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LABORWELT Nr. 5 / 2014 – 15. Jahrgang

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Intro Proteomik

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Proteomforschung wird erwachsen Dr. Martin Laqua, Redaktion LABORWELT Egal ob es um das Auffinden neuer, robuster Biomarker oder exklusiver Wirkstofftargets geht, die Analyse der in einer Zelle oder einem Gewebe versammelten Proteine ist zu einem zentralen Forschungsgegenstand geworden. Möglich gemacht wurde dies mit dem Aufkommen neuer Technologien wie der 2D-Gelelektrophorese oder der Massenspektrometrie. In der Folge wurde 1995 der Begriff „Proteom“ analog zum Genom, der Gesamtheit aller genetischen Informationen, geprägt. Erst im Sommer 2014 machten zwei Forschergruppen mit einer ersten experimentellen Bestimmung des Gesamtproteoms des Menschen auf sich aufmerksam, darunter die Freiburger Gruppe von Bernhard Küster (NATURE, doi:10.1038/nature13319). Beide Teams konnten jeweils circa 18.000 Proteine kartieren und damit etwa 90% der geschätzten Gesamtmenge aller menschlichen Proteine abdecken. An Küsters Erfolg hatte auch die Heidelberger Cellzome GmbH ihren Anteil. Die Tochterfirma von GlaxoSmithKline (Großbritannien) hat sich auf die Analyse von molekularen Zielstrukturen und deren Interaktion mit Wirkstoffen spezialisiert. LABORWELT sprach mit Gerard Drewes, dem wissenschaftlichen Leiter Cellzomes, über ein aktuelles Projekt, das Cellzome mit Forschern aus Schweden und wiederum Küsters Freiburger Gruppe zum Abschluss gebracht hat. Durch das Erstellen von Schmelzkurven tausender Proteine in Ab- und Anwesenheit von Medikamenten gelang es den Proteomik-Experten, das Wirkungs- aber auch Nebenwirkungsprofil dieser Substanzen in nie zuvor erreichter Qualität zu bestimmen (siehe Seite XIV). Mit der vorgestellten Methode können Drewes und sein Team derzeit 8.000 Proteine auf einen Schlag analysieren. Allerdings hofft er, diese Zahl noch steigern und alle etwa 15.000

Proteine einer Zelle erfassen zu können. Wenn von dem Proteom einer Zelle (15.000 Proteine) oder dem des Menschen (20.000) die Rede ist, sind zumeist physiologisch wichtige Varianten dieser Moleküle in den Zahlenangaben noch nicht enthalten. Durch alternatives Splicing und posttranslationale Modifikationen ist die Zahl tatsächlich vorkommender Proteine noch nicht bekannt. Schätzungen gehen von 100.000 bis zu zwei Millionen Spielarten aus. Um ein möglichst ganzheitliches Bild des Proteinnetzwerks zu bekommen, konzentriert sich Michael Hecker von der Universität Greifswald auf das Proteom von Bakterien. Zum einen fällt bei Prokaryoten das Splicing weg, zum anderen besitzen Bakterien insgesamt deutlich weniger Proteine als zum Beispiel menschliche Zellen. In seinem Beitrag auf Seite VII arbeitet Hecker am Beispiel des als „Krankenhauskeim“ bekanntgewordenen Bakteriums S. aureus

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Visualisierung des auf einem 2D-Gel aufgetrennten Proteoms durch Farbkodierung heraus, wie die Proteomik bei der Aufklärung der Pathophysiologie von Krankheitserregern helfen kann. Eine Standardmethode zur Ermittlung von Protein-Protein-, Protein-Peptid- oder auch Protein-DNA-Wechselwirkungen ist die Display-Technologie. Bei In-vivo-Display-Methoden wird eine Bibliothek von gentechnisch veränderten Phagen, Hefen oder Bakterien eingerichtet, die jeweils verschiedene Peptide oder Proteine auf der Oberfläche exprimieren. Durch die Gabe auf immobilisierte Zielstrukturen kann so schnell derjenige Klon identifiziert werden, auf dessen Oberfläche ein an das Ziel bindendes Peptid/Protein vorhanden ist. Darüber hinaus wurden auch In-vitro-Display-Varianten wie mRNA- oder Ribosome-Display entwickelt. Auf Seite XIX stellen die LABORWELT-Experten die neuen Trends dieses Forschungsfelds vor.

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15. Jahrgang | Nr. 5/2014 | III

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Serie Labormarkt im Umbruch (22)

Sysmex: Auf Durchfluss geschaltet

Sysmex Corp. (2014) Umsatz: 1,35 Mrd. Euro Gewinn (EBIT): 240 Mio. Euro Umsatzrendite (nach Steuern): 11,1% Mitarbeiter: 6.211 Präsident und Vorstandsvorsitzender: Hisashi Ietsugu Nettoumsatz nach Regionen

Dr. Martin Laqua, Redaktion Laborwelt

Europa, Naher Osten, Afrika 28,9%; Japan 21,8%; Süd& Nordamerika 21,6%; China 19,7%; Pazifik 7,9%

Milliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieser LABORWELT-Serie einen Blick auf die wichtigsten Akteure, ihre Strategien und Deals zu werfen. Nach Jahrzehnten im Dornröschenschlaf scheint die Firma Sysmex aus dem japanischen Kobe seit etwa zehn Jahren wachgeküsst. Ihre Hämatologie-, Hämostase- und Urinanalyse-Geräte werden mittlerweile in der ganzen Welt verkauft – unter anderem durch Vertriebspartnerschaften mit Roche oder Siemens. Jetzt setzt auch die technologische Expansion ein. Nach der Aufnahme von Geräten zur automatisierten Immunhistochemieanalyse ins Portfolio greift Sysmex den Laborgerätemarkt auch aus der Richtung Durchflusszytometrie an. Den Startschuss gab 2013 die Übernahme der deutschen Firma Partec. Die verkaufte ihre kompakten Geräte bisher vorwiegend in Afrika. Mit Sysmex‘ Organisations- und Finanzkraft im Rücken sollen sie nun auch in den Laboren Europas Einzug halten. onszahlen in dieser Berufsgruppe führte. In den 90er Jahren expandierte die Firma zunächst vor allem geographisch. Zum Ende des Geschäftsjahres 2014 verbuchte Sysmex zum 14. Mal in Folge eine Umsatzsteigerung. Erwirtschaftete die Firma 2004 noch umgerechnet 480 Mio. Euro, schaffte sie 10 Jahre später schon knapp das Dreifache. Mit 60 Gesellschaften in 38 Ländern hat Sysmex bisher Geräte in fast alle Länder des Erdballs verkauft (170). Um weiter so konstant zu wachsen, wendet sich CEO Hisashi Ietsugu seit einiger Zeit verstärkt der personalisierten Medizin zu. So läuft seit 2013 eine Kooperation mit Japans Nationalem Krebszentrum zur Entwicklung neuer Reagenzien für die In-vitroDiagnostik (IVD). Auch die IVD-Produktion wurde ausgebaut: Mitte 2014 eröffnete in Japan eine neue Fabrik, die die Kapazitäten auf das Dreifache des bisherigen Niveaus schraubt. Den deutlichsten Schritt in Richtung Companion Diagnostics machten die Japaner aber in Deutschland. Sysmex war hier lange Zeit relativ unbekannt – obwohl die Region Europa für Sysmex enorm wichtig ist. Die in Norderstedt bei Hamburg beheimatete Sparte trägt 40% zum Gesamtumsatz bei. Sysmex fungierte bisher vor allem als Kooperationspartner: Seit Mitte der

© Sysmex

Die Ursprünge von Sysmex liegen im Jahr 1934. Mit der Herstellung und dem Vertrieb von Megaphonen verdiente sich TOA Electronics damals die ersten Sporen. Den Beschallungsspezialisten gibt es noch heute. Die 3.000 Mitarbeiter produzieren Verstärker, Konferenzsysteme und Sprachalarmanlagen. Auf der Suche nach neuen Geschäftsfeldern stieg die japanische Firma 1968 in das Medizintechnik-Geschäft ein, trennte die beiden Aktivitäten aber bereits vier Jahre später. Die Medizintechnikfirma wuchs unter dem Namen Toa Electric Co. über die Jahre stärker als die Mutterfirma und beschäftigt heute 6.000 Mitarbeiter. Die Umbennennung in Sysmex erfolgte 1998. Der Grund: Für viele Kunden war die Firma synonym mit der wichtigsten, bereits 1978 eingeführten Produktlinie, den Sysmex-Hämatologie-Instrumenten. Hier liegt auch heute noch die Kernkompetenz der Firma. Bis Mitte der 80er Jahre blieb die Entwicklung beschaulich, doch dann erkannte Sysmex das Potential einer größeren Automatisierung der Blutdiagnostik. Die Bestimmung von Blutparametern wie der Zahl, Größe und Art von Blutkörperchen durch Labortechniker erfolgte mit den neuen Geräten, ohne in Kontakt mit den Blutproben zu kommen, was zu einem deutlichen Rückgang der Infekti-

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Nettoumsatz nach Geschäftsfeldern Hämatologie 64,8%; Hämostase 15,1%; Urinanalyse 7,9%; andere IVD-Produkte 4,1%; Klinische Chemie 2,0%; Immunhistochemie & Biowissenschaften 2,0%

90er Jahre unterhält Sysmex mit dem Schweizer Konzern Roche und mit Siemens Healthcare aus Deutschland jeweils langjährige Vertriebs- und Serviceabkommen für Sysmex‘ Hämatologiebeziehungsweise Hämostase-Geräte.

Stark durch deutsches Know-how In aller Munde war Sysmex dann 2013, als die Japaner zwei deutsche Fliegen mit einer Klappe einfingen: Im Herbst 2013 sicherten sie sich alle Anteile der Diagnostik-Firmen Inostics aus Hamburg und Partec aus Görlitz. Inostics, 2008 durch die Hamburger Firma Indivumed gegründet, verfügt über das Wissen, wie DNA von Krebszellen im Blut aufgespürt und analysiert werden kann. Die „liquid biopsy“ kann somit Gewebebiopsien überflüssig machen. Damit hat sich Sysmex das Know-how gesichert, die Diagnostik für individualisierte Krebstherapien zu stemmen. Inostics profitiert vor allem vom starken Sysmex-Vertrieb, bekommt aber auch Zugang zu dessen Pharmakontakten. Die Akquise von Partec ist ähnlich gelagert, wenn auch auf einem für Sysmex deutlich vertrauterem Terrain. Die Ostsachsen stellen Durchflusszytometriegeräte und Fluoreszenzmikroskope her. Mit Partecs starker Präsenz in Afrika hat Sysmex auf einen Schlag Vertriebskanäle in 200 Länder – und Partec selbst nun den gewünschten Zugang zu den asiatischen Märkten. Sysmex‘ nachhaltiges Engagement beweist eine derzeit laufende 7,5 Mio. Euro schwere Investition in eine Produktionserweiterung. Das ausgegebene Ziel: ein Angriff auf die Platzhirsche der Durchflusszytometrie Becton, Dickinson & Co. und Beckman Coulter auf den etablierten Märkten USA und Europa. Die Initiative zu der Übernahme kam übrigens von Partec selbst. Eine auf sich allein gestellte Firma wäre im wachsenden Markt für Durchflusszytometrie-Analysen schnell marginalisiert worden, so die Befürchtung der Deutschen. Dass Sysmex nicht lange überredet werden musste, lag zum einen an Partec selbst. Auf der anderen Seite gilt es für die Japaner, das eingeschlagene Wachstumstempo zu halten und somit Chancen zu nutzen, wenn sie sich auftun. Auch wenn Sysmex‘ Aktivitäten noch keinen Tsunami auf dem Labormarkt auslösen, der in Kobe ausgelöste Wellengang wird stärker. LABORWELT

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Proteomik Biopharmazeutika-Produktion

