu hóa pha động, giảm mẫu, giảm toC,...

31

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.3. Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký Mặc dù, đã đƣa ra khái niệm về n và H nhƣng:

+ Không giải thích đƣợc hiện tƣợng giãn rộng của vùng mẫu; + Pic sắc ký không cân đối.

Vì vậy, Van Deemter đã phát triển và đƣa ra “Thuyết dòng khuếch

tán trong sắc ký”.

Khi quá trình sắc ký diễn ra, có 03 loại khuếch tán quyết định sự di chuyển của chất tan xuất hiện, gồm:

- Khuếch tán xoáy (H1); - Khuếch tán dài (H2); - Khuếch tán do chuyển khối (H3).

32

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.3. Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký a. Khuếch tán xoáy

Độ giãn rộng vùng chất trên cột do sự khuếch tán xoáy gây ra và đƣợc mô tả bằng:

H1 = 2 .  . d p

Trong đó: + Hx: là đại lƣợng đặc trƣng cho khuếch tán xoáy. phụ thuộc vào: - Độ đồng đều của hạt hồi;

- Đƣờng kính hạt nhồi - Khả năng nhồi cột. + dp: đƣờng kính hạt nhồi; +  : Hệ số nạp cột, nếu nạp tốt thì  = 1,5.

33

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.3. Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký b. Khuếch tán phân tử trong các pha L và pha K

Hiện tƣợng các chất phân tích có xu thế di chuyển về 2 phía của cột và tốc độ của pha động và do vậy,

dẫn đến sự sự khuếch tán dài (dọc) và đƣợc xác định qua biểu thức: H2 = 2 .  . D m / u Trong đó,

+ Dm: Hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động; + u: Tốc độ di chuyển thẳng của dòng pha động; + : Hệ số khúc khuỷu, phụ thuộc vào hình dáng của hạt và khoảng cách giữa các hạt chất nhồi (độ khít đặc).

34

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.3. Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký c. Sự khuếch tán do chuyển khối

Các cấu tử có khối lƣợng phân tử khác nhau sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau.  tốc độ trao đổi chất giữa

2 pha là khác nhau.

Mặt khác, còn phụ thuộc nhiều vào tốc độ hấp phụ và giải hấp.

Do đó:

Trong đó,

H3 = (Cs + Cm) . u

- CS đặc trƣng cho chuyển khối trên pha tĩnh. Khi tốc độ

dòng F  1 thì CS  1. Giá trị CS đƣợc tính qua biểu thức: CS = K . dS2 / DS

+ K: hệ số;

+ dS: chiều dầy của pha tĩnh;

+ DS: hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh.

35

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.3. Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký c. Sự khuếch tán do chuyển khối

- Cm đặc trƣng cho chuyển khối trên pha động. Giá trị Cm đƣợc tính qua biểu thức: Cm =  . dp2 / Dm

+ : hệ số thực nghiệm, có giá trị từ 0,5 đến 1; + dp: chiều dầy của pha động; + Dm: hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

Kết hợp cả ba sự khuếch tán, ta có: H = H1 + H2 + H3 = (2 .  . dp) + (2 .  . Dm / u) + (Cs + Cm) . u H = (2 .  . dp) + (2 .  . Dm / u) + (K . dS2 / DS +  . dp2 / Dm) . u Hay viết gọn lại là: H = A + B/u + C.u (phƣơng trình Van Deemter) 36

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.3. Nội dung của thuyết dòng khuếch tán trong sắc ký c. Sự khuếch tán do chuyển khối

- Để tính toán chiều cao đĩa cực tiểu (Hmin), lấy đạo hàm

phƣơng trình (*) ta có: H’ = -B/u2 + C = 0  u2 = B / C

 Hmin = A + 2 .

