UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA DISCIPLINA: FARMACOGNOSIA I
Como comprovar a segurança e eficácia de um novo medicamento? Talita Magalhães Rocha Mestre em Farmacologia
Julho - 2017
RDC nº 26, de 13 de maio de 2014
Ensaios não clínicos e clínicos de segurança e eficácia Registro simplificado
Lista de medicamentos fitoterápicos de registro simplificado - IN n° 2/2014
Presença nas monografias de fitoterápicos de uso bem estabelecido elaboradas pelo Comitê de Produtos Medicinais Fitoterápicos da European Medicines Agency (EMA)
Avaliação da toxicidade • Objetivo Predizer possíveis efeitos tóxicos, que podem se manifestar quando da exposição humana à determinados produtos, como medicamentos e outros.
• Modelos animais - Educacional - Desenvolvimento novos medicamentos e outros produtos
Stokes, 2002; Meyer, 2003; HSU, 2003
Aspectos históricos de pesquisa envolvendo animais • Hipócrates (450 a.C.) - Órgãos humanos x animais; • Galeno (129 - 210 d.C.) - Medicina Científica; • René Descartes (1596 - 1650) Animais não sentiam dor; • Jeremy Benthan, 1789 - base para proteção animal
Aspectos históricos de pesquisa envolvendo animais •
Claude Bernard (século XIX) - Postura indiferente ao sofrimento dos animais de laboratório; • Século XIX - Sociedades Protetoras dos Animais; • Associação Médica Americana (1909) - Ética na experimentação animal; • UNESCO (1978) - Declaração Universal dos Direitos dos Animais.
Animais de laboratório • Fácil manutenção, manejo e observação • Padronização do ambiente • Pequeno porte • Docilidade • Grande amostragem • Ciclo reprodutivo curto • Fisiologia conhecida • Baixo consumo alimentar
Animais De Laboratórios Espécies Utilizadas
Cães Gatos Primatas Aves Ratos Camundongos Cobaias Insetos
Espécies convencionais
Ratos (Rattus norvegicus) Camundongos (Mus musculus) Hamster (Mesocrisetus auratus) Cobaias (Cavia porcellus) Coelhos (Oryctolagus cuniculus)
Geneticamente modificados
KO-LDL. Adquirido em 2005 – USP, Brasil Rato NIH (NUDE): imunodeficiente, espontâneo
Animais De Laboratรณrios
Ferreira et al, 2005
Utilização de animais na pesquisa: aspectos éticos Uso disseminado de animais na pesquisa Reavaliação do uso de animais Desenvolver e Validar novos métodos Implementação regulatória de testes alternativos
White, 2001; Schechtman, 2002; Russel & Burch, 1992
Regulamentação
Lei Arouca nº 11.794 de 8 de outubro de 2008
Regulamentação do Uso de Animais para fins didáticos e científicos - Uso dos animais para atividades didáticas e científicas em Instituições de ensino superior e ensino técnico na área biomédica - Criação do CONCEA - Obrigatoriedade de constituição de uma CEUA
The Principles Of Humane Experimental Technique – 3Rs Diminuir o número de animais utilizados na pesquisa, minimizar a dor e o desconforto e buscar alternativas para a substituição de testes
Rex L. Burch and William M.S. Russell (1959)
O princípio dos 3 Rs • Replace - substituição
• Reduce - redução
• Refine - refinamento
Normas para avaliações toxicológicas de medicamentos
• Organização intergovernamental • América do Norte, Europa e Ásia
• Guia de avaliação da segurança de produtos químicos “Guidelines for testing of chemicals” (OECD, 1996). • Segurança de novos alimentos, etc • Organizações participantes: FDA, WHO etc
OECD guideline for testing of chemicals • Acute oral toxicity - guideline 401, 1981
Criticado frente ao programa 3Rs • Alternative methods - Fixed dose method - OECD 420, 1992 - Acute toxic class method – OECD 423, 1996 - Up-and-down procedure – OECD 425, 1998 Meta 3Rs: Reduzir o nº de animais Sofrimento dos animais
E no Brasil...
Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos
1. Indica métodos padronizados para os estudos de toxicologia pré-clínica de acordo com Resolução vigente para registro e renovação de registro de fitoterápicos. 2. Os estudos de toxicidade devem ser conduzidos com amostras padronizadas do medicamento fitoterápico ou do derivado vegetal a partir do qual é produzido.
