Issuu

CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG

Mục tiêu học tập 1. Trình bày được sơ đồ của máy HPLC và vai trò của từng bộ phận. 2. Trình bày được nguyên tắc hoạt động của detector UV-VIS. 3. Phân biệt được các loại pha tĩnh trên nền silicagel thường dùng trong HPLC và đặc tính của chúng. 4. Phân biệt được sắc kí lỏng phân bố pha thuận và pha đảo. 5. Trình bày cách tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng. 2

SẮC KÍ LỎNG

SẮC KÍ CỘT

Sắc Kí cột cổ điển

Sắc Kí lỏng hiệu năng cao

SK MẶT PHẲNG:

Sắc Kí lớp mỏng

Sắc kí giấy

Thông số Chất nhồi cột

SK cột cổ điển

HPLC

Hoá chất tinh chế 150-200 µm Vài cm- m Do cột nước

Chất nhồi đăc biệt cho cột HPLC Kích thước hạt 5-10 µm Chiều dài cột 10- 30 cm áp suất Bơm cao áp (tới 600 bar ) Lượng chất dùng mgLiquid Chromatography µg - HPLC: High Presure Thời gian PT > VàI giờ Ngắn, vàI phút - Sắc kí lỏng cao áp. Đời sống cột Bỏ sau PT Dùng nhiều lần HPLC: High Performance Liquid Chromatography Detector Không Nhiều loại, nhạy

Sắc kí lỏng hiệu năng cao.

1.1. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Bình đựng dm

Cột sắc kí Hệ thống tiêm mẫu

Bơm

Thải

1.1 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

1.1.1. Hệ thống cấp pha động: • Pha động thường được chứa trong bình thuỷ tinh • Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai dung môi hoà tan vào nhau. • Trước khi sử dụng, cần lọc qua màng lọc 0,45µ µm dưới áp suất giảm. • Đuổi khí hoà tan trong pha động bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ như heli... 7

1.1.1. Hệ thống cấp pha động: Bình thuỷ tinh chứa hỗn hợp 2-3 dung môi

Loại bỏ bọt khí: - Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Chạy siêu âm, sục khí trơ như heli... 8

* Chương trình đẳng dòng (Isocratic):

Pha động th thư ường được được trộn sẵn và đựng trong 1 bình. bình.

* Ch Chươ ương ng trình dung môi (Gradient):

Thay đổi tỷ lệ thành phần MP nhờ bộ trộn. Hỗn hợp MP mỗi dung môi đựng trong một bình khác nhau.

Thay đổi tốc độ dòng pha động nhờ bơm 10

Chương trình dung môi (Gradient): - Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi môi,, th thư ường là 2 ÷ 4 loại được được đựng trong các bình khác nhau nhau.. - Tỷ lệ các thành phần thay đổi theo ch chươ ương ng trình đã định nhờ bộ trộn trộn.. - Tốc độ dòng pha động có thể thay đổi theo áp suất của bơm. 11

Chương trình dung môi áp suất thấp Dung môi 1

Van 1

Bộ phận hoà trộn

Dung môi 2 Dung môi 3

Bơm

Van tiêm mẫu

Van 3

• Ba dung môi đựng trong ba bình riêng. • Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hoà trộn. • Sau đó, dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu. ưu điểm: chỉ dùng một bơm Nhược điểm: dùng hệ thống ba van lấy ba dung môi 12 phức tạp và chi phí cũng cao.

Chương trình dung môi áp suất cao: Dung môi 1

Bơm 1

Dung môi 2

Bơm 2

Dung môi 3

Bơm 3

Bộ phận hoà trộn

Van tiêm mẫu

Điểm kh¸c chñ yÕu lµ mçi dung m«i cã mét b¬m riªng, viÖc hoµ trén ®−îc thùc hiÖn ë ¸p suÊt cao. ¦u ®iÓm: cã ®é ®óng vµ ®é lÆp l¹i cao h¬n. Nh−îc ®iÓm: Ch−¬ng trinh nµy cã tèn kÐm vµ cång kÒnh h¬n lo¹i hoµ trén ë ¸p suÊt thÊp. 13

1.1.2. Hệ thống bơm: - Bơm cao áp là bộ phận để đẩy pha động từ bình chứa dung môi đi qua cột bằng áp suất cao (250-500 at). - Có thể chịu được áp suất cao và không bị dung môi ăn mòn.

