1 diagnostico molecular de patogenos de plantas pptx

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATÓGENOS DE PLANTAS: ASPECTOS A CONSIDERAR, HERRAMIENTAS Y TÉCNICAS DISPONIBLES

Miguel Dita (1) Einar Martínez de la Parte (2) Monica Blanco (3) 1) Bioversity International, Costa Rica 2) INISAV - Cuba 3) Universidad de Costa Rica San Juan, Puerto Rico, Octubre 2013

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Por qué es importante un diagnós3co correcto y confiable y rápido

Incorrecto

Correcto

Es diferente en la agricultura?

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Diagnóstico oportuno: fundamental para el manejo del problema Generar medidas de control efectivas Permite la optimización de los recursos Reducción de los efectos negativos en el medio ambiente Origina información respecto a la interacción patógeno hospedante

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Hasta hace unos años la detección de patógenos dependía de métodos que requieren de mucha experiencia, habilidad y conocimiento de la taxonomía de los microorganismos

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Diagnóstico tradicional - Identificación morfológica • Diagnóstico microscópico: consiste en la observación de las estructuras del microorganismo fitopatógeno.

• Esta observación puede ser directamente al microscopio de luz, para el caso de las bacterias, hongos, nemátodos o el uso de microscopía electrónica para identificar a los virus

BACTERIAS HONGOS

PRUEBAS BIOQUIMICAS

IDENTIFICACION DE ESTRUCTURAS BAJO EL MICROSCOPIO

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS

Limitaciones de los métodos tradicionales de diagnóstico 1. Son demorados (días, semanas).

2. Bajo nivel de detección.

3. Incapacidad de discriminar especies relacionadas.

4. Pocos taxónomos y una grandísima diversidad de organismos.

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Las técnicas modernas han permitido una detección más eficiente de variedades patogénicas con mayor rapidez y precisión, ejemplo de ello es el uso de técnicas serológicas (ELISA) y moleculares (PCR)

Biología molecular “El estudio de la estructura, función y composición de las moléculas biológicamente importantes” Concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, lo que incluye relaciones del ADN con el ARN, la síntesis de proteínas, el metabolismo, y el cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un afinado funcionamiento de la célula.

Ramas de: Biología, Química, Bioquímica, Biofísica, Microscopía Electrónica, Citología y Genética

Mol茅cula de ADN (Acido desoxirribonucleico) Contiene la informaci贸n gen茅tica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, siendo el responsable de su transmisi贸n hereditaria.

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Molécula de ADN: - 1953 por James Watson (estudiante de zoología), Universidad de Chicago y Francis Crick (biólogo molecular y físico), Universidad de Cambridge - Ganaron premio Nobel en 1962

Rosalind Franklin

“Esta estructura posee nuevas características las cuales podrían considerarse de interés biológico”

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS Molécula de ADN: - Molécula de 2 hebras que forman una doble hélice -Cada hebra compuesta por: Azúcar Fosfato Base (adenina, timina, citosina, guanina)

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS AAACCGGGTTATCGACGATCGCATCACGACTCCGACGACTAGCATCATCTACACTAT

5’

3’

GACGATCGCATCACGACTCC

CTGCTAGCGTAGTGCTGAGG

3’

5’

Se habla en términos de miles de bases (kb o kilo bases) (ej. 4.5 kb = 4.500 bases) o millones de bases (mb o mega bases) (ej. 4.5 mb = 4.500.000 bases) Genoma humano: consiste de 3 billones de bases (3.000 millones o 3.000 megabases)

Material que puede ser utilizado Cualquier estructura (semilla, tejido vegetal, fruto, suelo, agua) con o sin s铆ntomas o sospecha de infecci贸n

Extrccci贸n de ADN

LIPIDOS

PROTEINAS

ATTGCCGTAACTG TGGTAACCGTACC GAAACCCTGCGTA

Extracción de ADN 1. Disrupción o lisis de las células: Buffer de extracción y Buffer de lisis e incubación a 65°C: NaCl (Cloruro de sodio): los fosfatos de la molécula de ADN repele unas moléculas de otras. Los iones Na+ forman un enlace iónico con los fosfatos y neutralizan la carga negativa permitiendo que las moléculas del ADN se agrupen EDTA (Ethylenediamine tetracetic acid): agente quelante con gran afinidad por iones metálicos e iones de Mg, cofactores de las ARNasas (enzimas que degradan el ADN). El EDTA se une a los iones y anula su efecto.

