Các phương pháp phân tích polyphenols trong nước ép trái cây, trong bia và rượu

ĐẠI HỌC C BÁCH KHOA TP H HỒ CHÍ MINH KHOA K KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂ ỂU LUẬN MÔN HỌC CÁC PHƯƠNG ƯƠNG NG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG C CỤ

ĐỀ TÀI: Các phương ương ng pháp phân tích polyphenols trong nướcc ép trái cây, trong bia và rượu rrư GVHD: TS. HUỲNH KHÁNH DUY Họọc viên thực hiện: Lê Hà Việt Luân

MSHV 13053072

Thành ph phố Hồ Chí Minh, 12/ 2013

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

MỤC LỤC 1. Tổng quan ........................................................................................................................ 3 2. Cấu trúc của các polyphenol chính trong quả nho và rượu vang .................................... 4 3. Chiết tách phenolics từ quả nho ...................................................................................... 8 3.1. Phương pháp chiết lỏng-rắn ...................................................................................... 8 3.2. Tinh chế dịch chiết .................................................................................................. 10

uy N hơ n

4 . Phân tích thành phần rượu vang và chiết xuất.............................................................. 11 4.1. Xác định tổng lượng hợp chất phenolics ................................................................ 11 4.2. Chiết tách và phân tích các hợp chất phenolics (kỹ thuật sắc ký) .......................... 17

èm

Q

4.2.3. Phân tích, xác định các hợp chất phenolic ........................................................... 20

ạy K

5. Kỹ thuật tách mới .......................................................................................................... 26 6. Kỹ thuật để Thiết lập cấu trúc Tannin (Xác định mức độ trùng hợp) ........................... 28

G

oo gl

e.

co

m /+

D

7. Kết luận.......................................................................................................................... 30

Lê Hà Việt Luân

Trang 2

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

1. Tổng quan Các hợp chất phenolic là những chất chuyển hóa trung gian phổ biến nhất trong giới thực vật. Các hợp chất này có cấu trúc chung bao gồm một vòng benzen thơm với một hoặc nhiều nhóm thế hydroxyl. Cấu trúc này đại diện cho một nhóm lớn và đa dạng của các phân tử khác nhau được chia làm hai họ chính: flavonoids dựa trên cấu trúc C6C3-C6 trên bộ khung carbon và nhóm non-flavonoids. Trong cơ thể thực vật, phenolics đóng một vai trò trong sự phát triển, sinh sản và trong các phản ứng phòng vệ khác nhau của thực vật nhằm bảo vệ chống lại các tác động bên ngoài như tia UV hoặc đe dọa sinh

uy N hơ n

học như động vật ăn thịt và các tác nhân gây bệnh tấn công. Chúng cũng cấu thành các thành phần cơ bản của các hợp chất sắc tố, tinh chất và hương vị trong thực vật.

Q

Đa số các hợp chất phenolic (như resveratrol , quercetin , rutin , catechin ,

èm

proanthocyanidins) đã được công bố có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm cả khả năng

ạy K

bảo vệ tim mạch , chống viêm , chống ung thư , kháng virus và kháng khuẩn do các hợp

D

chất này chủ yếu đóng vai trò là chất chống oxy hóa và ức chế sự hoạt hóa của gốc tự do.

m /+

Các hợp chất phenolic đóng vai trò rất quan trọng cho chất lượng của sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ cây trồng nhờ vào đặc tính của chúng giúp cho sự ổn định

co

của sản phẩm không bị oxy hóa và tạo nên các đặc tính cảm quan. Thật vậy, tính chất

oo gl

e.

cảm quan rượu chủ yếu liên quan đến các hợp chất phenolic được chiết xuất từ nho trong quá trình sản xuất rượu vang . Trong số các hợp chất thuộc nhóm phenolics, flavonoid,

G

bao gồm anthocyanins và flavan-3-ols, đóng góp quan trọng nhất cho chất lượng của rượu. Anthocyanins là các hợp chất sắc tố tạo nền màu đặc trưng của rượu vang đỏ và các chất này chủ yếu nằm trong vỏ quả nho. Flavan -3- ols tồn tại không chỉ ở dạng đơn phân tử mà còn ở dạng đa và cao phân tử, được gọi là tannin hoặc proanthocyanidins. Tannin là các hợp chất có nguồn gốc từ quả nho đóng vai trò quan trọng đối với chất lượng rượu vang đỏ do đặc tính làm se, tạo vị cay, đắng và vai trò của chúng trong sự ổn định màu sắc lâu dài của sản phẩm. Cảm giác se và vị đắng là hai đặc điểm chính của nho và là yếu tố cảm quan xác định chất lượng tốt của sản phẩm rượu. Se là một cảm giác xúc giác, trong khi cay, đắng là một cảm giác vị giác. Kích thước phân tử của các Lê Hà Việt Luân

Trang 3

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

proanthocyanidins ảnh hưởng đến tính cay, đắng tương đối của chúng và mức độ se. Nhìn chung, hợp chất đơn phân tử tạo cảm giác cay, đắng nhiều hơn là cảm giác làm se, trong khi tính chất đó ngược lại đối với trường hợp của các chất dẫn xuất khối lượng phân tử lớn. Đối với các hợp chất tanin của hạt nho, giảm mức độ galloylation làm giảm cảm giác se.

Việc định danh và định lượng các thành phần cũng như nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến thành phần của các chất có hoạt tính sinh học bằng cách sử dụng các phương

uy N hơ n

pháp phân tích có độ nhạy cao và độ chính xác đáng tin cậy đang được ưu tiên phát triển hàng đầu. Một số cấu trúc chung của các hợp chất phenolics (catechin, proanthocyanidin, anthocyanin, ...) đã được xác định và định lượng trong rượu vang nhưng những hợp chất khác như phenol khối lượng phân tử cao hoặc các hợp chất mới được hình thành trong

èm

Q

quá trình lão hóa rượu vang vẫn còn đang được nghiên cứu. Nhiều phương pháp khác

ạy K

nhau đã được cải thiện qua thời gian. Nhìn chung, các phương pháp cho phép xác định một chỉ số tổng (ví dụ , "tổng số polyphenol") chủ yếu được thực hiện bằng cách phân

D

tích quang phổ, sau đó tiếp tục thực hiện các phép phân tích chi tiết hơn dựa trên phương

m /+

pháp phân tách từng hợp chất polyphenolic khác nhau được thực hiện bằng sắc ký lỏng

co

hiệu năng cao hoặc điện di mao quản và các cấu trúc này được xác định bởi máy dò khác

oo gl

e.

nhau, UV -vis và phổ khối lượng.

2. Cấu trúc của các polyphenol chính trong quả nho và rượu vang

G

Thành phần các hợp chất phenolics trong rượu vang phụ thuộc vào nguồn gốc loại nho được sử dụng và quy trình sản xuất rượu. Cấu trúc của các hợp chất phenolics bao gồm các vòng thơm đơn giản với trọng lượng phân tử thấp đến các tannin trọng lượng phân tử cao với cấu trúc phức tạp. Hai nhóm các hợp chất phenolic được chia làm hai họ chính: flavonoids dựa trên cấu trúc C6-C3-C6 trên bộ khung carbon và nhóm nonflavonoids.

Trong số các chất non-flavonoids, hợp chất chính là axit phenolic (axit hydroxybenzoic), axit hydroxycinnamic và stilbens. Axit hydroxybenzoic có cấu trúc C6Lê Hà Việt Luân

Trang 4

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

C1, bao gồm một vòng benzen với một nhóm thế -COOH trên vòng. Các dẫn chất acid khác được phân biệt bởi các nhóm thế R1-R4 lần lượt trên vòng benzen tương ứng của chúng. Vanillic, syringic và gallic acids là các hợp chất chính từ cấu trúc cơ bản này (cấu trúc của chúng được minh họa trong hình 1). Một số axit hydroxycinnamic (C6-C3) có mặt trong nho và rượu vang . Chúng được xác định tồn tại ở dạng tự do với lượng nhỏ, chủ yếu là tồn tại ở dạng ester hóa, đặc biệt là với axit tartaric. Các hợp chất này cũng có thể tồn tại ở dạng ester glycosides đơn giản của glucose. Một họ polyphenol cấu trúc phức tạp hơn cũng có mặt trong nho, gỗ sồi và rượu đó là Stilbenes, các phân tử này có

uy N hơ n

hai vòng benzen, được liên kết bởi phân tử ethane, hoặc có thể là chuỗi ethylene. Trong số các hợp chất đồng phân dạng trans, resveratrol, hoặc 3,5,4 - trihydroxystilben (Hình 1),

G

oo gl

e.

co

m /+

D

ạy K

èm

Q

được cho là được sản xuất bởi dây nho như một phản ứng tự nhiên khi cây bị nhiễm nấm.

Lê Hà Việt Luân

Trang 5

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

co

m /+

D

ạy K

èm

Q

uy N hơ n

Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

e.

