ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ & SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS LẠI THỊ THU TRANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH

ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ

Nội dung 1

Các khái niệm cơ bản

2 3 4 5 6

Phân loại Thành phần, thông số đặc trưng, lực liên kết Pic sắc ký và sắc đồ Đĩa lý thuyết và phương trình vandemter Ứng dụng

ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ I. Khái niệm Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử chất phân tích trên 2 pha: Một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động.

Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Quá trình tách sắc ký trên cột của 2 chất A và B

THỨ TỰ RA KHỎI CỘT

Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau

SẮC KÝ ĐỒ

II. PHÂN LOẠI II.1. Phân loại theo trạng thái của pha động và pha tĩnh

Pha động

Pha tĩnh

Sắc ký lỏng Sắc ký khí Chất rắn Chất lỏng

III. THÀNH PHẦN HỆ SẮC KÝ CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG- LỰC LIÊN KẾT III.1. Thành phần hệ sắc ký Pha

tĩnh: Chức năng lưu giữ chất phân tích

Pha

động: Phân bố, tương tác di chuyển chất phân tích trên

pha tĩnh Chất

phân tích: Phù hợp với các pha

III.2. LỰC LIÊN KẾT

Lực liên kết ion

Lực phân cực

Lực phân tán

Lực liên kết Hidro, liên kết cho nhận…

THỜI GIAN LƯU Thông số quan trọng để tách chất, tối ưu hóa quá trình sắc ký

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột. tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết. tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.

Hệ

số phân bố K

Hệ

số dung lượng k’ Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.

CM : nồng độ cấu tử trong pha động.

ĐỘ CHỌN LỌC Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.

Giá trị chọn lọc luôn lớn hơn 1.

Giá trị lớn hay nhỏ đều tác động đến quá trình tách sắc ký

IV. PIC SẮC KÝ VÀ SẮC ĐỒ

Hình dáng pic sắc ký

Tính cân đối của pic sắc ký AF

b AF = a 0,9 < AF <= 1,1

Tính cân đối của pic sắc ký

Pic chuẩn

Pic ñổ ñầu

Pic kéo ñuôi

C, Xác định nồng độ chất

Sắc đồ

V. Đĩa lý thuyết ĐLT (N) + Martin và Synge đã dùng phương pháp ĐLT để mô tả quá trình sắc ký. + Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình cơ bản này là tuần hoàn của sự hấp phụ và giải hấp phụ. Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của các cấu tử trong cột + Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý thuyết + Các đĩa xếp dọc theo chiều dài của cột. Mỗi một chất khi di chuyển trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau (hấp phụ / giải hấp phụ) nên số đĩa khác nhau

+ Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có: Tổng lượng chât tan mT là tổng số lượng chất tan được pha động di chuyển tới từ đĩa thứ (j -1) nằm cân bằng tại thời điểm (i-1) và lượng chất tan thực sự có sẵn ở đĩa thứ j tại thời điểm (i-1) có

Hạn chế của đĩa lý thuyết: Không giải thích được hiện tượng giãn rộng pic do không tính đến phân tán trong cột do sự khuyêch tán của các hợp chất

Xác định số đĩa lý thuyết ĐLT - N Gọi N là số đĩa lý thuyết, L chiều dài của cột sắc ký, H là chiều cao ĐLT

Với W1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao pic (phút) W là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí đáy pic (phút) Bề rộng pic

XÁC ðỊNH SỐ ðĨA LÝ THUYẾT - N

w1/2 là độ rộng tại ½ chiều cao pic sắc ký. w1/2 = 2,35σ. Độ rộng của pic tính tại nền và được đo ở chiều cao đạt được là 13,5% sao với chiều cao cực đại của pic sắc ký w = 4σ

Độ phân giải

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn lọc và hiệu quả tách.

Phương trình Vandemter Phương trình mô tả sự ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến hiệu quả tách.