CTAB (Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide): detergente utilizado para romper las membranas celulares y remover lípidos de la membrana Otros agentes estabilizadores: Tris HCl, sorbitol, bisulfito de sodio, DTT, detergentes: SDS (remueve lípidos), sarkosyl, triton, PVP (une a polifenolescomponentes de la pared celular-removiendolos), 2-mercaptoethanol (desnaturaliza proteínas).

Extracción de ADN 2. Adición de cloroformo-isoamil alcohol (24:1) o fenol- cloroformoisoamil alcohol (25:24:1). Centrifugación.

Son solventes orgánicos, de forma que los componentes lisados de las células que son hidrofóbicos quedan atrapados, ej. lípidos de la membrana, secuencia de polipéptidos (proteínas), o polisacáridos. Además desnaturalizan proteínas.

Fase acuosa: compuestos hidrofílicos, ac. nucleicos, sal, azúcares Interface: ADN Fase orgánica: compuestos hidrofóbicos

3. Las proteínas se eliminan agregando una proteasa (acetato de sodio o de amonio)

Extracción de ADN 4. El ADN se precipita con alcohol – usualmente etanol puro frio o isopropanol (2-propanol). Puesto que el ADN es insoluble en alcohol, este precipita y forma un pellet en el fondo del tubo luego de la centrifugación. Este paso también remueve sales solubles en alcohol.

Precipitado de ADN

Extracci贸n de ADN 5. El ADN se limpia con alcohol al 70%, se deja secar y se diluye en buffer TE (protege el ADN de la degradaci贸n al guardarlo por largos periodos) o agua destilada autoclavada.

Kits para extracci贸n de ADN Quiagen

Cuan7ficación de ADN

a. Espectrofotómetro/ nanómetro

DNA/RNA absorben luz ultravioleta con un pico de absorción de 260 nm Detector mide la luz que pasa a través de la muestra (↑ absorción de luz -­‐ ↑ concentración de ácidos nucleicos)

ADN/ARN esta presente Resultado puede ser alterado por contaminantes (fenol, proteínas) 260/280 = 1.8 estable 260/280 = 2.0 o > (contaminación con proteínas) 260/280 = 1.6 o < (contaminación con ARN)

Cuantificaci贸n de ADN b. Electroforesis en gel de agarosa

Herramientas y tĂŠcnicas disponibles

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS

Principales técnicas de diagnóstico molecular Técnica

Sensibilidad

Molécula blanco o target

PCR

Alta-­‐M (ng)

ADN

qPCR

Alta (fg)

ADN

ICPCR

Alta

Proteina-­‐ADN

Elisa

Media

Proteínas

Microarrays

Alta

ADN o ADNc

Reacci贸n en cadena de la polimerasa (PCR) ADN polimerasa

ADN ligasa

Topoisomerasa ADN polimerasa Helicasa Proteinas de uni贸n a la cadena simple

Reacci贸n en cadena de la polimerasa (PCR)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ATCGGTCATGGCCTAACTTATGGCCCAAAAT GGACTAGCTACGATAGCTAGCTAGCTTAAAC GATCGTAGCTAGTCGATATTAAAAGCTATAGC PRIMERS O CEBADORES TAGCTAGCTAGTATATCGAATCGGTCATGGCC TAACTTATGGCCCAAAATGGACTAGCTACGAT AGCTAGCTAGCTTAAACGATCGTAGCTAGTC AMPLICÓN GATATTAAAAGCTATAGCTAGCTAGCTAGTAT ATCGAATCGGTCATGGCCTAACTTATGGCCC AAAATGGACTAGCTACGA PRIMERS O CEBADORES