31 de janeiro de 2013 - VersĂŁo 2
Fundamento • Baseado em documentos de agências e instituições reconhecidas na área FDA: Food and Drug Administration EMA: European Medicines Agency OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development
ICH: International Conference on Harmonization NCI : National Cancer Institute WHO: World Health Organization
Objetivo • Possibilitar uma maior harmonização com a regulamentação internacional; • Racionalizar estudos não clínicos, evitando duplicidades e utilização desnecessária de animais sem que isso comprometa a obtenção e confiabilidade de informações referentes à segurança da droga a ser testada; • Fornecer dados confiáveis para subsidiar as Pesquisas Clínicas.
Condução • De acordo com as Boas Práticas de Laboratório (BPL) - OECD Principles of Good Laboratory Practice • HANDBOOK: GOOD LABORATORY PRACTICE (GLP) / WHO (Quality practices for regulated non-clinical research and development), quando aplicável; • Os animais a serem utilizados deverão ser saudáveis, preferencialmente livres de patógenos (SPF – Specific Pathogen Free), e de origem conhecida, além de possuir peso e idade adequados ao experimento.
Desenvolvimento de medicamentos
Biodisponibilidade
Eficรกcia
Efeitos tรณxicos
Adaptado de BERKOWITZ (2006)
Avaliação da segurança não clínica
Estudos não clínicos de segurança 1. Estudos de toxicidade de dose única (aguda) 2. Estudos de toxicidade de doses repetidas 3. Estudos de toxicidade reprodutiva 4. Estudos de genotoxicidade 5. Estudos de tolerância local 6. Estudos de carcinogenicidade 7. Estudos de interesse para a avaliação da segurança farmacológica 8. Estudos de toxicocinética 9. Ensaios não clínicos necessários para condução de estudos clínicos com associações em dose fixa
Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos Amostras padronizadas do fitoterápico ou do derivado vegetal Amostra Toxicidade aguda Toxicidade de doses repetidas
Toxicidade subcrônica
Toxicidade crônica
Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos Testes adicionais
Estudo especial genotoxicidade
Avaliação toxicológica tópica
Sensibilização dérmica Quando houver indicação de uso contínuo ou prolongado do medicamento em humanos
Irritação cutânea
Irritação ocular
1. Estudos de Toxicidade de Dose Única (Aguda) OBJETIVO: Avaliar a toxicidade em 1 ou mais doses até 24 horas observação dos animais por 14 dias após a administração. RE Nº 90 : uma espécie MODELO de mamífero ANIMAL:evitando-se animais nocom mínimo características 2 espécies genéticas de mamíferos: especiais. um roedor No mínimo e um não 6 roedor machos (machos e 6 fêmeas e fêmeas) por dose. adultos VIAS DE ADMINISTRAÇÃO: (1) pretendida para administração em humanos (oral – gavagem); (2) parenteral (endovenosa)
1. Estudos de Toxicidade de Dose Única (Aguda) DOSE: Dose limite: evidência de toxicidade não letal ou até no máximo 1000 mg/kg/dia para roedores e não roedores.
OBS: exigidasuficientes a determinação de observação DL50. Podem ser RE NºNão 90:édoses para de utilizados a estimativa dose possíveismétodos efeitosalternativos adversos epara estimativa dada DL50. letal envolvendo um menor número de animais, tais como Se nãoosforem observados efeitos adversos, preconizados nos guias da OECD. utilizar doseOralmáxima possível. (OECD Guideline 425 a - Acute Toxicity – Up-and-Down-Procedure )
1. Estudos de Toxicidade de Dose Única (Aguda) Alteração da locomoção
Frequência respiratória
Piloereção
Diarreia
Alteração do tônus muscular
Convulsões
Contorções abdominais
2. Estudos de Toxicidade de Doses Repetidas OBJETIVO: Caracterizar o perfil toxicológico da droga pela administração repetida sobre diversos parâmetros, indicação da NOEL e NOAEL. no-observed effect level no-observed-adverse-effect level
MODELO RE NºANIMAL: 90 : no Roedores: mínimo 2No espécies mínimode 10mamíferos: machos e 10 umfêmeas, roedor por e um dose não Não-roedores: roedor (n° igual no de mínimo machos 3 machos e fêmeas e 3em fêmeas, idade por adulta dose Incluir um grupojovem) veículo da formulação
VIA DE ADMINISTRAÇÃO: Pretendida para administração em humanos. Pode-se usar uma via parenteral quando a absorção em animais for baixa.
