Uma Introdução às… Técnicas de Trabalho em Microbiologia Investigar… O quê? Onde? Como?
Aceite para publicação em 25 de Outubro de 2013.
Investigar… O quê? O que são os microrganismos? E a microbiologia? A microbiologia é um ramo da Ciência que tem por objetivo o estudo dos microrganismos, seres vivos invisíveis a olho nu.
(20µm) (400x)
(1000x)
Bactérias Domínios Archaea e Bacteria
Leveduras (Reino Fungi) Domínio Eukarya (100x)
Bolores (Reino Fungi) Domínio Eukarya Algas Domínio Eukarya (400x)
Investigar… Onde? Onde se encontram os microrganismos?
Água
Solo
Ar
Quais as consequências da atividade dos microrganismos?
Uns deterioram os alimentos e/ou causam doenças….
Outros são utilizados pelo Homem…
Que condições são necessárias para o estudo dos microrganismos?
É necessário… 1. Evitar que os microrganismos em estudo contaminem os investigadores e o meio. 2. Evitar que os microrganismos do ambiente contaminem as culturas e/ou o local de trabalho.
Que condições deve apresentar um laboratório de microbiologia? O laboratório deve estar subdividido em diferentes zonas, permitindo um trabalho sequencial e reduzindo o risco de contaminação.
Zona de Lavagem/ Descontaminação Bancadas de Trabalho
Investigar… Como? Como se poderá estudar a quantidade e diversidade de microrganismos de uma amostra?
MAS…
A utilização do microscópio requer experiência e tempo!
Se os microrganismos forem colocados num meio com as condições necessárias ao seu desenvolvimento, multiplicam‐se, formando colónias visíveis!
Meio de Cultura: Preparado, sólido ou líquido, de composição apropriada, esterilizado, que permite, in vitro, o desenvolvimento de microrganismos. RBC PCA
Cada microrganismo origina uma colónia, que já pode ser observada a olho nu.
Bactéria Esporo de um bolor Multiplicação das bactérias.
Desenvolvimento das hifas em todas as direções.
Os meios de cultura devem ser adequados ao tipo de microrganismos que se pretende estudar, existindo meios seletivos, isto é, específicos para determinados grupos. RBC PCA
Rose‐Bengal Chloramphenicol Agar (RBC): Meio seletivo para fungos.
Plate Count Agar (PCA): Meio não‐seletivo, que permite o desenvolvimento de bactérias e fungos, apesar de ser mais favorável às primeiras.
Etapas (um possível percurso…) 1. Preparação e Esterilização do Meio de Cultura/ Materiais
2. Preparação das Amostras (realização de diluições, se necessário)
Sementeira por riscado 3. Inoculação Sementeira por espalhamento 4. Incubação em Estufa
. Em microbiologia é fundamental a esterilização dos meios de cultura e materiais. Só assim é possível prevenir contaminações!
Para preparação prévia do material… Incineração: Queima direta do material pelo fogo (lamparina/ Bico de Bunsen).
Esterilização de uma ansa à chama do bico de Bunsen.
Chamejamento com álcool: Queima do álcool presente num material.
Chamejamento de um espalhador de vidro.
Esterilização pelo ar quente (calor seco): Para material resistente a altas temperaturas (vidros/ metais). Alternativa… Estufa de um laboratório escolar
Forno Pasteur
Material preparado para ser esterilizado: Utilização de cilindros metálicos, papel de Kraft ou outros materiais.
Utilização adequada de materiais esterilizados…
Esterilização pelo calor húmido sob pressão: Para materiais sensíveis a altas temperaturas: meios de cultura, soluções, borrachas e plásticos. Alternativa… Panela de pressão de um laboratório escolar
Autoclaves de diferentes dimensões
Na atividade laboratorial…
Deve desinfectar‐se a bancada com álcool, antes e depois da sua utilização.
O trabalho deve ser feito nas proximidades de uma chama, recorrendo‐se ao bico de Bunsen ou lamparina.
Os tubos de ensaio e restantes recipientes devem estar devidamente protegidos de contaminações a partir do exterior.
Que cuidados ter com os meios de cultura esterilizados acondicionados em placas de Petri?
Os meios de cultura esterilizados e acondicionados em placa de Petri devem ser conservadas no frigorífico.
As placas a usar só devem ser abertas nas proximidades de uma chama.
A identificação das placas deve ser feita no fundo, antes da inoculação.
As placas com meio de cultura inoculado devem ser incubadas em estufa na posição invertida, à temperatura e durante o tempo adequados.
Como reduzir a quantidade de microrganismos de uma amostra de forma a possibilitar a sua quantificação? Para a obtenção de colónias bem isoladas a partir de uma amostra com elevada carga microbiana, recorre‐se ao método das diluições decimais sucessivas.
1mL da amostra
9 mL de diluente
1mL 1mL
10-1
10-2
1mL
10-3
10-4
Inoculação das caixas de Petri com 0,2 mL de inóculo de cada uma das diluições efetuadas, seguida de incubação à temperatura adequada. Diluição 1:10 (10‐1)
Diluição 1:100 (10‐2)
Diluição 1:1000 (10‐3) Diluição 1:10000 (10‐4)
O que fazer após a incubação das placas?
1) Descrição das características das colónias Forma, margem, elevação, coloração… 2) Contagem do número de colónias: Para posterior cálculo do número de UFCs por determinada quantidade de amostra, tendo em conta as diluições realizadas e a quantidade de amostra ou diluição inoculada.
Contagem das Colónias Nas condições ideais…
Contador de Colónias: Apresenta uma superfície iluminada, com uma grelha que facilita a contagem e uma lupa.
Em aula…
Contagem direta na placa.
Não te esqueças que existem microrganismos causadores de doenças, pelo que todo o trabalho deve ser feito com uma atenção redobrada, para evitar contaminações! O material utilizado deve ser adequadamente descontaminado, recorrendo‐se a tratamentos térmicos (autoclave) ou a soluções desinfectantes adequadas.
Por exemplo: Recipiente com solução desinfectante, para colocação imediata das pipetas contaminadas.
Dezembro de 2013 Ficha Técnica Autora: Ana Isabel dos Santos Rebelo Professora, Agrupamento de Escolas de Aljustrel Revisão Científica: Professora Maria Teresa Gonçalves dos Santos Instituto Politécnico de Beja ‐ Escola Superior Agrária Realizado no âmbito do Curso Profissional de Técnico de Processamento e Controlo da Qualidade Alimentar (11.º Ano) Ano Letivo 2012/ 2013
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