1.1.2. Hệ thống bơm: • Với cột có đường kính trong bé khoảng 2,1 mm, chiều dài cột khoảng 30 mm và kích cỡ hạt nhồi 1,7 µm. • Máy sắc ký lỏng hiện đại (Ultra Performance Liquid Chromatography) có cấu hình hoàn thiện hơn: - Bơm tạo được áp suất cao có thể đến 700 bar. - Tạo lưu lượng dòng dao động từ 2 - 3 µl/phút đến 20 mL/phút. 15

1.1.3. Hệ tiêm mẫu:

Dung dịch mẫu phân tích được tiêm thẳng vào pha động bằng một xilanh qua van tiêm có vòng chứa mẫu.

Sample

loop có

dung tích khác nhau: 0,50 ÷ 20 µL. 16

Nguyên lí hoạt động của van tiêm mẫu

Tiêm mẫu Lọ thải 17

Autosampler

Auto sampler chứa nhiều mẫu và tiêm lần lượt các mẫu vào hệ thống sắc kí theo chương trinh đã chọn. 19

1.1.4. Cột và pha tĩnh:

Cột được chế tạo bằng thép không gỉ tr trơ ơ với hoá chất và chịu được được áp suất cao. cao. 20

1.1.4. Cột và pha tĩnh: ChiÒu dµi Đ-ường cét kÝnh trong cét 1980’s 15-30 cm 4- 10 mm

Cì h¹t nhåi

Lo¹i SK

5-10 µm

HPLC

1990’s

9-10 cm

2,1-4 mm

3,5 µm

HPLC

> 2004

3-7,5 cm

1-2 mm

1,7 µm

UPLC

1.1.4. Cột và pha tĩnh: • Cột nhồi: Cột có chiều dài thường có hạt cỡ 5 hoặc 10 µm. Số đĩa lý thuyết dao động 40000 đến 60000/m. 1990’s có loại cột nhỏ (microcolumn) với đường kính trong 1 - 2 mm, dài 3 ÷ 7,5 cm. Loại cột này được nhồi hạt cỡ 3,5 µm. Có trị số N đến 100 000 đĩa/m. ưu điểm nổi bật của chúng là chạy sắc ký tốn ít dung môi và ít thời gian.

1.1.4. Cột và pha tĩnh:

Trong cột nhồi pha tĩnh: Pha tĩnh trên nền Nhôm oxyd Pha tĩnh trên nền cao phân tử (Polystyren, Cellulo) Pha tĩnh trên nền mạch carbon

Pha tĩnh trên nền Silicagel.

1.1.4. Cột và pha tĩnh: CÁC THÔNG SỐ CỘT Đường kính trong

Kích thước lỗ xốp Bản chất pha tĩnh

Kích thước hạt nhồi

Chiều dài cột 24

- Hình dạng tiểu phân (Particle shape)

Hạt hình cầu (Spherical)

Hạt không đều (Irregular) 25

Kích thước tiểu phân (Particle size): B B 2 H=A+ +C.U=A. ( dp ) + +C.(dp) .U U U L=30cm 10 dp=10 µm

L=15cm dp=5 µm L= 9cm dp= 3,5 µm 26

Kích thước tiểu phân (Particle size):

Độ xốp tiểu phân (Porosity particle) Hạt silicagel không có lỗ xốp (Non-porous) thì S bề mặt tiếp xúc nhỏ, nên N thấp (Hiệu lực cột thấp).

Để tăng hiệu lực cột, người ta chế tạo ra hạt silicagel có lỗ xốp (Porous).