37

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng trong phƣơng pháp tách 1.4.1. Phương pháp nội chuẩn (Internal Standard)

Tiêu chuẩn chọn chất chuẩn nội: + Tinh khiết; + Có cấu trúc hóa học tƣơng tự với chất phân tích;

+ Không có mặt trong mẫu; + Thời gian lƣu gần với thời gian lƣu của chất cần phân tích; + Có nồng độ tƣơng tự.

a. Chuẩn hóa đơn giản (bao gồm 6 bước) 1. Chuẩn bị 2 mẫu chuẩn: DD1: chất nội chuẩn; DD2: chất phân tích; 2. Phân tích 2 mẫu chuẩn (chạy mẫu); 38

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng trong phƣơng pháp tách 1.4.1. Phương pháp nội chuẩn (Internal Standard)

3. Tính toán hệ số đáp ứng (Response Factor)

SIS, CIS: Diện tích, nồng độ của chất nội chuẩn; SXS , CxS: Diện tích, nồng độ chuẩn của chất phân tích.

4. Thêm chất chuẩn nội có nồng độ biết trƣớc vào mẫu thật;

5. Phân tích mẫu thật và chất chuẩn nội (ở bƣớc 4); 6. Tính toán nồng độ chất cần phân tích:

39

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng trong phƣơng pháp tách 1.4.1. Phương pháp nội chuẩn (Internal Standard)

b. Chuẩn hóa nhiều mức 1. Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn chứa nồng độ chất phân tích khác nhau (biết trƣớc) và nồng độ chất chuẩn nội nhƣ nhau ;

2. Phân tích dãy mẫu chuẩn; 3. Thiết lập đƣờng chuẩn; 4. Thêm một nồng độ tƣơng tự chất chuẩn nội vào mẫu phân tích;

5. Phân tích mẫu thật; 6. Tính toán nồng độ của dung dịch phân tích bằng phƣơng pháp nội suy.

40

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký 1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng trong phƣơng pháp tách 1.4.2. Phương pháp ngoại chuẩn (External Standard)

Điều kiện thực hiện: - Điều kiện sắc ký không thay đổi; - Thể tích mẫu không đổi.

a. Chuẩn hóa đơn giản Hoàn toàn tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp thêm chuẩn. b. Chuẩn hóa nhiều mức

Hoàn toàn tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp đƣờng chuẩn.

41

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph – HPLC) HPLC là phƣơng pháp thuộc sắc ký lỏng (GL)

- GL cổ điển đƣợc thực hiện: + Áp suất thƣờng; + Chiều dài cột lớn (50  500 cm)

+ Kích thƣớc hạt nhồi lớn (150  200 m); + Hiệu quả tách các chất không cao....

- GL hiện nay:

+ Áp suất cao  “Sắc ký lỏng áp suất cao”. + Chiều dài cột ngắn, đặc biệt là kích thƣớc hạt nhỏ (cỡ vài m, nm) và là sự phát triển PP. điện di mao quản  Hiệu quả tách cao.  “Sắc ký hiệu năng suất cao”.

42

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) HPLC bao gồm nhiều PP., trong đó có 2 PP. (kỹ thuật) chính sau:

2.1. Sắc ký lỏng pha liên kết 2.1.1. Pha tĩnh - Pha tĩnh thƣờng là silicagen. Nó có một số đặc tính sau:

+ Xốp – bề mặt gồ ghề – có nhiều mao quản  S bề mặt lớn.

- Ngoài ra cón có các nhóm nhƣ silanol, ankylxilan, ankyl (R – phân cực, ít phân cực hay không phân cực)  Có khả năng tách sắc ký tốt.

Nhóm silanol

Dẫn xuất clorosilan

Dẫn chất siloxan – R

43

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.1. Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.1. Pha tĩnh Đối với pha tĩnh thƣờng sử dụng 2 loại sắc ký sau: a. Sắc ký pha thường

- Pha tĩnh: thƣờng dùng là silicagen để tách các hợp chất không phân cực hoặc phân cực ít.

- Pha động: sử dụng dung môi không phân cực (n-hexan, toluen,...).

- Hoặc silicagen gắn các nhóm ankyl ít C mang các nhóm phân cực cũng đƣợc gọi là sắc ký pha thƣờng.

44

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.1. Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.1. Pha tĩnh b. Sắc ký pha đảo - Pha tĩnh: là silicagen gắn gốc ankyl không phân cực – C8 hoặc C18;

để tách các hợp chất không phân, ít phân cực và phân cực.