Hình 1 - Cấu trúc của một số phenolics đơn phân tử quan trọng trong nho và rượu vang

oo gl

Flavonoids, các thành phần phenolics chính trong nho và các loại rượu vang, có

G

một cấu trúc khung carbon chung, bao gồm ba vòng (A, B, C). Họ phenolics này được phân chia thành các phân nhóm thứ cấp khác nhau bao gồm, flavones , flavonols , flavanones , flavanols và anthocyanins phân biệt trong cấu trúc bởi độ chưa bão hòa của vòng carbon và các nhóm thế khác nhau tương ứng (Hình 1).

Anthocyanins là hợp chất đặc trưng phân bố ở vỏ của các loại nho có sắc đỏ. Cấu trúc của chúng là phân tử flavylium cation, bao gồm hai vòng benzen được liên kết bởi một dị vòng có oxy chưa bão hòa ở dạng cationic, dẫn xuất từ phân tử 2-phenylbenzopyrylium (Hình 1) . Chúng là các dẫn xuất glucosylate hóa của năm aglycones hoặc anthocyanidins bao gồm: cyanidin , peonidin , petunidin , delphinidin và malvidin.

Lê Hà Việt Luân

Trang 6

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Flavan-3-ols hình thành các phân nhóm flavonoid thứ cấp có cấu trúc phức tạp hơn (Hình 1). Các hợp chất này bao gồm đơn phân tử đơn giản như (+)-catechin và (-)-epicatechin

nhưng cũng có thể ở dạng đa phân tử hoặc các polymer cao phân tử gọi là proanthocyanidins vì chúng bị phân hủy giải phóng anthocyanidins khi bị nung nóng trong dung dịch có tính axit (Hình 2). Cấu trúc của các proanthocyanin khác nhau về bản chất của các tiểu phân cấu tạo của chúng, và mức độ trùng hợp ( mDP ) trung bình và vị

co

m /+

D

ạy K

èm

Q

uy N hơ n

trí liên kết.

oo gl

e.

Hình 2 - Cấu trúc của proanthocyanidins: flavan-3-ol được liên kết tại vị trí C4-C8 / C4-C6

Các hợp chất này phân bố trong tất cả các phần của quả nho nhưng phần vỏ có

G

chứa một lượng proanthocyanidins thấp hơn trong hạt và đặc điểm cấu trúc của chúng cũng khác nhau. Proanthocyanidins trong hạt nho chỉ bao gồm procyanidin (tiểu phân được cấu thành từ (+)-catechin (C) và (-)-epicatechin (EC)), trong khi proanthocyanidins ở phần vỏ nho bao gồm cả prodelphinidins và procyanidinsand [tiểu phân cấu thành từ ()-epigallocatechin (EGC)]. Proanthocyanidins ở phần vỏ quả nho có mDP cao hơn và có tỷ lệ của tiểu phân galloylated thấp hơn ở trong hạt. Tannin là các hợp chất có nguồn gốc từ quả nho đóng vai trò quan trọng đối với chất lượng rượu vang đỏ do đặc tính làm se, tạo vị cay, đắng và vai trò của chúng trong sự ổn định màu sắc lâu dài của sản phẩm.

Lê Hà Việt Luân

Trang 7

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

3. Chiết tách phenolics từ quả nho Để phân tích cấu trúc đặc trưng của các hợp chất phenolics, các thành phần anthocyanins hoặc tannin trước tiên cần được chiết tách từ mẫu nho. Trong trường hợp sản phẩm rượu vang, một số tác giả đề nghị rằng mẫu rượu không cần qua bất kỳ xử lý đặc biệt nào trước mà có thể được bơm trực tiếp vào thiết bị phân tích trong khi những tác giả khác cho rằng việc chiết tách, định lượng và định danh sẽ cho kết quả tốt hơn nếu thực hiện một số bước tinh chế mẫu trước khi phân tích (điểm này sẽ được trình bày kỹ

uy N hơ n

hơn trong phần phương pháp phân tích).

3.1. Phương pháp chiết lỏng-rắn

Hạt nho và phần vỏ được tách riêng trước khi được chiết bằng các dung môi như

Q

acetone trong dung môi nước và đôi khi được tiếp tục chiết tách với dung dịch methanol.

èm

Anthocyanins và anthocyanidins thường được chiết từ phần vỏ hoặc phần pomaces với

ạy K

dung môi hữu cơ được axit hóa, thường là methanol.

Hiện nay, những phương pháp chiết tách rắn - lỏng trên được thay thế bằng các kỹ

m /+

D

thuật mới như chiết bằng chất lỏng được nén ở áp suất cao, phương pháp siêu âm, điện và hỗ trợ vi sóng. Những kỹ thuật này giúp rút ngắn thời gian chiết, giảm lượng dung môi

co

tiêu thụ, làm tăng hiệu quả quá trình chiết tách.

e.

Phương pháp chiết bằng chất lỏng được nén áp ở suất cao (PLE) trong thương mại

oo gl

được gọi là phương pháp chiết dung môi tăng tốc (ASE). Mô hình của hệ thống này được

G

mô tả trong Hình 3. Phương pháp này cho phép chiết tách nhanh chóng hợp chất cần phân tích trong một môi trường kín và trơ dưới áp lực cao (3,3-20,3 MPa) và nhiệt độ từ 40200 °C. Ưu điểm chính của kỹ thuật này là dung môi vẫn còn trong trạng thái lỏng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi của chúng, điều này cho phép việc chiết tách thực hiện ở nhiệt độ cao làm tăng khả năng hòa tan chất cần phân tích trong dung môi và giải hấp động học nhanh hơn từ hỗn hợp nền ban đầu.

Lê Hà Việt Luân

Trang 8

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

uy N hơ n

Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Hình 3 - Mô hình hệ thống thiết bị PLE

Q

Do đó, các dung môi chiết tách bao gồm cả nước (ít hiệu quả khi sử dụng trong

èm

chiết tách chất thực vật ở nhiệt độ thấp) có thể hiệu quả hơn nhiều khi áp dụng phương

ạy K

pháp PLE. Trong nghiên cứu của mình, Ju và Howard cho thấy phương pháp PLE: ở nhiệt độ cao (80-100 °C) và sử dụng nước axit hóa mang lại hiệu quả chiết tách tương

m /+

D

đương khi sử dụng methanol 60 % axit hóa trong chiết tách anthocyanin từ vỏ trái nho.

Trong các nghiên cứu khác, hiệu suất chiết tổng lượng polyphenol và flavonoid từ vỏ trái

co

nho Pinot thu được khi tiến hành tại 150 °C rất cao mặc dù các hợp chất flavonoids có xu

oo gl

e.

hướng phân hủy khi thời gian chiết kéo dài (hơn 210 phút). Bên cạnh đó, Pineiro và đồng nghiệp cho thấy thí nghiệm chiết tách hạt nho bằng PLE sử dụng methanol như dung môi

G

cho kết quả về độ thu hồi của catechin và epicatechin đặc biệt cao hơn so với những trường hợp thu được bằng phương pháp khuấy từ hoặc chiết tách dưới sự hỗ trợ của sóng siêu.

Một phương pháp chiết khác là kỹ thuật hỗ trợ điện áp trong quá trình chiết tách.

Boussetta và đồng nghiệp nhận thấy rằng quá trình chiết tách vỏ trái nho Chardonnay với sự hỗ trợ bằng xung điện trường (PEF) và điện áp cao (HVED) giúp tăng tốc quá trình chiết tách các chất tan và polyphenol trong nước ở 20 °C về mặt độc học. Kỹ thuật HVED được giải thích do có khả năng tạo ra các sóng xung kích giúp hỗ trợ sự phá vỡ Lê Hà Việt Luân

Trang 9

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

mô và vách các tế bào trong trái nho, phóng thích polyphenols làm tăng tốc quá trình khuếch tán polyphenols. Tuy nhiện, một số thông số quan trọng phải được tối ưu hóa vì phương pháp chiết tách hỗ trợ điện áp tiến hành quá lâu có thể ảnh hưởng làm phân hủy polyphenols dẫn đến giảm nồng độ của chúng trong dịch chiết. Hơn nữa, các nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu trên catechin hoặc tổng lượng phenols chứ chưa áp dụng cho việc chiết tách các hợp chất dễ bị oxy hóa như anthocyanins.

Cuối cùng, phương pháp chiết tách có hỗ trợ vi sóng giúp thúc đẩy quá trình

uy N hơ n

truyền năng lượng trong toàn bộ môi trường chiết (dung môi và chất nền) một cách hiệu quả và đồng đều. Ứng dụng các điều kiện tối ưu để chiết hạt nho Cabernet-Sauvignon, Shiraz, Sauvignon blanc và Chardonnay công bố rằng khoảng 92 % trong tổng số

Q

polyphenol được chiết tách, kết quả thu được tốt hơn so với các phương pháp chiết khác

èm

(siêu âm, ... ).

ạy K

3.2. Tinh chế dịch chiết

Sản phẩm thu được từ các phương pháp chiết tách rắn - lỏng trình bày ở trên là

m /+

D

một hỗn hợp thô mà độ tinh khiết vẫn có thể được nâng cao bằng các phương pháp tinh chế. Vì vậy, các phương pháp chiết lỏng/ lỏng ở các phân đoạn khác nhau có thể sử dụng

co

nhằm làm tinh khiết và tách các phân đoạn procyanidin khác nhau về khối lượng phân tử.

oo gl

e.

