Media getoetst

Groot verschil in productiviteit en selectiviteit

Bij bepaling van de aan- of afwezigheid van micro-organismen kunnen analisten gebruikmaken van een groot aantal media. In de onlangs verschenen ISO 11133 worden de eisen beschreven waaraan media moeten voldoen en hoe dat gecontroleerd kan worden. Enkele praktijktesten wijzen uit dat er grote verschillen zijn in houdbaarheid van media van diverse aanbieders, vooral bij selectieve media.

Standardisation (ISO) is eind vorige eeuw begonnen hiervoor een norm te schrijven. Deze norm ISO 11133: ‘Preparation, production, storage and performance testing of culture media’ is dit jaar gepubliceerd. Publicatie van een toevoeging voor de bevestigings- en identificatiereacties volgt waarschijnlijk volgend jaar.

Controle documentatie

Voorafgaand aan het toetsen van media met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve methoden, dient de laborant eerst een aantal controlestappen te doorlopen. Dat begint al bij de aflevering van het medium: is de verpakking intact, klopt de identificatie van het product en is er documentatie aanwezig? Verder moeten er instructies zijn voor de houdbaarheid van het medium en voor de bewaartemperatuur, en zowel voor als na aanbreken van de verpakking.

Selectie uit de norm

Bij het bereiden, steriliseren en bewaren van media kunnen tussen de verschillende componenten chemische reacties optreden, die de kwaliteit kunnen beïnvloeden. Bovendien zijn er bij het bereiden van media veel verschillende stappen, waardoor de kans groot is dat er fouten worden gemaakt, zoals verkeerd afwegen, verkeerde pH of verkeerd verhitten. Betrouwbare toetsen en criteria voor een medium zijn dus noodzakelijk. Dat is een belangrijke reden om alle media voor gebruik te toetsen volgens vast omschreven procedures. De International Organisation for

Dit artikel kan niet alle voorbeelden uit de norm omvatten. Daarom is er een selectie gemaakt. Filtratiemedia, filters en kwantitatieve methoden voor het toetsen van selectiviteit worden niet behandeld. Het boek Microbiologie van Voedingsmiddelen (2015, MYbusinessmedia, Capelle aan de IJssel) of de officiële norm ISO 11133 (NEN, Delft) kan daarvoor worden geraadpleegd. Ook kan worden deelgenomen aan een seminar over dit onderwerp (FiMM, Wageningen).

In de documentatie die de producent of de bereider verstrekt, moet minimaal vermeld zijn: naam van het medium; individuele componenten; eventuele supplementen; productcode; technische gegevens als samenstelling, af te wegen hoeveelheid en referenties; veiligheidsgegevens; batchnummer; gewenste pH van het complete medium; bewaarinstructies; houdbaarheid; criteria en resultaten van toetsen met relevante micro-organismen.

Transportmedia

Voor het transport van monsters naar het laboratorium worden soms transportmedia gebruikt. Eenmaal op het lab worden de monsters vaak verdund met een verdunningsvloeistof of een ophopingsmedium. Voor zowel de transportmedia als verdunningsvloeistoffen geldt dat het aantal toegevoegde micro-organismen niet te veel mag toe- of afnemen. Binnen de voorgeschreven tijd – bijvoorbeeld één uur bij kamertemperatuur voor verdunningsvloeistof en 24 uur bij een temperatuur van 5 ºC voor een transportmedium –moet het aantal kolonievormende eenheden (kve) per ml binnen de grenzen liggen van T0 ± 30 procent. T0 is het aantal toegevoegde micro-organismen aan het medium: bijvoorbeeld 1 ml met 104 kve/ml toegevoegd aan 9 ml verdunningsvloeistof.

Direct na toevoegen en goed mengen en na één uur wordt 0,1 ml uitgespateld op een neutraal medium, bijvoorbeeld

Trypton Soya Agar (TSA), en worden de platen volgens voorschrift bebroed en geteld. Zo wordt kwantitatief bepaald of de vloeistof aan het criterium voldoet.