Độ xốp tiểu phân (Porosity particle)

Độ xốp tiểu phân và kích thước lỗ xốp • Diện tích bề mặt bên trong của các lỗ xốp gấp 1000 lần diện tích bề mặt bên ngoài hạt silicagel.

- Kích thước lỗ xốp (Pore size) thường khoảng 10 nm (150A0). 30

1.1.4. Cột bảo vệ Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, nhồi hạt cùng loại và kích thước hạt lớn hơn.

- Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các tạp chất có mặt trong pha động. 31

1.1.4. Cột và pha tĩnh: • Điều nhiệt cột: - Trong sắc ký lỏng vận hành thiết bị thường ở nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột. - Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại thường được trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể đến 150oC.

Detector UVUV-VIS

Detector khối phổ

Detector huỳnh quang

DETECTOR

Detector đo chỉ số khúc xạ

Detector tán xạ bay hơi 33

Detector UV-VIS * Nguyên tắc hoạt động: - Detector loại này thực chất là một máy đo quang phổ UV-VIS. - Dựa vào khả năng hấp thụ quang của chất PT tại bước sóng đã chọn để định tính va định lượng chất phân tích.

Detector UV-VIS Buồng đo là cuvet động (flowcell: ống hình trụ 2R= 1mm, d= 10 mm).

Dung dịch đo là pha động chảy liên tục qua buồng chứa mẫu.

1. Detector có bư bước sóng cố định - Nguồn sáng: Đèn thuỷ ngân áp suất thấp. Chỉ sử dụng duy nhất 1 bước sóng đã được lựa chọn (thường 254, 280, 334, 436 nm)

1. Detector có bư bước sóng cố định - Hạn chế: Đối với các chất PT không hấp thụ quang tại bước sóng này thì không phát hiện được . Đối với các chất hấp thụ quang yếu tại các bước sóng này thì giới hạn phát hiện sẽ lớn.

UV-VIS DETECTOR

2. Detector đo ở bước sóng thay đổi - Nguồn sáng: Đèn D2- Deuterium (vùng UV: 190-360 nm) Đèn Wolfram (vùng VIS: 360-800 nm) - Ưu điểm: Có thể đo ở bất kỳ bước sóng nào trong vùng UV-VIS (190 - 800 nm)

VARIABLE WAVELENGTH DETECTOR

Sơ đồ detector đo ở bước sóng thay đổi.

3. DAD - (Diod Array Detector) Mảng Diod

Cách tử kẻ vạch bằng lase

Nguồn sáng Buồng đo

Mật độ quang Mật độ quang

Thời gian Mật độ quang

Thời gian

X,Y= Sắc kí đồ Z,Y= Quang phổ

Bước sóng

ỨNG DỤNG DAD TRONG ĐỊNH TÍNH

- Có thể chồng phổ chất thử với chất chuẩn để định tính được được ngay chất PT theo th thư ư viện phổ phổ.. 45

ỨNG DỤNG DAD TRONG ĐỊNH LƯỢNG

• Loại này có thể đo nhiều bước sóng cùng lúc • Chọn bước sóng phù hợp cho từng chất PT trong 46 hỗn hợp mẫu.

ỨNG DỤNG DAD TRONG ĐỊNH LƯỢNG

* Giới hạn phát hiện nhỏ cho cả 2 chất phân tích tích.. * Phù hợp để PT hỗn hợp ở nồng độ thấp. thấp.

1.1.6. Bộ phận ghi và sử lí số liệu • Máy ghi (Recorder) • Máy tích phân (Intergrator) • Máy tính với phần mềm điêù khiển (Computer)

Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là một kỹ thuật tách các chất phân tích ra

khỏi nhau khi chúng di chuyển theo pha động qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Chất PT F1 Pha tĩnh

F2 Pha động 49

Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu năng cao B B A BAB B B B B A BA A AA A A

A B A B BA B B BBABB A B B AA A B AA AB B A A B

Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu năng cao A A A B BB B B BB B B BB B B BB B B BB B B BB B B BB B B BB B B BB B B BB B

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A

1.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hâp Phụ (L (L--SC)

Phân bố (L (L--LC) Rây phân tử

Trao đổi ion ÁI LỰC

Sắc ký là quá trình hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt chất rắn. Pha tĩnh là chất rắn phân cực.