Như vậy, sau khi loại bỏ các chất ưa dầu bằng chloroform, Lorrain và đồng nghiệp sử dụng ethyl acetate để phân tách các phần proanthocyanidin đơn và đa phân tử trong pha

G

hữu cơ với các phần proanthocyanidin cao phân tử trong pha nước.

Các phân đoạn tinh hơn (bảy phần từ DPM 3-12) có thể thu được bằng cách tiếp tục thực hiện chiết lỏng / lỏng với tỷ lệ tăng dần của chloroform trong methanol. Ngoài ra, có thể làm giàu và chiết tách phần dịch chiết thô bởi phương pháp sắc ký lỏng pha thuận (C18) hoặc bằng phương pháp tách chiết pha rắn sử dụng chất hấp thụ đa dạng như C18 , XAD hoặc PVPP.

Lê Hà Việt Luân

Trang 10

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

4 . Phân tích thành phần rượu vang và chiết xuất Hiện nay, hai phương pháp tiếp cận chung để phân tích và xác định tổng hàm lượng polyphenolic trong dịch chiết và trong rượu vang được sử dụng. Một là phương pháp xác định chỉ số polyphenol tổng bằng các phép phân tích quang phổ, hai là việc chiết tách các thành phần hợp chất phenolics riêng biệt và phân tích từng thành phần.

4.1. Xác định tổng lượng hợp chất phenolics Một số phương pháp quang phổ để định lượng các hợp chất phenolics trong

uy N hơ n

nguyên liệu thực vật đã được phát triển. Những phương pháp này dựa trên các nguyên tắc khác nhau và được sử dụng để xác định các nhóm chức khác nhau hiện diện trong cấu trúc các hợp chất phenolics. Nhìn chung, phương pháp đơn giản nhất cho kết quả dự đoán

Q

nhanh tổng hàm lượng hợp chất phenolic trong rượu hoặc dịch chiết là đo độ hấp thụ ở

èm

280 nm (với độ pha loãng mẫu thích hợp). Giá trị này được dựa trên phổ hấp thu đặc

ạy K

trưng của các vòng benzen trong đa số cấu trúc hợp chất phenolics ở 280 nm.

Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm thời gian và có tính lặp. Tuy nhiên, một

D

số các phân tử nhất định, chẳng hạn như axit cinnamic và Chalcone, không có độ hấp thụ

m /+

tối đa ở bước sóng này. Tuy nhiên, do chúng có mặt trong rượu ở nồng độ rất thấp, bất kỳ

co

sai biệt nào trong các giá trị kết quả thu được sẽ rất nhỏ và chấp nhận được. Mặt khác,

e.

các phân tử không thuộc nhóm phenolics có thể có một vòng benzen (amino acid) do đó

oo gl

có độ hấp thụ ở 280 nm sẽ gây sai biệt trong kết quả phân tích tổng hàm lượng.

G

Một phương pháp khác cho một phép xác định hàm lượng phenol tổng là thí nghiệm Folin-Ciocalteu đặc hiệu cho các nhóm phenol do tính chất khử của chúng. Trên thực tế, phương pháp này là phản ứng khử các axit phosphomolybdic của các hợp chất phenolic trong môi trường kiềm tạo thành một phức chất màu xanh. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn không đặc trưng vì một số nhóm phenolic chiết từ protein hoặc các chất có tính khử như acid ascorbic cũng có thể tham gia vào các phản ứng khử nêu trên. Các phương pháp riêng biệt hơn như định lượng vanillin, DMACH, Bate-Smith đã được đề xuất để xác định hàm lượng của proanthocyanidic tannin.

Lê Hà Việt Luân

Trang 11

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Định lượng Vanillin và DMACH dựa trên sự hình thành của các sản phẩm màu từ phản ứng giữa tannin và các chất phản ứng họ aldehyde trong khi phương pháp BateSmith dựa trên sự depolymerization của proanthocyanidin qua sự phân hủy của các liên kết flavonol nội phân tử trong môi trường có tính axit khi được gia nhiệt. Sự phân hủy này dẫn đến sự hình thành các carbon cation một phần được chuyển đổi thành cyanidins đỏ (với sự hấp thụ đặc trưng tại 550 nm) nếu môi trường thuận lợi cho quá trình oxy hóa.

Các phương pháp khác dựa trên phản ứng tạo kết tủa chọn lọc với tanin bằng protein (ví dụ albumin huyết thanh bò) hoặc các thuốc thử khác như polymer

uy N hơ n

(Polyetylenglycol, polyvinylpyrrolidone, ...). Methyl cellulose, một dạng polysacharride, cũng được sử dụng để thực hiện phản ứng kết tủa cho việc định lượng tannin trong rượu vang đỏ hoặc dịch chiết từ nho, gọi tắt là phương pháp định lượng tannin bằng MCP.

Q

Phương pháp này được dựa trên tương tác polymer-tanin, tạo thành phức chất không tan.

èm

Nhìn chung, tất cả các phương pháp trên đều phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm

ạy K

pH, điểm đẳng điện, lực ion, cấu tạo protein và nhiệt độ. Nhìn chung, những phương

D

pháp này thiếu tính đặc trưng và lặp lại. Cuối cùng, liên quan đến định lượng

m /+

anthocyanins, các phương pháp hóa học dựa trên các thuộc tính đặc trưng của anthocyanins: biến đổi màu sắc theo độ pH và phản ứng tẩy trắng bằng sulfur dioxide đã

co

được đề nghị.

oo gl

e.

Các phương pháp quang phổ truyền thống có thể dẫn đến kết quả xác định tế hàm lượng tổng các polyphenol của dịch chiết thô cao hơn mức thực tế do sự ảnh hưởng bởi

G

các hợp chất có thể hấp thụ tia UV. Hơn nữa, các phương pháp này tiêu tốn thời gian và nhiều dung môi (phương pháp Folin, Bate-Smith).Các phương pháp mới đang được phát triển để quy trình thực hiện đơn giản hơn, cho kết quả phân tích đáng tin cậy và có thể phổ biến trên phạm vi toàn cầu. Trong số đó, kỹ thuật phân tích điện và phổ hồng ngoại (IR) được xem là có nhiều tiềm năng nhất.

Trong thời gian gần đây, các phương pháp điện hóa khác nhau đã được đề xuất để định tính và định lượng polyphenol trong rượu vang trên cơ sở là tất cả các hợp chất polyphenolic có trong rượu vang là hợp chất hoạt động điện hóa học. Thật vậy, các đặc tính chống oxy hóa của các hợp chất này có liên quan đến khả năng của chúng có thể cho Lê Hà Việt Luân

Trang 12

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

đi điện tử. Vì vậy, hầu hết các đặc tính điện và sự oxy hóa điện hóa của các hợp chất này được khai thác cho các thí nghiệm phân tích. Những đặc tính này cho phép phát hiện có chọn lọc các polyphenol với độ nhạy cao, ngay cả trong các mẫu rất phức tạp, chẳng hạn như rượu vang.

Clyclic voltametry (CV) là phương pháp điện hóa đầu tiên được sử dụng để phân tích đặc tính của các chất polyphenols và xác định hàm lượng tổng polyphenol trong rượu (Hình 4). Kilmartin và đồng nghiệp đầu tiên sử dụng kỹ thuật này để xác định một loạt các nhóm hợp chất axit phenolic và flavonoid, acid ascorbic và metabisulfite natri, các

m /+

D

ạy K

èm

Q

uy N hơ n

chất này có vai trò quan trọng đối với khả năng chống oxy hóa của rượu.

co

Hình 4 - Thiết bị Clyclic voltametry

e.

Các tác giả chỉ ra rằng điện cực carbon thủy tinh là tốt nhất cho thí nghiệm này vì

oo gl

nó giảm thiểu sự ảnh hưởng của ethanol do có khả năng ôxi hóa tại các điện cực kim loại trơ như bạch kim và vàng. Kết quả cho thấy sự hiện diện của các tín hiệu điện tại các điện

G

thế tương ứng có tương quan với sự hiện diện của các chất polyphenolics có hoạt tính chống oxy hóa cao, trong khi những hợp chất với tính chống oxy hóa thấp cho thấy tính hiệu điện ở điện thế dương cao hơn.