- Pha động: sử dụng dung môi phân cực (nƣớc, metanol, axetonitril) - Nhiều công trình đã sử dụng sắc ký pha đảo trong HPLC để phân

tích các chất phân tích.

45

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.1. Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.2. Pha động - Trong sắc ký pha thƣờng, pha động là các dung môi không phân cực. Ngƣợc lại sắc ký pha đảo lại sử dụng dung môi phân cực.

- Ngoài sử dụng đơn dung môi, còn dùng hệ nhiều dung môi với tỷ lệ khác nhau sao cho có độ phân cực thích hợp để tách các chất.

Sự thay đổi tỷ lệ các dung môi có thể theo thời gian, các trƣờng

hợp khác nhau  Gọi là Gradien nồng độ

46

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.1. Sắc ký lỏng pha liên kết

2.1.2. Pha động Các điều kiện của pha động:  Trơ với pha tĩnh;

Hòa tan tốt chất phân tích;

 Bền trong khí chạy sắc ký;

 Có độ tính khiết cao;

 Phù hợp với detector;

 Rẻ tiền.

2.1.3. Ứng dụng

- Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid (dƣợc); - Acid amin, protein, hydrat cacbon, lipid (hóa sinh); - Thuốc, chất độc, cồn trong máu, … (y lâm sàng); - Thuốc trừ sâu, diệt cỏ, phenol (môi trƣờng).

47

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký Ví dụ:

48

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.2. Sắc ký trao đổi ion

- Ionit đƣợc sử dụng có thể là ionit tự nhiên hoặc ionit tổng hợp; - Ionit tự nhiên có một vài nhƣợc điểm là: + Dung lƣợng trao đổi thấp;

+ Độ lặp lại của tín hiệu đo không cao,...  Hạn chế - Ionit tổng hợp có nhiều ƣu điểm: + Dung lƣợng trao đổi cao;

+ Độ lặp lại của tín hiệu đo tốt; + Độ bền về mặt hóa học và vật tốt  Đƣợc sử dụng nhiều trong sắc ký ion.

49

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.2. Sắc ký trao đổi ion

2.2.1. Tổng hợp ionit - Việc tổng hợp các ionit chủ yếu là dựa vào các phản ứng trùng hợp, sau đó tách loại sản phẩm và tinh chế các sản phẩm đó.

- Có nhiều cách để tổng hợp các ionit ở các dạng khác nhau cho các mục đích phân tích khác nhau. Các dạng ionit tổng hợp nhƣ: + Cation axit mạnh;

+ Cation axit yếu; + Anion: anion mạnh hay yếu chủ yếu phụ thuộc vào gốc amin; + Nhựa tạo phức. (xem thêm cách tổng hợp trong các trang 192 194)

50

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.2. Sắc ký trao đổi ion

2.2.2. Phân loại ionit Tùy theo mức độ hoạt động của ionit có thể chia thành các loại sau: a. Ionit loại 1: là ionit thể hiện tính axit mạnh hoặc bazơ mạnh.

Đặc điểm: + Có thể làm việc ở mọi giá trị pH khác nhau; + Dung lƣợng hấp thu (hấp dung) ít thay đổi theo pH; + Là ionit đơn chức.

b. Ionit loại 2: là ionit thể hiện tính axit yếu hoặc bazơ yếu. Đặc điểm: + Làm việc ở một giá trị pH xác định; + Dung lƣợng hấp thu ít thay đổi theo pH; + Là ionit đơn chức.

51

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.2. Sắc ký trao đổi ion

2.2.2. Phân loại ionit c. Ionit loại 3: là ionit thể hiện tính chất nhƣ là hỗn hợp của tính axit mạnh và axit yếu hoặc bazơ mạnh và bazơ yếu.

Đặc điểm: + Là ionit đa chức; + Với cationit: –SO3H; –COOH, –OH,...  Ở pH cao: nhóm hoạt động: cả 3 nhóm

 Ở pH thấp: nhóm hoạt động: –SO3H + Với anionit: chủ yếu là do nhóm amin  Ở pH cao: nhóm amin bậc 4 quyết định;  Ở pH thấp: tất cả các nhóm amin bậc 1, 2, 3 và 4.