Electroforesis/gel de agarosa ATCGGTCATGGCCTAA CTTATGGCCCAAAATG GACTAGCTACGATAGC TAGCTAGCTTAAACGAT CGTAGCTAGTCGATATT AAAAGCTATAGCTAGC TAGCTAGTATATCGAAT CGGTCATGGCCTAACT TATGGCCCAAAATGGA CTAGCTACGATAGCTA GCTAGCTTAAACGATC GTAGCTAGTCGATATTA AAAGCTATAGCTAGCTA GCTAGTATATCGAATCG GTCATGGCCTAACTTAT GGCCCAAAATGGACTA GCTACGA

M

1

2

3

4

5

Resultado positivo: hay presencia del hongo o la bacteria en la muestra

6

7

8

9

10 C+ C-

Resultado negativo: NO hay presencia del hongo o la bacteria en la muestra

M: marcador de peso molecular (indica el número de pares de bases que hay en la banda

Otros tipos de anรกlisis: PCR en tiempo real o PCR cuantitativo en tiempo real

http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU

Otros tipos de análisis: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) 1985 - Utilizado para la detección de especies de algunos patógenos - Detecta la variación existente en el ADN de un secuencia que puede ser observada al romper el ADN en diferentes partes con enzimas de restricción y la visualización de los fragmentos resultantes mediante electroforesis en gel.

RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) - Enzima de restricción o endonucleasa de restricción: enzimas encontradas en bacterias o Archae y han evolucionado como mecanismo de defensa para contraatacar virus

37° C- activa 95 ° C- inactiva

DIAGNÓSTICO DE FITOPATÓGENOS

Otros tipos de análisis: Secuenciación: - Se utiliza el amplicón generado en la reacción de la PCR - La muestra se limpia o purifica directamente de la PCR o la banda se extrae del gel con kits o enzimas especiales - Paginas como la de Gen Bank (www.ncbi.com) permiten la comparación de secuencias con secuencias depositadas en el sitio (librerías)

Secuenciaci贸n CGGTCATGGCCTAACTTATGGCCCAAAAT

ADN desconocido

Desconocido:

CGGTCATGGCCTAACTTATGGCCCAAAAT

Pseudomonas sp.: CGGTCATGGCCTAACTTATGGCCCAAAAT Agrobacterium sp.: CGGTGTTGGCCTAACAAATGGCCCTCAAT Burkholderia sp.:

AGGTCATCGCCTATGTTATGGGGGAAAAT

Resultado: el ADN desconocido tiene 100% de similitud con secuencias de Pseudomonas syringae (g茅nero y especie)

Nucleótidos correspondientes a cada pico Puntaje Phred: la calidad estadística de cada base leída. Barras altas tienen puntaje de 20 (0.01 de probabilidad de que una base sea mal leída)

Cromatogramas determinan la secuencia de ácidos nucleicos A. Alta calidad, picos espaciados y uniformes los cuales tiene muy poco ruido de fondo B. Secuencia de nucleótidos de baja calidad, con muchos picos superimpuestos y mucho ruido (mezcla de dos o mas secuencias de ADN)

Enfermedades cuarentenarias o de importancia económica para LAC : consideraciones sobre su diagnós7co Moho blanco-­‐Sclero'nia sclero'orum

Síntomas y estructuras de S. Sclerotiorum en varios cultivos

Enfermedades cuarentenarias o de importancia económica para LAC : consideraciones sobre su diagnós7co

S. sclerotiorum es un patógeno polífago con un rango de hospedantes extremadamente amplio que incluye a 75 familias, 278 géneros y 408 especies hasta 1994 (CABI, 2007).