Selectieve ophopingsmedia

Voor selectieve ophopingsmedia gelden twee criteria: het doelorganisme moet goed groeien tijdens de bebroedingstijd en begeleidende micro-organismen moeten voldoende geremd worden. Voor gangbare media doet de gebruiker een kwalitatieve test om na te gaan of het medium voldoet aan de eisen. Dit kan in één buis worden gedaan, waarin zowel het doelorganisme als het te remmen micro-organisme wordt geënt, of in twee afzonderlijke buizen. Van het toetsorganisme worden <100 kve per buis met 10 ml medium toegevoegd en van het te remmen micro-organisme >100 kve per buis. Na bebroeden, waarvoor de kortst genoemde termijn in de norm wordt gekozen, wordt 10 μl afgestreken.

Vanuit de buis met het doelorganisme

Vanuit de buis die beide toetsstammen bevat, wordt afgestreken op het voorgeschreven selectief isolatiemedium. Na bebroeden mag er geen groei aanwezig zijn van het te remmen micro-organisme. Het doelorganisme moet gegroeid zijn als een lijn met samenvloeiende kolonies, en moet >10 kolonies bevatten.

Vloeibare media wordt afgestreken op een niet-selectief medium, bijvoorbeeld TSA. Na bebroeden moet de groei zichtbaar zijn als een lijn met samenvloeiende kolonies. Deze moet >10 kolonies bevatten.

Vanuit de buis met het te remmen micro-organisme wordt afgestreken op het bij de ophoping voorgeschreven selectieve isolatiemedium. Na bebroeden mag er geen groei (dit is <10 kolonies) aanwezig zijn op de entstreep.

In de ISO-norm 11133 wordt ook een kwantitatieve buismethode beschreven voor het toetsen van vloeibare media. Er wordt onderscheid gemaakt tussen heldere media zoals Nutrient Broth (NB) en niet-heldere media zoals Brilliant Green Bile Broth (BGLB). Een helder niet-selectief ophopingsmedium zoals Buffered Pepton Water (BPW) kan kwalitatief worden getest door het doelorganisme toe te voegen in een concentratie van <100 kve per buis van 10 ml. Na bebroeden wordt de buis beoordeeld op troebelheid: 0 = de buis blijft helder, 1 = de buis is licht troebel en 2 = de buis is goed troebel. Score 2 is vereist voor een goed medium.

Een niet-helder medium, bijvoorbeeld het bevestigingsmedium BGLB, wordt aangeënt met 1 μl suspensie van de toetsstam die >106 kve bevat. Na bebroeden wordt 1 μl afgestreken op een vast neutraal medium, bijvoorbeeld TSA. Na bebroeden wordt de groei als volgt beoordeeld: 0 = er is geen groei, 1 = zwakke groei (losse kolonies) en 2 = goede groei (aaneengesloten). Score 2 is vereist voor een goed medium.

Vaste media

Vaste media kunnen zowel kwalitatief als kwantitatief worden onderzocht. Bij kwalitatief onderzoek wordt 1 μl van de toetsstam afgestreken op het te testen medium. Het medium moet goede groei vertonen (score 2) voor gewenste microorganismen. Bovendien moet de groei karakteristiek zijn voor dit micro-organisme (kleur, uiterlijk, eventuele hofvorming). Voor niet-gewenste micro-organismen moet de remming volledig (score 0) of gedeeltelijk (score 1) zijn. Als dat nodig is, kunnen meerdere stammen op een plaat worden afgestreken.

Kwantitatieve toetsen voor vaste media worden uitgevoerd door van een werkcultuur met 100 kve 0,1 ml op een vast medium of 1 ml in een lege petrischaal te brengen. Vervolgens worden de beënte platen gespateld en de petrischalen met de suspensie gegoten met het te testen medium. Voor neutrale media als TSA wordt een ander neutraal medium, bijvoorbeeld Plate Count Agar (PCA), als referentiemedium gebruikt. Voor een selectief medium wordt een neutraal medium als referentiemedium gebruikt. Na beënten of gieten van de platen van test- en referentiemedia worden de platen bebroed op de kortst genoemde tijd in de norm en vervolgens geteld.Voor niet-selectieve media geldt dat de productiviteitsratio (PR; dat is het quotiënt van testmedium (Tm) en referentiemedium (Rm)) > 0,7 moet zijn: PR = Tm/Rm = > 0,7. Voor selectieve media geldt dat dit quotiënt > 0,5 moet zijn. Als de gevonden PR hoger is dan 1,4, moet er gezocht worden naar de oorzaak hiervan. Verder moet het uiterlijk van de kolonies voldoen aan de karakteristieke kenmerken van het toetsorganisme.