52

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.2. Sắc ký trao đổi ion

2.2.2. Phân loại ionit d. Ionit loại 4: là ionit thể hiện tính chất nhƣ là hỗn hợp của nhiều axit yếu có các hằng số axit khác nhau và do đó hấp dung thay đổi liên tục.

2.2.3. Ứng dụng - Tách và xác định các chất vô cơ và hữu cơ có tính chất ion; - Xác định nống độ của muối;

- Điều chế các chất tinh khiết; Lưu ý: Ngoài “PP. sắc ký trao đổi ion” còn có “PP. sắc ký ion” có cùng phản ứng trao đổi ion, nhưng trong “PP. sắc ký ion” cần chú ý tới cơ chế tách và phát hiện. (xem thêm ở trang 196).

53

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) 2.3. Sơ đồ thiết bị HPLC

Tƣơng tự nhƣ các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC cũng có 3 phần chính: Đầu vào – Tách – Phát hiện và xử lý số liệu.

2.3.1. Sơ đồ khối

a. Pha động:

Van điều chỉnh tỷ lệ dung môi

Vòng bơm mẫu

Bơm vao áp

Van điều tiết xung Cột bảo vệ

- Bằng thủy tinh - Lọc loại hạt tạp chất,

Cột SK

- Đuổi khí hòa tan trong dung Môi, thƣờng bằng siêu âm.

- Có thể dùng kết hợp hỗn hợp dung môi để rửa giải (gradien).

Bể chứa pha động

Detector

54

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) b. Hệ thống bơm cao áp:

- Yêu cầu: +Tạo áp suất cao: khoảng 250 – 500 at. + Lƣu lƣợng bơm khoảng 0,1 – 10 ml/phút.

+ Bơm không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi.

Trong phân tích hay dùng bơm tốc độ hằng định.

- Bơm cơ:

+ Kiểu syringe đẩy dung môi liên tục; + Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên (Hình 9.16 trang 201)

55

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) c. Hệ tiêm mẫu:

- Có thể dùng syringe tiêm qua một tấm đệm đàn hồi (độ lặp lại kém và chỉ dùng ở áp suất thấp dƣới 110 at) - Trong phƣơng pháp tiêm dòng dừng, ngƣời ta dừng bơm và dùng

syringe tiêm mẫu vào đầu cột sau khi mở một cái khóa.

- Phƣơng pháp phổ biến là dùng một van tiêm có vòng chứa mẫu với dung tích xác định và chính xác. Có thể thay đổi các vòng mẫu

dung tích khác nhau: 5 đến 500 l. Dùng van tiêm có độ chính xác cao.

- Van tiêm có hai vị trí để nạp mẫu và bơm mẫu (Hình bên).

56

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) c. Hệ tiêm mẫu:

a. Tiêm mẫu vào vòng mẫu; b. Pha động đẩy mẫu vào đầu cột 57

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) d. Cột HPLC:

- Cột bằng thủy tinh dùng ở áp suất thấp (dƣới 50 at) hoặc cột bằng thép không gỉ đƣợc dùng phổ biến, chịu đƣợc áp suất cao (đến 500 at).

- Cột dài 10 – 30 cm, đƣờng kính trong d = 4 – 10 mm, hạt chất nhồi

cỡ 5 – 10 m. Với chất nhồi từ 3 - 5 m có thể dùng các cột ngắn (3 – 10 cm) và nhỏ (d = 1 – 4 mm). Loại cột này có hiệu lực cao, số đĩa lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1 m cột.

- Chất nhồi thƣờng là silicagen hoặc silicagen có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hay liên kết hóa học với chất hữu cơ). Có thể dùng nhôm ôxyt, polyme xốp, chất trao đổi ion.

58

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) e. Detector

Trong HPLC có hai loại detector: - Loại theo dõi tính chất của pha động.

Dựa vào tính hóa hoạc hoặc vật lý của pha động có liên quan đến

chất phân tich.