2. Estudos de Toxicidade de Doses Repetidas DOSE: 3 doses: a maior deve produzir efeitos tóxicos observáveis, mas não morte nem sofrimento, no máximo de 1000 mg/kg/dia, seguidas de sequncia descendente com intervalos de 2 a 4 vezes. OBS: Os dados de segurança obtidos nesses estudos dão suporte às Fases 1, 2 e 3 da Pesquisa Clínica. Período de uso
Duração mínima do estudo das doses repetidas
Até 30 dias de uso por ano
4 semanas
Acima de 30 dias de uso por ano 12 semanas
2. Estudos de Toxicidade de Doses Repetidas Roedores Não roedores PARÂMETROS AVALIADOS RE Nº 90 : Sinais clínicos (incluindo parâmetros x x • alterações comportamentais, comportamentais) • variação do peso corpóreo (semanal),x Mortalidade x • hemograma completo e análises bioquímicas de x Variações no peso corporal x sangue (sódio, potássio, gama glutamiltranspeptidase, Consumo de ração e água x x aminotransferases, Patologia clínica (hematologia,fosfatase alcalina,xureia, creatinina, x ácido úrico, colesterol, triglicerídeos, glicose, proteínas bioquímica) totais e bilirrubina); Duração e reversibilidade da toxicidade x x • Exames anatomopatológicos Investigações anatomo e histopatológicas x x • Exames macroscópicos órgãos vitais Oftalmologia
x
2. Estudos de Toxicidade de Doses Repetidas Duração mínima do estudo
Período de intervenção clínica
roedores
não roedores
Até 2 Semanas
2 Semanas
2 Semanas
Entre 2 semanas e Entre 2 semanas e Entre 2 semanas e 6 meses 6 meses 6 meses Acima de 6 meses
6 meses
9 meses
Toxicidade de doses repetidas em ratos Droga teste: Cápsula do Extrato Seco de A. cearensis (ESAC)
Marcadores: cumarina e amburosídio A Espécie: ratas Wistar e cão Beagle
Via administração: oral Tratamento: 4 – 12 semanas
Pesos de ratas registrados durante as quatro semanas de tratamento dos animais com ESAC Peso (g)/ (Média ± EPM)
Grupos
0
19 dias
26 dias
33 dias
Controle
127,3 ± 2,52
170,9 ± 2,10
185,3 ± 3,25
211,6 ± 3,52
ESAC 250
129 ± 3,60
164,0 ± 5,42
168,7 ± 9,28
186,0 ± 8,06
ESAC 500
128,8 ± 4,58
167,9 ± 7,85
186,0 ± 5,14
179,6 ± 5,61
ESAC 750
128,6 ± 3,84
168,1 ± 5,32
180,0 ± 4,24
176,4 ± 5,85
Avaliação toxicológica do ESAC: parâmetros bioquímicos do sangue de ratos PARÂMETROS
ESAC
ESAC
ESAC
Valores de
250 mg / Kg
500 mg / Kg
750 mg / Kg
Referência
CONTROLE
Glicosea
64,43 ± 6,68
59,86 ± 5,54
62,57 ± 4,62
64,67 ± 3,90
59,59 - 107,15
Triglicerídeosa
25,86 ± 2,15
36,71 ± 2,91
33,00 ± 2,64
34,00 ± 4,02
27,00 - 63,40
Colesterola
55,71 ± 3,56
48,43 ± 5,30
50,14 ± 3,42
53,17 ± 7,53
36,07 - 79,13
HDLa
32,29 ± 1,43
29,57 ± 5,17
35,71 ± 2,96
37,50 ± 5,35
--
Creatininaa
0,77 ± 0,03
0,72 ± 0,03
0,71 ± 0,02
0,75 ± 0,03
0,54 - 1,06
TGO / ASTb
225,6 ± 13,36
247,1 ± 17,59
202,4 ± 14,96
193,3 ± 14,21 106,70 – 204,50
TGP / ALTb
38,57 ± 2,63
32,86 ± 1,96
35,29 ± 3,12
37,33 ± 4,02
34,00 - 96,60
Uréiaa
50,71 ± 3,61
53,14 ± 4,47
59,71 ± 5,34
57,00 ±1,34
42,00 - 71,20
3. Estudos de Toxicidade Reprodutiva OBJETIVO: Revelar substâncias toxicas na reprodução de mamíferos FASES: A. Fertilidade e desenvolvimento embrionário inicial; B. Desenvolvimento pré e pós-natal, incluindo função materna; C. Desenvolvimento embrio-fetal.