Kết quả cho thấy rằng, các chất dễ bị oxy hóa như ortho-diphenols có một tính hiệu ở điện thế thấp khoảng 400 mV, các anthocyanin trong rượu vang đỏ có tín hiệu cao hơn ở 650 mV, và các hợp chất có nhóm chức khó bị oxy hóa có tín hiện ở điện thế cao hơn cả, tính chất này giúp phân biệt các hợp chất này. Trong nghiên cứu của mình, Inanother, De Beer và đồng nghiệp đã cố gắng so sánh kết quả xác định các chất phenolic

Lê Hà Việt Luân

Trang 13

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

thu được bằng các phương pháp khác nhau. Họ cập đến việc sử dụng CV để đo tổng số phenol sử dụng Q500 (500 mV) có những nhược điểm bởi kết quả chỉ phản ánh hàm lượng tổng chất phenolics có chứa pyrogallol, gallate, và các nhóm catechol trong monome, oligomer hoặc các polymer như flavanol, proanthocyanidins, flavonol và axit phenolic. Thật vậy, phần lớn anthocyanins là hợp chất phenol trong rượu vang trắng chỉ cho tín hiệu anốt tại điện thế cao hơn 500 mV không bao gồm trong kết quả phân tích này.

Tuy nhiên, việc xác định lượng các chất phenol tại điện thế cao hơn là khá phức

uy N hơ n

tạp do sản phẩm của quá trình oxy hóa polyphenol tích tụ trên bề mặt điện cực anode tại các điện thế cao. Tuy nhiên, mặc dù có những nhược điểm nhưng phương pháp CV có thể cung cấp thông tin định tính và bán định lượng về hàm lượng polyphenol và có mối

Q

tương quan so với các phương pháp khác (Folin Ciocalteu, RP-HPLC).

èm

Gần đây, Sanchez Arribas và đồng nghiệp trình bày phương án cải tiến phương

ạy K

pháp CV bằng sự thay đổi điện cực cacbon thủy tinh với một ống nano carbon đa vách và

D

nối với một thiết bị phân tích tiêm mẫu. Họ cho thấy ưu điểm của điện cực cải tiến này là

m /+

cho phép cung cấp độ nhạy và độ ổn định cao được minh chứng bằng các kết quả phẩn tích tổng số polyphenol trong rượu vang. Tác giả cho rằng có thể sử dụng thiết bị này để

co

ứng dụng thực tế trong phân tích mà kết quả ổn định được yêu cầu trong thời gian dài.

oo gl

e.

Phương pháp Differential pulse voltametry (DPV) cũng đã được ứng dụng trong phân tích các polyphenol trong các loại thực phẩm cho đến khi Seruga và đồng nghiệp cố gắng

G

áp dụng phương pháp này cho phấn tích các loại rượu vang. Họ thực hiện một nghiên cứu đầy đủ bởi phương pháp DPV, HPLC và phương pháp quang phổ trong 11 loại rượu vang đỏ Croatia. Trong phương pháp DPV, họ nhận thấy ba đỉnh tính hiệu anốt oxy hóa lớn trên voltammograms rượu (P1, P2, P3) (Hình 5).

Lê Hà Việt Luân

Trang 14

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

uy N hơ n

Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

èm

Q

Hình 5 - Biểu đồ voltammograms của rượu vang đỏ: (a) Frankovka, (b) Pinot noir, (c) Zweigelt, (d) Plavac Hvar, (e) Ivan Dolac

ạy K

Seruga và đồng nghiệp cho thấy DPV là một phương pháp có độ nhạy cao và chọn lọc để xác định tổng hàm lượng polyphenol trong rượu vang đỏ và là cải tiến đáng kể so

m /+

D

với phương pháp voltametry vòng (CV) và phương pháp Folin Ciocalteu. Nhìn chung, kỹ thuật voltametry đã trở thành lựa chọn thay thế so với phương pháp quang phổ truyền

e.

và thống nhất kết quả.

co

thống. Tuy nhiên, kinh nghiệm của người làm thí nghiệm cần thiết để đảm bảo tính lặp lại

oo gl

Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) là kỹ thuật nhanh chóng, chính xác và không

G

phá hủy mẫu. Đây là một thay thế cho phân tích hóa học thông thường đặc biệt để theo dõi sự biến đổi trên thực tế của các thành phần khác nhau trong quá trình sản xuất rượu vang cũng như quá trình lão hóa của nho. Do đó, một số nghiên cứu thực hiện trên các giống nho khác nhau đã chỉ ra rằng quan phổ hồng ngoại gần (NIR) và hồng ngoại trung (MIR) kết hợp với phân tích đa biến là phù hợp để đánh giá sự phát triển của các thông số hóa học chính tham gia vào quá trình lên men rượu vang cũng như các hợp chất phenolic (phenolic tổng, tổng tannin và anthocyanin tổng số) độc lập về những thay đổi liên tục của ma trận trong quá trình sản xuất rượu vang và cung cấp thông tin quan trọng về chất lượng của sản phẩm cuối cùng.

Lê Hà Việt Luân

Trang 15

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Phổ NIR còn được sử dụng để xác định các hợp chất phenolic trong vỏ, hạt hoặc quả còn nguyên vẹn. Ferrer-Gallego và đồng nghiệp đã xác định nồng độ của các họ phenolics chính (flavanol, anthocyanins, flavonol và axit phenolic) và tổng hàm lượng hợp chất phenolic trong vỏ nho và quả nho đỏ trong quá trình chín.

Các tác giả đã phát triển các mô hình cho phép xác định nồng độ chính xác và nhận định rằng kết quả tốt nhất thường thu được trực tiếp ghi quang phổ của nho còn nguyên vẹn do sự vắng mặt thực tế của mẫu ofthe thao tác đó là cần thiết. Các tác giả cũng có công bố một nghiên cứu về khả năng sử dụng NIR để đánh giá thành phần

uy N hơ n

flavanol monomeric và oligomeric trong hạt.

Rolle và đồng nghiệp đã phát triển một phương pháp để đánh giá tổng hàm lượng phenol có trong hạt nho sử dụng quang phổ Fourier Transform-Near Infrared (FT-NIR).

Q

Họ thu được kết quả đầy hứa hẹn nhưng nhấn mạnh sự cần thiết phải cải thiện mô hình

èm

này. Cuối cùng, quang phổ hồng ngoại đã được sử dụng trực tiếp trong quả nho để xác

ạy K

định tổng hàm lượng anthocyanin cũng như các anthocyanins có thể chiết xuất được (pH

D

1 và 3.2) và tổng hàm lượng phenol. Họ báo cáo các kết quả khác nhau đối với các giống

m /+

nho khác nhau; anthocyanin chiết ở pH 1.0 và pH 3.2 có thể được dự đoán từ quang phổ cận hồng ngoại của toàn bộ quả nho trong trường hợp của nho Syrah, trong khi họ không

e.

co

thể được dự đoán giống như đối với các giống nho khác như Cabernet-Sauvignon, Merlot

oo gl

và Carmenere.

Mặt khác, Cozzolino và đồng nghiệp cũng cho thấy giá trị thấp không phù hợp của

G

R trong kết quả ước tính tổng anthocyanins trong quả nho còn nguyên vẹn. Nhìn chung, sự phát triển và ứng dụng kỹ thuật hồng ngoại có thể trở thành một công cụ chính xác và hiệu quả để hỗ trợ việc ra quyết định tại thời điểm thu hoạch và theo dõi quá trình sản xuất rượu vang. Tuy nhiên, kết hợp các phương pháp hóa học và xử lý thống kê cần được sử dụng để hiệu chuẩn cũng như là việc thu thập các bộ dữ liệu của các loài nho hoặc rượu vang (khu vực khác nhau sản xuất, giống nho khác nhau, giai đoạn trưởng thành khác nhau, loại rượu khác nhau đối với rượu vang) cần được sử dụng để hiệu chuẩn là rất quan trọng để luôn luôn thu được kết quả đáng tin cậy.

Lê Hà Việt Luân

Trang 16

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

4.2. Chiết tách và phân tích các hợp chất phenolics (kỹ thuật sắc ký) Kỹ thuật HPLC được sử dụng rộng rãi cho việc chiết tách và định lượng các hợp chất phenolic. Các công cụ hỗ trợ khác nhau, pha động, cột và thiết bị đầu dò để phân tích các anthocyanins, procyanidin, flavonol, flavan-3-ols, và các axit phenolic. Một số phương pháp tập trung ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, bài viết sẽ tập trung đến những tiến bộ gần đây liên quan đến phân tích trong nho và rượu.

4.2.1. Chuẩn bị mẫu

uy N hơ n

Đối với mẫu rượu vang, bước chuẩn bị mẫu trước khi phân tích đôi khi rất cần thiết vì tính phức tạp của sắc ký đồ. Phương pháp chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn được sử dụng rộng rãi nhất để đơn giản hóa các sắc ký đồ của mẫu rượu. Porgaly và

Q

Büyüktuncel đã cho thấy chiết lỏng-lỏng rượu vang với ethyl acetate ở pH 2 thực sự cải

èm

thiện dữ liệu sắc ký thu được của họ. Ngược lại, trong nhiều công trình, các loại mẫu

ạy K

rượu vang được lọc và tiêm mà không cần bất kỳ sự chuẩn bị mẫu trước. Độ phân giải của các đỉnh của hợp chất chính luôn luôn chấp nhận được. Liên quan đến nho hoặc từ

m /+

D

chiết xuất, một phương pháp đơn là giản hòa tan bột khô trong dung môi thích hợp, tiếp

co

theo bước lọc trước khi tiêm vào thiết bị phân tích.

oo gl

e.