- Loại theo dõi tính chất của chất phân tích Dựa vào phản ứng đặc trƣng của chất phân tích.

- Hai detector thƣờng dùng là + Detector quang phổ hấp thụ phân tử; + Detector đo độ dẫn 59

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) e. Detector

 Detector quang phổ hấp thụ phân tử

60

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) e. Detector

 Detector quang phổ hấp thụ phân tử - Detector tử ngoại (UV) dùng đèn thủy ngân cho các vạch 254 nm và 280 nm. Nhiều chất hấp thụ ở bƣớc sóng này.

- Detector tử ngoại (đèn deuteri) và khả kiến (đèn vonfram) có thể làm việc theo bƣớc sóng chọn tùy ý tùy thuộc vào bản chất của chất hấp thụ. Loại này đƣợc dùng nhiều nhất.

- Detector đo chỉ số khúc xạ (RI) là detector vạn năng nhƣng kém nhạy.

- Detector huỳnh quang và detector điện hóa có độ nhạy, độ chọn lọc cao, hay dùng trong phân tích vết.

61

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatograph) e. Detector

 Detector đo độ dẫn Hệ gồm 1 điện cực làm việc và 1 điện cực so sánh hay có thể thêm một điện cực phụ trợ.

62

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) GC là do pha động là chất khí, còn pha tĩnh là chất lỏng hoặc chất rắn. Hiện nay để PP. sắc ký khí có hiệu quả phải lựa chọn cấu hình máy

và điều kiện thí nghiệm phù hợp: - Cột tách có pha tĩnh thích hợp; - Detector phù hợp với phƣơng pháp cũng nhƣ tính chất và mẫu;

- Khí mang phù hợp với chất cần phân tích và nguyên lý làm việc của detector; - Khí phụ trợ có thành phần và tính chất phù hợp;

- Quy trình vận hành phải đƣợc tự động hóa.

63

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1. Sơ đồ thiết bị GC

64

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1. Sơ đồ thiết bị GC 3.1.1. Khí mang (pha động)

- Khí mang là khí trơ (Nitơ, Heli, Argon) đƣợc đựng trong bom khí có gắn van giảm áp và điều chỉnh.

- Khí mang có thể đƣợc cấp từ máy sinh khí Nitơ. Khí mang cần có

độ tinh khiết cao (99,999%).

3.1.2. Bộ phận tiêm mẫu Đƣợc đốt nóng, thƣờng dùng bơm tiêm bơm thẳng mẫu qua một

tấm đệm cao su silicol và một ống thủy tinh đặt trong một khối kim loại đốt nóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cột 200C để hóa hơi mẫu trƣớc khi đi vào cột.

65

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1. Sơ đồ thiết bị GC 3.1.2. Bộ phận tiêm mẫu

66

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.3. Cột sắc ký - Đƣợc đặt trong lò có thể điều chỉnh nhiệt độ theo chƣơng trình.

- Có hai loại cột: + Cột nhồi: thƣờng là cột thủy tinh hoặc kim loại (đồng, thép không gỉ) hình chữ U hoặc cuộn tròn dài 1 - 4 m, đƣờng kính trong 1 - 4 mm.

+ Cột mao quản: thƣờng bằng thủy tinh hay silica nung chảy, có đƣờng kính trong 0,1 - 0,5 mm, dài từ 10 - 50 m hay dài hơn.  Pha tĩnh đƣợc giữ trên mặt trong cột thành một lớp mỏng 0,5 - 1

m: cột WCOT (Wall coated opened tubular)  Pha tĩnh là các hạt nhỏ xếp gắn trên mặt trong cột hoặc pha tĩnh đƣợc tẩm trên các hạt nhỏ đó: cột SCOT hoặc PLOT (Support Coated Open Tubular hoặc Porous Layers Open Tubular).

67

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.3. Cột sắc ký a. Cột pha tĩnh lỏng (SK khí – lỏng)

Pha tĩnh đƣợc giữ trên chất mang - Chất mang: là những hạt chất rắn nhỏ, bền nhiệt, trơ về hóa học, xốp, có lỗ cỡ 1 - 5 m, bề mặt riêng lớn từ 1 đến 10 m2/g. Đơn vị - mesh

- Ví dụ: chromosorb 80 - 100 là loại hạt rây qua rây có 80 lỗ in2 rồi rây tiếp qua rây 100 lỗ in2 đƣợc hạt cỡ 177 - 149 m.

