2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay

Kết quả: Xuất hiện phức chất màu xanh tím.

2.4.3.8. Gum và chất nhầy

- Hút 2ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm - Thêm 25 ml cồn tuyệt đối, khuấy liên tục

Kết quả: Xuất hiện kết tủa trắng đục chứng tỏ có sự hiệm diện của gum và chất nhầy.

2.4.4. Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do (DPPH assay) 2.4.4.1. Nguyên tắc hoạt động gốc tự do DPPH

DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.

Hoạt tính chống oxy hóa của một chất được xác định bằng phương pháp đo phổ UV, sử dụng thuốc thử là DPPH.

Phản ứng được tiến hành dựa theo trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy so màu ở bước sóng 517 nm (Hình 2.3).

Hình 2.3. Phản ứng của DPPH (gốc tự do) thành DPPH (không có gốc tự do).

2.4.4.2. Biểu diễn kết quả thử nghiệm DPPH

Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxy hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo

công thức: ( )

Kết quả thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được báo cáo bằng IC50 (half maximal Inhibitory Concentration). IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính kháng oxy hoá càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.  Cách tính IC50: Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau và tính I% của từng nồng độ. Với những mẫu có phần trăm bắt gốc tự do biến thiên tuyến tính với nồng độ, vẽ đường phi tuyến biểu diễn mối liên hệ giữa phần trăm bắt gốc tự do và nồng độ mẫu (với y là phần trăm bắt gốc tự do và x là nồng độ mẫu). Tìm phương trình phi tuyến, xác định hệ số a và b của phương trình. Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50)  Quy trình - Bước 1: hòa tan DPPH vào methanol tuyệt đối để đạt nồng độ 0,6 mg/ml. - Bước 2: hòa tan vitamin C (đối chứng dương) vào nước cất sau đó vortex để đạt nồng độ 2 mg/ml. Pha loãng dung dịch xuống nồng độ 0,2 mg/ml và bao tube lại bằng giấy bạc. - Bước 3: mẫu cao ô dược thô được hòa tan trong ethanol tuyệt đối, vortex để đạt nồng độ 1 mg/ml. Pha loãng mẫu thành dãy các nồng độ. - Bước 4: hút 100 μl methanol tuyệt đối – đối chứng âm. - Bước 5: hút 100 μl vitamin C - đối chứng dương ở nồng độ 0,2 mg/ml. - Bước 6: hút lần lượt 100 μl mẫu ở các nồng độ đã pha.