B H = A + + Cu u Trong đó: A là hệ số khuyêch tán xoáy B là hệ số khuyếch tán dọc theo cột C là hệ số truyền khối Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s ; C là s

Hiệu quả cột cao nhất khi H nhỏ nhất tương ứng tốc độ tối ưu

B u= C

VI. ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ

Định tính So sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu

1

của chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu

2

phân tích đã thêm chuẩn để đối chiếu trong cùng điều kiện

3

• Kết hợp với một số máy móc khác để phân tích

PHƯƠNG PHÁP ĐƯỜNG CHUẨN Đường chuẩn Fenobucarb

y = 3990x - 5018.5 R2 = 0.9994

4500000

9000000 8000000

3500000 3000000

7000000 6000000

Diện tích Diệ

Diện tích Di

4000000

2500000

5000000

2000000

4000000

1500000 1000000

3000000 2000000

500000

1000000

0 0

500

1000

0

1500

0

Nồng độ (ppb)

500

1000

1500

2000

Nồng độ (ppb)

Nồng độ (ppb)

20

50

100

200

500

1000

1500

Diện tích (mAu)

1818155

4323952

8848970

17287122

38708909

75531554

95077738

PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN

Tên hoạt chất

400000 350000

S (mAu.s)

300000

200000

Y=A+B*X Thong so Gia tri Sai so ----------------------------------------------------------A 201954,33333 2310,60358 B 94320 1789,78583 -----------------------------------------------------------

0 -2,0

-1,5

-1,0

0

200921

1

298341

2

389561

3

478932

Cx

Cs

C2

C3

2,14 3,18

150000

50000

-2,5

Diện tích S (mAu.s)

250000

100000

-3,0

∆C

-0,5

0,0

CPEN (mg/l)

0,5

1,0

1,5

2,0

PEN G

4,15 5,17

PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUẨN Không có mặt trong mẫu (mà phải được thêm vào).

- Tín hiệu phân tích của nội chuẩn phân biệt rõ với chất phân tích và các tạp chất khác trong mẫu - Thời gian lưu càng gần với chất phân tích càng tốt - Lượng nội chuẩn bằng nhau trong tất cả các dung dịch chuẩn và mẫu - Nồng độ nội chuẩn nên có để tín hiệu phân tích nằm khoảng 1/3 của đường chuẩn chất phân tích.

PHƯƠNG PHÁP CHUẨN HÓA DIỆN TÍCH

BÀI TẬP 1) Cho 2 chất có thời gian lưu tR1=1,43, tR2= 4,5 và bề rộng đáy Wb1=0,1; Wb2 = 0,3. Tính số đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất 2) Mội cặp peak có độ chọn lọc a = 1,1 và hệ số phân giải Rs=1, hệ số chứa K’2=0,5. Tính số đĩa lý thuyết N? 3) Một hỗn hợp gồm 2 chất có hệ số chứa K’1= 2,58 và K’2=2,64.

Tính hệ số chọn lọc α?

BỘ Y TẾ

SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ LC-MS

1. Nguyên tắc – Phân loại F lo w o f M o b ile P h a s e

I n je c to r

D e te c to r

T= 0

T= 10’

T= 20’

M ost

I n t e r a c t io n w it h S t a t io n a r y P h a s e

Least

Các chất được tách ra với thời gian lưu tương ứng

* Detecter huỳnh quang Sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh quang cho detector huỳnh quang.

ðộ chọn lọc và ñộ nhạy có thể hơn ñến 1000 lần detector hấp thụ

Áp dụng: Hợp chất thơm ña vòng, dẫn chất quinolin, steroid, anc Do ñộ ñ nhạy nh y cao nên sử s dụng d ng cho phân tích lượng lư ng vết, v t, mẫu m u sinh học, giám ñịnh pháp y,…

So sánh 2 kỹ thuật ESI và APCI ESI

APCI

Ion hóa ở pha lỏng trong vùng Bay hơi dung môi, chất phân thế cao. Các chất phân cực tích. Dễ dàng phân tích các hơn sẽ dễ dạng ion hóa hơn chất có phân tử lượng nhỏ và Bay hơi dung môi > tạo hạt ít phân cực sương nhỏ hơn Ion hóa các chất, tạo ion ở thể Ion tạo thành sẽ di chuyển khí bởi kim tích điện thế cao nhờ lực hút tĩnh điện ( Các ion Ion tạo thành bởi phản ứng có mật độ điện tích cao và sức giữa ion proton và phân tử chất căng bề mặt thấp sẽ di chuyển phân tích dễ hơn)

Ứng dụng của HPLC/MS

42

3.3. Phương pháp định lượng

Định lượng

Phương pháp cơ bản Thêm Chuẩn

Đường Chuẩn

Nội chuẩn

Lựa chọn kỹ thuật…

Tôi cần tách Kháng sinh khỏi hỗn hợp thật nhanh đảm bảo chất lượng.