Als Lohnhersteller zur schwarzen Null LABORWELT Herr Kintzel, warum drängt die Cevec GmbH auf den Lohnherstellermarkt? Kintzel Wir haben inzwischen eine ganze Reihe von Kunden, die unsere CAP-Zelllinie für ihre klinischen Projekte evaluieren oder bereits einlizenziert haben. Bisher haben wir neben der eigentlichen Zelllinie auch schon die eigenen Zellkulturmedien sowie Protokolle für die Prozessführung mit angeboten. In der Wertschöpfungskette waren wir so aber auf den Bereich Lizenzen limitiert. LABORWELT Es geht also um zusätzliche Umsätze? Kintzel Wir haben festgestellt, das viele unserer Kunden zusätzliche Unterstützung wünschen, zum Beispiel auf regulatorischer Ebene oder bei der Prozessoptimierung. Das haben sie bisher von einer Contract Manufacturing Organisation (CMO) beauftragt. Wir können das aber besser. LABORWELT Wie erfolgt der Einstieg in die Lohnherstellung denn ganz konkret? Kintzel Wir haben schon bisher mit verschiedenen CMOs zusammengearbeitet. Erst kürzlich haben wir ein nicht-exklusives Joint Venture mit dem por tugiesischen Unternehmen Genibet gestartet. Die Firma in Lissabon hat bereits zuvor mit unseren Zelllinien gearbeitet. Der Kunde kann jetzt das Projekt vollständig bei Cevec beauftragen. Wir übernehmen das gesamte Projektmanagement, die Generierung von stabilen Zelllinien sowie die Betreuung der regulatorischen Aspekte. LABORWELT Ist es für den Kunden nicht egal, ob er sich direkt an Cevec wendet oder eine CMO beauftragt? Die CAP-Zelllinie könnte er ja in jedem Fall einlizenzieren, wenn er das möchte … Kintzel Wir merken schon, dass es qualitativ einen massiven Unterschied macht, ob wir oder VI | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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Dritte den Prozess von den ersten Versuchen bis zur Produktionsoptimierung steuern. Wenn in der Vergangenheit ein CMO neben unserer auch andere Zelllinien wie HEK293 oder CHO ausprobiert hat, dann hat das in der Regel nicht dazu geführt, dass der Kunde sich nicht für die CAP-Zellen entschieden hat. Das Projekt hat dann aber natürlich länger gedauert und ist für den Kunden auch teurer geworden. LABORWELT Mit ihrem Angebot treten Sie in Konkurrenz zu ihren wichtigsten bisherigen Geschäftspartnern, den CMOs. Ist das nicht problematisch? Kintzel Grundsätzlich könnte man denken, das sei eine Konkurrenzsituation. Die Realität hat jedoch gezeigt: Wir kommen eher mit mehr CMOs ins Gespräch, als dass wir auf Ablehnung stoßen. Es gibt mit Sicherheit auch kompetitive Situationen, mit denen man leben muss. Aber wir sind da positiv gestimmt – auch weil wir einigen CMOs weiterhin die Möglichkeit geben, unsere Zelllinie einzulizenzieren und selbst dem Kunden anzubieten. LABORWELT Wie finanzieren Sie die zusätzlichen Investitionen? Kintzel Cevec macht bereits eigene Umsätze. Durch den Einstieg ins CMO-Geschäft wollen wir ab 2016/2017 profitabel werden. Mit einer Finanzierungsrunde, die wir im kommenden Jahr abschließen wollen, möchten wir zusätzlich 4 Mio. Euro beschaffen. Das Geld soll sowohl von bestehenden als auch neuen Anlegern kommen. LABORWELT Mit CAP-CMV hat Cevec ja bereits ein biotherapeutisches Projekt ausgegründet. Wird diese Strategie weiterverfolgt? Kintzel Wir haben drei sehr interessante neue Biotherapeutika: einen C1-Inhibitor, ein humanes alpha1-Antitrypsin und eine alkalische Phosphatase. Zwei dieser Proteine sind bereits als blutgereinigte Präparate im Markt. Die kann

© Cevec

Seit Ende September tritt die Cevec GmbH in Köln auch als Lohnhersteller für die eigene CapZelllinie auf. Gleichzeitig hat das Unternehmen die Geschäftsführung kräftig umgebaut. Im Interview mit LABORWELT spricht Firmenchef Wolfgang Kintzel über die zukünftigen Pläne des Unternehmens in Köln.

Wolfgang Kintzel

Wolfgang Kintzel wurde 2010 Geschäftsführer der Cevec Pharmaceuticals GmbH. Zuvor war er bei der Amaxa GmbH für Marketing & Sales zuständig, begleitete die Entwicklung des Unternehmens vom Start up mit wenigen Mitarbeitern bis zum Verkauf als mittelständisches Unternehmen an die Lonza-Gruppe 2008.

man rekombinant bisher nur in Cap-Zellen in ausreichender Qualität herstellen. In diese Projekte haben wir viel Zeit und Geld investiert. Im Tierversuch zeigten unsere glykooptimierten Proteine bessere Halbwertszeiten als das jeweilige Originator-Produkt. Ob wir diese Moleküle auslizenzieren oder wie im Falle des HCMV-Impfstoffs ausgründen, entscheiden wir in den kommenden Monaten. LABORWELT Wovon hängt diese Entscheidung ab? Kintzel Eine Ausgründung würde zunächst die Investorenstruktur von Cevec widerspiegeln. Die Anteile einigeer Fonds, die nicht in Projekte investieren dürfen, würden zukünftig verwässert. Zudem würde Cevec natürlich Assets in die neue Tochter hineingeben müssen. Bei einer Auslizenzierung würden die Erlöse zunächst direkt Cevec zugute kommen. Hier gilt es eine gute Balance zu finden, gegebenenfalls durch ein Mischmodell, bei dem einzelne Moleküle auslizenziert und andere ausgegründet werden. Aber hier ist noch nichts entschieden. LABORWELT Warum entwickelt Cevec die Moleküle nicht selbst? Kintzel Wir haben uns schon überlegt, das selbst zu machen und als klinisches Projekt zusätzlich zu finanzieren. Dies würde unser Geschäftsmodelll aber zu sehr diversifizieren. LABORWELT

24.10.2014 12:45:56 Uhr

Modellorganismen Proteomik

Proteomik erhellt (Patho-) Physiologie von Bakterien

mensionalen Gelelektrophorese Proteine des Gram-positiven Modellorganismus Bacillus subtilis zu analysieren. Diese Technik ermöglicht die Auftrennung hunderter verschiedener Proteinspezies. Wenig später ermöglichten Analysen mittels MALDI-ToF die Identifikation aufgetrennter Proteinspots. Als große Limitation dieser Technologie stellte sich aber schon bald das stark eingeschränkte analytische Fenster sowie die geringe Empfindlichkeit heraus. Vor allem hydrophobe Proteine oder Proteine mit extremen molekularen Massen oder isoelektrischen Punkten lassen sich damit nur aufwendig oder gar nicht nachweisen. Gelbasierte Methoden erlauben deshalb, nur einen kleinen Teil des Proteoms sichtbar zu machen. Diese Einschränkung konnte durch moderne gelfreie massenspektrometrische Verfahren überwunden werden. Sie ermöglichen die Analyse komplexer Proteingemische direkt nach Trypsinverdau und zeigen im Vergleich eine mehrfach höhere Auflösung. Trotz der genannten Nachteile finden gelbasierte Methoden vor allem für (bakterien-) physiologische Fragestellungen bis heute breite Anwendung. Mit ihrer Hilfe können beispielsweise unbekannte posttranslationale Modifikationen einfach sichtbar gemacht werden. Die Bedeutung gelfreier Analysen ist für die Erfassung des Gesamtproteoms aber unumstritten. Optimierte Protokolle erlauben die umfassende Analyse des Proteoms Gram-

Michael Hecker, Stephan Fuchs, Dörte Becher, Frank Schmidt, Susanne Engelmann und Uwe Völker, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Greifswald „What is life?“ Mit den ersten vollständig entschlüsselten Genomsequenzen von Haemophilus influenzae und Saccharomyces cerevisiae eröffnete sich den Lebenswissenschaften Mitte der 1990er Jahre eine neue Ära – und eine Antwort auf Erwin Schrödingers Frage schien greifbar. Erstmals war es möglich, das Leben in seiner Gesamtheit und nicht nur in Teilen zu analysieren. Der anfänglich großen Euphorie folgte allerdings Ernüchterung, da die tatsächlichen Prozesse des Lebens nur bedingt von der genomischen Sequenz abgeleitet werden können. Die funktionelle Genomforschung versucht nun, hier anzuknüpfen. Technologien zur Erfassung der Gesamtheit aller Proteine einer Zelle oder eines Organismus (Proteomik) kommen deshalb auf dem Weg vom Bauplan des Lebens zur Zellphysiologie eine besondere Bedeutung zu. Mit zunehmender Komplexität des betrachteten Organismus ist dieses Ziel schwerer zu erreichen. Deshalb bieten sich Bakterien mit ihren nur einigen hundert bis wenigen tausend verschiedenen Proteinspezies als Modellsysteme an. Das menschliche Proteom hingegen umfasst weit mehr als 100.000

Proteinspezies und scheint damit für eine systemweite Untersuchung noch zu komplex. Dies zu ändern und das humane Proteom in seiner Gesamtheit und Dynamik zu analysieren, ist Ziel intensiver Anstrengungen weltweit. Um Einblicke in die molekularen Vorgänge des Lebens zu gewinnen, sind die Erfassung der molekularen Akteure des Lebens und damit die Inventur des Gesamtproteoms wichtige erste Schritte. Bereits Anfang der 1980er Jahre wurde deshalb begonnen, mit Hilfe der zweidi-

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Proteomik Modellorganismen

positiver Bakterien in vier Hauptfraktionen: zytosolisches Proteom, Membranproteom, oberflächenassoziiertes Proteom und Sekretom. Untersuchungen des Sekretoms liefern beispielsweise wichtige Informationen über die Sekretionsleistung eines Organismus, was für die Optimierung von Enzymbildnern wie B. licheniformis im Rahmen der weißen Biotechnologie von großem (wirtschaftlichen) Interesse ist.

Erst Modellorganismus, dann Krankheitserreger Die Kombination der beschriebenen Techniken erlaubt es, das Proteom von B. subtilis und anderen Bakterien nahezu vollständig zu erfassen. In jüngerer Zeit konnte die in Greifswald vorhandene Proteomexpertise vom Modellorganismus B. subtilis auf verwandte pathogene Bakterien, insbesondere Staphylococcus aureus, übertragen werden, um zu einem neuen Verständnis der Pathogenität dieser höchst gefährlichen Bakterien zu gelangen. Diese Bakterien können schwerwiegende und lebensbedrohliche Erkrankungen wie Sepsis, Endokariditis oder Osteomyelitis Abb. 1. Gesamtproteom von S. aureus (Stamm COL). A: Elektronenmikroskopische Aufnahme von S. aureus COL mit Illustration der Hauptfraktionen des Proteoms. B: Das theoretische 2D-Gel von S. aureus COL. Jeder Punkt repräsentiert ein aus der Genomsequenz abgeleitetes Protein mit spezifischer Molekularer Masse und isoelektrischem Punkt. Jeder Proteinspot wurde entsprechend der vorhergesagten Lokalisation eingefärbt. C: Übersicht der abgeleiteten und tatsächlich nachgewiesenen (identifizierten) Proteine in Abhängigkeit ihrer vorhergesagten Lokalisation.

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Abb. 2. Das Gesamtproteom von S. aureus (Stamm COL). Humane Zellen wurden eine bzw. sechs Stunden lang mit S. aureus infiziert. Mittels eines speziellen Zellsortierungsverfahrens wurden die Bakterien anschließend wieder isoliert und ihre Proteine durch massenspektrometrische Verfahren identifiziert und quantifiziert. Die infektionsbiologische Interpretation unterstützen Visualisierungsverfahren wie die gezeigte Voronoi Treemap auf Basis normalisierter und logarithmierter Proteinmengen. hervorrufen. Neben ihrem virulenten Potential zeichnen sich Staphylokokken durch die Fähigkeit aus, Resistenzen gegenüber allen bisher bekannten Klassen von Antibiotika zu erwerben. Solche multiresistenten Staphylokokken (MRSA) sind für etwa ein Drittel der gefürchteten und nur schwer zu behandelnden Krankenhausinfektionen verantwortlich. Die weltweite Ausbreitung von MRSA nährt die Befürchtung, in präantibiotische Zeiten zurückzufallen. Der „Panoramablick“ der Proteomanalyse soll deshalb helfen, die Physiologie und Pathogenität dieses Bakteriums in einer neuen Komplexität und Dimension zu erfassen und zu verstehen. Auch hier galt der erste Schritt der möglichst vollständigen Charakterisierung des Gesamtproteoms. Unter Berücksichtigung verschiedenster Wachstumsbedingungen, Nährstoffmangel- und Stresssituationen konnten mehr als 80% aller exprimierten Proteine nachgewiesen werden (Abb. 1). Neue Methoden der absoluten Quantifizierung ermöglichen einen nahezu lückenlosen Überblick über aktive LABORWELT

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Modellorganismen Proteomik

g n i v r se s! t s i t scien

Stoffwechselprozesse und den Abgleich mit Konzentrationen von Stoffwechselintermediaten (Metabolomics).

Infektionen: Welche Proteine sind relevant? Untersuchungen des oberflächenassoziierten Proteoms sowie des Sekretoms sind im Falle pathogener Bakterien von besonderem Interesse. Diese Proteine vermitteln den ersten Kontakt mit dem menschlichen Wirt und sind damit von zentraler Bedeutung für Kolonisierung, Invasion und Biofilmbildung. Das Sekretom umfasst die Mehrzahl der Virulenzfaktoren. Diese Studien leisten damit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Pathogenität von S. aureus, was wiederum Voraussetzung für die Entwicklung effektiver Therapien ist. Neue Einblicke in infektionsrelevante Vorgänge zu gewinnen und damit geeignete Ziele für neue Behandlungsstrategien zu identifizieren, zählt zu den wichtigsten aktuellen Herausforderungen der Forschung. Nicht weniger bedeutend ist die Identifikation von Markerproteinen, deren Expression einen spezifischen physiologischen Zustand des Bakteriums signalisieren. So lassen sich die Bedingungen im natürlichen Habitat oder infiziertem Gewebe besser verstehen. Für S. aureus konnte basierend auf den Proteomstudien der letzten Jahre eine Proteomsignaturbibliothek aufgebaut werden. Sie vergleicht relative Proteinsyntheseraten unter verschiedenen infektionsrelevanten Bedingungen wie Sauerstoffmangel, oxidativem Stress oder nach Antibiotikaexposition. Diese In-vitro-Befunde müssen nun um Untersuchungen zur Interaktion von Pathogen und Wirt in vivo erweitert werden. In solchen Studien (Infektionssettings) ist der Nachweis von bakteriellen Proteinen vor dem Hintergrund massiver Mengen an Wirtsproteinen problematisch. Mittels Kombination von Fluoreszenzmarkierung der Bakterien, Zellsortierung und hochsensitiven massenspektrometrischen Verfahren konnte aber ein optimierter Arbeitsablauf etabliert werden, der es erlaubt, Proteine aus nur einer bis drei Millionen Bakterien, die nach Internalisierung durch humane Wirtszellen reisoliert wurden, effektiv zu erfassen (Abb. 2). Inzwischen erlauben weitere Verbesserungen dieses standardisierten Arbeitsablaufs, aus nur einer bis zwei Milllionen Bakterien über 50% aller kodierten S. aureus-Proteine nachzuweisen. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, die Adaptation von S. aureus an das intrazelluläre Mileu der Wirtszelle zu untersuchen. Effiziente Visualisierungsmethoden unterstützen die infektionsbiologische Interpretation der gewonnenen Daten und deren Abgleich mit der Proteomsignaturbibliothek. Dies alles trägt zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie von S. aureus und anderen Krankheitserregern bei, um die Voraussetzungen für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien im Kampf gegen gefährliche Infektionskrankheiten zu schaffen.