- Trong số các chất mang hay dùng có chromosorb P (pink) và

chromosorb W (white) - Pha tĩnh: chịu nhiệt, hóa lỏng ở nhiệt độ phân tích, trơ về hóa học.

Một số loại pha tĩnh thƣờng dùng các polyester glycol, polyether glycol (các loại Carbowax), các silicol (OV, SE, XE…), các hydrocarbon no.

68

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.3. Cột sắc ký a. Cột pha tĩnh lỏng (SK khí – lỏng)

Chọn pha tĩnh: - Trơ về mặt hóa học; - Bền nhiệt;

- Ít bay hơi; - Có độ phân cực thích hợp để tách chất phân tích. b. Cột pha tĩnh rắn (sắc ký khí - rắn)

Một số pha tĩnh rắn thƣờng dùng: - Các chất rây phân tử - Các polymer xốp Porapak.

69

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.4. Detector a. Các detector không đặc hiệu (phát hiện tất cả các chất)

- Detector dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector, TCD): khi có chất đi qua có sự thay đổi độ dẫn nhiệt của môi trƣờng, xuất hiện tín hiệu điện. Đây là detector vạn năng nhƣng độ nhạy thì thuộc loại trung

bình.

- Detector ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector, FID): khi có chất hữu cơ đi qua thì ngọn lửa sẽ bị ion hóa. Các ion này đƣợc góp

lên điện cực. Đây là detector đƣợc dùng nhiều nhất, nhẹ hơn TDC khoảng 3 lần, phát hiện đến 10-9 g.

70

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.4. Detector b. Detector đặc hiệu

- Detector phát xạ nhiệt ion (Thermionic emission detector, TED): cấu tạo tƣơng tự FID nhƣng ngọn lửa nghèo nhiên liệu, nhiệt độ thấp, đáp ứng các chất có N, P và Hal–, nhạy hơn FID nhiều từ 10 – 100 lần.

- Detector bắt điện tử (Electron capture detector, ECD): Ở một điện cực có điện tử bắn ra. Khi có chất phân tích là chất ái điện tử M đi qua thì M kết hợp với điện tử thành M–. Số điện tử giảm cho ta tín hiệu của

M. Độ nhạy cao, đạt tới từ 10-12g, nhạy với các Hal–, phát hiện đƣợc với các chất thơm đa vòng.

- Detector đo quang ngọn lửa (FPD): Trong detector này ngọn lửa giàu hydro, khử mạnh, có đáp ứng với các chất P và S.

71

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.4. Detector Sau đây là cấu tạo của một số detector

 Detector dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector, TCD):

72

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.4. Detector  Detector ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector, FID):

73

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.1.4. Detector  Detector bắt điện tử (Electron capture detector, ECD):

74

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.2. Ứng dụng Là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi trong phân tích:

- Phân tích nhiều đối tƣợng khác nhau; - Thời gian phân tích nhanh chóng, ít tốn kém, - Phân tích các chất dễ bay hơi nhƣ: tinh dầu, hợp chất thiên nhiên.

Nhƣng đối với các chất khó bay hơi hay dễ bị nhiệt phân hủy (trong

đó có nhiều chất có hoạt tính sinh học) thì sử dụng sắc ký lỏng có nhiều thuận lợi hơn.

3.1. Định tính và thử tinh khiết

Nếu sắc ký nhiều lần trong các điều kiện giống nhau và luôn chỉ có một pic thì có khả năng mẫu thử là tinh khiết và không bị phân hủy nhiệt. Có thể định tính bằng cách dùng chất chuẩn.

75

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.2. Ứng dụng 3.1. Định lƣợng

- Trong sắc ký khí, việc định lƣợng đƣợc tiến hành bằng cách đo diện tích hay chiều cao của pic.