Silicagel tráş§n (silica)

1.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao Phân bố (L (L--LC) - Sắc kí lỏng-lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt mang rắn.

- Sắc kí pha liên kết: Các hạt chất nhồi rắn được gắn kết với các nhóm hoá học có khả năng

liên kết với chất phân tích.

Silicagel biến tính

Nhóm Silanol

CH3 H3C CH3 HCl Si O Si R Cl Si R CH3 H3C CH3 DC Clorosilan

DC Siloxan

Đặc tính của Silicagel biến tính 1. Thường chỉ 50% nhóm Si-OH phản ứng với hợp chất Clorosilan còn 50% nhóm -OH vẫn còn trên bề mặt hạt silicagel. - Nếu chạy SK phân bố pha đảo: Các nhóm silanol Si-OH (mang tính phân cực) sẽ lưu giữ các chất phân cực gây hiện tượng kéo đuôi.

Đặc tính của Silicagel biến tính - Để hạn chế ảnh hưởng của nhóm -OH → Khoá

các nhóm này bằng cách: CH3 Si-OH + Cl-Si-CH3 CH3

CH3 Si-O-Si-CH3 CH3

CH3 Si-O-Si-(CH2)17-CH3 CH3

Bề mặt silica của cột Ended-Capping

Đặc tính của Silicagel biến tính 2. Silicagel pha liên kết chỉ bền trong vùng pH = 2-8. Nên pha động chỉ pha trong vùng pH này. Nền Silica sẽ bị thuỷ phân

Silicagel 2

Liên kết Si-R dễ bị thuỷ phân thành Si-OH

* Cơ chế tác động của SK phân bố F2

* Pha tĩnh phân cực -(CH2)2-NH2

Amino

-(CH2)2-CN

Cyano

- (CH2)2-O-CH(OH)-CH2OH

Diol

* Pha tĩnh không phân cực -(CH2)17-CH3

ODS (C18) Octadecyl siloxan

-(CH2)7-CH3

OS (C8) Octa siloxan

- C 6 H5

(C6H5) Phenyl siloxan 61

2. Pha động: TT

Dung môi không PC

Dung môi PC trung bình

Dung môi PC mạnh

Tªn dung m«i

Dé ph©n cùc (P')*

1 n-hexan

0,1

2 Benzen

2,7

3 Metylen clorid

3,1

4 n-propanol

4,0

5 Tetrahydrofuran

4,0

Ethyl acetat 7 Cloroform 8 Aceton

4,4

9 Ethanol

4,3

4,1 5,1

10 Acid acetic

6,0

11 Acetonitril

5,8

12 Methanol

5,1

13 N-ước

10,2

Độ phân cực của hỗn hợp dung môi P’AB= TA.P’A + TB.P’B • Độ phân cực của hỗn hợp Nước:Methanol = 60:40. P’AB=(0.60).(10,2) + (0,40). (5,1) = 8,2 • Độ phân cực của hỗn hợp Nước:Methanol = 40:60. P’AB=(0.40).(10,2) + (0,60). (5,1)=7,1 63

3. Chất phân tích Độ phân cực của chất phân tích: • Dựa vào khung hoá học: - Khung carbon càng dài, càng cồng kềnh càng kém phân cực. - Hydrocarbon mạch thẳng kém phân cực hơn hydrocarbon thơm. • Dựa vào nhóm chức. - Độ phân cực của nhóm chức hữu cơ tăng dần theo thứ tự: - Dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester aldehyd ceton < alcol ≈ amin < sulfon < sulfoxid < amid < acid carbonxylic < nước. 64

3. Chất phân tích 3.1. Chất Phân cực: Độ phân cực của chất phân tích phụ thuộc vào: trọng lượng phân tử (mạch C) và các nhóm chức.