Tôi sẽ nghiên cứu công nghệ tách.

44

I’ll get on it!

Lựa chọn công nghệ nào?

45

Quy trình phân tích 1

Xác ñịnh ñ nh mục m c tiêu phân tích

2

Chọn Ch n kỹ k thuật thu t xử x lý mẫu m u

3

Chọn Ch n cột c t tách phù hợp h p

4 5 6

Chọn Ch n detecter thích hợp h p Chọn Ch n ñiều ñi u kiện ki n sắc s c ký ðánh giá phương pháp phân tích

Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam PHƯƠNG PHÁP

PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN HÓA

PHƯƠNG PHÁP QUANG HỌC

PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dụng cụ và hoá chất Máy móc và dụng cụ Máy HPLC model LC-10A của hãng Shimadzu Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV-1650 PC Máy đo pH Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45mm ; 0,2mm , bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ sấy, máy sinh khí nitơ, cột chiết pha rắn SPE-C18, và các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác.

Hoá chất Các chất chuẩn PEN G, AMP.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O, OXA, do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48A Hai Bà Trưng – Hà Nội) sản xuất và cung cấp.

MeOH, ACN tinh khiết cho chạy HPLC Merck (Đức). Các hoá chất khác: axit acetic, natri acetate, axit boric, HCl, KOH tinh khiết phân tích và nước cất 2lần.

Dung dịch đệm được pha từ axit acetic và natri acetate, dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45mm trước khi bơm vào cột sắc ký.

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU DƯỢC PHẨM Nghiền mịn, cân 20mg

20mg thuốc + metanol

Lắc, siêu âm 15’ , lọc qua cartrig 0,45µm Thổi khô bằng khí Nito, pha loãng Dung dịch 20mg/20ml

Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection Column

Detector

Solvents

50

time

Sắc đồ chất chuẩn ACN/MeOH/đệm Acetat pH=4 là 15/15/70. Tốc độ 0.8ml/phút. Nồng độ đệm 10mM

OXA

CLO

AMP

PEN G

CEP

pH dung dịch đệm Điều kiện khảo sát: ACN/MeOH/đệm

3,50

Acetat = 15/15/70. Tốc độ 0.8ml/phút.

3,00

Nồng độ đệm 10mM

2,50

Khảo sát thành phần dụng dịch đệm

k'

PEN G CEP

2,00

AMP

1,50

CH3COOH/CH3COONa có nồng độ

1,00

10mM với khoảng pH thay đổi từ 3,5

0,50

– 5,0.

0,00

OXA CLO pH 3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

Thứ tự rửa giải của các b-lactam là : PEN G, CEP, AMP, OXA, CLO

Sự phụ thuộc k’ vào pH pha động Tạii pH = 3,5 các píc sắc c ký có sự khác nhau rõ rệtt về hệ số tách k’, sự tách rõ ràng hơn, thời y, kếtt quả th i gian lưu ngắn ng n hơn. hơn. Như vậy, qu chọn ch n pH = 3,5 cho các thí nghiệm nghi m tiếp ti p theo

Tỷ lệ thành phần pha động ACN/MeOH/đệm Acetat pH=3,5 là 15/15/70. Tốc độ 0.8ml/phút. Nồng độ đệm 10mM

k'

5,00 4,50 4,00 3,50 3,00

PEN G

2,50

AMP

2,00 1,50

OXA

ACN/MeOH/đệm

PEN G

CEP

AMP

OXA

CLO

05/25/70

0,38

0,70

1,24

1,91

4,33

%ACN

10/20/70

0,52

0,88

1,52

2,23

3,17

30

15/15/70

0,31

0,58

1,51

1,80

2,54

20/10/70

0,16

0,51

0,87

1,16

3,29

25/05/70

0,27

0,56

0,79

1,27

1,59

CEP

CLO

1,00 0,50 0,00 0

10

20

Hệ số k’

Sắc đồ sắc ký tại tỷ lệ thành phần pha động khác nhau ACN/MeOH/đệm acetat (a). 05/25/70 (b). 10/20/70 (c). 15/15/70 (d). 20/10/70 (e). 25/05/70

Sự phụ thuộc k’ vào thành phần pha động

Nhận thấy khi thành phần ACN cao, pic sắc ký xuất hiện sớm, hệ số k’ gần nhau, các chân pic tách nhau không rõ ràng , ảnh hưởng đên kết quả phân tích.