4.2.2. Cột

Sắc ký lỏng đảo pha trên C18 hoặc pha tĩnh tương đương thích hợp là phương

G

pháp phổ biến nhất được sử dụng cho việc tách anthocyanins cũng như các hợp chất phenolic chính (proanthocyanidins, flavonol, axit phenolic. Các cột này thường chứa chặt các hạt hình cầu của silica liên kết nhờ chuỗi octadecyl (C18). Tuy nhiên, những phân tích sắc ký này thường mất quá nhiều thời gian và đôi khi phải được bắt đầu bằng một bước dọn rửa dũng cụ trước khi phân tích tốn thời gian. Trong quan điểm này, phương pháp sử dụng cột đơn khối cho việc nhồi cột đã được đề xuất trong phân tích phenolic.

Các tính năng đặc trưng của vật liệu không hạt là một nhân vật liên tục của bộ xương, đáp ứng đầy đủ các phòng tách biệt. Do cấu trúc cứng và xốp của các vật liệu này, chúng cho phép các dòng dung môi chảy qua cột nhanh hơn, thời gian thí nghiệm ngắn Lê Hà Việt Luân

Trang 17

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

hơn và cột nhanh chóng tái cân bằng giữa chạy. Một số nghiên cứu chứng minh những ưu điểm của loại cột này. Ví dụ, Castellari et al. báo cáo rằng cột nguyên khối có thể hoạt động ở một vận tốc dòng chảy cao hơn so với dòng chảy trong cột RP thông thường với sự sụt giảm áp lực giảm và thời gian rửa ngắn hơn và cũng như tái cân bằng nhanh hơn.

Một kết quả chiết tách nhanh (36 phút) của các hợp chất phenol monomeric và cải thiện tín hiệu / nhiễu đã đạt được nhờ sử dụng loại cột này. Liazid và đồng nghiệp phát triển một phương pháp nhanh chóng hơn (8 phút) cho phép tách và định lượng 13 họ polypheno trong rượu vang bằng cách sử dụng một cột nguyên khối RP-18E. Các tác giả

uy N hơ n

cho thấy rằng phương pháp của họ cung cấp kết quả đáng tin cậy, độ phân giải cao và có tính lặp và có thể được áp dụng cho mẫu thực có chứa các họ khác nhau của hợp chất phenolics.

Q

Phương pháp LC pha đảo có thể cung cấp thông tin cụ thể về các nhóm chất khác

èm

nhau của các chất phenolics trong rượu vang đỏ nhưng giới hạn khả năng của phương

ạy K

pháp này đối với phân tích các hợp chất có khối lượng phân tử cao. Kennedy và

D

Waterhouse đã đề nghị sử dụng phương pháp sắc ký pha thuận (NP-LC) cho phép phân

m /+

tích các proanthocyanidins cao phân tử khi có sự hiện diện của anthocyanin. Họ đã phát

co

triển một phương pháp mới sử dụng cột silica pha thuận và rửa giải cột với pha động

e.

methylen clorua, metanol, axit fomic và axit heptanesulfonic, mà không cần làm tinh

oo gl

khiết thêm. Dựa trên thứ tự rửa giải của proanthocyanidins và anthocyanins, phenol rửa giải theo sự tăng dần khối lượng phân tử. Trong so sánh của mình về các phương pháp

G

phân tích xác định phenolics, De Beer và đồng nghiệp nhấn mạnh rằng NP-HPLC là phương pháp phổ biến nhất cho polymer định lượng, bởi polyme với khối lượng phân tử khác nhau có thể được tách ra.

Mặt khác, để phân tích favan-3-ols, kỹ thuật này ít thích hợp do các đỉnh tín hiệu của "monomer" cũng bị nhiễu do bao gồm nhiều hợp chất đơn phân tử không phải họ flavanol. Các giới hạn tương tự gặp phải khi phân tích hợp chất anthocyanins monomer với lý do là các hợp chất riêng biệt cùng tồn tại tại đỉnh tín hiệu. Tuy nhiên, NP-HPLC có thể là một công cụ hữu ích cho việc phân tích tuổi các loại rượu vang kể do nồng độ cả

Lê Hà Việt Luân

Trang 18

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

hai nhóm chất monomer và polyphenol trọng lượng phân tử thấp đều bị giảm xuống liên quan đến độ tuổi của rượu.

Việc sử dụng phương pháp tiên tiến cột đảo pha trao đổi ion hỗn hợp cũng đã được ứng dụng bởi Vergare và đồng nghiệp. Các cột này có cấu trúc đặt biệt, được cấu tạo bởi một nhóm chất điện tích dương nhúng trong một chuỗi kỵ nước cho thấy kết quả đầy hứa hẹn cho việc chiết tách anthocyanin, bao gồm pyranoanthocyanidins trong rượu vang Cabernet Sauvignon-và các loại rượu khác. Trong nghiên cứu này, Vergara và đồng ghiệp cho thấy anthocyanins và pyranoanthocyanins xuất hiện trong các giai đoạn rửa

uy N hơ n

giải khác nhau và chọn lọc so với trường hợp dịch chiết thu được trong trường hợp sử dụng C-18 làm pha tĩnh. Mặc dù thời gian phân tích gần gấp đôi thời gian như phương pháp phân tích cổ điển, kỹ thuật này cho phép một rửa giải riêng biệt rõ ràng đầu tiên là

Q

anthocyanins monoglucosides, sau đó là dẫn xuất acetyl của chúng, tiếp theo là dẫn xuất

èm

coumaroyl. Pyranoanthocyanins xuất hiện giữa dẫn xuất coumaroyl và cuối cùng là đỉnh

ạy K

tín hiệu của các hợp chất cao phân tử, xuất hiện tương quan với tuổi rượu vang.

D

Cuối cùng, cột lõi vỏ đã được thử nghiệm để phân tích thành phần hợp chất

m /+

phenolic của nước trái cây và rượu vang được sản xuất từ giống nho lai. Như một kỹ thuật thay thế cho UHPLC (sắc ký lỏng hiệu suất cao), công nghệ cột lõi vỏ được thiết kế

co

để hoạt động trên các công cụ tiêu chuẩn HPLC trong hầu hết các trường hợp. Trong

oo gl

e.

những thiết kế này, một số phương pháp thông qua cột lõi vỏ được đánh giá để đạt được phân tích tốt nhất của các thành phần phenolic không điển hình như anthocyanins

G

diglucoside được tìm thấy trong các giống nho lai. Kết quả cho thấy cột lõi vỏ C18 và PFP (pentafluorophenyl) cải thiện độ chọn lọc đáng kể. Như vậy, anthocyanin / anthocyanidin, các hợp chất đơn phân tử không thuộc họ anthocyanins hoặc tannin sau khi phloroglucinolysis hóa, các thiết bị phân tích dạng cột lõi vỏ cung cấp một kết quả nhanh chóng, tiêu thụ dung môi ít hơn, ngưỡng nồng độ phát hiện thấp và độ lập lại kết quả phân tích ....

Lê Hà Việt Luân

Trang 19

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

4.2.3. Phân tích, xác định các hợp chất phenolic Các phương pháp phát hiện khác nhau đã được áp dụng song song kết hợp cùng với HPLC cho hợp chất phenolic. Phenolics trong rượu thường được phát hiện bằng phổ UV-vis (tia cực tím có thể nhìn thấy), mảng photodiode (DAD), huỳnh quang và phân tích khối lượng nhưng phương pháp UV vẫn còn thông dụng nhất vì các hợp chất phenolic có phổ hấp thu đặc trưng trong vùng UV. Thật vậy, anthocyanins thấy hai dải hấp thụ maximain tại 265-275 nm và vùng 465-560 nm trong khi flavanol cho hai dải hấp thụ tại 210 nm và 278 nm. Các tính chất này được sử dụng, việc phát hiện và định lượng

uy N hơ n

các hợp chất này hiện tại được tiến hành giữa 520 nm và 546 nm cho anthocyanins và ở 280 nm cho flavanol. Tuy nhiên, phát hiện tia cực tím là không đặc trưng cho proanthocyanidin khi có sự hiện diện của polyphenol khác.

èm

Q

Phương pháp thay thế bao gồm phát hiện huỳnh quang đã được đề xuất. Bằng cách

ạy K

kết hợp thiết bị dò phổ hấp thu và phổ huỳnh quang, Porgaly và Büyüktuncel đồng thời xác định 14 hợp chất phenolic trong rượu vang đỏ và phân biệt các đỉnh tín hiệu bị chồng

D

chéo thường xuyên gặp trong phân tích rượu. Guerrero cũng sử dụng một sự kết hợp của

m /+

phát hiện UV (ở 320 nm) và tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích = 290 nm, bước

co

sóng phát xạ = 320 nm) đặc trưng cho axit hydroxycinnamic và flavan-3-ols, tương ứng.

e.

