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Microscopia a fluorescenza


Fluorocromi e Fluorescenza

Certe molecole, in virtù della loro struttura chimica, hanno la capacità di essere eccitate da luce di una specifica lunghezza d’onda (es. luce blu) e di emettere luce di lunghezza d’onda maggiore (es. luce verde). Questo processo di assorbimento e riemissione della luce è chiamato “fluorescenza” e le molecole che esibiscono questo comportamento si chiamano “fluorocromi”. Per esempio, la proteina fluorescente verde (GFP - Green Fluorescent Protein) assorbe luce blu ed emette luce verde.


Lunghezze d'onda della luce visibile raggi gamma

raggi X

raggi UV

Luve visibile

raggi IR

Onde radio

La luce visibile è una porzione dello spettro elettromagnetico compresa approssimativamente tra i 400 e i 700 nm (nell'aria). La luce è anche caratterizzata dalla sua frequenza. Frequenza e lunghezza d'onda obbediscono alla seguente relazione: λ=υ/ν (dove λ è la lunghezza d'onda, υ è la velocità nel mezzo considerato nel vuoto in genere si indica con c -, ν è la frequenza della radiazione).


Microscopia a fluorescenza Il sistema ottico di un microscopio a fluorescenza

oculare 3 secondo filtro barriera

Sorgente luminosa

(filtro di emissione): consente il passaggio solo della luce fluorescente verde emessa dal campione (lunghezza d’onda tra 520 e 560 nm)

2 specchio dicroico:

riflette la luce < 510 nm trasmette la luce > 510 nm

1 primo filtro barriera (filtro di eccitazione): consente il passaggio solo della luce blu (lunghezza d’onda tra 450 e 490 nm)

lente dell’obiettivo campione

Un cubo per fluorescenza contiene due filtri barriera (1 = filtro di eccitazione; 3 = filtro di emissione) e uno specchio dicroico (2) (uno specchio dicroico riflette la luce a bassa lunghezza d’onda e lascia passare quella ad alta lunghezza d’onda). Nell’esempio è rappresentato un set di filtri per il rilevamento della proteina fluorescente verde (GFP).


La luce viene filtrata tramite una combinazione di filtri A C

B

Cubo per fluorescenza A) Filtro di eccitazione B) Ripartitore dicroico C) Filtro di emissione

Il filtro di eccitazione (A) filtra solo la luce monocromatica (2) dalla radiazione della sorgente luminosa (1). Le proprietà del ripartitore dicroico sono essenziali: esso riflette nell'obiettivo la luce di eccitazione a breve lunghezza d'onda quasi senza perdite e lascia passare invece quasi completamente la luce di fluorescenza (3) che ritorna all'obiettivo. Contemporaneamente, la maggior parte della luce d'eccitazione viene nuovamente riflessa e non può essere perciò di disturbo nella formazione dell'immagine. Sopra il ripartitore dicroico, la luce di emissione e la residua luce di eccitazione colpiscono il filtro di emissione (C). Solo la luce di fluorescenza può passare quasi indisturbata attraverso il filtro, dato che le sue lunghezze d'onda sono maggiori di quelle della luce di eccitazione.


Il percorso ottico del microscopio per fluorescenza 5

9 6

La luce viaggia dalla forte sorgente di luce (1) attraverso il filtro antitermico (2), il filtro di attenuazione del rosso/cursore di sbarramento (3) ed il diaframma di campo (4) fino al filtro di eccitazione (5). Questo è incorporato nel cursore per fluorescenza, che contiene anche il ripartitore dicroico dei raggi (6). Il ripartitore dicroico riflette la luce d'eccitazione a breve lunghezza d'onda sul preparato (8) attraverso l'obiettivo (7). L'emissione prodotta, che presenta una lunghezza d'onda maggiore della luce d'eccitazione, viene raccolta dall'obiettivo (7) e trasmessa attraverso il partitore dicroico (6). Poi i raggi passano anche attraverso il filtro di emissione (9), dove viene filtrata la residua luce di eccitazione. La lente del tubo (10) e l'oculare (11) formano l'immagine microscopica, che si compone ora solamente di luce di fluorescenza.


Microscopi

Microscopio modulare dritto per routine e ricerca Microscopio modulare rovesciato per routine e ricerca


Microscopi per studi su cellule vive

Microscopio rovesciato per micromanipolazione

Microscopio rovesciato per videomicroscopia


Fluorescenza multipla

Per la marcatura dei preparati viene usata sempre piĂš spesso la "fluorescenza multipla". Questo metodo fa risaltare le differenti strutture con diversi colori. Queste possono essere osservate singolarmente â&#x20AC;&#x201C; ognuna per sè - passando da un'immagine all'altra con l'uso del cursore portafiltri. In alternativa, è possibile ricorrere a speciali combinazioni di filtri che permettono l'osservazione simultanea di due o tre marcature in una sola immagine.


Proteine fluorescenti

Meduse fluorescenti

Osamui Shimomura Nobel per la Chimica 2008


Chimica, Nobel a Shimomura, Chalfie e Tsien

Il Nobel per la Chimica 2008 è stato assegnato a Osamui Shimomura, Martin Chalfie e Roger Tsien, per la scoperta della proteina fluorescente GFP.

Nella motivazione, il comitato dei Nobel ricorda che «la GFP venne osservata per la prima volta nel 1962 nella bellissima medusa Aequorea victoria. Da allora questa proteina è diventata uno degli strumenti più importanti delle bioscienze contemporanee. Con l’aiuto della GFP i ricercatori hanno sviluppato metodi per analizzare sostanze sino a quel momento invisibile, come lo sviluppo delle cellule nervose del cervello o la diffusione delle cellule del cancro». «Usando la tecnologia del DNA - prosegue la motivazione - gli scienziati possono ora collegare la GFP ad altre proteine che restano invisibili. La fluorescenza della GFP consente di analizzare i movimenti, le posizioni e le interazioni delle proteine che interessano». La Stampa 8/10/2008


GFP

(Green Fluorescent Protein)

(238 AMMINOACIDI)

GFP espressa nei neuroni di un embrione dâ&#x20AC;&#x2122;insetto


Un arcobaleno di colori prodotti da proteine GFP modificate


Proteine fluorescenti Una scena della spiaggia di San Diego disegnata con colonie batteriche che esprimono proteine fluorescenti derivate dalla GFP (Green Fluorescent Protein) e dalla RFP (Red Fluorescent Protein). Le proteine fluorescenti utilizzate sono le seguenti: BFP, TFP1, Emerald, Citrine, Orange, Apple, Cherry and Grape. Creata nel laboratorio di Roger Tsien nel 2006


Embrione di Ophryotrocha diadema (verme marino) con sistema nervoso e zampe in evidenza (25x)


lezione 4