Khi giảm tỷ lệ ACN thì mất nhiều thời gian rửa giải chất ra khỏi cột hơn, hệ số k’ tăng, đồng thời pic bị doãng.

Chọn tỷ lệ pha động có chứa tỷ lệ như sau: ACN / MeOH / Đệm là 10/20/70

Nồng độ đệm acetat của pha động ACN/MeOH/đệm Acetat pH = 3,5 là 10/20/70. Tốc độ 0.8ml/phút.

Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm C (mM)

t (phút) PEN G

CEP

AMP

OXA

CLO

12

2,722

3,790

4,470

5,281

6,808

10

3,047

4,162

4,917

5,811

7,426

8

3,049

4,178

4,844

5,818

7,472

6

3,144

4,184

4,921

6,276

8,133

Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau C (mM)

Spic PENG

CEP

AMP

OXA

CLO

6

381511

980696

953589

1046897

936952

8

427124

1002316

1168266

1051618

1023112

10 12

Sắc đồ sắc ký ở các nồng độ khác nhau 950603 1130074 1061320 981943 (a). C = 12mM (b). C = 10mM (c). C = 8mM (d). C = 6mM 417793 375940

976765

1097411

939179

Chọn nồng độ đệm C = 10mM cho các khảo sát tiếp theo

977458

Tốc độ pha động ACN/MeOH/đệm Acetat pH=3,5 là 10/20/70. Nồng độ đệm 10mM

Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động F (ml/phút)

Spic PEN G

CEP

AMP

OXA

0,6

1162139

1283828

1412412

1625354

0,8

877983

962871

1185631

1221644

1109561

1,0

692386

710296

908504

877315

867648

1,2

485335

581914

790420

800429

689707

1800000

CLO 1479415

Spic

1600000 1400000

PEN G

1200000

CEP

1000000

AMP

800000

OXA

600000

CLO

400000 200000

F (ml/phút)

Sắc đồ sắc ký ở các tốc độ khác nhau 0,9 1,1 1,3 (a).0,5 1,2ml/phút 0,7 (b). 1,0ml/phút (c).0,8ml/phút (d).0,6ml/phút 0

Chọn tốc độ 0,8ml/phút cho các thí nghiệm tiếp theo.

ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU Các điều kiện tối ưu để tách các β-lactam

Pha tĩnh: Cột Supelcosil RP-C18 với kích thước hạt nhồi 5µ µm của hãng Sulpenco-Autralia

Pha động: ● pH = 3,5 ● Tỷ lệ ACN/MeOH/đệm là 10/20/70 ● Nồng độ đệm 10mM ● Tốc độ 0,8ml/phút ● Chạy đẳng dòng

Nhiệt độ cột tách 30oC

Thể tích mẫu 20µ µl

Detector đơn bước sóng 225nm

Sắc đồ sắc ký tại điều kiện tối ưu

ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

250000

S (mAu.s)

200000

150000 Y=A+B*X

100000

Thong so Gia tri Sai so -----------------------------------------------------------A 1387,76949 1189,01108 B 125161,88226 1154,86965 ------------------------------------------------------------

50000

R SD N P -----------------------------------------------------------0,99987 1793,58359 5 <0.0001 -------------------------------------------------

0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CCEP (ppm)

Sự phụ thuộc của Spic vào nồng ñộ chất phân tích 0,10,1-2,0 ppm

Sử dụng phần mềm Origin version 7.5 xây dựng đường chuẩn

ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Sử dụng phần mềm Origin version 7.5 xây dựng đường chuẩn 250000

200000

200000

200000

150000

Y= A + B * X Thong so Gia tri Sai so -----------------------------------------------------------A -1204,58375 1322,34821 B 101183,39967 1284,37812 ------------------------------------------------------------

50000

150000 Y= A + B* X

100000

50000

R SD N P -----------------------------------------------------------0,99976 1994,7182 5 <0.0001 --------------------------------------------------