Moho blanco-­‐Sclero'nia sclero'orum Yin et al., 2009- Detection of Sclerotinia sclerotiorum in Planta by a Real-time PCR Assay. J. Phytopathol 157:465–469

Separación electroforética de la huella genómica (DNA fingerprint) de S. sclerotiorum y otros aislados fúngicos generada por el cebador microsatélite M13. La flecha indica e fragmento característico de S. sclerotiorum amplificado por el cebador. Línea 2-8: aislados de S. sclerotiorum , línea 9: Botrytis cinerea, línea 10: Monilinia fructicola, línea 11: Fusarium graminearum y línea 12: Aspergillus flavus.

Moho blanco-­‐Sclero'nia sclero'orum Yin et al., 2009- Detection of Sclerotinia sclerotiorum in Planta by a Real-time PCR Assay. J. Phytopathol 157:465–469

Producto de amplificación 1.2 Kb (M13) Purificación, clonaje y secuenciación

Secuencias Edicion y alineamiento

SEQUENCHER version 4.7 (Genecodes)

Cebadores específicos ©NC State University

PCR o qPCR SsF (5´-AGTCGAGGGACGGGTACTAA-3´) SsR (5´-CTTGTCCTCATTGCCGTTT-3´)

Moho blanco-­‐Sclero'nia sclero'orum Rogers et al., 2009- Detection and quantification of airborne inoculum of Sclerotinia sclerotiorum using quantitative PCR. Plant Pathology, 58: 324–331.

Secuencias del intron rARN de la subunidad menor mitocondrial Edicion y alineamiento

GenEMBL GenEMBL database

(GenBank + EMBL)

Análisis BLAST (BLASTN)

Cebadores para PCR o qPCR mtSSFor (5´AGGTAACAAGTCAGAAGATGATCGAAAGAGTT-3´) mtSSRev (5´-GCATTAAGCCTGTCCCTAAAAACAAGG-3’)

Comprobación de la especificidad

Moho blanco-­‐Sclero'nia sclero'orum Rogers et al., 2009- Detection and quantification of airborne inoculum of Sclerotinia sclerotiorum using quantitative PCR. Plant Pathology, 58: 324–331.

Tabla 1- Deteccción de ADN de diferentes hongos y una especie de planta mediante PCR y qPCR con el empleo de los cebadores diseñados

Mancha negra de los cítricos-­‐ Guignardia citricarpa

A

B

Síntomas de la mancha negra de los cítricos. A: en fruto y B: en hoja

Mancha negra de los cítricos-­‐ Guignardia citricarpa

Phyllos'cta citricarpa

Phyllos'cta citricarpa

Mancha negra de los cítricos-­‐ Guignardia citricarpa Stringari et al., (2009). High Molecular Diversity of the Fungus Guignardia

citricarpa and G. mangiferae and New Primers for the Diagnosis of the Citrus Black Spot. Brazilian Archieves Biology and Technology, 52(5):1063-­‐1073.

Estudio de variabilidad genética con marcadores RAPDs y desarrollaron un marcador SCAR para el diagnóstico especifico de G. citricarpa.

Electroforesis en gel de agarosa de los productos de la amplificación de ADN de aislados de G. citricarpa y G. mangiferae con el empleo de los cebadores GCP1/GCP2. Leyenda: M: Marcador de peso molecular 100 bp. 1-9: G. citricarpa, 10 - 20: G. mangiferae .

Mancha negra de los cítricos-­‐ Guignardia citricarpa van Gent-Pelzer et al. (2007). A TaqMan PCR Method for Routine Diagnosis of the Quarantine Fungus Guignardia citricarpa on Citrus Fruit. J. Phytopathology, 155: 357– 363.

Prod. de amplificación ITS secuenciación Secuencias Edicion y alineamiento

MegAlign Software

Diferencias en secuencias entre especies Primer Express software Diseño de Cebadores específicos

TaqMan probe GcP1 (5´-AAAAAGCCGCCCGACCTACCTTCA-3´) TaqMan primer pair GcF1 (5´-GGTGATGGAAGGGAGGCCT-3´) GcR1 (5´-GCAACATGGTAGATACACAAGGGT-3´)

Mancha negra de los cítricos-­‐ Guignardia citricarpa van Gent-Pelzer et al. (2007). A TaqMan PCR Method for Routine Diagnosis of the Quarantine Fungus Guignardia citricarpa on Citrus Fruit. J. Phytopathology, 155: 357– 363.