Silva và cộng sự. trình bày một phương pháp nhanh chóng và đơn giản cho việc định

oo gl

lượng flavan-3-ols trong rượu vang. Bởi phổ huỳnh quang, họ đã có thể xác định số

G

lượng đơn phân tử flavanol, nhị phân và chất tam phân (bước sóng kích thích = 280 nm, bước sóng phát xạ = 320 nm) cũng như (-)-epicatechin gallate và procyanidin B2-gallate, hai hợp chất không bao giờ định lượng bằng cách phát hiện này cho đến bây giờ khi sử dụng bước sóng kích thích / phát xạ tương ứng (270 nm / 377 nm) (Hình 6).

Lê Hà Việt Luân

Trang 20

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

uy N hơ n

Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Q

Hình 6 - Phổ HPLC-Fluo chromatograms của rượu vang Merlotand a Sauvignon

èm

Thông tin cấu trúc để xác định các hợp chất phenolic có thể thu được nhờ sử dụng

ạy K

khối phổ (MS). Sự phát triển và thông tin sẵn có của sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) và phổ khối lượng nhiều (MS / MS và MSN) cung cấp các công cụ rất hữu ích để nghiên

m /+

D

cứu cấu trúc polyphenol cũng như cơ chế mà chúng có liên quan đến quá trình lão hóa rượu. ESI (electrospray ion hóa) là một phương pháp đặc biệt hiệu quả và kỹ thuật được

co

sử dụng để phân tích các flavan-3-ols và anthocyanin trong các phương thức ion dương

oo gl

e.

và âm. Chế độ ion hóa này đã trở thành một lựa chọn tốt để FAB (nhanh bắn phá nguyên tử) được sử dụng vào đầu những năm 1990, đòi hỏi nhất thiết phải có bước làm tinh khiết

G

và hòa tan mẫu trong một nền phân cực.

Như vậy, trong năm 1997, Cheynier và đồng nghiệp nghiên cứu tannin (oligome và polyme flavan-3-ols) trong chiết xuất hạt nho sử dụng hệ thống LC-MS được trang bị với một nguồn ESI hoạt động ở chế độ ion âm và một máy phân tích khối tứ cực. Họ xác định một loạt các đỉnh tín hiệu do procyanidin không có nhóm thế từ trimers đến hexadecamers và dẫn xuất acyl hóa của chúng có chứa một, hai hoặc ba dư lượng acid galic. Gần đây, NP-HPLC-ESI-MS cho phép Nunez và đồng nghiệp xác định hợp chất không galloylate hóa và monogalloylate hóa của flavan-3-ols lên đến octamers, và di-và

Lê Hà Việt Luân

Trang 21

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

trigalloylated flavan-3-ols đến heptamers trong chiết xuất từ hạt nho Graciano, Tempranillo và Cabernet Sauvignon.

Họ quan sát thấy nồng độ của monogalloylated flavan-3-ols thấp hơn gấp 10 lần non-galloylated flavan-3-ols: hiện tượng giảm nồng độ này được quan sát ở tất cả các mẫu nhưng nó có thể là kết quả của sự giảm hiệu quả quá trình ion hóa của dạng galloylate hóa so với dạng không galloylate hóa. Tuy nhiên, do thiếu mẫu galloylate hóa tiêu chuẩn, giả thuyết này không thể kiểm tra được. Dựa trên so sánh tương đối của các

uy N hơ n

nồng độ, người ta nhận thấy rằng sự phân bố của flavan-3-ols trong hạt giống bị chi phối bởi các yếu tố như di truyền, và cũng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu .

Các công trình khác gần đây kết hợp kỹ thuật ESI-MS và ESI-song song (MS / MS) được ứng dụng cho việc xác định / định lượng của procyanidin được galloylate hóa

èm

Q

trong hạt nho. Thật vậy, khối phổ song song cho phép có được thông tin cấu trúc cụ thể

ạy K

hơn của một hợp chất đặc biệt trong hai giai đoạn phân tích khối lượng. Các ion kích thích, tạo thành từ bước ion hóa đầu tiên được cô lập bởi giá trị m / z đặc trưng của chúng

D

và sau đó lại bị phân mảnh và xách định trong bước phân tích thứ hai. Tandem MS có thể

m /+

được thực hiện trong hai quang phổ kế khối lượng lắp ráp song song (ví dụ: hai

co

quadrupoles) hoặc trong một thiết bị phân tích khối lượng duy nhất có khả năng lưu trữ

e.

ion (ví dụ: ion bẫy tứ cực).

oo gl

Trong công trình của Guerrero và đồng nghiệp, MS-MS phân mảnh có hiệu quả để

G

phân biệt một số hợp chất như quercetin-3-glucuronide và isorhamnetin-3 glucoside mà hiện nay có cùng khối lượng và ion mẹ đầu tiên (m / z = 477) nhưng được phân biệt bởi các ion phổ khối lượng sau (301 cho quercetin-3-glucuronide và 315 cho isorhamnetin-3glucoside). Gần đây (năm 2012), Delcambre và Saucier chứng minh hiệu suất của UHPLC kết hợp với ESI và Q-TOF (thời gian bay gấp 4 lần) trong chế độ MS / MS để xác định cấu trúc mới. Phổ khối lượng thời gian bay dựa trên một nguyên tắc tách khối lượng đơn giản. Xem xét loại ion hóa bắt đầu từ vị trí tương tự tại cùng một thời gian và được tăng tốc bằng một trường tĩnh điện đồng nhất không đổi, vận tốc của chúng một cách rõ ràng liên quan đến tỷ lệ khối lượng trên điện tích và thời gian đến trực tiếp tại Lê Hà Việt Luân

Trang 22

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

một máy dò cho thấy khối lượng của chúng. Các công cụ của thiết bị này sở hữu một số lợi thế đặc biệt hơn hầu hết các loại máy phân tích khối lượng. Về mặt lý thuyết, kỹ thuật này có thể cho phép xác định phạm vi khối lượng rộng hơn vì không cần chùm tia ion quét, cho phép có được một quang phổ khối lượng đầy đủ cho mỗi quá trình ion hóa. Độ truyền cao, độ nhạy cao và sự cần thiết sử dụng một lượng mẫu rất nhỏ (<1018 mol trong các công cụ hiện đại nhất) là những lợi thế khác được biết đến của kỹ thuật này. Do đó, Delcambre và Saucier xác định riêng biệt lần đầu tiên 14 hợp chất glycosyl hóa flavanol monomeric dựa trên bốn aglycons ((+)-catechin-, (-)-epicatechin-, (-)-

uy N hơ n

epigallocatechin-gallate và epicatechin monoglycosides) trong rượu vang đỏ và chiết xuất hạt nho bởi ESI-MS/MS. Chế độ MS / MS targeted cung cấp thêm thông tin về cấu trúc của các hợp chất này. Các mảnh vỡ từ các phân mảnh của các hợp chất này cung cấp một

Q

tín hiệu đặc trừng cho phép xác định tốt hơn.

èm

Tuy nhiên, phương pháp này, dựa trên khối lượng chính xác và mô hình phân

ạy K

mảnh cụ thể không thể cung cấp thông tin về vị trí chính xác của nhóm glucose. Việt kết

D

hợp phương pháp HPLC với khối phổ cũng là một phát triển quan trọng để xác định

m /+

thông tin về cấu trúc và xác định cấu trúc của anthocyanins, anthocyanidins và dẫn xuất

co

anthocyanin. Năm anthocyanins chung trong nho từ Vitis: viniferaare delphinidin (Dp),

e.

cyanidin (Cy), petunidin (Pt), peonidin (Pn) và malvidin (MV), hiện nay 3-O-

oo gl

monoglucosides, 3-O-acetylmonoglucosides và 3 monoglucosides-O-(6-Op-coumaroyl).

Trong năm 2010, Ông và các cộng sự. khẳng định sự tồn tại của một anthocyanin thứ sáu,

G

pelargonidin-3-O-glucoside trong loài nho không teinturier V. vinifera (Cabernet Sauvignon và Pinot Noir. Trong vinifera không Vitis, anthocyanin với một liên kết glucose bậc 2 đếnnhóm hydroxyl -C 5 có thể tồn tại.

Gần đây, De Freitas và Mateus đã báo cáo sự đa dạng của pyranoanthocyanins trong rượu vang. Sự hình thành các sắc tố anthocyanin có nguồn gốc từ tự nhiên xảy ra trong quá trình lão hóa rượu vang đỏ và một loạt các cấu trúc (cụ thể là carboxypyranoanthocyanins, methylpyranoanthocyanins, pyranoanthocyanin-flavanol, pyranoanthocyanin phenol, portisins, oxovitisins và pyranoanthocyanidin liên hợp bậc 2) đã được xác định trong hai thập kỷ qua. Hoạt động thông thường trong chế độ ion dương Lê Hà Việt Luân

Trang 23

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

và trong môi trường axit, anthocyanin được phát hiện ở dạng cation flavylium, M + để cung cấp tín hiệu với cường độ cao. Bằng cách kết hợp HPLC và electrospray với một máy dò khối lượng, sáu mươi sáu anthocyanins khác nhau đã được phát hiện trong rượu vang đỏ Vitis viniferaDornfelder từ năm 1997. Những anthocyanin đã được xếp vào các nhóm cấu trúc chứa đơn và diglucosides (dạng acetyl-và-coumaryl) các loại rượu vang.

