ĐẠI CƯƠNG VỀ PHÂN TÍCH DỤNG CỤ
• Mục tiêu • Giới thiệu được các cách định lượng trong phân tích dụng cụ • Giải thích được một số đặc trưng trong phân tích dụng cụ • Trình bày được các loại sai số và cách giảm thiểu sai số
• Tài liệu tham khảo: • Hóa phân tích 1, 2: Đại học Dược Hà Nội • Xử lý số liệu trong Hóa phân tích: TS Tạ Thị Thảo – Đại Học Quốc Gia Hà Nội • Thẩm định phương pháp hoa học-Viện kiểm nghiệm thực phẩm Quốc Gia • János Pogány, pharmacist, PhD, consultant to WHO Pretoria, South Africa, 28 June 2005 • An Introduction to Quality Assurance in Analytical Science - Dr Irene Mueller Harvey – UK analytical partnership
NỘI DUNG • • • • •
1. Khái niệm – Phân loại 2. Hiệu chuẩn – chất chuẩn 3. Một số đặc trưng của phân tích dụng cụ 4. Các loại sai số 5. Ứng dụng
1. Khái niệm - Phân loại Dựa vào cách tác động lên đối tượng phân tích và quá trình diễn ra, trong đó có 4 nhóm chính sau: • Phân tích quang học: Dựa vào hiệu ứng của bức xạ điện từ • Phân tích điện hóa: Dựa vào quá trình điện cực xảy ra khi cho dòng điện đi qua dung dịch • Kỹ thuật tách: Dựa vào tương tác của CPT với các pha • Nhóm hóa học: Dựa vào tín hiệu phân tích
2. Hiệu chuẩn và chất chuẩn 2.1. Hiệu chuẩn (calibration) Khái niệm: Là quá trình thiết lập đáp ứng của thiết bị đo lường (phân tích) với nồng độ (lượng chính xác) của chất phân tích trong điều kiện cụ thể Là so sánh đại lượng đo được với giá trị đối chiếu Cách hiệu chỉnh: Phương pháp đường chuẩn Phương pháp thêm chuẩn Thiết bị và dụng cụ dùng cho phân tích: Cân, bước sóng, độ hấp thụ quang, dụng cụ thủy tinh…
Đặc điểm: Xác lập mối quan hệ giữa khối lượng hay nồng độ của CPT và tín hiệu phân tích (độ hấp thụ, diện tích, chiều cao…) Đánh giá tác động của thành phần nền đến tín hiệu đáp ứng được biết dưới tên hiệu ứng nền (matrix effect)
2.2. Chuẩn hóa học (chemical standard): Sử dụng các đơn chất hoặc hợp chất tinh khiết ổn định được dùng phổ biến trong chuẩn độ thể tích 2.3. Chất đối chiếu (reference material): Được dùng để chứng minh độ đúng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Chất đối chiếu (CRM,SRM) được cung cấp bởi các tổ chức đo lường quốc tế như NIST, BAS Chất đối chiếu phải thỏa mãn: Tinh khiết, có thành phần nền đã biết (mẫu chuẩn) Chất đối chiếu dùng để: Thẩm định một phương pháp mới; Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác, khẳng định giá trị pháp lý của 1 phương pháp đã chuẩn hóa
3. Một số đặc trưng của phân tích dụng cụ Sensitivity: Độ nhạy Độ đúng: Trueness
Precision: Độ chụm
Accuracy: Độ chính xác Bias: Độ chệch Limit of Detecter: Giới hạn phát hiện: LOD Selectivity: Độ chọn lọc
Linear Range:Khoảng tuyến tính
Dynamic range Concentration range
3.1. Độ đúng và độ chụm
Độ chụm tốt Độ đúng kém
Độ chụm kém Độ đúng kém
Độ đúng tốt Độ chụm kém
Độ đúng tốt Độ chụm tốt
Độ chụm (precision) • Độ chụm: Dùng để chỉ mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ xi của các phép đo lặp lại. Nói cách khác, độ chụm được dùng để chỉ sự sai khác giữa các giá trị xi so với giá trị trung bình . • Ba khái niệm thống kê được dùng để mô tả độ chụm của một tập số liệu là độ lệch chuẩn, phương sai và hệ số biến thiên Độ chụm tốt