Ventajas del método de qPCR vs PCR convencional (Bonants et al., 2003). ü El RT-PCR es más sensible que el PCR convencional al presentar un límite menor de detección,10 fg respecto a 20 pg del PCR. ü La talla del amplicon de PCR es de 490 pb mientras que el del RT-PCR es de 69 pb. ü El método diagnóstico por PCR convencional en lesiones sin picnidios es demorado (time consuming) y la visualización del amplicon puede ser difícil cuando existen bajos niveles del producto de PCR.

Roya de la caña de azúcar Puccinia kuehnii

Puccinia melanocephala

Roya de la caña de azúcar Glynn et al. (2010). PCR assays for the sugarcane rust pathogens Puccinia

kuehnii and P. melanocephala and detec3on of a SNP associated with geographical distribu3on in P. kuehnii. Plant Pathology ,59:703–711.

Análisis de secuencias conservadas entre los dos patógenos publicadas en la base de datos del GenBank (NCBI-­‐Na3onal Center for Biotechnology Informa3on).

PkPmF-­‐AAGAGTGCACTTAATTGTGGCTC PkPmR-­‐TCCCACCTGATTTGAGGTCT 5.8s

18s

ITS 1

28s ITS 2

5s IGS 1

PkPm-F ITS1

ITS2

PkPm-F

IGS 2

Roya de la caña de azúcar Glynn et al. (2010). PCR assays for the sugarcane rust pathogens Puccinia kuehnii and P. melanocephala and detec3on of a SNP associated with geographical distribu3on in P. kuehnii. Plant Pathology ,59:703–711.

PkPmF / PkPmR-­‐Prod. de amplificación P kuehnii-­‐606 pb P melanocephala-­‐ 585 pb Purificación, clonaje y secuenciación Secuencias Edicion y alineamiento

SEQUENCHER version 4.7 (Genecodes)

Cebadores específicos

PCR P kuehnii-­‐ Pk1F/Pk1R-­‐527 pb P melanocephala-­‐ Pm1F/Pm1R -­‐480 pb

qPCR P kuehnii-­‐ Pk2F/Pk2R-­‐142 pb P melanocephala-­‐ Pm2F/Pm2R -­‐130 pb

Roya asiá7ca de la soya-­‐ Phakopsora pachyrhizi

Métodos para el diagnóstico de P. pachyrhizi.

1. Morfológico.

2. Inmunulógico (ELISA y tiras inmunocromatográficas) .

3. Molecular (PCR y RT-PCR).

Roya asiá7ca de la soya-­‐ Phakopsora pachyrhizi

A

C

B

D

E

Estructuras de interés taxonómico en P. pachyrhizi. A-B: paráfisis, C: teliosporas, D: telios y E: uredosporas.

Roya asiá7ca de la soya-­‐ Phakopsora pachyrhizi Frederick et al., (2002). Polymerase chain reac3on assays for the detec3on and discrimina3on of the soybean rust pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae. Phytopathology 92:217-­‐227.

Prod. de amplificación ITS (ITS 4 e ITS5 [White et al., 1990]) secuenciación Secuencias Edicion y alineamiento

MegAlign Software

Diferencias en secuencias entre especies Primer Express software Diseño de Cebadores específicos

PCR

qPCR

Métodos de Diganós7co-­‐ Phakopsora pachyrhizi kit Quickstar de Envirologix

Morfología

PCR o Real Time PCR Phakopsora sp.

Frederick et al., 2002 5 horas

Nega3vo

Posi3vo 15 min

P. meibomiae o P. pachyrhizi

Métodos de Diganós7co-­‐ Phakopsora pachyrhizi

Jurick et al., (2007). A comparative analysis of diagnostic protocols for detection of the Asian soybean rust pathogen, Phakopsora pachyrhizi. Online.