Protein-Elektrophorese ▐ Fertiggele ▐ Proteinmarker ▐ Färbereagenzien ▐ Gelmedien & Puffer ▐ Geräte

Wie organisieren Proteine das Leben? Mit der Erfassung des Proteininventars und seiner Dynamik in Modellorganismen wie B. subtilis und S. aureus ist der entscheidende zweite Schritt nach der Genomsequenzierung auf dem Weg zum Verständnis des Lebens gemacht. Die komplexen Regulationsmechanismen der Genexpression garantieren, dass jedes einzelne Protein in der aktuell benötigten Menge und zur rechten Zeit zur Verfügung gestellt werden kann. Der nächste Schritt wird es nun sein, zu verstehen, wie die Lücke von der Bereitstellung des Proteininventars bis zum eigentlichen zellulären Leben geschlossen werden kann. Systembiologische Arbeiten beschäftigen sich mit den Interaktionen der Proteine und legen damit ein immer größer werdendes, fragiles Proteinnetzwerk frei. Proteine werden modifiziert, geschädigt, repariert. Irreparable oder nicht mehr benötigte Proteine geben ihre wertvollen Ressourcen im proteolytischen Abbau wieder frei. So beschreibt das Leben der Proteine das Leben des Organismus. Der Weg von der Proteinsynthese am Ribosom bis zu den eigentlichen Prozessen des Lebens bleibt noch lange nicht verstanden und stellt die zell- und systembiologische Herausforderung der kommenden Jahre dar – letztlich um Schrödingers Frage „What is life“ neu zu beantworten. LABORWELT

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Proteomik Spitzentechnologie

Besseres Screening durch neue Proteinaufreinigung Dr. Maria Zweig, Mettler Toledo GmbH Mit Hilfe der modernen Gentechnik ist es heutzutage möglich, nahezu jedes annotierte Gen in einem geeigneten Expressionssystem zu exprimieren. Die Identifizierung von optimalen Expressionsbedingungen spielt dabei eine entscheidende Rolle, ob das Testmolekül zu einem Marktprodukt werden kann. Zuerst werden kleine Mengen des Proteins in einer maximalen Anzahl an sinnvollen Variationen exprimiert, um die quantitativ und qualitativ optimalen Bedingungen zu identifizieren. Eine alternative, flexible Technologie für eine schnelle parallele Aufreinigung mehrerer Proben bietet Mettler Toledo mit dem PureSpeed-System. Rekombinante Proteine sind aus unserem Alltag nicht mehr wegzudenken. Sie finden eine große Anwendung in der Lebensmittel-, Waschmittel- und Pharmaindustrie. Die prominentesten Beispiele sind das Hormon Insulin, das die Behandlung der Zuckerkrankheit unterstützt und das Enzym Lab, das bei der Produktion bestimmter Käsesorten eingesetzt wird. Aus Kosten- und Risikogründen sind medizinisch und diagnostisch genutzte Proteine vor allem rekombinante Proteine. Erst 1982 wurde in Deutschland das erste rekombinante Insulin und somit das erste gentechnisch hergestellte Medikament (Biopharmazeutikum) überhaupt auf den Markt gebracht. Heute gibt es in Deutschland be-

reits mehr als 100 gentechnisch hergestellte Arzneistoffe in mehr als 150 Medikamenten. Die Ergebnisse des Branchenreports „Medizinische Biotechnologie in Deutschland 2014“ belegen, dass 2013 die Umsätze mit Biopharmazeutika in Deutschland um 8,5 % auf mehr als 6,5 Mrd. Euro gewachsen sind. Diese Studie belegt, dass die Bedeutung der Biopharmazeutika weiter zunimmt und die medizinische Biotechnologie weiterhin gute wirtschaftliche Perspektiven hat. Die gentechnische Herstellung dieser Wirkstoffe ist aufgrund der beteiligten Prozesse und Verfahren sowie der Größe der Moleküle (im Durchschnitt circa 1.000-mal größer als viele chemische Wirkstoffe) sehr komplex.

Abb. 1. Das Rainin PureSpeed-Proteinreinigungssystem besteht aus mit verschiedenen Harztypen vorgepackten Pipettenspitzen und einer elektronischen E4 XLS-Mehrkanalpipette. Das Standardprotokoll kann für jeden Versuch individuell angepasst werden. Jeder Parameter ( Probenvolumen, Durchflussrate, Anzahl der Binde- oder Waschzyklen) kann nach Belieben definiert werden. Der Reinigungsprozess erfolgt halbautomatisch: Sobald eine Reinigungsphase angeschlossen ist, wird der Bediener mit einem akustischen und visuellen Signal informiert, dass die Pipette in die nächste Wellreihe plaziert werden kann. Mit dieser Technologie können bis zu 12 Proben parallel in sehr kleinem Maßstab aufgereinigt oder unter bis zu 12 verschiedenen Bedingungen gescreent werden. X | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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Heutzutage ist es mit Hilfe der modernen Gentechnik möglich, nahezu jedes annotierte Gen in einem geeigneten Expressionssystem zu exprimieren. Ob das Testmolekül zu einem Marktprodukt werden kann, hängt vom Erfolg bei der Identifizierung optimaler Expressionsbedingungen ab. Die Auswahl an Wirtsorganismen und Expressionsvektoren ist groß und meist müssen viele verschiedene Kombinationen ausprobiert werden, bevor es zu einer erfolgreichen Proteinproduktion kommt. Zuerst werden kleine Mengen des Proteins in einer maximalen Anzahl an sinnvollen Variationen exprimiert, um die quantitativ und qualitativ optimalen Bedingungen zu identifizieren. Erst im zweiten Schritt werden die identifizierten Bedingungen im großen Maßstab zur Expression eingesetzt und weiter verfeinert.

Häufige Proteinaufreinigungs­ methoden Rekombinante Proteine können durch Verwendung spezifischer Markerstrukturen (tags) relativ unproblematisch gereinigt werden. Typische Beispiele sind Fusionsproteine, bei denen auf DNA-Ebene die kodierenden Bereiche für eine tag-Struktur und für das gewünschte Protein ligiert und als ein Protein exprimiert werden. Über spezifische Affinitätschromatographien mit Antikörpern gegen die tag-Struktur können solche Fusionsproteine mit einem einzigen Schritt gereinigt werden. Die Affinitätsreinigung wird häufig mit Schwerkraft- oder Spinsäulen durchgeführt. Handelsübliche Schwerkraftsäulen weisen eine geringe Durchflussrate auf, was das Einsammeln von Fraktionen sehr zeitaufwendig macht. Das Trennverfahren mit Spinsäulen läuft im Vergleich zu Schwerkraftsäulen deutlich schneller ab. Allerdings wird auch dieses Verfahren zu einer zeitaufwendigen Angelegenheit, wenn mehrere Proben bearbeitet werden. Jedes Eluat muss einzeln entfernt und für die nachfolgende Analyse aufbewahrt werden, bevor die Matrix mit dem nächsten Puffer im Schrittgradienten befüllt und die Probe erneut zentrifugiert wird. Die Magnetic-Bead-Technologie ist eine manuelle Methode, die ebenfalls sehr zeitintensiv ist. Obwohl damit einzelne Proben schnell vorbereitet sind, erhöhen viele Proben die Bearbeitungszeit, weil auch diese nacheinander bearbeitet werden müssen. Die „Fast Protein Liquid Chromatography“ liefert sehr reine Endproben, erfordert aber auch erhebliche finanzielle Investitionen. Eine alternative, flexible Technologie für eine schnelle parallele Aufreinigung mehrerer Proben bietet Mettler Toledo mit dem ­PureSpeed-System (siehe Abb. 1). Das System besteht aus einer elektronischen Mehrkanalpipette und Affinitätsharzspitzen. Die Produktfamilie der PureSpeed-Spitzen umfasst LABORWELT

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Spitzentechnologie Proteomik

eine große Auswahl an Affinitäts-, Ionenaustausch- und C18-Harzen. Das neue, patentierte Design der PureSpeed-Spitzen ermöglicht einen bidirektionalen Strom der Flüssigkeit durch das Harzbett und daher eine verbesserte Reinigung gegenüber Spitzen mit nur einer Flussrichtung, sodass die Menge und die Reproduzierbarkeit der Proteinaufnahme maximiert wird. Die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung der Probe stellt sicher, dass selbst langsame Proteine eine ausreichende Kontaktzeit mit dem Harz haben, und eine maximale Bindung des Proteins gewährleistet wird. Rainin PureSpeed-Affinitätsharzspitzen besitzen ein geringes Totvolumen und bieten dank hydrophiler Diaphragmen mit einer bis zu 100-mal kleineren Fläche als herkömmliche Diaphragmen entscheidende Vorteile, da die Bindung von Verunreinigungen reduziert wird. Auf diese Weise wird ein sehr hohes Verhältnis von Waschvolumen und Harzvolumen von bis zu 50:1 ermöglicht, das in Kombination mit der bidirektionalen Bewegung des Waschpuffers die Effizienz bei der Abscheidung nicht spezifisch gebundener Verunreinigungen aus dem Harzbett erhöht. Es sind nur zwei bis drei Bettvolumen der Elutionslösung – das heißt nur 10 µl für eine 5 µl-Bettspitze – erforderlich, um im Vergleich zu den anderen Technologien Proteine mit einer fünf- bis zehnmal höheren Konzentration zu erhalten. Am Beispiel des Hochleistungsimmunopräzipitationsystems (HPIP) werden die Flexibilität bei den Arbeitsprotokollen, schnellere Arbeitsabläufe und eine verbesserte Datenqualität demonstriert. Das Prinzip der Immunpräzipitation (IP) basiert darauf, dass ein Antigen und der passende (multivalente) Antikörper einen Komplex bilden, der ab einer bestimmten Konzentration ausfällt. Die IP kann dazu verwendet werden, einzelne Proteine aus einem Proteingemisch zu konzentrieren und nachzuweisen – beispielsweise aus Zellysaten, Körperflüssigkeiten oder anderen biologischen Quellen. In dem nachfolgenden Versuch wurden 10 µg α-GST Antikörper eingesetzt, um 5 µg GST-getagten Antigen mit PureSpeed-Protein G oder losen Protein G-Agarose-Beads zu präzipitieren. Die Reaktion fand statt im 200 µl E.coli-Lysat. Es konnte demonstriert werden, kDa

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Abb. 2. Das SDS-Page-Gel zeigt die Immunopräzipitation von 5 µg GST-getaggtem Antigenprotein mit 10 µg α-GST-Antikörper mit PureSpeed-Protein-G-Pipettenspitzen im Vergleich zu losen Protein-G-Agarosekügelchen. Die Proteinmarker-Leiter ist mit L gekennzeichnet, das E.coli Proteinlysat ist mit SP und SA gekennzeichnet. Die IP mit dem PureSpeed-System war wesentlich schneller (für 6 Proben 30 Minuten gegenüber 190 Minuten) und lieferte eine größere Menge immunpräzipitiertes Protein. dass die direkte IP mit dem PureSpeed-System wesentlich schneller ist und eine höhere Ausbeute liefert (siehe Abb. 2).

Trennung von BSA und Lysozym mit starken Anionenaustauschspitzen Die isoelektrischen Punkte von Lysozym und BSA sind 11, 4 und 4,8. In Lösungen mit neutralem oder fast neutralem pH-Wert ist Lysozym positiv und BSA negativ geladen. BSA bindet mit einer höheren Affinität an das Harz als Lysozym und wird mit höheren Salzkonzentrationen eluiert. 833 µg Lysozym und 833 µg BSA wurden vermischt und anschließend mit starken PureSpeed-Anionenaustauschspitzen getrennt. Lysozym (untere Bande) weist eine positive Nettoladung bei einem pH-Wert von 7,63 auf, bindet nur schwach an das Harz und wird bei 80 mM NaCl-Konzentration eluiert. BSA (obere Bande) 80 100 120 140 160

L

weist eine negative Ladung bei einem pH-Wert von 7,63 auf und bindet stark an das Harz und kann somit erst ab einer hohen (> 80 mM) NaClKonzentrationen eluiert werden. Das Screening von 18 verschiedenen Salzkonzentrationen für das Eluieren des gewünschten Proteins hat insgesamt nur 90 Minuten gedauert. Dieses neue System bildet in Kombination mit Ionenaustausch-, Affinitäts- (IMAC, ProA und ProG) und Entsalzungsspitzen eine neue, effiziente, ökonomische und zeitsparende Methode für Proteinaufreinigung und Screening.