• Độ lệch chuẩn s (standard deviation SD): Đặc trưng cho độ phân tán các số liệu trong tập hợp với giá trị trung bình 2
s=
∑(x − x) i
N −1
2
(tập số liệu < 30)
s=
∑(x − x) i
N
(tập số liệu > 30)
Với: x là giá trị trung bình; xi là giá trị từng thí nghiệm N là tổng số thí nghiệm; N-1 là số bậc tự do • Độ lệch chuẩn tương đối RSD: Đánh giá độ lệch chuẩn chiếm bao nhiêu phần trăm của giá trị trung bình. RSD = s/x • Hệ số biến thiên CV: CV = RSD.%
Phương sai s2(variance) • Phương sai: Là giá trị trung bình của tổng bình phương sự sai khác giữa các giá trị riêng rẽ trong tập số liệu so với giá trị trung bình. Phương sai là bình phương của độ lệch chuẩn
Độ lệch mẫu Độ lệch nền Tín hiệu mẫu Tín hiệu nền
3.2. Độ đúng • Độ đúng: chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và giá trị qui chiếu được chấp nhận. • Do đó, thước đo độ đúng thường ký hiệu bằng độ chệch. • Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. • ISO: Độ chính xác = Độ chụm +
Độ đúng
Sai số tuyệt đối (EA)
Sai số tương đối ER
• Là sự sai khác giữa giá trị đo • Là tỷ số giữa sai số tuyệt đối và giá trị thật hay giá trị đã được (xi) với giá trị thật hay biết trước, được chấp nhận. giá trị qui chiếu được chấp nhận (kí hiệu là µ). EA = xi - µ • Sai số tuyệt đối có giá trị âm
ER =
xi − µ
µ
hay ER % =
EA
µ
. 100%
Theo phần nghìn EA ER =
µ
. 1000 (ppt)
hoặc dương, cùng thứ nguyên • Sai số tương đối cũng có giá trị âm hoặc dương và không với đại lượng đo và không có thứ nguyên, được dùng để biểu diễn độ chính xác của cho biết độ chính xác của phương pháp phân tích. phương pháp.
3.3. Độ nhạy (Sensitivity) và độ chọn lọc (selectivity) Độ nhạy của một thiết bị hay một phép
Assessment of method sensitivity 1200
đo là khả năng phân biệt được một sự Cách xác định: Hệ số góc m của đường chuẩn m = dy/dx
Signal
thay đổi nhỏ của nồng độ chất phân tích
1000 800 600
dy
400 200
dx
0 0
10
20
Concentration
30
Độ chọn lọc • Giả sử phân tích chất A trong mẫu phân tích, ngoài tín hiệu phân tích do chất A tạo ra còn có sự đóng góp của chất B, C…. Người ta gọi đây là những chất cản trở • Khi đó mức độ gây ảnh hưởng của B và C đến phép xác định A được biểu diễn qua hệ số chọn lọc kB,A = bB/bA ; kC,A = bC/bA Trong đó: b là hệ số độ nhay k là hệ sô chọn lọc
Độ chọn lọc (selectivity) Độ chọn lọc đặc trưng cho mức độ mà nó có thể phát hiện và xác định rõ ràng một chất phân tích nhất định trong một hỗn hợp mà không có sự ảnh hưởng từ các thành phần khác Độ chọn lọc cho biết ảnh hưởng của các chất gây cản trở chất phân tích Hệ số này càng nhỏ thì phép phân tích càng chọn lọc, độ chính xác càng cao
3.4. Giới hạn phát hiện và gới hạn định lượng (Limits of detection LOD and quantity LOQ) • Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể được phát hiện với mức độ tin cậy xác định. Giới hạn này phụ thuộc vào tỷ số giữa tín hiệu phân tích và mức độ thăng giáng tín hiệu của mẫu trắng Phân loại: Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) • Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể định lượng được với độ chụm và đúng chấp nhận được trong điều kiện tiến hành phân tích Phân loại: Giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) và giới hạn định lượng của phương pháp (MQL)