0

0,0

0,5

1,0

1,5

Thong so Gia tri Sai so -----------------------------------------------------------A 1387,76949 1189,01108 B 125161,88226 1154,86965 -----------------------------------------------------------R SD N P -----------------------------------------------------------0,99987 1793,58359 5 <0.0001 -------------------------------------------------

0 0,0

2,0

0,5

1,0

1,5

2,0

100000

Y= A + B * X Thong so Gia tri Sai so -----------------------------------------------------------A -880,73134 986,88916 B 96837,01493 958,55149 ------------------------------------------------------------

50000

R SD N P -----------------------------------------------------------0,99985 1488,68941 5 <0.0001 --------------------------------------------------

0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CAMP ( ppm)

CCEP (ppm)

C (ppm)

S (mAu.s)

100000

S (mAu.s)

S (mAu.s)

150000

250000

250000 200000

Đường chuẩn của các 150000

150000 Y= A + B * X

100000

Thong so Gia tri Sai so -----------------------------------------------------------A 188,36318 278,63793 B 121186,89055 270,63708 ------------------------------------------------------------

50000

R SD N P -----------------------------------------------------------0,99999 420,31602 5 <0.0001

0 0,0

0,5

1,0

CoxA (ppm)

1,5

2,0

S (mAu.s)

S (mAu.s)

200000

100000

β-lactam trong khoảng nồng độ

Y= A + B * X Thong so Gia tri Sai so -----------------------------------------------------------A -801,5738 2307,5596 B 105681,80763 2241,30002 ------------------------------------------------------------

50000

0,10ppm đến 2,00ppm

R SD N P -----------------------------------------------------------0,99933 3480,87675 5 <0.0001 ---------------------------------------------------

0 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CCLO (ppm)

Sự phụ thuộc của Spic vào nồng ñộ chất phân tích

Giá trị Ftính , giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Chất phân tích

Phương trình hồi quy

Hệ số góc (b)

Độ lệch chuẩn (Sy)

y = (-880,7313± ±1740,4004) + (96837,0149± ±1725,4107)x

96837,0149

1488,6894

AMP y = (96205,5472± ± 1133,9571 )x

96205,5472

1450,3141

y = (1387,7695± ±2140,2199) + (125161,8823± ±2078,7653)x

125161,8823

1793,5836

CEP y = (126156,8868± ±1464,4764)x

126156,8868

1873,0434

y = (188,3632± ±501,5482) + (121186,8906± ±487,1468)x

121186,8906

420,3160

OXA y = (121321,9434± ±305,5133 )x

121321,9434

390,7462

y = (801,5738± ±4153,6072) + (105681,8076± ±4034,3400)x

105681,8076

3480,8768

CLO y = (105107,0943± ±2403,9021)x

105107,0943

3074,5547

Ftinh

Fbang

LOD (ppm)

LOQ (ppm)

1,05

9,55

0,0461

0,1537

1,09

9,55

0,0431

0,1433

1,16

9,55

0,0104

0,0347

1,28

9,55

0,0988

0,3294

BẢNG KHẢO SÁT ĐỘ CHÍNH XÁC VÀ ĐỘ LẶP LẠI CỦA PHÉP ĐO TT

1

2

3

4

5

Chất

PEN G

CEP

AMP

OXA

CLO

C (ppm)

Độ lệch chuẩn S(mAu.s)

Độ chính xác %X

Độ biến động CV(%)

0,15

482,80

1,2

3,59

0,40

113,74

5,4

0,31

0,80

584,75

4,7

0,70

0,15

307,04

0,19

2,21

0,40

235,30

2,8

0,64

0,80

1512,16

2,7

1,92

0,15

1027,16

3,5

4,92

0,40

227,82

4,5

0,47

0,80

901,23

0,3

0,89

0,15

283,97

2,8

1,50

0,40

509,84

4,7

1,11

0,80

950,61

4,2

0,94

0,15

372,79

1,9

2,20

0,40

436,27

5,3

1,07

0,80

1520,65

6,0

1,68

Phương pháp có độ chính xác và độ lặp lại tốt

Phân tích mẫu dược phẩm Penicillin G

Savixin

Nhà sản xuất Số lô sản xuất

CTCP Hoá-Dược phẩm MEKOPHAR 10043 TN

Số đăng ký Thành phần

VD-8951-09 Dạng bột, mỗi lọ chứa 1.000.000 IU PEN G, tá dược vừa đủ. (≈ 600mg)

Hạn sử dụng Nhà sản xuất Ngày sản xuất Số đăng ký Thành phần

Ampicillin

Hạn sử dụng Nhà sản xuất Ngày sản xuất Số đăng ký Thành phần

CTCPDP Hà Tây VD-1891-06 Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg cephacillin, tá dược vừa đủ.