• Dựa vào mạch Carbon: - Mạch carbon càng dài, càng kồng kềnh thì độ phân cực càng giảm. - Hydrocarbon mạch thẳng kém phân cực hơn hydrocarbon thơm. 65

3. Chất phân tích 3.1. Chất Phân cực: • Dựa vào nhóm chức. Các nhóm chức có nguyên tử mang điện âm: O, N, S, F, Cl… như: -OH, -CO, -NO2, -NH2, -COOH… là các nhóm phân cực. Chất PT chứa càng nhiều nhóm PC thì PC càng mạnh. Các chất phân cực thường tan trong nước và các dung môi phân cực. 66

3. Chất phân tích 3.2. Chất không phân cực: - Chất không Phân cực là: Các chất HC không chứa các nhóm phân cực hoặc 1 nhóm PC yếu. - Chất không PC đều tan trong ete và các dung môI không PC. - Ngược lại, không tan trong nước và các dung môI PC.

3. Chất phân tích 3.3. Chất phân cực trung bình: - Chất PC trung bình là chất không ion hóa, có số mạch C <5, có 1 nhóm PC nhưng không phảI là nhóm PC mạnh. - Chất PC trung bình là chất vừa tan trong nước vừa tan trong ete.

4. Nguyên tắc chọn pha tĩnh và pha động? -

Nếu có hỗn hợp chất phân tích:

1. Dự đoán độ phân cực của từng chất trong hỗn hợp dựa vào cấu trúc hoá học. 2. Chọn pha tĩnh có độ phân cực gần với độ phân cực của các chất phân tích. 3.

Chọn pha động có độ phân cực khác xa với độ phân cực pha tĩnh. 69

5. Sắc ký pha thuận và pha đảo: • Pha tĩnh lỏng phân cực: Triethylen glycol, nước. • Pha động là dung môi ít phân cực hơn: hexan, iso propyl ether. Sắc ký pha thuận (normal-phase chromatography). • Pha tĩnh không phân cực nh như ư hydrocarbon hydrocarbon.. • Pha động phân cực hơn pha tĩnh: tĩnh: nước ớc,, acetonitril. acetonitril. • Loại sắc ký này với độ phân cực của pha tĩnh và pha động ng ngư ược với sắc ký pha thuận. thuận. Sắc ký pha đảo (reversed (reversed--phase chromatography). chromatography) . 70

Chất phân tích Phân cực cực? ? • Chọn pha tĩnh? Phân cực: R là diol, amino, cyano.

• Chọn pha động? Không phân cực: n-hexan, Metylen clorid, CHCl3…..

Sắc kí phân bố pha thuận 71

• Muốn thời gian lưu giảm tă tăng độ phân cực của pha động ộng..

Chất không phân cực

Chất ít phân cực

Chất phân cực 72

Chất phân tích không phân cực? cực? • Chọn pha tĩnh? Không phân cực: R là C2, C4, C8, C18, phenyl….

• Chọn pha động? Phân cực: Acetonitril, Methanol, Nước…

Sắc kí phân bố pha đảo 73

• Muốn thời gian lưu giảm giảm độ phân cực của pha động ộng..

Chất phân cực

Chất ít phân cực

Chất không phân cực 74

Tại sao thường sử dụng SK pha đảo? 1. Thuốc muốn được hấp thu thừơng phải đi qua màng sinh học. Màng này có lớp lipid kép nên đa phần thuốc thường dạng thân lipid (không phân cực) dễ hấp thu. 2. Dung môi phân cực rẻ hơn và ít gây độc hơn dung môi không phân cực. 75

Hạn chế của SK pha đảo? • Không phân tích được các chất rất phân cực. • Hỗn hợp nhiều thành phần có cả chất phân tích phân cực và không phân cực. • Phải chạy cả SK phân bố pha thuận và pha đảo

• Tìm cách phân tích được chất rất phân cực bằng SK phân bố pha đảo ??? 76

Khi phân tích các acid HC có pka=4-5. + pH<pka-2: HA + pH>pka+2: A Nên chạy SK trong môi trường: 2<pH<pka-2 để hạt silicagel không bị phân huỷ.