LOD, LOQ, LOQ, SNR (nhiễu) • Limit of Quantitation (LOQ) • Limit of Detection (LOD) • Signal to Noise Ratio (SNR) Peak A LOD
Nền
Nhiễu SNR
Peak B LOQ
Công thức tính LOD • Tín hiệu chất phân tích Sm Sm = So + k.SD • Nồng độ: Cm Cm = (Sm – So)/m • m là độ nhạy đường chuẩn • Thực tế: LOD = 3,3.SDo
Công thức tính LOQ • Khi biết độ lệch chuẩn của mẫu trắng SDo, nồng độ chất phân tích bằng không LOQ = 10.SDo • Nếu có dữ liệu LOD LOQ = 3.LOD
3.5. Khoảng tuyến tính và khoảng làm việc (linearity and working range) Khoảng tuyến tính (LOL): Là khoảng nồng độ của chất phân tích mà phương pháp phân tích cho kết quả phân tích tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích Khoảng làm việc (WR): Khoảng nồng độ của chất phân tích mà thiết bị cho tín hiệu đáp ứng tốt. Khoảng này bắt đầu ở nồng độ thấp nhất có thể định lượng được (LOQ) Tính toán độ tuyến tính và khoảng làm việc Phân tích các mẫu chuẩn đã biết nồng độ Tối thiểu phân tích tại 5 cấp nồng độ Vẽ đồ thị từ các kết quả thu được • Đánh giá độ tuyến tính (r2 > 0,99) • Xác định khoảng tuyến tính tương đối
4. Các loại sai số (error) • Khái niệm: Sai số là sự sai khác giữa các giá trị thực nghiệm thu được so với giá trị mong muốn. Tất cả các số liệu phân tích thu được từ thực nghiệm đều mắc sai số. Sai số phép đo dẫn đến độ không chắc chắn (độ không đảm bảo đo) của số liệu phân tích. • Phân loại: Sai số hệ thống Sai số ngẫu nhiên Sai số thô, sai số tích lũy…
Sai số hệ thống • Khái niệm: Là loại sai số do những nguyên nhân cố định gây ra, làm cho kết quả phân tích cao hơn giá trị thực (sai số hệ thống dương -positive bias) hoặc thấp hơn giá trị thật (sai số hệ thống âm–negative bias). • Phân loại: Sai số hệ thống không đổi Sai số hệ thống biến đổi ( sai số tỷ lệ)
Sai số hệ thống biến đổi
Sai số hệ thống không đổi
Khối lượng chất
Giá trị đúng
phân tích (mg)
Khối lượng mẫu (g)
Biểu diễn sai số hệ thống không đổi và biến đổi
Nguồn gốc sai số hệ thống Do dụng cụ phân tích Do phương pháp phân tích Do người phân tích Phát hiện và loại trừ sai số Phân tích mẫu chuẩn Phân tích độc lập Phân tích mẫu trắng Thay đổi lượng mẫu
Sai số ngẫu nhiên • Khái niệm: Là những sai số gây nên bởi những nguyên nhân không cố định, không biết trước. • Nguyên nhân: Khách quan: nhiệt độ tăng đột ngột, thay đổi khí quyển, đại lượng đo có độ chính xác giới hạn… Chủ quan: thao tác thí nghiệm không chuẩn xác (có thể gây ra giá trị bất thường); thành phần chất nghiên cứu không đồng nhất… • Do sai số ngẫu nhiên không thể biết trước được nên để loại trừ nó cần phải làm nhiều thí nghiệm và tiến hành xử lý thống kê số liệu phân tích
Sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên
Ý nghĩa Sai số ngẫu nhiên
Ý nghĩa Sai số hệ thống
Độ đúng và độ chụm
Inaccurate & Không đúng và imprecise không chụm
Inaccurate but
Chụm và precise không đúng
Accurate but Đúng và imprecise
không chụm
Đúng và chụm
Ví dụ: Kết quả đo mẫu amoxilin bằng HPLC thu được kết quả sau Tín hiệu nền So = 4 Độ lệch chuẩn đường nền SDo=12 Tại nồng độ 500ppb cho tín hiệu hấp thụ 2000 Xác định LOD, LOQ của chất phân tích biết k = 3 Tín hiệu chất phân tích: Sm Sm = So + k.SDo = 4 + 3(12) = 40 Nồng độ xác định được: LOD = [40/2000] x 500 ppb = 10 ppb LOQ = 3,3.LOD