Có thể tính diện tích pic nhƣ sau:

S = 0,627 HW H: chiều cao pic W: độ rộng pic ở đáy

- Thông thƣờng hàm lƣợng chất tỉ lệ thuận với chiều cao pic hoặc diện tích pic. (phải kiểm tra lại bằng thực nghiệm)

76

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 3. Sắc ký khí (Gas Chromatograph – GC) 3.2. Ứng dụng 3.1. Định lƣợng

Ví du:

77

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH

78

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.1. Sắc ký giấy Sắc ký giấy là bao hàm ý nghĩa của việc sử dụng vật liệu chất mang

là giấy, còn pha tĩnh là chất lỏng trên bề mặt giấy.

- Giấy là một vật liệu bao gồm những sợi cellulose trên đó có chứa nhóm –OH phân cực  Là vật liệu ƣu nƣớc.

- Khi bề mặt giấy đƣợc tẩm bằng nƣớc  Pha tĩnh phân cực. Còn pha động là không phân cực  Sắc ký giấy thuộc loại sắc ký phân bố L – L.

- Thông thƣờng khi pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực thì đƣợc gọi là sắc ký pha thƣờng.

- Nếu pha tĩnh đƣợc tẩm bằng dung mối ít phân cực và pha động phân cực thì đƣợc gọi là sắc ký pha đảo.

79

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.1. Sắc ký giấy - Trong sắc ký giấy đại lƣợng đƣợc sử dụng để đánh giá sự di

chuyển của chất phân tích là hệ số trễ (Rf) và đƣợc tính theo công thức

Ví dụ: Hình bên ta có:

F

- OA: Khoảng cách chất cấu tử A di chuyển (mm); - OB: Khoảng cách chất cấu tử B di chuyển (mm);

- OF: Khoảng cách dung môi di chuyển (mm);

B

B A

A

O

80

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.2. Sắc ký lớp mỏng - Sắc ký lớp mỏng là bao hàm ý nghĩa của việc sử dụng vật liệu chất

mang là tấm kính hoặc tấm nhựa, còn pha động là chất lỏng (dung môi) phân cực, không phân cực hoặc dung dịch đệm.

- Đối với sắc ký lớp mỏng, trên bề mặt của chất mang đƣợc phủ lên

các chất có đặc tính khác nhau – Pha tĩnh. Có thể có nhiều loại: + Chất hấp phụ; + Trao đổi ion;

+ Rây phân tử; + Tẩm dung môi khác nhau.  Sắc ký lớp mỏng có đầy đủ 4 cơ chế tách.

81

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.3. Quá trình và kỹ thuật sắc ký 4.3.1. Chuẩn bị dụng cụ:

- Chọn bình sắc ký thích hợp; - Chuẩn bị dung môi, trộn các dung môi theo tỷ lệ thích hợp; Nếu các dung môi không tan vào nhau thì cho vào phếu chiết lắc đều, sau

đó để yên cho tách lớp.

Ví dụ: hệ butanol – Axit axetic – nƣớc. Sau khi tách lớp: + Lớp trên là pha động;

+ Lớp dƣới là pha tĩnh.

- Nên cho dung môi vào bình sắc ký trƣớc một thời gian để bão hòa hơi dung môi.

82

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.3. Quá trình và kỹ thuật sắc ký 4.3.1. Chuẩn bị dụng cụ

- Chuẩn bị giấy: là loại giấy đặc biệt mang tên hãng sản xuất, và có ký hiệu phụ thuộc tính chất của giấy.

Ví dụ : giấy whatman, schleicher, munktell,...

- Tùy theo chất cần tách mà chọn loại giấy thích hợp.

- Kích cỡ của giấy chọn sao cho phù hợp với bình sắc ký.

- Kẻ 1 đƣờng xuất phát cách mép trên khoảng 3 – 5 cm và đánh dấu

những điểm cách nhau và cách mép giấy khoảng 2 – 2,5 cm.

83

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.3. Quá trình và kỹ thuật sắc ký 4.3.2. Chấm dung dịch lên giấy

Dùng micropipet chấm khoảng 1 – 5 L dung dịch mẫu hoặc chất chuẩn lên giấy, các chấm càng gọn càng tốt. Tránh vết chấm loang rộng, có thể chấm nhiều lần.