Testresultaten

Hierna worden enkele resultaten getoond van het toetsen van media. Vaak voldoet een medium aan de norm. Het komt echter ook voor dat de opbrengst van media – dat wil zeggen het aantal kve dat zich ontwikkelt – in korte tijd snel achteruit gaat. Daarom is het beslist noodzakelijk media voor gebruik te testen om verzekerd te zijn van een stevig fundament voor microbiologische analyses. Bovendien kan men door regelmatig te testen, bijvoorbeeld wekelijks, de houdbaarheid van media bepalen. Plate Count Agar (PCA), afkomstig van drie verschillende fabrikanten, werd direct getoetst na bereiden en na twee weken gekoeld (7 ºC) bewaren. In beide gevallen was het resultaat voldoende: de productiviteitsratio (PR) was > 0,7 en < 1,4. Tussen de drie fabrikanten was geen duidelijk verschil aantoonbaar.

Vooral bij selectieve media kunnen bij bewaren verschillen ontstaan in de produc- tiviteitsratio. Voor Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC), voor het isoleren of tellen van Clostridium perfringens, is de PR direct na bereiden voldoende. Na twee en vier weken bewaren bij 7 ºC daalt de PR aanzienlijk tot 0,6 (nog net voldoende) en 0,1 (onvoldoende). Tussen de media van de twee fabrikanten is er geen duidelijk verschil aantoonbaar.

Ook de keuze van het toetsingsorganisme heeft invloed op het testresultaat. Een medium moet in staat zijn ook karakteristieke kolonies te geven met toetsstammen die minder robuust zijn. Daarom staat in ISO 11133 een overzicht van de te gebruiken stammen en is, waar mogelijk, aangegeven of het een robuuste stam is of niet. Alle toetsstammen die in de norm worden genoemd, hebben een nummer van het World Data Centre for Microorganisms (WDCM). De website van World Federation for Culture Collections (www.wfcc.info) vermeldt onder welke andere collectienummers de stam ook bekend is.

• RIJKELT BEUMER, WILMA HAZELEGER • R. Beumer, levensmiddelenmicrobioloog FiMM, extern medewerker Wageningen Universiteit, Rijkelt.Beumer@ wur.nl; W. Hazeleger, levensmiddelenmicrobioloog, Wageningen Universiteit.

Natuurlijk rood door tomaat of schimmel

Eiwitten voor glutenvrije producten

Arla lanceert het melkeiwit Nutrilac om de smaak en textuur van glutenvrije producten te verbeteren. Volgens het bedrijf simuleert het eiwit de structuur en functionaliteit van tarwegluten, waardoor een elastisch deeg ontstaat dat op dezelfde manier kan worden verwerkt als gistdeeg. Dit zorgt volgens Arla voor een goede kruimweerstand. Brood kan zodoende goed worden gesneden en het krijgt een knapperige korst. De eiwitten zijn natuurlijk en hebben een neutrale melksmaak.

www.arlafoodingredients.com www.lycored.com

Lycored introduceert twee natuurlijke rode kleurstoffen. Tomat-O-Red is afkomstig van lycopeen uit tomaten. Volgens het bedrijf is het stabieler dan rood uit bieten of anthocyaniden. De tomatenkleurstof is stabiel bij een brede pH-range, ascorbinezuur en hoge temperaturen. Lyc-O-Beta is afkomstig van Blakeslea trispora, een betacaroteenrijke, allergeenvrije schimmel, gecultiveerd door Lycored. De betacaroteen die uit deze schimmel wordt geëxtraheerd levert een reeks gele tot oranje kleuren op voor gebruik in bakkerijproducten, vullingen, snoep, zuivel en dranken. Beide ingrediënten zijn verkrijgbaar in vloeibare vorm en verschillende kleurintensiteiten. De kleurstoffen zijn goedgekeurd voor gebruik in voedingsmiddelen in de Verenigde Staten, Europa, Japan en Australië.