Ngoài ra, các este của axit axetic và este của axit coumaric 3-glucosides đã được phát hiện. Sản phẩm lão hóa như vitisin A (m / z = 561) và vitisin B (m / z = 517) và acetylvitisinA (m / z = 603) và B (m / z = 559), đã được xác định trong các công trình

uy N hơ n

khác cũng được xác định trong loại rượu này. Fulcrand et al. cho thấy vitisin Một kết quả từ tạo vòng giữa cacbon 4 và nhóm 5-hydroxyl của flavylium phân nưa originalanthocyanin với các liên kết đôi của mẫu enolic acid pyruvic, tiếp theo là

Q

dehydratation và rearomatization bước. Cuối cùng, bằng cách áp dụng một quá trình thủy

èm

phân axit với rượu vang, Heier et al. chỉ ra rằng tất cả các pigmentsdetectable tại 525 nm

ạy K

được lấy từ xương của delphinidin, cyanidin, peonidin, petunidin, malvidin và derivates

D

của họ acid pyruvic và acetaldehyd. Gần đây hơn, Xu và đồng workersattempted để phát

m /+

triển một phương pháp nhanh chóng và chính xác để định lượng anthocyanidin trong nho và nước ép nho thông qua một quá trình thủy phân hỗ trợ sử dụng LC / MS. Trong điều

co

kiện tối ưu, năm anthocyanidins lớn (Dp, Cy, Pt, Pn, MV) được phân tách hoàn toàn

oo gl

e.

trong 25 phút và định lượng thành công. Phương pháp này đã được đề xuất như một phương pháp tiếp cận toàn diện để xác định số lượng anthocyanidins để tránh những khó

G

khăn ofseparation / nhận dạng của nhiều anthocyanin có trong ma trận nho và rượu vang.

Sau khi phân đoạn của vật liệu màu rượu vang đỏ, sự tồn tại của anthocyanins dimeric (A-A +), trước đây được phát hiện trong vỏ của trái nho đã được thể hiện bởi AlcaldeEon et al.. Nhờ vào việc phát hiện hàng loạt trong loạt (MSN, n = 1-4), oligomer mới được phát hiện trong rượu vang. Chúng bao gồm một flavanol (catechin, epicatechin, gallocatechin hoặc epigallocatechin), liên kết thông qua C4position của mình cho các vị trí ái nhân của các đơn vị trên của một anthocyanin dimeric (FA-A +). Tất cả các hợp chất được xác định có chứa malvidin là một trong những tiểu đơn vị anthocyanin, trong khi phân nưa anthocyanin khác có thể là một trong hai Dp, Cy, Pt, Pn hoặc Mv. Nghiên Lê Hà Việt Luân

Trang 24

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

cứu này là một ví dụ thú vị về sức mạnh utilityand của ESI / MSN phân tích cùng hoặc không để HPLC. Trong nghiên cứu của Villiers và cộng sự. Điều kiện sắc ký tối ưu được phát triển và áp dụng cho một loại rượu Pinotage 2 tuổi, để cho phép tách và xác định hơn một trăm anthocyanin và các chất màu có nguồn gốc từ một lần chạy mẫu duy nhất. Như vậy, theo cách này, các tác giả dự kiến xác định 17 họ anthoycanin-glucosides và diglucosides, bảy anthocyanins oligomeric, 24 anthocyanin-tanin trực tiếp như Mv-GLC-(epi) gallocatechin

uy N hơ n

(A-Ttype), chín tanin acetaldehyde qua trung gian , 10 sản phẩm ngưng tụ anthocyaninvinylflavanol, tám sản phẩm ngưng tụ anthocyanin-vinylphenol (pyranoanthocyanins), 12 sản phẩm axit anthocyanin-pyruvic (vitisin dẫn xuất A), năm dẫn xuất anthocyanin-

Q

acetaldehyd (vitisin dẫn xuất B) và 2 dẫn xuất anthocyanin có acetone.

èm

Acevedo de la Cruz và đồng nghiệp gần đây đã cho thấy hiệu quả của sự kết hợp

ạy K

của khối phổ và quang phổ NMR trong việc xác định 33 anthocyanin trong bốn Loài Vitis khác nhau. Đặc biệt, mới được báo cáo là đồng phân cis của p-coumaric-dẫn xuất đã

m /+

D

được xác định (petunidin-, peonidin và malvidin-3 (6-p-coumaroyl)-5-diglucoside). Cuối cùng, các công trình gần đây đề nghị thay thế cho chế độ ion hóa dương điện cổ điển

co

bằng cách áp dụng chế độ âm điện đối với đặc tính của anthocyanins. Trong chế độ

oo gl

e.

dương điện, glycosides flavonol, ví dụ quercetin glycosides, có các ion phân tử tương tự và mô hình phân mảnh giống như các anthocyanin tương ứng, ví dụ như, glycosides

G

delphinidin ([M] + chất anthocyanins và [M + H] + glycosides flavonol) đều giống nhau. Đổi lại, phổ MS thu được ở chế độ ion âm được chứng minh là một công cụ có giá trị cho sự phân biệt các anthocyanin với các polyphenol không anthocyanin (Hình 7). Cụ thể, các ion kép của [M-2H] và [M-2H + H2O] - đặc trưng tới anthocyanin trong khi một ion phân tử duy nhất [M-H]-chiếm ưu thế trong quang phổ của các chất polyphenol không anthocyanin.

Lê Hà Việt Luân

Trang 25

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn

ạy K

èm

Q

uy N hơ n

Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

D

Hình 7 - So sánh giữa delphinidin-3-O-glucoside và quercetin-3-O-glucoside trong 2 chế độ ion hóa khác nhau

m /+

5. Kỹ thuật tách mới

co

Các phương pháp chiết tách mới như UPLC (sắc ký lỏng hiệu năng rất cao) xuất

e.

hiện gần đây để vượt qua những hạn chế của kỹ thuật LC và cung cấp một số lợi ích rõ

oo gl

ràng về thời gian phân tích, tiêu thụ dung môi, và đến một mức độ nhạy tốt hơn. Thật vậy, sau khi trích ly polyphenol từ các loại rượu vang của SPE trên một chất hấp thụ cân

G

bằng ưa nước-tan trong mỡ mới, Silva và cộng sự. đã tách riêng biệt và phân tích, trong năm phút, mười lăm hợp chất phenolic chủ yếu thuộc các flavonol, flavanol và axit phenolic.

Kỹ thuật điện di mao mạch (CE) đã nhận được sự chú ý đáng kể như một phương pháp tách dựa trên chất lỏng thay thế cho HPLC từ những năm 1990. Nó đặc biệt thích hợp cho việc tách và định lượng các hợp chất phân tử thấp đến trung bình phân cực hay có tích điện, kết quả thu được thường nhanh hơn và hiệu quả hơn so với ly HPLC tương ứng. CE cho phép phân tích đồng thời chất phân tích với tính chất khác nhau trong một Lê Hà Việt Luân

Trang 26

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

lần hoạt động duy nhất. Trong các loại rượu vang, các hợp chất đại diện nhất là các hợp chất phenolic, amino axit, protein, các loài nguyên tố, độc tố nấm mốc và các axit hữu cơ.

Tuy nhiên phương pháp CE thường có độ nhạy thấp hơn và khắc nghiệt hơn so với các phương pháp HPLC tiêu chuẩn, và một phần vì những lý do khác, kỹ thuật này đã chủ yếu được ứng dụng trong một số lĩnh vực thích hợp, CE cung cấp lợi ích rõ ràng so với HPLC (ví dụ tách chiral). Liên quan đến phân tích các hợp chất phenolic trong rượu vang, sự so sánh của vùng mao quản điện-UV-vis-MS với RP-LC-UV-ESI-MS để phân tích các hợp chất phenolic monomeric trong chiết xuất các loại rượu vang đỏ cho thấy

uy N hơ n

rằng RP-LC vẫn là phương pháp của lựa chọn để phân tích phenolic. Rất ít báo cáo xuất hiện trên các ứng dụng của phương pháp CE cho việc tách chất anthocyanins và không áp dụng trực tiếp vào các loại rượu vang đã được báo cáo có thể là do sự vắng mặt của cải

èm

Q

thiện sự tách biệt của mẫu phức tạp so với kỹ thuật LC.