4. Estudos de Genotoxicidade Genotoxicidade: Estudo da ação de qualquer agente físico, químico ou biológico que produz danos no material genético de células (DNA ou cromossomos). Os testes avaliam o dano diretamente na célula. Mutagenicidade: Mudança ou dano gênico no mecanismo de reparo ao DNA provocado pelo agente físico químico ou biológico, resultando em uma célula alterada. Os testes avaliam a expressão da mutação.
4. Estudos de Genotoxicidade OBJETIVO: testes in vitro e in vivo desenhados para detectar o potencial de causar mutações genéticas e cromossômicas. RE Nº 90 : Estudo que deve ser efetuado quando houver indicação de uso contínuo ou prolongado do medicamento em humanos. Compostos que apresentam resultados “positivos” são potencialmente agentes carcinogênicos e/ou mutagênicos para seres humanos.
4. Estudos de Genotoxicidade MODELOS BIOLÓGICOS TESTE DE MUTAÇÃO GENÉTICA: Para detectar mudanças nos sítios de Guanina-Citosina (G-C) TESTE DE MICRONÚCLEO: in vivo recomenda-se a utilização de roedores (camundongos ou ratos), apenas um sexo, de preferência machos. TESTES DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS: podem detectar mudanças na integridade cromossomal em nucleotídeos de células hematopoiéticas de roedores
RE Nº 90 : 1. Avaliação in vitro da reversão de mutação em bactérias incluindo ativação metabólica ou de dano cromossomal de células de mamíferos ou de linfoma de camundongo; 2. Avaliação in vivo do dano em cromossomo em células hematopoiéticas de roedores (teste de micronúcleo).
Análises Farmacocinéticas • Absorção do fármaco no intestino depois de, por exemplo, uma dose oral ou mobilização do local após a injeção • Distribuição do princípio ativo (API) no organismo • Taxa do metabolismo da droga, do envolvimento enzimático metabólico e da natureza dos metabólitos produzidos.
Testes complementares de toxicidade: modelos experimentais de citotoxicidade
Modelos Experimentais de Citotoxicidade MTT - Metabolismo mitocondrial
Lactato desidrogenase (LDH) - Permeabilidade da membrana
CĂŠlula humana
Modelos Experimentais de Citotoxicidade – Atividade LDH Meio intracelular
Meio extracelular
Citoplasma LDH
LDH
Drogas e outros agentes
LDH
Alteração da permeabilidade
LDH PIRUVATO NADH
LACTATO
NAD+
Modelos Experimentais de Citotoxicidade – Teste do MTT partículas de ATP sintase espaço intermembranar matriz mitocondrial cristas ribossomos grânulos
membrana interna DNA membrana externa
succinato-tetrazol redutase (mitocôndria)
MTT
Formazan
MTT: brometo 3[4,5-dimetiltiazol]-2,5,difeniltetrazólio. MOSMANN, 1983
Ensaios ClĂnicos
Brasília – DF 2008
Fases de um estudo clínico ENSAIOS DE FASE I
ENSAIOS DE FASE II
VOLUNTÁRIOS limites de doses farmacocinética efeitos inesperados
PACIENTES eficácia
ENSAIOS DE FASE III
ENSAIOS DE FASE IV
efeitos colaterais interações vantagens limitações
FARMACOVIGILÂNCIA vigilância póscomercialização
Validação de plantas medicinais Planta
Planta medicinal Novos Medicamentos
Fitoterápico
- Fitofármacos, - Fármacos semi-sintéticos - Protótipos para a síntese de novo fármaco
Consideraçþes finais
Obrigada! talitamagalhaesr@gmail.com