4.3.3. Cho dung môi chạy - Giấy đã chấm dung dịch phân tích và đƣợc đƣa vào bình sắc ký chứa pha động đã đƣợc bão hòa.

- Giấy sẽ đƣợc cho nhúng vào dung môi (pha động). Có thể cho dung môi chạy theo nhiều cách: + Sắc ký đi lên;

+ Sắc ký đi xuống;

+ Sắc ký đảo pha;

+ Sắc ký 2 chiều.

+ Sắc ký vòng; 84

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.3. Quá trình và kỹ thuật sắc ký 4.3.4. Phát hiện các vết

Sau khi chạy sắc ký các chất tan sẽ phân bố trên giấy sắc ký ở các vị trí khác nhau trên sắc đồ. Có thể phát hiện vệt bằng các cách sau: - Đối với sắc ký giấy:

+ Chiếu tia tử ngoại; + Đƣa thêm chất chỉ thị huỳnh quang, kết hợp với chiếu tia tử ngoại, chẳng hạn nhƣ dùng: fluorexein, morin, rodamin B,...

- Đối với sắc ký lớp mỏng: + Phun các chất oxy hóa; + Sử dụng các thuốc thử đặc biệt, chất tạo phức màu,...

- Xác định Rf

85

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.4. Ƣu, nhƣợc điểm của sắc ký lớp mỏng 4.4.1. Ưu điểm

- Dùng để đánh giá một cách định tính; - Có thể tiến hành nhiều mẫu song song; - Việc định lƣợng dựa vào chỉ số Rf là khá đơn giản, nhanh;

,...

4.4.2. Nhược điểm - Do tốc độ của dung môi (pha đông) không phải hằng số nên việc

định không chính xác.

- Việc định lƣợng dựa vào chỉ số Rf là không chính xác. Bởi vì nó còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm.

- Độ lặp lại không tốt.

86

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 4. Sắc ký phẳng 4.5. Một số ví dụ Ví dụ 1: Phân tích các cation kim loại: Ni2+; Co2+; Cu2+; Fe3+; Hg2+;Cd2+.

- Pha động: axeton 5%, HCl 8% - Thuốc hiện: 8 – oxiquynolin Ví dụ 2: Phân tích glucoza.

- Pha động: butanol : CH3COOH : H2O = 4 : 1 : 5 - Thuốc hiện: resorsin trong C2H5OH và HCl 0,2 N Ví dụ 3: Tách các amin.

- Pha động: butanol : CH3COOH : H2O = 4 : 1 : 5 - Thuốc hiện: Ninhydrin 0,2% trong axeton khan.

87

PHẦN THỨ BA – PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHƢƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp sắc ký Bài tập 1. Một hỗn hợp 2- metyl-hexan và 3- metyl-hexan đƣợc tách trên cột GC có 2500 đĩa lý thuyết. Hãy tính độ phân giải của cột nếu thời gian lƣu là 15ph đối với 2- metyl- hexan và 16ph đối với 3- metyl- hexan ?

2. Số liệu sau đây đƣợc lấy từ phép phân tích GC: tR = 10 ph; w = 0,30 ph; tair = 0,5 ph; Vs = 4 ml; F= 40 ml/ph.

Hãy tính: 1/ Dung lƣợng k’; 2/Thể tích pha động Vm; 3/ Hệ số phân bố KD ; 4/ Thể tích lƣu VR; 5/Số đĩa lý thuyết n 3. Số đĩa lý thuyết tại tốc độ dòng khác nhau đối với một cột LC dài 30 cm đƣợc xác định từ thể tích lƣu và bề rộng pic cho một phép phân tích.

Biết: u ( cm/s):0,1 và 2,0 khi n = 1500.

Hãy xác định tốc độ dòng tối ƣu, giá trị H tối thiểu và số đĩa lý thuyết đạt đƣợc tại tốc độ dòng tối ƣu này, giả sử số hạng A không đáng kể ( tức là bỏ qua số hạng A).

88