Kontakt: Dr. Maria Zweig maria.zweig@mt.com Tel.: +49 641-507294 Mettler Toledo GmbH Ockerweg 3, 35396 Gießen www.mt.com/PureSpeed

M 180 200 220 240 260 280 300 340 360

60 50 40 30 20 15 10

Abb. 3. Das SDS-Page-Gel zeigt die Auftrennung von BSA (obere Banden) und Lysozym (untere Banden) mit Hilfe der starken PureSpeed-Anionaustauschspitzen. L Proteinmarker-Leiter; M Proteingemisch; C Proteingemisch nach Erfassungsschritt; W Waschfraktion; xx-NaClKonzentrationen zum Eluieren. Bindungsschritt 8 min, Waschschritt 4 min, Eluierschritt 77 min. Gesamtdauer: 1 Stunde 29 Minuten. LABORWELT

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Proteomik 2D-PAGE

Verbesserte Triangulation für die 2D-Gel-Auswertung Günter Theßeling, SERVA Electrophoresis GmbH Durch die Einführung eines Referenzpunktgitters in die 2D-Elektrophorese gelingt eine deutlich verbesserte Koordinatenbestimmung von Proteinspots in der Auswertung von 2DGel-Mustern. Das Referenzgitter wird erzeugt durch fluoreszenzmarkierte Markerproteine, die in regelmäßigen Abständen aufgetragen werden und gleichzeitig mit der Probe laufen, die mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist und nach der Elektrophorese bei einer anderen Wellenlänge detektiert wird. Durch die Referenzpunkte wird die Genauigkeit der Spotlokalisierung um eine Größenordnung verbessert.

Falschfarbendarstellung einer CoFGE-Trennung von E.coli-Proteinen (mit G-Dye 300 rot markiert), Proteinstandard mit G-Dye 200 grün markiert. Die 2D-Elektrophorese ist die Protein-Separationsmethode mit der mit großem Abstand höchsten Auflösung – und der Fähigkeit, aus komplexen Proteingemischen tausende von „Proteinspots“ darzustellen. Hierbei wird die Technik der eindimensionalen isoelektrischen Fokussierung mit der Technik der eindimensionalen SDS-PAGE kombiniert, also die Trennung nach dem isoelektrischen Punkt mit der von der Molekülgröße abhängigen Trennung in der SDS-PAGE. Zur Auswertung der 2D-Gele werden heute in fast allen Fällen die Proteinspotmuster als Bild erfaßt und die XY-Koordinaten der Spots mit geeigneter Software trianguliert.

Das Problem der Vergleichbarkeit Um einen Vergleich der Muster verschiedener Gele zu ermöglichen, werden sie „normalisiert“ und übereinandergelegt. Nach der Bildbearbeitung werden dann die Spots ausgewählt, die weiter analysiert werden sollen. Die Spots werden ausgestochen, die Proteine im Gel enzymatisch verdaut und die Peptide dann im Massenspektrometer analysiert. XII | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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Eine durch Triangulation bestimmte XY-Koordinate der Proteinspots ist bei der Auswahl der zu analysierenden Spots eine wichtige Voraussetzung. Je genauer die XY-Positionen bestimmt werden können, desto zuverlässiger lassen sich auch verschiedene 2D-Gele miteinander vergleichen. Ein grundsätzliches Problem bei der Auswertung von 2D-Gelen sind die technischen Gel-zu-Gel-Variationen, die durch unterschiedliche Probenvorbereitung, Herstellung der Gele und Durchführung der Elektrophorese entstehen. Eine wesentliche Verbesserung der Reproduzierbarkeit wurde durch die Einführung des Markierens von Proben mit Fluoreszenzfarbstoffvarianten, die bei unterschiedlichen Wellenlängen detektiert werden, erreicht( Multiplexing DIGE).

Genauer durch Rasterfahndung Einen weiteren wichtigen Schritt zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der GelAuswertung stellt die hier vorgestellte „Comparative 2D Fluorescence Gel Electrophoresis“

(CoFGE) dar, die von Simone König und ihrer Arbeitsgruppe am IZKF der WWU in Münster entwickelt wurde. Durch das Einbringen sehr vieler Triangulationshilfspunkte in das Gel erlaubt eine CoFGE eine wesentlich präzisere XY-Koordinatenzuordnung. Dazu läßt man, gleichzeitig mit dem IPG-Strip mit der zuvor fokussierten und damit in der 1. Dimension aufgetrennten Probe, fluoreszenzmarkierte Proteinmarkergemische in der SDS-PAGE der 2. Dimension laufen. Die Markerproteine werden in regelmäßigen Abständen auf das SDS-Gel aufgebracht. Bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen werden die Probe und die Markerspuren gescannt und die beiden erzielten Bilder in einer Falschfarbendarstellung kombiniert. Der Proteinstandard enthält eine Reihe reiner Proteine von unterschiedlichem Molekulargewicht, die eine reproduzierbare „Kette“ von Markerpunkten darstellt, die – bei Einhaltung eines immer gleichen Auftragsabstandes – ein Referenzgitter für die Gel-Auswertung ergibt. Während bei der klassischen 2D-Gel-Auswertung die Proteinspots immer über die gesamte Gelfläche berechnet werden müssen, wird bei der CoFGE-Technik das Gel in bis zu 100 kleine Triangulationsfelder aufgeteilt, die eine wesentlich genauere und vergleichbarere Berechnung ermöglichen. Dabei werden die ermittelten Markerpunkte und das resultierende Raster zuerst normalisiert und rechnerisch in ein Idealraster umgerechnet, danach das Proteinspotmuster an das Idealraster angeglichen. Dadurch erreicht man, dass alle technischen Variationen, die durch Probenbehandlung und Gelelektrophorese entstehen, ausgeglichen werden.

Verneigung gegenüber Mercator Die Technik läßt sich sowohl für die weitverbreiteten Vertikalgele als auch für die horizontale SDS-PAGE einsetzen. Die Firma SERVA Electrophoresis GmbH hat in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe König ein spezielles Fertiggel für die horizontalen HPE-Elektrophorese-Systeme entwickelt. Die Gele haben vorgefertigte Aufgabeslots für den markierten Proteinstandard und den IPG-Strip aus der 1. Dimension. In Anlehnung an die Einführung der Meridianlinien in der Kartographie durch den Duisburger Gerd de Kremer, genannt Mercator, erhielten die Gele den Namen „Mercatorgele“. Die Gele und ein fluoreszenzmarkierter Proteinstandard zur Darstellung des Referenzgitters sind bei SERVA erhältlich.

Kontakt: Günter Theßeling SERVA Electrophoresis GmbH Carl-Benz-Straße 7 69115 Heidelberg guenter.thesseling@serva.de LABORWELT

23.10.2014 18:05:30 Uhr

Immunpräzipitation

Affinitäts-Tags in der Biochemie: Die zweite Karriere von GFP

Warten Sie nicht bis ein Warten Sie nicht bis ein Unfall passiert. Unfall passiert. Unfälle am Arbeitsplatz Unfälle am Arbeitsplatz kosten Unternehmen ca. kosten Unternehmen ca. 4% des BIPs†

4% des BIPs

†

Rundum Rundum Schutz Schutz liegt liegt in in Ihren Ihren Händen Händen

Schemata konventioneller Antikörper (Maus) und Schwere-Ketten-Antikörper (Alpaka). Bei ersterem sind im Gel Banden der kontaminierenden schweren und leichten Ketten sichtbar. Seine erste Karriere im Labor hat GFP (Green Fluorescent Protein) sicherlich der Mikroskopie zu verdanken, denn mit Hilfe von GFP lassen sich GFP-Fusionsproteine in Zellen visualisieren und untersuchen. Die zweite Karriere findet jetzt in der Biochemie, genauer in der Immunpräzipitation (IP) statt. Bislang wurden zum Präzipitieren von Fusionsproteinen meist kurze Epitop-Tags mit entsprechenden Antikörpern verwendet. Zu den bekanntesten dieser PeptidTags zählen Flag, HA und c-Myc. Wie schafft es GFP trotz seiner Größe von circa 27 kDa in Konkurrenz zu diesen etablierten Systemen zu treten? Worin besteht der Vorteil von GFP? Ein einleuchtender, wenn auch trivialer Vorteil, liegt natürlich an der grünen Fluoreszenz. Bevor man mit der IP startet, kann man sehen, ob das gewünschte Fusionsprotein überhaupt exprimiert wurde. Der eigentliche Vorteil von GFP in der IP liegt jedoch weniger bei dem Protein selbst als viel mehr bei dem es bindenden Protein GFP-Trap. Dieses Bindeprotein (siehe Grafik) besteht aus der Bindedomäne eines Schwere-Ketten-Antikörpers (single domain antibody, heavy chain antibody), die an eine Matrix gekoppelt ist. Diese Art von Antikörper kommen bei Kamelen (Camelidae) vor, zu denen Altweltkamele wie das Dromedar aber auch Neuweltkamele wie das Alpaka und das Lama gehören.

halten, reduziert und der Antikörper zerfällt. Dadurch kommt es in den nachfolgenden Experimenten oft zu einer störenden Kontamination durch die Antikörperketten. GFP-Trap hingegen besteht nur aus der Bindedomäne eines Schwere-Ketten-Antikörpers, die kovalent an die Matrix gebunden ist. Dadurch wird es nicht miteluiert und störende Kontaminationen werden vermieden. Zweitens bindet die GFP-Trap wesentlich schneller und stärker an GFP als dies bei normalen Interaktionen zwischen Antikörpern und Proteinen beziehungsweise Peptiden der Fall ist. Selbst bei kurzer Inkubationsdauer ist die Bindung von GFP-Trap an GFP extrem effizient und wird weder durch stringentes Waschen bei 8M Harnstoff noch unter Hochsalz-Bedingungen zerstört. Je nach Experiment kann somit ein großer Teil des störenden Hintergrunds weggewaschen werden. Beide signifikanten Verbesserungen, keine kontaminierenden schweren und leichten Ketten und ef fizienteres Binden, führen dazu, dass die Kombination von GFP und GFPTrap immer öfter für Immunpräzipitationen eingesetzt werden. Bis heute gibt es bereits 500 Veröffentlichungen, deren Ergebnisse auf diesem System beruhen.

Fest, fester, Alpaka

Christoph Eckert, PhD ChromoTek GmbH Am Klopferspitz 19 82152 Martinsried Tel.: +49 (0)89 78 79 73 08 Fax: +49 (0)89 78 79 73 11 c.eckert@chromotek.com www.chromotek.com

Gegenüber herkömmlichen Antikörpern hat GFP-Trap zwei signifikante Vorteile: Erstens, konventionelle Antikörper bestehen aus zwei leichten und zwei schweren Ketten. Während der Elution werden die Disulfidbrücken, die die leichten und schweren Ketten zusammenLABORWELT

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† “Inventory of socioeconomic costs of work accidents” https://osha.europa.eu/en/publications/reports/207 Jahrgang | Nr. 5/2014 | XIII European Agency for15. Safety and Health at Work. 2011