Cty CPDP TIPHARCO VD-2472-07 Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg ampicillin, tá dược vừa đủ

Hạn sử dụng

Cloxacillin

Clopencil

Nhà sản xuất Ngày sản suất Số đăng ký Thành phần Hạn sử dụng Nhà sản xuất Ngày sản suất Số đăng ký Thành phần Hạn sử dụng

Aegis Ltd, Nicosia, Cyprus, Europe VN-4699-07 Cloxacillin 500mg X.n.d.p.t. ư. I Pharbaco VNA-0538-03 Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg oxacillin, tá dược vừa đủ

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHẤT 450000 400000 350000

S (mAu.s)

300000 250000 200000 150000

Y=A+B*X

100000

Thong so Gia tri Sai so ------------------------------------------------------------A 247371,16667 5019,59993 B 125852,5 3888,16539 --------------------------------------------------------------

50000 0 -3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CCLO(mg/l)

Đồ thị xác định nồng độ chất theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc

ĐỒ THỊ XÁC ĐỊNH CX 400000 350000

450000

500000

400000

450000

350000

400000

300000

350000

200000 150000

250000 200000 150000 100000

Thong so Gia tri Sai so ----------------------------------------------------------A 201954,33333 2310,60358 B 94320 1789,78583 -----------------------------------------------------------

50000

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Thong so Gia tri Sai so ------------------------------------------------------------A 247371,16667 5019,59993 B 125852,5 3888,16539 --------------------------------------------------------------

50000

0 -2,5

Y=A +B * X

Y= A + B * X

100000

-3,0

S (mAu.s)

S (mAu.s)

S (mAu.s)

300000

250000

0 -3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

CPEN (mg/l)

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CCLO(mg/l)

500000

300000 250000 200000 150000

Y= A + B * X

100000

Thong so Gia tri Sai so ------------------------------------------------------------A 247371,16667 5019,59993 B 125852,5 3888,16539 --------------------------------------------------------------

50000 0

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

CMAP(mg/l)

400000

450000

350000

400000

300000

350000

S (mAu.s)

S (mAu.s)

300000 250000 200000 150000

Y =A+B* X

100000

0 -3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

CoxA (mg/l)

0,5

200000 150000 Y= A + B * X

100000

Thong so Gia tri Sai so --------------------------------------------------------------------------A 247371,16667 5019,59993 B 125852,5 3888,16539 ----------------------------------------------------------------------

50000

Đồ thị xác định các chất theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc

250000

1,0

1,5

2,0

Thong so Gia tri Sai so ------------------------------------------------------------A 201954,33333 2310,60358 B 94320 1789,78583 --------------------------------------------------------------

50000 0 -3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

CCEP(mg/l)

0,5

1,0

1,5

2,0

Sắc đồ thuốc kháng sinh β-lactam

OXA

AMP

CEP

Sắc đồ thuốc kháng sinh β-lactam

CLO

PEN G

Kết quả phân tích mẫu thuốc Tên hoạt chất

PEN G

CEP

AMP

OXA

CLO

∆C

Diện tích S (mAu.s)

Cx

Cs

mt thuốc

678,25

0

200921

2,14

1

298341

2,14

3,18

2

389561

2,14

4,15

0

189769

1,91

1

279788

1,91

2,82

2

385772

1,91

3,88

0

249616

1,97

1

368734

1,97

2,90

2

501321

1,97

3,96

0

242002

2,08

1

359586

2,08

3,09

2

474782

2,08

4,09

0

211566

2,09

1

317423

2,09

3,13

2

415532

2,09

4,10

583,75

Khối lượng thuốc xác định được trong 1 viên (mi) 580,58

475,13

Sai số so với hàm lượng in trên nhãn ( C%)