ạy K

Do tầm quan trọng của việc phát triển quy trình hóa học sạch, phương pháp mới cho mẫu thực phẩm được dựa trên các phương pháp hòa tan. Vinas và đồng nghiệp tập

D

trung nghiên cứu cho sự phát triển của một chiết microextraction pha rắn (SPME) GC-

m /+

MS phương pháp để phân tích một số polyphenol trong rượu vang và nho. Ngâm SPME

co

trực tiếp được sử dụng để hấp phụ các polyphenol và các chất xơ đã được đặt trong các

e.

khoảng trống của các chất phản ứng dẫn xuất, BSTFA bis (trimetylsilyl)

oo gl

trifluoroacetamide, cần thiết để chuyển đổi các hợp chất không bay hơi cực thành các dẫn

G

xuất dễ bay hơi. Các tác giả đã phát triển một phương pháp nhạy cảm mới để xác định cả hai đồng phân cis-và trans-resveratrol, piceatannol, catechin và epicatechin. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ hữu ích cho các hợp chất phân tử lượng thấp. Thật vậy, các dẫn xuất, cần thiết cho kỹ thuật này, làm tăng trọng lượng phân tử của hợp chất phenolic và điều này có thể dẫn đến rọng lượng phân tử cao vượt bậc so với các dữ liệu có sẵn cho các hệ thống GC / MS phổ biến nhất, do đó làm cho phương pháp này không hiệu quả.

Lê Hà Việt Luân

Trang 27

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

6. Kỹ thuật để Thiết lập cấu trúc Tannin (Xác định mức độ trùng hợp) Mối quan tâm nghiên cứu các đặc tính của ngưng tụ tannin đã tăng lên trong thập kỷ qua. Tannin Proanthocyanidic có thể khác nhau bởi tính chất và số lượng của các đơn vị cấu thành, tuỳ theo loại và vị trí của liên kết interflavanic kết nối các đơn vị monomeric (C4-C8 hoặc C4-C6) và cấu hình cuối cùng của chúng (tuyến tính so với phân nhánh) của polymer. Các đặc tính của tannin bởi depolymerisation thường được sử dụng. Xử lý một tanin đặc với axit, trong sự hiện diện của một tác nhân nucleophin một phloroglucinol như thiol cho phép cá nhân tiểu đơn vị được phân tích bằng HPLC và khối

uy N hơ n

lượng phân tử trung bình (thể hiện là "mức độ trung bình là trùng hợp, MDP") được tính

G

oo gl

e.

co

m /+

D

ạy K

èm

Q

toán (Hình 8).

Hình 8 - Các phản ứng của quá trình phloroglucinolysis.

Lê Hà Việt Luân

Trang 28

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

Thật vậy, proanthocyanidins trở thành depolymerized, tạo ra tiểu đơn vị như flavan-3-ol monomers và tiểu đơn vị mở rộng như flavan-3-ol. Các chất trung gian lực điện tử có thể bị mắc kẹt bởi các tác nhân ái điện tử để tạo ra sản phẩm phân tích được.

Hầu hết các kiến thức hiện tại của chúng tôi về thành phần chung và cấu trúc của nho và rượu vang tannin đã được thu được bằng cách depolymerization. Hạt nho proanthocyanidins chỉ bao gồm procyanidin (tiểu đơn vị cấu thành (+)-catechin và (-)epicatechin) trong khi vỏ nho proanthocyanidins bao gồm cả procyanidin và

uy N hơ n

prodelphinidins (tiểu đơn vị cấu thành (-)-epigallocatechin) ....

Proanthocyanidins vỏ nho có chỉ số MDP cao hơn và tỷ lệ thấp hơn của các tiểu đơn vị galloylated hơn hạt giống. Một số tác giả đã áp dụng những phương pháp depolymerization để phân biệt các loại rượu vang. Đặc biệt, Drinkine et al. sử dụng các

èm

Q

phloroglucinolysis để ethylidene-cầu nối phân tích flavan-3-ols là kết quả của thay đổi

ạy K

hóa học của flavan-3-ols xảy ra trong quá trình làm rượu vang và lão hóa. Bằng phương pháp này, các tác giả cho thấy cầu ethylidene thatflavan-3-ol đại diện ít hơn 4% của

D

flavan-3-ol và tỷ lệ các mối liên kết liên quan đến interflavan bản địa tăng theo tuổi rượu.

m /+

Tuy nhiên, Herderich và Smith nhấn mạnh rằng kỹ thuật này chỉ giới hạn cho các đặc

co

tính của tannin rượu vang do phần lớn tannin kháng lại quá trình depolymerization axit

oo gl

e.

trung gian, do đó cho phép chỉ một phần nhỏ của tanin được đặc trưng.

Những phương pháp depolymerization này khó thực hiện và không cung cấp

G

thông tin về sự phân bố polymer của một phần tanin bởi vì tất cả các polyme chứa trong các phần được cắt thành các đơn vị monomer trong quá trình phản ứng. Ví dụ, khi nghiên cứu depolymerization của một mẫu có chứa một hỗn hợp của 50% tetramerictannins nhỏ và 50% tannin octametric lớn hơn, sẽ mang lại một MDP sáu, giống như xem xét một mẫu bao gồm 100% tannin hexameric.

Một số nghiên cứu đã tập trung vào việc tách tannin theo kích thước của chúng cho mục đích phân tích và chuẩn bị. Liên quan đến các khía cạnh phân tích, tách thuận tiện có thể đạt được bởi NP HPLC như mô tả trước đây. Các khía cạnh chuẩn bị, sắc ký

Lê Hà Việt Luân

Trang 29

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

gel với gel khác nhau như TSK HW-40 đã được sử dụng. Thật không may, chỉ oligomer đến năm có thể dễ dàng tách biệt với các phương pháp này. Saucier et al. đề xuất một phân đoạn nhanh chóng của proanthocyanidins hạt nho dựa trên phân tách chiết lỏng / lỏng và khả năng hòa tan tương đối của các hợp chất trong các dung môi khác nhau (nước, ethyl acetate, methanol và chloroform). Bằng phương pháp này, họ đã có thể có được 6 phân số đã MDP khác nhau giữa ba và 13, khoảng, và họ có thể dễ dàng thu được với số lượng gram có thể hữu ích để nghiên cứu các tính chất của mỗi phần.

uy N hơ n

7. Kết luận Rất nhiều các nghiêu cứu cho các kỹ thuật phân tích nho và các hợp chất phenolic trong rượu đã xuất hiện trong bốn thập kỷ qua. Kỹ thuật phân tích mới đã làm sáng tỏ

Q

một số cấu trúc có nguồn gốc từ tannin và anthocyanin trong rượu vang và xác định cách

èm

thức chúng được hình thành. Như vậy, sự đa dạng của các phương pháp và quy trình tiến

ạy K

hành thực nghiệm phản ánh sự phức tạp của chất phân tích phenolic trong nho và trong rượu vang. Các phương pháp tiên tiến hơn vẫn còn tiếp tục được phát triển bởi một số

D

hợp chất hiện diện với số lượng rất nhỏ và quá nhiều hợp chất không xác định, đặc biệt là

m /+

với các phần polyme hóa. Xem xét các vấn đề môi trường, một số kỹ thuật phân tích đã

co

được phát triển để thay thế cho phương pháp thông thường, có ưu thế về thời gian phân

e.

tích với, tiêu thụ dung môi, hiệu quả phân tích và độ lặp lại của kết quả.

oo gl

Tuy nhiên, vẫn còn nhiều điều chưa kchuẩn hóa các bước chuẩn bị mẫu và phân

G

tích. Mỗi phương pháp cung cấp lợi thế riêng biệt, đặc trưng đối với một số hợp chất phenolic đặc biệt và các khía cạnh khác cần phải được suy nghĩ trước khi phân tích. Lựa chọn một phương pháp phân tích phenolic thích hợp phụ thuộc vào những thông tin được yêu cầu. Tùy thuộc vào nhu cầu của một thử nghiệm, sử dụng một số sự kết hợp của các phương pháp hiện nay là cách tiếp cận tốt nhất để mô tả đúng thành phần phenolic của một mẫu.

Lê Hà Việt Luân

Trang 30

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn Tiểu luận Các phương pháp phân tích công cụ

TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Weisshaar, B.; Jenkins, G.I. Phenylpropanoid biosynthesis and its regulation. Curr.

Opin. Plant Biol. 1998, 1, 251–257.

[2]. Winkel-Shirley, B. Biosynthesis of flavonoids and effects of stress. Curr. Opin. Plant Biol. 2002, 5, 218–223.

[3].

Santos-Buelga, C.; Scalbert, A. Proanthocyanidins and tannin-like compounds

nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health. J. Sci. Food Agric.

2000, 80, 1094–1117.

uy N hơ n

[4]. Teissedre, P.L.; Frankel, E.N.; Waterhouse, A.L.; Peleg, H.; German, J.B. Inhibition of In Vitro Human LDL Oxidation by Phenolic Antioxidants from Grapes and Wines. J. Sci. Food Agric. 1996, 70, 55–61.

Q

Frankel, E.N.; German, J.B.; Kinsella, J.E.; Parks,E.; Kanner, J. Inhibition of

èm

[5].

oxidation of human low-density lipoprotein by phenolicsubstances in red wine. Lancet

ạy K

1993, 341, 454–457.

D

[6] Bénédicte Lorrain , Isabelle Ky , Laurent Pechamat and Pierre-Louis Teissedre.

G

oo gl

e.

co

m /+

Evolution of Analysis of Polyhenols from Grapes, Wines, and Extracts, 2013.

Lê Hà Việt Luân

Trang 31

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định