24.10.2014 12:48:10 Uhr

Proteomik Interview

Proteomprofiling von Wirkstoffen in lebenden Zellen

LABORWELT Cellzome bezeichnet sich als Spezialist für chemische Proteomik. Was verbirgt sich hinter dieser Forschungsrichtung? Drewes Die chemische Proteomik analysiert die Wechselwirkungen von Proteinen in Organismen mit Chemikalien wie Arzneimitteln, Nährstoffen und Giften. Uns bei Cellzome interessieren natürlich insbesondere Wirkstoffe und deren Zielstrukturen auf und in der Zelle, die sogenannten Targets. Auf der Seite der Wirkstoffe erforschen wir vor allem zwei Parameter, das „target engagement“ und die „target occupancy“. Bei ersterem gilt es, in Zellen, im Tiermodell oder in den ersten klinischen Studien am Menschen zu beweisen, dass der Wirkstoff sein Ziel erreicht. Das ist oft nicht trivial und auch bei zugelassenen Wirkstoffen fehlt manchmal dieser Nachweis. Letzterer ist ein quantitativer Parameter: Wie viel Prozent der Zielstrukturen sind bei den verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen belegt? Wie muss ich somit den Wirkstoff dosieren, um für eine bestimmte Zeit eine Rezeptorbelegung von 100% zu erreichen? Beide Parameter sind sehr wichtig, um die Wirksamkeit und die Nebenwirkungen eines Wirkstoffkandidaten klar abschätzen zu können. LABORWELT Und auf der Seite der Targets? Drewes Hier geht es vor allem um die Identifizierung und Validierung dieser Wirkstoffziele. Zum Beispiel ist oft für eine Substanz nicht klar, wo genau sie einen therapeutischen Effekt verursacht beziehungsweise wo sie an ungewünschte oder nicht beabsichtigte Wirkstoffziele bindet und somit sogenannte Off-target-Effekte, also Nebenwirkungen, verursacht. Bei der Validierung geht es eher darum sicherzustellen, dass das festgemachte Target auch wirklich das beste für die gegebene Indikation ist. LABORWELT Welche Probleme haben Wirkstoffentwickler, wenn sie mögliche Off-target-Effekte einschätzen sollen? XIV | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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Drewes Zum einen kennt man in einem frühen Stadium des Projektes diese Off-targets gar nicht. Die am weitesten verbreitete Methode in der Industrie ist derzeit die target-basierte Wirkstoffentdeckung. Hier beginnt man mit einem definierten Target, macht dann einen Hochdurchsatzscreen mit einer Substanzbibliothek und erhält Kandidatensubstanzen. Diese werden dann mittels biochemischer Assays darauf getestet, ob sie das gewünschte Target binden und modulieren können. Für verwandte Off-targets einer Klasse von Zielstrukturen, wie zum Beispiel den Kinasen, gibt es kommerziell erhältliche Panels, mit denen man auch den Einfluss des Kandidaten überprüfen kann. Problematisch ist, wenn mögliche Off-targets anderen Klassen von Zielstrukturen angehören. Diese werden im Allgemeinen nicht entdeckt. Hier stellt sich oft erst in der späteren präklinischen Entwicklung heraus, dass die Substanz toxisch ist. LABORWELT Mit welchen Methoden wird denn derzeit nach solchen Off-targets gesucht? Drewes Aktuell arbeiten Wirkstoffentwickler vor allem mit Zellkulturverfahren, bei denen entweder die Targets oder die Wirkstoffe mit einem Farbstoff markiert sind. Damit wird aber wahnsinnig stark ins System eingegriffen. Zum Teil entfernt man sich da gleich meilenweit von der therapeutischen Anwendung. Cellzome hat bisher vor allem auf die „Kinobeads“-Technologie gesetzt. Das ist eine mittlerweile ausgereifte, quantitative Methode. Mit ihr können viele Zielstrukturen in ein, zwei Versuchen durchgetestet werden. Mittels einer Hilfs- oder Toolsubstanz, die dem zu untersuchenden Wirkstoff ähnelt, werden die entsprechenden Zielstrukturen aus einem Zelllysat isoliert. Diese Substanz ist im Allgemeinen mit einem Linker verbunden, so dass sie via Biotin an ein Bead gekoppelt und immobilisiert werden kann. Die Analyse der isolierten Proteine erfolgt mittels Massenspektrometrie. Ein Nachteil ist jedoch: Die Suche nach solchen Toolsubstanzen ist aufwendig. So muss sichergestellt werden, dass die Ködersubstanz sich

© Cellzome/GSK

In einer Rekordzeit von einem Jahr zwischen dem Start der Versuche und der Publikation im Fachmagazin Science haben Forscher von Cellzome eine neue Methode zur Identifizierung von Off-targets etabliert. Für Wirkstoffentwickler ist dieses Wissen Gold wert, scheiden doch viele Wirkstoffkandidaten im Laufe der Entwicklung durch ungewünschte und unerwartete Nebenwirkungsprofile aus. Die Heidelberger kombinierten für ihr „Thermal Proteome Profiling“ (TPP) ihre Massenspektrometrie-Expertise mit einer 20 Jahre alten Methode zur Bestimmung der Proteinstruktur. Der Clou an TPP: Es funktioniert auch mit lebenden Zellen.

Dr. habil. Gerard Drewes

Seit Juni 2012 ist Gerard Drewes Forschungsleiter von Cellzome. Vor der Übernahme der Heidelberger Firma durch den britischen Pharmakonzern GSK 2012 war Drewes seit seinem Start bei Cellzome 2000 zunächst Gruppenleiter in der Abteilung Wirkstoffentwicklung, ab 2007 dann deren stellvertretender Leiter. Seine wissenschaftliche Karriere begann der Doktor der Chemie am Max-Planck-Institut für Strukturelle Molekularbiologie in Hamburg, später wechselte er an die Universität der Hansestadt und nach London zu Cancer Research UK.

ähnlich verhält wie der eigentliche Wirkstoff. Der zweite Nachteil: Diese Methode lässt sich nur auf Zellextrakte anwenden, nicht aber auf lebende Zellen oder Gewebe. Insofern ist es ein Stück weit eine „künstliche“ Situation. LABORWELT Einen entscheidenden Schub hat die Forschung vor etwa einem Jahr durch einen Impuls vom Karolinska-Institut in Stockholm bekommen. Was haben die Schweden gemacht? Drewes Pär Nordlund hatte die geniale Idee, dass man auch von lebendigen, intakten Zellen sogenannte Thermal Shifts aufnehmen kann. Diese Methode gibt es seit 20 Jahren. Sie ist sehr simpel und benötigt vor allem keine Markierung mit Farbstoffen: Für ein gegebenes Protein wird bei verschiedenen Temperaturen die thermische Stabilität gemessen – mit und ohne Anwesenheit des Wirkstoffs. Die Erhitzung dauert dabei nur etwa eine Minute. Bindet der Wirkstoff, ändert sich die thermische Stabilität, was als Änderung in der sogenannten Schmelzkurve deutlich wird. Bisher ist das für einzelne, isolierte Proteine gemacht worden. Nordlund hat das Prinzip auf intakte Zellen angewendet und das Ergebnis – die denaturierten Proteine – via Western Blot verfolgt. Sein Cellular Thermal Shift Assay, kurz CETSA, wurde im Juli 2013 veröffentlicht [Science, 10.1126/science.1233606, d. Red.]. LABORWELT

23.10.2014 18:06:56 Uhr

Interview Proteomik

LABORWELT Und welche Auswirkungen hatte das auf Cellzome? Drewes Vorher hatten wir keinen Kontakt mit Nordlunds Gruppe. Sofort nach Veröffentlichung der Publikation haben wir erkannt, dass das ein komplett neuer Ansatz ist, der komplementär zu den bei Cellzome praktizierten Methoden ist. In vielen Feldern hat die neue Technologie das Potential, die Kinobeads-Methode abzulösen. Allerdings unter einer Bedingung: Es musste gelingen, den CETSA-Assay mit Proteomik-Methoden zu kombinieren, insbesondere mit der Massenspektrometrie. Nordlunds Methode war ja nicht ergebnisoffen. Da die Detektion mittels Western Blots erfolgte, musste immer der dem Protein entsprechende Antikörper eingesetzt werden. Für eine genaue Quantifizierung benötigt man darüber hinaus auch noch sehr selektive Antikörper, die es aber nur für vergleichweise wenige Targets gibt. LABORWELT Offenbar war Cellzome außerordentlich erfolgreich. Der nächste Science-Artikel wurde ja bereits ein Jahr später publiziert! Drewes Das stimmt! Wir hatten die nun veröffentlichten Versuche zu diesem „Thermal Protein Profiling“ oder kurz TPP in einem halben Jahr erledigt. Das lag zum einen an unserem sehr routinierten, erfahrenen Team. Zum anderen hatten wir die maßgeschneiderten MassenspektrometrieProteomik-Methoden griffbereit. So konnten wir sogenannte 10-Plex-Experimente machen. Hierbei werden Proteome oder andere komplexe Proteinmischungen unter zehn Bedingungen verglichen. Bisher nutzte Cellzome die Methode für zehn verschiedene Wirkstoff-Konzentrationen. Auf die CETSA-Methode angewandt haben wir zehn Temperaturen getestet. Die Verknüpfung der Technologien hat perfekt gepasst! LABORWELT Wie haben Sie die Tauglichkeit der neuen Methode demonstriert? Drewes Für die SCIENCE-Studie [10.1126/science.1255784, d. Red.] haben wir den Einfluss von Kinase-Inhibitoren auf die löslichen Proteine einer menschlichen Zelllinie untersucht. Die Übereinstimmung mit der etablierten Kinobeads-Technologie war überraschend hoch: So gab es kaum falsch-positive Targets. Allerdings gibt es etliche falsch-negative Funde, das heißt, dass wir mit dem Thermal Profiling ein paar Proteine übersehen, an die die Testsubstanz in Wirklichkeit doch bindet. Es gibt somit Proteine, deren Schmelzkurve sich nicht „shiften“ lässt. Das bedeutet, dass das Thermal Profiling nicht das alleinige Maß aller Dinge zur Bestimmung von Targets ist und eher komplementär zu anderen Methoden eingesetzt LABORWELT

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werden wird. Wir glauben, dass die Methode vor allem große Proteine – wie Multi-DomänenProteine mit vielen verschiedenen Faltungseinheiten – nicht erfasst. Diese lassen sich durch die Bindung einer Substanz einfach nicht genügend stabilisieren. Davon abgesehen konnten wir innerhalb der Studie gleich noch eine zuvor ungeklärte Nebenwirkung eines weit-verbreiteten Kinase-Inhibitors mit beschreiben.

10 times smaller 5 times better

LABORWELT Wie kam es dazu? Drewes Für die getestete Natursubstanz Staurosporin hatten wir zunächst herausgefunden, dass dieser Kinase-Inhibitor off-target an eine Ferrochelatase bindet. Dieses Enzym katalysiert einen wichtigen Schritt im Häm-Synthese-Weg. Bei der Recherche zu diesem Protein entdeckten wir schließlich, dass es hier eine Erbkrankheit gibt. Patienten mit einer Mutation im FerrochelataseGen weisen eine erhöhte Fotosensitivität der Haut auf, eine sogenannte Protoporphyrie. Dann erinnerte sich jemand in unserem Team, dass es auch therapeutisch eingesetzte Kinaseinhibitoren mit ähnlichen Nebenwirkungen gibt. Daher lag der Schluss nahe, dass auch diese Wirkstoffe zusätzlich zu ihren therapeutischen Targets an Ferrochelatase binden. Für Vemurafinib – ein Wirkstoff, der für die Therapie der Hautkrebserkrankung malignes Melanom zugelassen ist – konnten wir das mit TPP dann bestätigen. Auch das therapeutische Target Vemurafinibs, die Kinase B-Raf, wurde natürlich in dem Screen erfasst. Durch den Vergleich zwischen den Schmelzkurven der beiden Targets konnten wir genau das Fenster zwischen den beiden Bindungen bestimmen. Und dieses Fenster ist sehr klein: Die Bindung an die Ferrochelatase erfolgt schon bei einer Konzentrationserhöhung von Vemurafinib um den Faktor 5 verglichen mit der Bindungskonzentration Vemurafinibs an B-Raf. Mit diesem Wissen könnten nun neue Wirkstoffe entwickelt werden, die entweder gar nicht mehr an die Ferrochelatase binden oder zumindest größere Unterschiede in der Bindungsaffinität zwischen den beiden Targets aufweisen.

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LABORWELT Kann die Methode noch verbessert werden? Drewes Wir können jetzt bis maximal 8.000 Proteine in der Zelle durchsuchen. Es wird aber geschätzt, dass es bis zu 15.000 verschiedene Proteine in einer Zelle gibt. Hier werden wir in Zukunft daran arbeiten, einen immer größer werdenden Teil des Zellproteoms analysieren zu können. Trotzdem wenden wir bei Cellzome TPP schon relativ breit bei vielen verschiedenen therapeutischen Projekten an. Unsere Einschätzung ist, dass TPP in der Zukunft eine der wichtigsten Methoden zur Ermittlung von Wirkstoffzielspektren werden wird. Die Methode kann Wirkstoffentwicklern helfen, schon früh aufs richtige Pferd zu setzen.

www.chromotek.com 15. Jahrgang | Nr. 5/2014 | XV

23.10.2014 18:06:57 Uhr

Proteomik Interaktionsanalyse

Analyse von Protein-„small molecule“-Interaktionen Dr. Caroline End und Christian Walczuch, Promega GmbH, Mannheim Untersuchungen zu Protein-Wechselwirkungen sind sowohl für das Verständnis biologischer Prozesse als auch für die Medikamentenentwicklung elementar. Insbesondere für die Analyse von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen sind robuste und screeningfähige Methoden unverzichtbar. Die neue NanoBRET TM-Technologie erlaubt den Aufbau von robusten Protein-Interaktionssystemen in lebenden Zellen mit einem vorteilhaften Signal-Hintergrund-Verhältnis. Die Anwendung von NanoBRET TM umfasst sowohl die Analyse von Protein:Protein- als auch Protein:„small molecule“ Interaktionen (Target Engagement). Die NanoBRET TM -Technologie ermöglicht mittels Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) den Aufbau von robusten und screeningfähigen Testsystemen für zahlreiche Fragestellungen mit biologischer und medizinischer Relevanz. Der Wert dieser neuen Plattform zeigt sich bereits an aktuellen Untersuchungen für epigenetische Targets.

Grundlage der NanoBRET TMTechnologie Herzstück der Technologie stellt die kleine und lichtintensive NanoLuc-Luciferase dar, die mit tels BRET einen fluoreszenten Liganden zum „Leuchten“ bringt. Die NanoLuc®-Luciferase dient dabei als Donor-,

der fluoreszente Ligand (NanoBRET TM 618) als Akzeptormolekül. Donor- und AkzeptorEmissionen überlappen nur geringfügig, wodurch hervorragende Signal-HintergrundVerhältnisse erreicht werden, die eine sensitive Messung in einem breiten dynamischen Messbereich ermöglichen. Dies stellt letztlich den entscheidenden Vorteil gegenüber konventionellen BRET-Systemen dar, die auf Basis der vergleichsweise signalschwachen Renilla-Luciferase beruhen.