Hiệu suất trung bình %H0

-3,24

102,2

-4,99

94,65

473,39

-5,30

605,00

503,36

0,67

575,25

509,67

0,19

600,75

96,68

100,48

102,52

Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so với kết quả in trên nhãn thuốc và độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU SINH HỌC

Mẫu sinh học Hút 1,5 – 2ml

Ly tâm 15 phút , 10.000rpm , tách cặn Hút 50µl dung dịch Dung dịch + cho 200µl etanol + 500µl n-hexan + TCA - Loại bỏ protein

+ Ly tâm 15 phút ở 10.000rpm

Dịch chiết Lọc, hút 200 µl dịch lọc thổi khô bằng khí nito Hòa tan bằng dung môi chạy mẫu (rung siêu âm 2 phút)

Phân tích mẫu nước tiểu

ST

2

3

Tên

CEP

AMP

∆C

Diện tích S (mAu.s)

Cx

Cs

%H

Hiệu suất trung bình %H0

90,62

0

179896

1,89

1

259788

1,89

2,73

83,62

2

365412

1,89

3,85

97,62

0

221213

1,63

1

325414

1,63

2,39

76,63

2

482351

1,63

3,55

96,03

Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu

86,33

Kết quả một số phương pháp khác xác định kháng sinh cùng loại Điện di mao quản

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điện hoá

Chất phân tích LOD (mg/l)

LOQ (mg/l)

CEP

0.98

AMP

LOD (mg/l)

LOQ (mg/l)

LOD (µ µg/l)

LOQ (µ µg/l)

3.26

0,0461

0,1537

6,15

20,50

0.73

2.45

0,0431

0,1433

PENG

0.85

2.82

0,0591

0,1971

OXA

0.93

3.08

0,0104

0,0347

CLO

1.00

3.34

0,0988

0,3294

Hiệu suất thu hồi

83,43%-116,80%

94,52%-105,21%

93,6%-97,52%

Ưu nhược điểm của phương pháp Điện di mao quản

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điện hoá

- Xác định được trên nhiều - Xác định được trên nhiều - Chỉ một số đối tượng đối tượng khác nhau

đối tượng khác nhau

điển hình

- Lượng mẫu phân tích nhỏ, - Lương mẫu phân tích nhỏ, Ưu điểm và nhược điểm

thao tác đơn giản

thao tác phức tạp

- Chi phí không cao

- Chi phí cao

- Thao tác đơn giản - Chi phí ít

- Phân tích được nhiều chất - Phân tích được nhiều mẫu - Chỉ phân tích từng mẫu cùng một lúc

cùng một lúc

đơn lẻ

- Giới hạn phát hiện và định - Giới hạn phát hiện và định - Giới hạn phát hiện và lượng thấp

lượng

cao

pháp điện di

hơn

phương định lượng cao

KẾT LUẬN Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký: 1. Pha tĩnh: Cột Supelcosil RP-C18 với kích thước hạt nhồi 5µm hãng Sulpenco-Autralia 2. Pha động: pH = 3,5 Tỷ lệ ACN/MeOH/đệm acetat là 10/20/70 Nồng độ đệm 10mM Tốc độ 0,8ml/phút 3. Chạy đẳng dòng 4. Nhiệt độ cột tách 30oC 5. Thể tích mẫu 20µl 6. Detector đơn bước sóng tại 225nm

KẾT LUẬN Đánh giá phương pháp phân tích: - Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0,10 – 2,00ppm, hệ số tương quan các đường chuẩn R2 > 0,99 - Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,01ppm đến 0,10ppm. Giới hạn định lượng LOQ từ 0,03ppm đến 0,30ppm - Độ chính xác ở các nồng độ 0,15ppm; 0,40ppm; 0,80ppm nằm trong khoảng 0,30% – 8,40 % - Hệ số biến động ở các nồng độ 0,15ppm; 0,40ppm; 0,80ppm nằm trong khoảng 0,31% - 4,92% Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và nước tiểu.

- Với mẫu thuốc: hiệu suất thu hồi đạt được từ 94,52%. đến 102.20%.

- Với mẫu nước tiểu: hiệu suất thu hồi từ 86,33% tới 90,62%.

Phân tích sulfonamid bằng kỹ thuật LC/MS/MS và HPLC

SULFONAMID