Natuurlijk umami voor vleesvervangers

Yama Products toont op de Anuga LUSS, het volledig natuurlijke smaaksysteem voor de voedingsmiddelenindustrie. Het vloeibare umamisysteem is onder andere geschikt als smaakstof in vleesvervangers. Vegetarische burgers, worsten, marinades hebben volgens Yama Products met dit systeem geen off-flavour meer. Bezoekers van de Anuga kunnen de producten met LUSS proeven in Hal 3.1, stand C-039.

www.yama.nl

Melk werkt remmend op Campylobacter

De ziekmakende bacterie Campylobacter wordt sterk geremd door gepasteuriseerde melk en babyvoeding. Dit blijkt uit onderzoek van de afdeling Medische Microbiologie en Infectieziekten van Erasmus MC. Onderzoeker Rogier Louwen en zijn team onderzochten samen met FrieslandCampina de invloed van gepasteuriseerde melk op de Campylobacter-bacterie. Dit deden zij door darmcellen te kweken en deze te incuberen met melk waarin de bacterie zat. Onderzoekers ontdekten dat in de gekweekte darmcellen de ziekmakende werking van de bacterie werd geremd door gepasteuriseerde melk en babymelk. Vervolgonderzoek moet uitwijzen wat deze remming precies veroorzaakt en of het ook werkzaam is voor andere bacteriën.

www.erasmusmc.nl

Waterdichte rvs-kasten

Deurop heeft waterdichte kasten in het assortiment die volgens het bedrijf optimale bescherming bieden voor elektronische apparatuur in productieruimten. De kasten zijn uitgevoerd met een ruimtebesparende, gasgeveerde liftdeur van roestvast staal. Ze zijn leverbaar als inbouw, opbouw of vrijstaande kast. De kasten zijn volledig waterdicht volgens IP66 en uitgevoerd met FDA-goedgekeurde siliconenafdichting. Ze zijn beschikbaar in rvs 304 of 316 in geslepen uitvoering conform de richtlijnen voor hygiëne. Deurop produceert zijn producten op maat. Ze zijn beschikbaar vanaf één stuks. Volgens het bedrijf zijn ze altijd voordeliger geprijsd dan standaardproducten van al bestaande merken. www.deurop.nl

Lekdetectiesysteem

Ishida Europa introduceert een lekdetectiesysteem dat bederf bij voorverpakte foodproducten voorkomt. Het systeem is ontwikkeld voor tal van voedingsmiddelen zoals vers, gekookt en gezouten vlees, kip, vis, fruit, salades, groente en kaas. De Ishida AirScan gebruikt lasertechnologie om CO2-lekken in MAP-verpakkingen te detecteren uit gaten met een diameter van 0,5mm en met een snelheid van 180 verpakkingen per minuut. Het lasersysteem is zo ontworpen dat het volgens Ishida gemakkelijk integreert in bestaande productielijnen. ....................................... www.ishidaeurope.com/AirScan

Vleessoortidentificatie met SoortID

Alcontrol heeft een uitgebreid assortiment vleessoortidentificatie-testen in zijn portfolio met een nieuwe, duidelijke en unieke opzet voor de rapportage van de analyseresultaten. In de pakketten die ALcontrol aanbiedt, wordt de aanwezigheid van het DNA van maximaal zeven diersoorten bepaald in aparte PCR-runs. Tevens wordt een additionele PCR-reactie uitgevoerd voor universal meat, waarbij de totale hoeveelheid aanwezig DNA van gewervelde diersoorten gemeten wordt. De relatieve percentages van de verschillende diersoorten op het totale DNA kunnen op basis van de verkregen Cq-waarden berekend worden. Meer informatie? Stuur een e-mail naar info@alcontrolfood.com.

....................................................www.alcontrolfood.com

Met PestConnect 24/7 muizen signaleren

Muizen kunnen een organisatie in de kern raken. Bij sommige bedrijfsonderdelen, zoals productie- of serverruimten kan geen enkele muis worden getolereerd. Zelfs de aanwezigheid van één ongewenste muis kan grote gevolgen hebben: problemen met productie, verlies van omzet en schade aan een zorgvuldig opgebouwde reputatie. Rentokil biedt met PestConnect de mogelijkheid om via draadloze technologie binnengedrongen muizen te signaleren.

Om de tien minuten maakt de centrale controle-eenheid in het gebouw van de klant een verbinding met alle PestConnect Radars om hun status op te vragen. Elke activiteit wordt opgemerkt en binnen enkele minuten gerapporteerd. Als een detector een muis heeft gesignaleerd, ontvangt de servicemedewerker van Rentokil een sms’je, zodat hij weet dat de detector een controlebeurt moet krijgen. De klant ontvangt een melding in myRentokil, zodat hij altijd weet of er wel of geen muizen in het gebouw zijn.

....................................................................www.rentokil.nl/pestconnect waterdichte kasten op maat