NanoBRET TM für die Analyse von Protein:Protein-Interaktionen (PPI) Zur Untersuchung von Protein:ProteinWechselwirkungen wird einer der Interaktionspartner als NanoLuc®-Fusionsprotein, der

andere Partner als HaloTag®-Fusionsprotein exprimiert. Der Energietransfer auf den fluoreszenten NanoBRET TM-618-Liganden findet nur dann statt, wenn beide Interaktionspartner sich in einem Abstand zueinander von weniger als 10 nm befinden. Der fluoreszente Ligand ist dabei kovalent an das HaloTag®-Protein gebunden (siehe Abbildung). Für einige Anwendungsgebiete – wie beispielsweise die Epigenetik – gibt es bereits gebrauchsfertige NanoBRET TMAssays. Hierbei handelt es sich um vorgetestete und optimierte Proteinpaare, welche für Induktions- und Inhibierungsstudien eingesetzt werden. Erhältlich sind unter anderem therapeutisch interessante BromodomainHiston-Proteinpaare.

Interaktionen mit niedermolekularen Molekülen Die Analyse von Interaktionen zwischen Proteinen und niedermolekularen Molekülen („small molecules“) in lebenden Zellen ist ein weiteres Anwendungsgebiet der NanoBRET TM-Technologie. Hierbei wird der fluoreszente NanoBRET TM-Ligand chemisch an eine niedermolekulare Verbindung gekoppelt und das entsprechende Zielprotein als NanoLuc-Fusionsprotein exprimiert. Dadurch lassen sich Systeme aufbauen, um direkt Interaktionen zwischen einem Protein-Target und der entsprechenden Substanz in lebenden Zellen zu messen (Target Engagement). Diese Systeme können sowohl für Inhibierungsstudien als auch für Induktionsstudien eingesetzt werden.

Fazit Zusammengefasst handelt es sich bei NanoBRET TM um eine robuste Technologie für die Analyse von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Dank der vielfältigen Kombinationsmöglichkeiten der Technologie sind umfassende Untersuchungen sowohl von Protein:Protein als auch Protein:„smallmolecule“-Interaktionen möglich.

Kontakt: Bei der Messung von Protein:Protein-Interaktionen mit der NanoBRET TM-Technologie werden die Proteininteraktionspartner (X;Y) als NanoLuc- bzw. HaloTag-Fusionsproteine in Zellen exprimiert. Der Energietransfer auf den NanoBRET TM-618-Fluorophor findet nur dann statt, wenn Protein X und Protein Y einen Abstand zueinander von weniger als 10 nm besitzen. Das NanoBRET TM-618-Fluorophor ist dabei kovalent an das HaloTag® Protein gebunden. (B) Zur Verwendung von NanoBRET für die Chemoproteomics/Target Engagement wird das Proteintarget X als NanoLuc-Fusionsprotein exprimiert und der NanoBRET-Ligand 618 chemisch an das „small molecule“ gekoppelt. (C) Das Ergebnis sind äußerst günstige Signal/Hintergrund-Verhältnisse dank einer breiten spektralen Separation zwischen der NanoLuc®-Luciferase-Emission (EmMAX 460nm) und der Emission des NanoBRET-618-Fluorophors (EmMAX 618nm). XVI | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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Promega GmbH Dr. Caroline End Produktmanager Proteomics Tel.: +49 (0)621 850 11 87 caroline.end@promega.com www.promega.com

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23.10.2014 18:09:03 Uhr

STED-Mikroskopie Advertorial

››› ATTO-TEC

ATTO-Farbstoffe als Wegbereiter des Chemie-Nobelpreises 2014 Der Göttinger Forscher Prof. Stefan W. Hell hat den Nobelpreis für Chemie erhalten. Die ATTO-TEC GmbH gratuliert ihm herzlich zu dieser verdienten Auszeichnung. Die Siegener Firma und Hells Arbeitsgruppe blicken auf eine langjährige Zusammenarbeit zurück.

Die Bedeutung von Fluoreszenzmarker-Farbstoffen wird unterstrichen durch die Nobelpreise von Eric Betzig und William E. Moerner, die gleichzeitig mit Stefan Hell (Max-PlanckInstitut Göttingen) geehrt wurden. Beide haben bei ihren preisgekrönten Forschungen auch Farbstoffe verwendet, die von ATTOTEC-Wissenschaftlern entwickelt wurden und sich für die „Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie“, unter anderem für das nun prämierte STED-Verfahren (Hell), als besonders geeignet herausgestellt haben.

Farbstoffprofis aus Siegen Weltweit gibt es nur eine gute Handvoll Firmen, die in der Lage sind, solche fluoreszierenden Farbstoffe in hoher Reinheit zu produzieren. Einer dieser Hersteller ist die im Herbst 1999 als Ausgründung der Universität Siegen ins Leben gerufene ATTO-TEC GmbH. Der Hauptgesellschafter und Leiter der Farbstoffentwicklung, Prof. Karl H. Drexhage, verfügt über jahrzehntelange Erfahrung auf dem Gebiet der Chemie und Fluoreszenz von Farben: Bereits vor seiner Berufung nach Siegen entwickelte er unter anderem spezielle LaserLABORWELT

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farbstoffe in den USA. Diese fachliche Expertise und der stetig steigende Bedarf an hochsensitiven Markierungsmethoden in Biologie und Medizin waren die Grundlage für die Entwicklung und Vermarktung unserer neuen Farbstoffe. Bereits Mitte der 90er Jahre wurde Prof. Drexhage von dem damals noch kaum bekannten jungen Wissenschaftler Stefan Hell kontaktiert. Dieser erläuterte seine Ideen der optischen Nanoskopie und erkundigte sich nach Möglichkeiten, sie mit Hilfe von Farbstoffen zu realisieren. Zur Unterschreitung der beugungsbegrenzten Auflösung in Lichtmikroskopen benötigt das von ihm konzipierte STED-Verfahren nämlich fluoreszierende Farbstoffe mit ganz besonderen Eigenschaften. Die einzelnen Zellbestandteile werden angefärbt und so bei Bestrahlung zum Leuchten (Fluoreszenz) angeregt. Die bei dieser Art der optischen Höchstauflösung eingesetzten hohen Laserintensitäten führen aber gewöhnlich zu einem sehr schnellen Ausbleichen der Farbstoffe. Dieses Phänomen ist aus dem Alltag bekannt. Bei starker und andauernder Sonneneinstrahlung werden die meisten Farbstoffe zerstört: Bilder verblassen, grüne Blätter werden gelb.

Viele ATTO-Farbstoffe zeichnen sich durch eine besonders hohe Lichtechtheit aus. Bei der Entwicklung und Synthese kamen dem Wissenschaftler-Team von ATTO-TEC (Bild von links nach rechts: Dr. M. Hamers-Schneider, K. Limper, Dr. A. Zilles, J. Burgmann, Dr. N. Kemnitzer, B. Niesenhaus, Prof. K. H. Drexhage, Dr. J. Arden-Jacob und ATTO-TEC-Geschäftsführer Dr. J. Reichwein) viele Erfahrungen aus der Studienzeit zugute, denn etliche Mitarbeiter haben auch bei Prof. Drexhage in Siegen viele Jahre studiert und promoviert. In den 15 Jahren ihres Bestehens hat sich ATTO-TEC als weltweit anerkannter Lieferant fluoreszierender Farbstoffe für den LifeSciences-Bereich am Markt positioniert. Die Produktpalette des Unternehmens umfasst patentierte Fluoreszenzlabel vom ultravioletten bis zum infraroten Spektralbereich sowie Farbstoffe mit speziellen Indikator-Eigenschaften. Als Fluoreszenzmarker werden sie nicht nur zur DNA-Analyse („genetischer Fingerabdruck“) und Entschlüsselung des Genoms eingesetzt, sondern darüber hinaus auch zur zerstörungsfreien Materialprüfung oder zum Schutz vor Produktpiraterie benutzt. Jede Anwendung stellt dabei immer wieder andere Anforderungen an den verwendeten Marker. Deshalb stehen die kundenorientierte Synthese von maßgeschneiderten Farbstoffen sowie eine stete Weiter- und Neuentwicklung von hochwertigen Fluoreszenzsonden im Vordergrund der Unternehmensstrategie von ATTO-TEC.

Kontakt Dr. Jörg Reichwein ATTO-TEC GmbH Am Eichenhang 50, 57076 Siegen Tel.: +49-271/238530 Fax: +49-271/2385311 reichwein@atto-tec.de www.atto-tec.de 15. Jahrgang | Nr. 5/2014 | XVII

23.10.2014 18:25:10 Uhr

Service Verbände

DiagnostikNet-BB

LABORWELT-Partner Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)

Abend der Diagnostik auf der Medica

www.dgkl.de

Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung www.dgpf.org BIO Deutschland www.biodeutschland.org Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)

www.dghm.org

bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.)

 Das DiagnostikNet-BB organisiert vom 12. bis 15. November den Diagnostik-Gemeinschaftsstand der Länder Berlin und Brandenburg in Halle 3 (G52/54) auf der Medica (Düsseldorf). Neben Halle 1 und 2 ist die Halle 3 der Dreh- und Angelpunkt der In-vitro-Diagnostik: Hier präsentieren Aussteller aus aller Welt das gesamte Spektrum diagnostischer Produkte und Dienstleistungen wie Probenbereitstellung, Biobanking, Biomarkerentwicklung sowie Geräte- und Softwareherstellung. Auf dem Ländergemeinschaftsstand stellen 17 Firmen ihr Portfolio vor. Der erste Messetag klingt feierlich mit dem Abend der Diagnostik aus. Gemeinsam mit Ausstellern und Gästen sollen die Erfolge der vergangenen Jahre gefeiert werden, in der sich die Hauptstadtregion als Zentrum der In-vitro-Diagnostik etabliert

hat. Eine Spezial-Session widmet sich dem Zukunftsfeld der personalisierten Medizin. Die Teilnahme am Abend ist kostenfrei, bedarf jedoch der Anmeldung unter a.kopacek@ diagnostiknet-bb.de.  Vom 25. bis 26. November 2014 präsentiert sich das Companion Diagnostics Network (CDN) unter der Regie des DiagnostikNet-BB auf der 4. Münchner Biomarker-Konferenz. Dort sollen Kontakte zu Pharmaindustrie und Wirkstoffentwicklern aufgebaut und die CDx-Aktivitäten vorangetrieben werden. Am 27. November 2014 findet dann der Treffpunkt In-vitro-Diagnostik im Magnus-Haus in Berlin statt. Dieses Mal fokussiert der Vortragsabend – inklusive Get-together – auf das Thema Onkologie und widmet sich Standards und Trends in der Krebsdiagnostik.

www.bts-ev.de Gesellschaft für Genetik

GENE

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www.gfgenetik.de Gesellschaft für Signaltransduktion www.sigtrans.de Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie

www.dgpt-online.de

Nationales Genomforschungsnetz www.ngfn.de Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik www.hih-tuebingen.de/dgng/ Netzwerk Nutrigenomik www.nutrigenomik.de DiagnostikNet-BB www.diagnostiknet-bb.de Verband der Diagnostica-Industrie e.V. www.vdgh.de Österreichische Reinraumgesellschaft (ÖRRG) Österreichische Ges. f. Laboratoriumsmedizin & Klinische Chemie

XVIII | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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www.oerrg.at

www.oeglmkc.at

DGKL

Qualitätskontrolle auf hohem Niveau  Die Bundesärztekammer fordert in der Richtlinie zur Qualitätssicherung für laboratoriumsmedizinische Untersuchungen sowohl die Durchführung einer „internen Qualitätskontrolle“ (IQC), als auch für etwa 150 Analyte eine „externe Qualitätskontrolle“ (EQC) mittels Ringversuchen. In der aktuellen Richtlinie (Fassung vom 23.09.2011) werden die Untersuchungen in fünf Bereiche (Teil B1 bis B5) unterteilt. Das Referenzinstitut für Bioanalytik (RfB) ist eine der beiden deutschen Ringversuchsorganisationen, die von der Bundesärztekammer für die Durchführung dieser EQC bestellt wurde. Das Angebot umfasst dabei Ringversuchssysteme aus den Gebieten der Klinischen Chemie, Arzneimittel, Blutgase, Gerinnung, Hämatologie, Hormone, kardiale Marker, Lipoproteine, Tumormarker, Zytokine, Pathologie, Molekulare Diagnostik, Virologie, Bakteriologie, Parasitologie sowie spezielle Versuche für Allergologie, Autoimmunerkrankungen, Drogenscreening und Molekularbiologie. Bei allen RfB-Ringversuchen werden die Ergebnisse individuell und übersichtlich grafisch dargestellt, so dass jeder Teilnehmer die eigenen Messergebnisse sowie die der übrigen Teilnehmer erhält. Quantitative Ergebnisse werden in sogenannten YOUDEN-Diagrammen dargestellt, einer informativen Grafik von Kollektiven, die auf der Konzentrationsbestimmung von zwei Ringversuchsproben basieren. Der individuelle Wert eine Teilnehmers ist jeweils farblich markiert, ebenso wie die zugrundeliegenden Gesamtund Teilkollektive. Das RfB wurde von der Bundesärztekammer für die Teile B1, B2, B4 und B5 als Ringversuchsorganisation bestellt (Antrag auf Bestellung

für B3 läuft). Die Bestellung des RfB für B3 wird nach Informationen durch die Bundesärztekammer im September im Anschluss an die Fachgruppentagung D3 erfolgen. Damit haben die medizinischen Laboratorien die Möglichkeit, alle in Deutschland vorgeschriebenen Ringversuche beim RfB zu erhalten. Daneben umfasst das Aufgabengebiet des RfB auch die Entwicklung von Referenzmethoden, die Förderung von Forschungsprojekten im Bereich der Klinischen Chemie und Laboratoriumsmedizin sowie die Förderung und Schulung des wissenschaftlichen Nachwuchses und des medizinischen Fachpersonals. Dem RfB angeschlossen sind hierfür verschiedene Kalibrier- und Referenzlaboratorien. Das Referenzmethodenkonzept, mit einer kompletten Rückführbarkeit der ermittelten Werte über verschiedene Kalibratoren auf internationale Standards findet weltweit große Beachtung und unterscheidet sich wesentlich von den Konzepten anderer Länder, in denen ausschließlich assayspezifische Bewertungen durchgeführt werden. Gegenwärtig existieren jedoch nur für etwa 30 Analyte Referenzmethoden, so dass sich dieses Konzept nicht auf alle ringversuchspflichtigen Parameter anwenden lässt. Ein wissenschaftlicher Beirat unterstützt das RfB in allen Fragen zur externen Qualitätskontrolle, und eine Vielzahl wissenschaftlicher Berater stehen bei den Auswertungen der Ringversuche mit ihrer Fachexpertise zur Verfügung. Daneben arbeitet das RfB eng mit verschiedenen zertifizierten, nationalen und internationalen Kooperationspartnern (zum Beispiel: IFCC, EFLM, EQALM, PTB) zusammen, die alle das gleiche Ziel verbindet: externe Qualitätskontrolle auf höchstem Niveau. LABORWELT