Khi phân tích các base HC có pka=8-10. + pH<pka-2: BH+ + pH>pka+2: B - Nên chạy SK trong môi trường: + pH>pka+2: Để base HC tồn tại dạng phân tử (B) thì hạt silicagel bị phân huỷ. Phải dùng cột polymer (polystyren)

+ Nếu muốn chạy SK trong môi tr trư ường 2<pH<pka<pH<pka-2, để pha tĩnh ổn định thì base tồn tại dạng BH+

SK phân bố pha đảo tạo cặp ion: Thêm một đối ion vào trong pha động: như Natri Laurylsulfat (LS-Na+), Natri heptansulfonat. Các anion này (LS-) chiếm vào liên kết Si-OR làm cho bề mặt pha liên kết thành trao đổi ion. Khi BH+ đi vào cột tạo cặp ion BH+LS- sẽ bị lưu giữ trên cột và được rửa giải khỏi cột theo nguyên tắc SK phân bố pha đảo.

SK phân bố pha đảo tạo cặp ion: Nếu tách cation? Thêm một anion vào trong pha động: như Natri Laurylsulfat (LS-Na+), Natri heptansulfonat… LS-Na+ Na+ Silicagel

Na+ Na+

BH+ X-

BH+ Na+

X-

BH+ Na+ 80 X-

SK phân bố pha đảo tạo cặp ion: Khi BH+ đi vào cột tạo cặp ion BH+LS- (chất không phân cực). Sẽ bị lưu giữ trên cột và rửa giải theo nguyên tắc SK phân bố pha đảo.

Giải thích tại sao khi định lượng B1, B2, B6 thường cho Natri Heptansulfonat vào trong pha động?

SK phân bố pha đảo tạo cặp ion: • Nếu tách các anion? • Đưa một thuốc thử tạo là cation vào pha động. • Như: Muối amoni bậc bốn Tetrabutylammonium (R4N+X-)

VD: Hãy dự đoán thứ tự rửa giải của hỗn hợp 4 chất sau trong ĐK SK phân bố pha đảo.

Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao Hâp Phụ (LSC)

Phân bố (LLC)

Trao đổi ion

Rây phân tử

ÁI LỰ C

Sắc ký là quá trình hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt chất rắn. Pha tĩnh là chất rắn phân cực.

1.2.2. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao: * Cơ chế tác động của SK hấp phụ Chất phân tích tranh chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh. Lưu giữ chất phân tích là do lực hấp phụ. 87

1. Pha tĩnh a. Silicagel: - Silicagel trần (Silica) là chất hấp phụ thân nước. - Khả năng hấp phụ của nó là do các nhóm hydroxyl (–OH) trên bề mặt quyết định. - ổn định trong vùng pH hẹp:2-8

1. Pha tĩnh b. Nhôm oxid (Aluminas): - Nhôm oxid ổn định trong vùng pH=2-12. - Aluminas có các dạng khác nhau: + Dạng base với giá trị pH là 9,0-10,0 dùng tách các chất có tính base như: amin, acid amin. + Dạng acid với pH=4,0-4,5 dùng tách các hợp chất có đặc tính acid. + Dạng trung tính với pH=7,0-8,0 dùng tách các hợp chất hydrocarbon no, aldehyd, ceton... 89

2. Pha động: Để rửa giải các chất đã bị hấp phụ, người ta dùng pha động có sức rửa giải phù hợp dựa vào hằng số điện môi εo. Trị số εo càng lớn, sức rửa giải càng mạnh. Nếu pha động gồm nhiều dung môi, dựa vào phân số mol của từng dung môi để tính trị số εo của hệ. 90