Plant Health Progress doi:10.1094/PHP-2007-0531-01-RS. ü Con una adecuada preparación, los especialistas son capaces de identificar a P. pachyrhizi después de la observación al microscopio de las pustulas, teliosporas y uredosporas. ü Los métodos moleculares (PCR y qPCR) son particularmente útiles en la detección temprana de la enfermedad antes del desarrollo de los síntomas de la roya ü El kit de ELISA evaluado no fue especie específico, requiere de más tiempo por muestra que los demás métodos y no presentó igual sensibilidad que el PCR cuando se trabajó con muestras que habían sido almacenadas o transportadas en condiciones no óptimas.

Pudrición negra de la raíz-­‐ Thielaviopsis basicola

Pudrición negra de la raíz causada por T. basicola . A: zanahoria, B: algodón y C: poinsettia. 1-raíces afectadas, 2-raíces sanas

Pudrición negra de la raíz-­‐ Thielaviopsis basicola

D Síntomas provocados por: A: T. basicola, B: T. thielavioides y C: Alternaria radicina; D: clamidosporas de T. basicola.

Pudrición negra de la raíz-­‐ Thielaviopsis basicola Huang, J. y Kang, Z. (2010). Detection of Thielaviopsis basicola in soil with real-time quantitative PCR assays. Microbiological Research, 165: 411—417.

Secuencias de las regiones ITS

Búsqueda de secuencias de T. basicola con el empleo del Nucleo3de Sequence Search P r o g r a m ( N C B I -­‐ N a 3 o n a l C e n t e r f o r Biotechnology Informa3on).

Secuencias conservadas Edicion y alineamiento-Blast

GenBank, EMBL y DDBJ

Secuencias específicas de T. basicola Primer Express 1.0 Diseño de Cebadores específicos TaqMan probe TbP (5´-­‐CCCGAGAGGCACCTGC CAAAGCA-­‐3´) TaqMan primer pair Tb1 (5´-­‐TATTCATTGCTGAGTGGC-­‐3´) / T b2 (5´-­‐GGTTTTCCGGCATGTTAT-­‐3´) Tb3 (5´-­‐ACCATATGTGAACGTACCTTTTCT-­‐3´) / Tb4 (5´-­‐ AGTTTATAAATGCTACCGGCAGAA-­‐3´)

Pudrición del cuello de la cebolla [Botry's spp] (Onion neck rot)

Causada fundamentalmente por tres especies de Botrytis transmisibles por semilla: B. aclada, B. allii y B. byssoidea

Pudrición del cuello de la cebolla [Botry's spp] (Onion neck rot)

Limitaciones de los métodos traicionales de análisis de semilla de cebolla en la detección de Botrytis spp. " Gran variación en su especificidad y sensibilidad . " Influenciados por las condiciones de incubación de la semilla (luz, temperatura), por el desinfectante y tiempo de desinfección empleado, etc. " Requieren de varias semanas para el diagnóstico final. " Requieren de personal entrenado y recursos para la diferenciación de Botrytis spp.

Pudrición del cuello de la cebolla [Botry's spp] (Onion neck rot) Chilvers et al., (2007). A real-­‐3me, quan3ta3ve PCR seed assay for Botry's spp. that cause neck rot of onion. Plant Dis. 91:599-­‐608.

5.8s

18s SSU

ITS 1

28s ITS 2

LSU

18s

5s IGS 1

IGS 2

LR 12R LSU

LR12R (5´-GAACGCCTCTAAGTCAGAATCC-3´) CNS1 (5´-GAGACAAGCATATGACTACTGT-3-)

IGS1

IGS2

SSU CNS 1

Pudrición del cuello de la cebolla [Botry's spp] (Onion neck rot) Chilvers et al., (2007). A real-­‐3me, quan3ta3ve PCR seed assay for Botry's spp. that cause neck rot of onion. Plant Dis. 91:599-­‐608.