23.10.2014 18:13:28 Uhr

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Display-Techniken

CANDOR

Ralf Wagner, Universität Regensburg; Andreas Plückthun, Universität Zürich; Stefan Dübel, Technische Universität Braunschweig Bei Display-Techniken werden aus großen, rekombinanten Erbgut-Bibliotheken Peptide oder ganze Proteine funktionell auf der Oberfläche von Bakteriophagen, Hefen, Bakterien, Säugetierzellen oder Ribosomen präsentiert, um anschließend geeignete Bindepartner für einen bestimmten Liganden zu identifizieren. Sie werden zum Beispiel für die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen oder mittels gerichteter Evolution für die Entwicklung neuer Biopharmazeutika genutzt.

© Uni Braunschweig

Prof. Dr. Stefan Dübel

lehrt an der Technischen Universität Braunschweig. Außerdem ist er Mitgründer der Yumab GmbH.

LABORWELT Ihre Firma Yumab bietet weltweit die Entwicklung von Antikörpern über Phagen-Display an. Welches Konzept steckt dahinter? Dübel Ein großes Problem der biomedizinischen Forschung am Menschen ist unser mangelndes Wissen über die Struktur der meisten Gene. Nur für einen Bruchteil der 20.000 Stück existieren Antikörper. Klar, für ein paar wie p53 gibt es tausend verschiedene. Aber für viele Genfamilien gibt es nur für zwei oder drei von zehn Genprodukten Antikörper, die dann meist nicht einmal spezifisch genug sind. Wir arbeiten daran, einen kompletten, monoklonalen und erneuerbaren Antikörpersatz für alle 20.000 Humanproteine zu generieren. Das geht preiswert und mit hoher Verlässlichkeit nur mit Phagen-Display. Bei der heute immer noch häufig eingesetzten Hybridomtechnik bräuchte man dafür ein Maushaus von hier bis nach Kiel! Phagen-Display ist robust, einfach, steuer-, miniaturisier- und automatisierbar – und es können gezielt Antikörper auch für sehr ähnliche Antigene produziert werden. Das hat sich in der Pharmaindustrie herumgesprochen, die schon therapeutische Antikörper damit produziert, allerdings noch zu wenig in der akademischen Forschung.

Prof. Dr. Andreas Plückthun © Universität Zürich

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CANDOR CANDOR

ist Leiter des Biochemischen Instituts der Universität Zürich (Schweiz).

LABORWELT Auf welche Display-Technik vertrauen Sie? LABORWELT

Plückthun Wir sind wohl eines der wenigen Labore weltweit, das zugleich Ribosomen-, Phagen- und Hefen-Display beherrscht. Nachdem wir zunächst an Antikörperwirkstoffen gearbeitet hatten, sind wir im Lauf der Zeit verstärkt zu Darpins (Designed Ankyrin Repeat Proteins) gewechselt. Da diese künstlichen Proteine sich sehr gut in vitro falten, lassen sie sich mit Ribosomen-Display sogar besser präsentieren als Antikörper. Ein großer Vorteil gegenüber dem Phagen-Display ist das fehlende „Focusing“: Alle nach mehreren Runden gut ans Zielmolekül bindenden Liganden sind von der Sequenz her verschieden.

Prof. Dr. Ralf Wagner

© Uni Regensburg

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Expertenpanel Proteomik

forscht am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene an der Universität Regensburg.

LABORWELT Bei Ihrer Suche nach Super-Antigenen des HIVHüllproteins, die die breit neutralisierenden Antikörper reaktivieren, vertraut Ihr Labor auf Säugetierzellen-Displaytechniken. Warum? Wagner Unser Anforderungsprofil sah wie folgt aus:Wir wollten komplexe Proteine wie das Hüllprotein – mit Disulfidbrücken und oligomer aufgebaut – richtig gefaltet durch den Golgi-Apparat schleusen. Auch war uns die korrekte posttranslationale Modifikation wichtig. Weder Ribosomen-, noch Phagen- oder mRNA-Display kommen da in Frage. Da wir so nah wie möglich an die biologische Situation einer HIV-Infektion herankommen wollten, fiel auch der Hefe-Display heraus. Der Grund: Oft brauchen die Proteine die Bedingungen einer Säugerzellmembran für die korrekte Ausrichtung. Nachdem wir zunächst mit Lentiviren transfiziert hatten, sind wir nun auf Plasmide umgestiegen. Nun können wir im Hochdurchsatz stabile HEK-293T-Zelllinien generieren, wo in jeder Zelllinie genau ein Gen an einem definierten Ort integriert ist. Wir denken, dass wir hier ein sehr sauberes System haben.

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Blocking, primary and secondary antibody Blocking, primary in one step! Blocking, primary and secondary antibody and secondary in one step! antibody in one step! CANDOR Bioscience GmbH CANDOR Bioscience GmbH CANDOR Bioscience GmbH

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Service Produktwelt Wako Chemicals GmbH

CEM GmbH

Keine Angst vor Phosphorylierungen Entstehung, Therapie und Verhinderung von Krankheiten zu erhalten. Die Wako Chemicals GmbH bietet für die Proteinforschung eine Vielzahl an unterschiedlichen Produkten zur Aufreinigung, Trennung, Färbung und Detektion von Proteinen an. So wird bereits die Lysyl-Endopeptidase (MS Grade) erfolgreich für den In-Gel-Verdau angewandt. Das Enzym überzeugt durch eine hohe Spezifität und Effizienz. Seit 2011 ergänzt die Phos-tag™-Linie der NARD Institute Ltd. das Angebot. Phos-tag™ ist ein funktionales Molekül, das spezifisch an Phosphoproteine bindet. Es ist sowohl für die spezifische Auftrennung von phosphorylierten Proteinen als auch für die Detektion im Western Blot, die Aufreinigung mittels Agarose-Gelchromatographie und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analysen anwendbar. Die Proteinchemie ist ein sich rasant entwickelndes Forschungsfeld der Life Sciences, deren Zielsetzung es unter anderem ist, Antworten auf Fragen zur Regulation der natürlichen Lebensvorgänge und insbesondere zur

Prämierte Peptidsynthese Proteine beziehungsweise Peptide spielen für die physiologische und biochemische Funktion lebender Organismen eine herausragende Rolle. Seit langem werden diese Wirkstoffe auf ihre pharmakologische Wirksamkeit untersucht. Deshalb ist es wichtig, unterschiedliche Peptide synthetisch in Forschungslaboratorien herzustellen. Mit dem automatisierten Peptid-Synthesizer Liberty Blue lassen sich reine Peptide und schwierige Sequenzen in wenigen Stunden synthetisieren. Erst kürzlich erhielt CEM einen R&D 100 Award des Jahres 2014 für den Liberty Blue. Die Auszeichnung wird einmal im Jahr von den Herausgebern des R&D Magazin für die 100 „technologisch bedeutendsten innovativen Produkte und Prozesse des Jahres” verliehen.

Wako Chemicals GmbH Fuggerstr. 12 41468 Neuss www.wako-chemicals.de biochem@wako-chemicals.de

IBA GmbH

His-STREPPER – für noch sauberere His-tag-Proteine Der His-STREPPER ist ein kleines Adaptermolekül, das ohne Klonierungsschritt ein His-tagProtein in ein Strep-tag-Protein umwandelt. Dadurch lässt sich der Vorteil des Strep-tag/ Strep-Tactin-Systems – die hohe Reinheit des gereinigten Fusionsproteins – auch für His-tagProteine einfach und schnell nutzen. Der His-STREPPER besteht aus einem StreptagII-Peptid (SA-WSHPQFEK), an das Ni2+ beladenes trisNTA fusioniert ist. Das trisNTA bindet an das 6xHis-tag-Fusionsprotein und wandelt es dadurch in ein Strep-tag-Fusionsprotein um. Der His-STREPPER findet dann Anwendung, wenn durch die His-tag-Reinigung über Ni-NTA nicht die gewünschte Reinheit des His-tagFusionsproteins erzielt wurde. Der His-STREPPER kann im stöchiometrischen Verhältnis sowohl

zum Zelllysat direkt hinzugegeben werden oder zur Elutionsfraktion nach der Ni-NTA-Reinigung (zur Reinigung von 1 mg eines 28 kDa His-tagProteins verwendet man zum Beispiel 100 µg des 2,8 kDa His-STREPPERs). Nach kurzer Inkubationszeit wird das umgewandelte Protein über eine Strep-Tactin-Matrix aufgereinigt. Zu beachten ist hierbei, dass der His-STREPPER kein Imidazol/ EDTA im Puffer toleriert (die Bindung des trisNTA an den His-tag wird unterbunden) und dass das System nur effektiv im pH-Bereich > 7 eingesetzt werden kann. Der His-STREPPER wird sowohl separat (500µg; Kat.-Nr. 2-0920-005), als auch in Kombination mit einem „Trial Kit“ (Kat.-Nr. 2-0920-999) angeboten. www.strep-tag.com

Folgende Kriterien bestimmten die Entscheidung der Jury: l 4-Minuten-Kupplungszyklen ermöglichen die Peptidsynthese in Stunden statt in Tagen l Bis zu 90% Einsparung an Lösemitteln l Von Kleinstmengen für PNA-Synthese bis zum Scale-up von 5mmol l 27 Positionen für Reagenzien, Umbenennen von Reagenzien l Intuitive Software erleichtert das Programmieren von Sequenzen, und die einfache Technik mit wenig Ventilen und wenig Sensoren vereinfacht den Service. Die einzelnen Peptide können nach der Entnahme schnell aufgereinigt werden, während die nächste Synthese läuft. Zudem erfüllt der Liberty Blue die patentrechtlichen Anforderungen an das Einsetzen der Mikrowelle beim Kuppeln und Entschützen. Literatur Collins, J.; Porter K. A.; Singh S. K.; Vanier, G. S.; Hig Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS); Org. Lett. 2014, 16, 940−943

CEM GmbH Carl-Friedrich-Gauß-Straße 9 47475 Kamp-Lintfort Tel.: + 49-2842-96 44 0 Fax: + 49-2842-96 44 11 www.cem.de info@cem.com XX | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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LABORWELT

23.10.2014 18:27:49 Uhr

Produktwelt Service Brady Corp.

Porvair Sciences Ltd.

Schnellere Etikettenerstellung mit LabelMarkTM 6

Die neue Version der Etiketten-Software LabelMarkTM 6 bietet wesentlich mehr Optionen und verfügt über eine einfach zu bedienende App-Benutzeroberfläche, was das Einrichten der

Etiketten, das Management und die Ausführung optimiert. Zudem ermöglicht die Software automatische Updates und informiert den Anwender über neue Patches und Versionen. Die neue LabelMark 6-Oberfläche ist mit MS Windows 8 Metro Style und MS Office 2013 abgestimmt. „Kurz gesagt, sie ist größtenteils vergleichbar mit einer Smartphone Oberfläche“, so Tom Bieseman, EMEA Product Manager Systems bei Brady. Mit der Software können schnell und professionell Etiketten für Klemmblöcke, Leitungen, Bedienfelder, Geräte für Sprach- und Datenkommunikation, Laborgeräte und Stromkästen erstellt werden. LabelMark 6 ist außerdem imstande, bidirektional mit Brady-Etikettendruckern zu kommunizieren. Jedes Etikettenformat kann automatisch auf die Drucker IP, BMP41, BMP51, BMP53, BMP71 oder BBP33 geladen werden.

Probenvorbereitung für Festphasenextraktion Porvair Sciences führt den Microlute Startkit zur Probenvorbreitung für die Festphasenextration (SPE) ein. Dieser Kit enthält alle erforderlichen Materialien für eine produktive SPE-Probenvorbereitung im 96-Well-Plattenformat, darunter zwei Entwicklungs-Filterplatten und eine gängige C18-Sorbens-Filterplatte, 2-ml-Sammelplatten, Einweg-Abfallschalen und einen Microlute Vakuum-Röhrenkollektor aus Acryl.