Phân bố

Hấp phụ

Phân bố pha đảo

Phân bố pha thuận

Trao đổi ion

Chât không PC Chất không tan/nước

Ion Chất tan/nước

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Pha tĩnh-Pha đảo

Pha tĩnh bình thường của LC

(Stationary Phases for Reversed-Phase LC)

(Stationary Phases for Normal LC)

Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) hoặc C18 (n-octyldecyl). Pha động là H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol). Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian chạy mẫu

Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene… Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ảnh hưởng của bản chất pha tĩnh đến chất lượng tách

Pha đảo

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Sơ đồ nguyên lý của HPLC

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các yêu cầu đối với dung môi Áp suất bơm: vài trăm atm (∼6000psi), lưu lượng 0,1 – 10 ml.min-1 với E<0,5% Vật liệu bơm bền ăn mòn đối với nhiều loại dung môi khác nhau Chế độ bơm piston Cỡ hạt trong cột sắc ký: 3 - 10µm Một hoặc nhiều bình chứa dung môi (500 ml) Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger) Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hiệu quả tách bằng phương pháp gradient elution Quá trình tách rửa (Elution) Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi: isocratic Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực (polarity) khác nhau nhiều: gradient elution Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc theo từng bậc Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve seperation efficiency)

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC Polar Solvents Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile Non-polar Solvents N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane

Lựa chọn pha động và pha tĩnh Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha tĩnh là tương đương còn pha động có độ phân cực sai biệt Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: thương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích và pha tĩnh ⇒ thời gian phân tích kéo dài

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection Systems) Sử dụng valve 6 cổng Nạp mẫu qua vòng lấy mẫu (sampling loops) ⇒ Sắc ký lỏng hiện đại Có thể thay thể sampling loops từ 5 µl đến 500 µl Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Cột sắc ký HPLC Thông thường: L = 10 – 30 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn ID = 4 – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 5 và 10µ µm 40.000 – 60.000 đĩa/m cột Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn L = 3 - 7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn ID = 1 – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 µm 100.000 đĩa/m cột Cột bảo vệ (Guard Column) Được lắp đặt trước cột phân tách để kéo dài tuổi thọ của cột Thành phần = thành phần của cột phân tách nhưng cỡ hạt lớn hơn để giảm tổn thất áp suất

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ổn định nhiệt độ của cột (Column Thermostats)

Phần lớn ứng dụng cua HPLC được thực hiện ở nhiệt độ phòng Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C) Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số < 0,05°C Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Đầu dò (Detector) dùng cho HPLC Không nhạy và có khả năng phân tích đa dạng như detector của GC Thường gặp nhất là Detector UV-Vis

LOC: Limit Of Detection

Mass LOD = concentration (mol/L) x inj. vol. (L) x FW (g/mol)

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) UV-Vis and Fluorescence Detector

Electrochemical Detector

λ = 200200-400nm λ sử dụng 254 nm

Amperometric detection = fixed potential and measure the current response.

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Refractive Index Detector

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC Tăng chiều dài của cột (Increase column length) Giảm đường kính của cột (Decrease column diameter) Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate) Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất (Uniform stationary phase (packing)) Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size) Lựa chọn pha tĩnh sạch hơn (Select proper stationary phase) Lựa chon pha động tinh khiết hơn (Select proper mobile phase) Sử dụng áp suất ổn định hơn (Use proper pressure) Thành phần của pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution)

So sánh HPLC và GC (Comparison of HPLC and GLC) Các đặc điểm chung: Hiệu quả, độ chọn lọc cao, ứng dụng rộng rãi Thể tich mẫu nhỏ Có thể không phá hủy mẫu (nondestructive of sample) Định lượng dễ dàng Ưu điểm của HPLC Áp dụng được với các mẫu không bay hơi và không bền nhiệt Áp dụng được cho các ion vô cơ

Ưu điểm của GC Thiết bị đơn giản và rẻ Nhanh chóng Dễ dàng kết nối với phổ khối