Amplificación de las regiones IGS ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Purificación, clonaje y Ready Reac3on Kit /PE Biosystems Automated DNA secuenciación Sequencer Secuencias Edicion y alineamiento

Vector NTI Suite v.10.0.1

Cebadores específicos 5ʹ′-­‐GAGCTAGCGCATTTGAAAGC-­‐3ʹ′ 5ʹ′-­‐TCACCGGGAGCTATCATAGGC-­‐3ʹ′

Comprobación de la especificidad

114 pb

Desarrollo de un método de diagnós7co específico para RT4 Morfología VCG VCG 01213=Foc raza 4

Fusarium oxysporum Pruebas de patogenicidad

PCR Foc raza 4 tropical

PERSPECTIVAS DE DIAGNÓSTICO A LARGA ESCALA PARA FINES CUARENTENARIOS Y DE EXPORTACIÓN La PCR ha revolucionado el diagnós7co y la inves7gación … pero Es necesario dominar y validar la técnica y disponer de informaciones para el diseño de primers específicos • Concentraciones de DNA , • Concentraciones y calidad de los componentes de la reacción • Cuidados con la contaminación • Condiciones de amplificación: El binomio TT = temperatura -­‐3empo • Termocicaldor • Análisis de resultados No es tan trivial así, principalmente en las condiciones de algunos Laboratorios de LAC

PERSPECTIVAS DE DIAGNÓSTICO A LARGA ESCALA PARA FINES CUARENTENARIOS Y DE EXPORTACIÓN La PCR ha revolucionado el diagnós7co y la inves7gación … pero ■ Hay muchos componentess que no pueden ser detectados por PCR

Prions, Toxinas, Allergens etc

■ Muestras Complejas puede ser un problema para la detección basada en ácidos nucleicos – ejemplo suelo, alimentos ■ A veces algunas proteinas virales solo existen en una fase muy específica de la enfermedad en la ausencia d ela replicación del virus ■ Detección de proteinas ofrece informaciones importantes acerca de la infección ac3va

PERSPECTIVAS DE DIAGNÓSTICO A LARGA ESCALA PARA FINES CUARENTENARIOS Y DE EXPORTACIÓN Limitación de número de muestras

Que tal hacer más por menos ?

• • • •

Automa3zación +++ Mayor sensibilidad +++ Menor can3dad de ADN No hay necesidad de correr geles

速 OpenArray System

Genotyping & Real Time PCR

The

速 OpenArray

System

OpenArray® system • Combina identificación y cuantificación del patógeno simultanemanete • Tiempo corto de respuesta • Sensitivity and specificity equivalente o mejor que metodos standars de cultivo • Detección simultánea multi-patogeno en una plataforma simple, fácil de usar y comercialmente validada

BioTrove - OpenArray™ Anatomy

48 sub-arrays en cada placa n Cada sub-array consiste en 64 pocillos n High throughput. – Larga escala n Tres placas que corren : 3 x 3072 PCR’s en paralelo ~9 000 reacciones n

30 nL

BioTrove - OpenArray™ Anatomy “Corriendo el gel"

BioTrove - OpenArray™ Anatomy

Sensibilidad & Especificidad

Mezcla de DNA de 17 patogenos en diferentes concentraciones fueron diluidos 10-veces, y puestos the OpenArray plates and cycled in the NT Schoen  2009  Cycler.

Proximity Liga3on Amplifica3on PLA 3ene la especificidad de un immunoensayo con la sensibilidad versa3lidad de PCR. Después de la ligación la nueva cadena de DNA quimérica puede ser amplificada por PCR or Rolling circle amplifica3on (RCA)

Schoen 2009

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATÓGENOS DE PLANTAS: ASPECTOS A CONSIDERAR, HERRAMIENTAS Y TÉCNICAS DISPONIBLES.

Hay otros varios métodos….

Cual u3lizar?

Depende de: • Obje3vo • Dosponibilidad de equipos • Número de muestras • Cliente

Gracias & Preguntas?