Brady Deutschland emea_request@bradycorp.com www.bradyeurope.com

I&L Biosystems GmbH

Enzymatischer Verdau in Minuten Für die massenspektroskopische Analyse von Proteinen, zum Beispiel zur Charakterisierung des Proteoms, ist es wichtig, einen effizienten und vollständigen Trypsin-Verdau zu Peptiden zu verwirklichen. Die dafür relevanten Bedingungen im klassischen Verdau sind Puffer, Dauer und Temperatur. Der Prozess verläuft über einen halben Tag und damit äußerst langsam. Der Barocycler von Pressure Biosciences beschleunig t den Tr ypsin-Verdau durch Pressure Cycling und reduziert die Dauer von circa 12 Stunden auf höchstens 30 bis 60 Minuten. Dadurch können am gleichen Tag mehrere Verdaue als Folgeexperimente durchgeführ t werden. Zudem ist die Reproduzierbarkeit signifikant verbessert. Pressure Cycling steht für einen ständigen Wechsel des hydrostatischen Drucks von Hoch- zu Normaldruck, der auf die Probe in mehreren Zyklen einwirkt. Die Methode bewirkt eine Änderung der Konformation des Trypsins, welche die Wirkung des Enzyms enorm steigert. Für den Prozess werden die Proben in Einweg-Kartuschen, wahlweise zwischen 50 und 150 µl, gefüllt und bis zu 48 Proben parallel prozessiert. Der Anwender kann den Druck bis 2.400 bar (35 KPSI) frei auswählen, programmiert die Zeit der sich abwechselnden Hochdruck- und Normaldruckphasen und die Anzahl der Zyklen. Die Temperatur des Prozesswassers, das den Druck auf die Kartuschen überträgt, kann zwischen 0°C und 80°C liegen und über einen ThermosLABORWELT

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taten kontrolliert eingestellt werden. Das System ist robust gebaut und kann leicht bedient werden. I&L Biosystems GmbH Königswinterer Str. 409a 53639 Königswinter Tel.: +49-2223-9192-0 info@il-biosystems.de www.il-biosystems.de

Der neue Startkit bietet alle Vorteile der SPEProbenvorbereitung in einem praktischen Mikroplattenformat, das 96 Proben in einem Arbeitsgang rasch und präzise verarbeiten kann, auch mehrmals. Für den Einsatz ist nur noch ein geeigneter Vakuumanschluss erforderlich. Bei der Handhabung von kleinen Proben erhöht der Microlute™ SPE-Startkit die analytische Sensibilität durch Aufreinigung und Konzentration der Proben vor der Injektion. Die zwei Microlute „Entwicklungsplatten” im Kit sind mit acht verschiedenen Sorbentien vorbehandelt und erleichtern die Methodenentwicklung. Standard-Probensammelplatten mit 2-ml-Wells werden mitgeliefert, aber es können auch spezielle Testplatten mit Well-Volumina von 350 µl und 1 ml verwendet werden. Mit Hilfe eines patentgeschützten Verfahrens konnte Porvair die Kanalisierungswirkungen vermeiden, die häufig die Leistung der SPE-Säulen einschränken. Jede Vertiefung der Microlute™-Testplatte hat eine eigene Ablasstülle, sodass ein 100 %iger Probentransfer und die Vermeidung von Kreuzkontaminationen gewährleistet ist. Zur Gewinnung getrockneter oder konzentrierter Proben kann der Microlute™ SPE-Startkit mit einem Porvair MiniVap Probenkonzentrator gekoppelt werden. Porvair Sciences Tel.: +44-1978-666240 www.porvair-sciences.com/en/services-menu/solid-phase-extraction/spe-starter-pack/ int.sales@porvair-sciences.com 15. Jahrgang | Nr. 5/2014 | XXI

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Ausblick

Vorschau Heft 1/2015

Publikationen

Haben schwedische Forscher zu viel Freilauf?       Wissenschaftliche Artikel sind schwere Kost. Ein paar Pop-Referenzen zu Bob-Dylan-Songs machen da zumindest Lust aufs Lesen. Der Spleen einiger Forscher mündete gar in einen Wettstreit: Fünf in Schweden forschende DylanFans haben seit 17 Jahren eine Wette laufen, wer die meisten Dylan-Referenzen in seinen wissen-

schaftlichen Veröffentlichungen unterbringen kann – egal ob es sich dabei um Liedtexte, Songoder Albumtitel handelt. Einzige Bedingung:„Die Referenz muss sich auf den wissenschaftlichen Inhalt beziehen und die Kernaussage des Artikels verstärken“, so Jonas Frisén vom KarolinskaInstitut in Stockholm. Seine Kollegen Jon Lundberg und Eddie Weitzberg von einer anderen Abteilung des Instituts hatten 1997 mit ihrem Artikel „Nitric Oxide and Inflammation: The answer is blowing in the wind“ den Stein ins Rollen gebracht. Andere Beispiele sind: „Blood on the tracks: a simple twist of fate“ oder „The biological role of nitrate and nitrite: the times they are a-changin“. Die Wette läuft noch bis zur Pensionierung der Teilnehmer. Wetteinsatz ist ein Essen im Restaurang Jöns Jacob, welches passenderweise nach dem Vater der modernen Chemie, Jöns Jakob Berzelius, benannt ist.

Aroma-Forschung

Enzyme veredeln Wein-Bouquet       Jeder Wein hat sein eigenes Aroma. Verantwortlich dafür sind Terpene. Forscher haben bei der Analyse von fünf Weinvarietäten nun Enzyme entdeckt, die über die sogenannte Terpen-Glykosylierung das Bouquet des Weins zum Zeitpunkt der Reife prägen: Je aktiver die zwei gefundenen Enzyme die Terpene glykosylieren – also mit Zuckern versehen –, desto weniger aromatisch wird der Wein. Terpene setzen sich mit zunehmendem Reifungsgrad vor allem in der Haut der Weintrauben (Vitis vinifera) ab. Im Rahmen eines von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten

Projektes haben Wissenschaftler der Technischen Universität München (TUM), der Hochschule Geisenheim und der Universität Bonn damit einen grundlegenden Mechanismus gefunden, der für die Züchtung neuer oder die Veredelung bekannter Rebsorten relevant sein könnte (Plant Physiology, dx.​doi.​org/​10.​1104/​pp.​ 114.​242578). Rebenzüchter können nun gezielt Weinsorten mit einem hohen Anteil freier Terpene auswählen, um besonders aromatische Sorten zu entwickeln. Die Forscher wollen außerdem die Genprofile der bekanntesten Rebsorten ermitteln.

Adenosin schmilzt Hüftgold Unter dem Mikroskop ist es leicht zu unterscheiden: Das Energie-verbrennende braune und das lästige weiße Fettgewebe (im Bild rot eingefärbt sind im Gewebe eingelagerte Lipidtröpfchen). Wie man weißes in braunes Fett umwandeln kann und so vielleicht einmal die Pfunde purzeln könnten, zeigt nun ein internationales Forscherteam. Ihre erstaunliche Entdeckung: Das körpereigene Adenosin kann braunes Fett aktivieren und weißes Fett „bräunen“. Zentraler Schalter des Stoffwechselweges ist der Adenosinrezeptor A2A.Wie der Prozess genau geregelt ist, ist aber noch unklar. Das Forscherteam um Alexander Pfeifer von der Universitätsklinikum Bonn hat seine Ergebnisse Mitte Oktober im Fachjournal Nature (doi:10.1038/nature13816) veröffentlicht. XXII | 15. Jahrgang | Nr. 5/2014

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Bizarre Wette um Dylan-Songs

Themen

Laborautomation Beginnend in den 70er Jahren hat die Automatisierung von Abläufen in Life-SciencesLaboren mit dem Aufkommen von immer genauer werdenden Liquid-Handling-Technologien im vergangenen Jahrzehnt ungeahnte Impulse bekommen. Auf der anderen Seite profitiert auch die Forschung vom standardisierten Abwickeln von Routineprozessen, insbesondere wenn dies im Hochdurchsatz geschieht. Das nächste LABORWELT-Spezial widmet sich beiden Seiten der Medaille und stellt jeweils neue Ideen, Produkte und Anwendungen vor. Erscheinungstermin für das erste Heft des Jahres ist der 29. Januar 2015. Beiträge können bis 13. Januar 2015 eingereicht werden (Redaktionskontakt: m.laqua@biocom.de).

Termine Werbekunden bietet diese Ausgabe, begleitend zum redaktionellen Inhalt, eine ideale Plattform für ihre Anzeigen. Reservieren Sie Ihren Werbeplatz bis spätestens 16. Januar 2015. Informationen geben Oliver Schnell (Tel.: +49-30-264921-45, E-Mail: o.schnell@ biocom.de) und Christian Böhm (Tel.: +49-30264921-49, c.boehm@biocom.de).

Impressum LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint 5-mal im Jahr im Verlag der BIOCOM AG Lützowstraße 33–36 10785 Berlin, Germany Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11 laborwelt@biocom.de www.biocom.de Redaktion Dr. Martin Laqua Tel.: 030/264921-68 Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt und dürfen ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOM Verlages nicht reproduziert oder verbreitet werden.

LABORWELT

24.10.2014 12:51:26 Uhr

Da bleibt nichts drin Neue Low-Retention Spitzen Pipettiergenauigkeit ist auch eine Frage der richtigen Spitze! Proben, die Detergenzien oder andere organische Bestandteile enthalten, bleiben oft an den Wänden von handelsüblichen Spitzen haften. Die Low-Retention Spitzen erhöhen die Pipettiergenauigkeit durch eine Verringerung des Rückstandsvolumens. Durch den Einsatz eines einzigartigen Produktionsverfahrens fertigt METTLER TOLEDO Spitzen, die ein homogenes ultrahydrophobes Feld bilden. Das Ergebnis: Flüssigkeiten können nicht mit der Spitzenoberfläche reagieren, sodass insbesondere problematische Flüssigkeiten rückstandslos über die Innenfläche der Spitze gleiten. Die breite Öffnung und die hochabweisende Oberfläche bilden eine ideale Kombination für das Pipettieren von viskosen/zähflüssigen Proben, Zellkulturen und hochmolekularen Polymeren wie z.B. genomische DNA. Mettler-Toledo GmbH, Ockerweg 3, 35396 Gießen, Tel.: +49 (0)641 507 444, Labor.DZ@mt.com

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23.10.2014 18:29:52 Uhr

SAVE THE DATE

SWISS BIOTECH DAY 2015

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The leading Swiss Biotech Conference and Annual General Assembly of the Swiss Biotech Association

Mark your calendar for next year´s Swiss Biotech Day, the leading biotechnology conference in Switzerland. This event will bring together more than 300 senior executives from the life science industry across Europe. Programme highlights in 2015 will include key notes from renowned industry experts, the presentation of the Swiss biotech report, and the annual general assembly of the Swiss Biotech Association.

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... ONE BIOTECH CLUSTER

The Swiss Biotech Day offers a unique opportunity to meet top-ranking representatives of the Central European life science sector.

APRIL 9, 2013 14 APRIL 2015 SIX Swiss Exchange, Zurich

Basel More information on the conference will be published ConventionPoint, soon. Fill out your contact data on the event website sector is internationally visible. The project-specific www.swissbiotechday.ch“WHITE and BIOTECHNOLOGY” we will keep you updated. WORKING GROUP

participating companies (most of them young and internationally less savvy) find a comprehensive partner Leading chemical companies are exploring the opwhich is helping to put them in the public window. portunities that have been opened up by modern bio- The participating Life Science Regions are important technology, especially in the field of “white” or indusinternal carriers of the dynamics in the Biotech sectrial biotechnology. And they are also applying these tor, thus enhancing the common understanding of the technologies, wherever it makes sense. The SBA takes industry. This and more knowledge is brought into such initiatives seriously and has formed a working Europa Bio, the European Biotech Association, where group specifically dedicated to white biotechnology. the SBA is an active member. The Swiss Industrial Biocatalysis Consortium is an important partner in this effort. The group includes leading multinational companies that support white Supporting Partner: Media Partner: biotechnology as a pillar of economic growth. The planned activities are in agreement with OECD strategies. In partnership with the Swiss Biotechnet (see pages European 14/15) the SBA develops training programmes and useful support tools for the industry. It isBiotechnology of importance Net work that the industry specifies its training needs so that the academic side can create tailor-made education. This strategy ensures that the industry gets the right Domenico Alexakis workforce with the right education. The SBA profits is Executive Director from the marketing alliance “Swiss Biotech” (see box) of the Swiss Biotech in a multiplied form. Thanks to Swiss Biotech, the Association.

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SWISS BIOTECH...

...is an alliance of four leading Biotech regions of Switzerland (Bio Alps, BioPolo Ticino, Basel Area and Greater Zurich Area). They have combined efforts to streamline interests of the national biotech sector. The SWX Swiss Exchange holds a leading position in terms of lifescience listings and offers companies from that industry – be they located in Switzerland or abroad – access to an internationally recognised financial marketplace. The initiative was co-founded by the SBA which also manages Organised by: the executive office of Swiss Biotech.

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For further information please visit www.swissbiotechassociation.ch www.swissbiotech.org

22.10.2014 18:42:13 21:14:06 Uhr Uhr 23.10.2014