UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA CURSO DE FARMÁCIA
Introdução a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): análise de extratos vegetais Rayanne Brito de Freitas Mestranda em Ciências Farmacêuticas
O que é Cromatografia? Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Características O sistema de CLAE Aplicações
Vantagens e Desvantagens Considerações Finais
O que é Cromatografia?
Método físico-químico que separa individualmente os constituintes de uma mistura de substâncias
Fase móvel
Fase estacionária
Cromatografia Líquida
A cromatografia fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase estacionária (FE) e a outra um fluido que se move através da fase estacionária sendo chamada de fase móvel (FM). Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida!
(LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998)
O princĂpio da cromatografia
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA COLUNA
PLANAR
CCD
C O N VEN CI O N AL
CP CLAE
ADSORÇÃO
Longo tempo de análise; Monitorização E X C L US Ã O I Ô N I CA visual PA R T I ÇÃ O
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HPLC = High Performance (Pressure) Liquid Cromatography CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica cromatográfica que utiliza uma elevada pressão para forçar a passagem do solvente pelas colunas, contendo partículas muito finas que proporcionam separações muito eficientes.
(HARRIS, 2001).
Características da CLAE
• Fase móvel líquida • Fase estacionária finamente dividida • Pressões elevadas Alto desempenho • Diferencial: bomba propulsora – tipo de eluição
Aplicações - CLAE
•
Identificação de compostos;
•
Quantificação dos componentes;
•
Purificação de compostos;
•
Separação dos componentes de uma mistura.
Aplicações CLAE
Indústria
Analitos
Alimentos
Açúcares, ácido ascórbico, ácido benzóico, parabenos, vitaminas, proteínas, peptídeos, aminoácidos
Tintas
Resinas, Tensoativos, biocidas
Química
Polímeros
Clínicas
Metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos
Farmacêutica
Princípios ativos
Vantagens - CLAE
Economia Versatilidade Sensibilidade
Análise qualitativa: Tr Análise quantitativa: baixa dispersão < 5%. Automação.
Desvantagens - CLAE
Alto custo do equipamento e manutenção Recursos humanos altamente qualificados
Falta de detector universal sensível
O sistema de CLAE
CLAE
O sistema de CLAE
O sistema de CLAE
1. RESERVATÓRIOS DA FASE MÓVEL
2. SISTEMA DE BOMBEAMENTO 3. SISTEMA DE INJEÇÃO DE AMOSTRAS 4. COLUNA
5. DETECTOR 6. AQUISIÇÃO DE DADOS
1. Reservatรณrios da fase mรณvel
1. Reservatórios da fase móvel
Frascos de vidro para armazenamento de fase móvel (1 – 3L) Filtros do reservatório de aço inoxidável (10 a 40 µm): capta a fase móvel e evita que partículas suspensas na FM obstruam os capilares ou contaminem a bomba
Características da fase móvel
• Apresentar alto grau de pureza, • Miscível com a amostra e não decompor seus componentes, • Não alterar a fase estacionária, • Apresentar baixa viscosidade, • Compatível com o tipo de detector, • Característica química que permita a separação dos componentes da amostra (extratos vegetais).
2. Sistema de bombeamento
2. Sistema de bombeamento • Vazão contínua
• Vazão constante independentemente da pressão (0,1 – 10 mL/min)
• Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes
comuns • Opera a altas pressões (até 6000 psi)
• Material inerte
2. Sistema de bombeamento
Tipos de eluição Isocrátic o A composição da fase móvel permanece constante ao longo da análise
Gradiente A composição da fase móvel altera ao longo da análise
3. Injeção da amostra
3. Injeção da amostra
Injetor manual
- As amostras são introduzidas com seringas.
Injetor automático
- As amostras são postas em um frasco localizado dentro do amostrador Injetor: • Mede o volume correto da injeção; • Injeta a amostra; • Prepara o injetor para a próxima amostra
4. Coluna Cromatogrรกfica
4. Coluna Cromatográfica
Analíticas
Preparativas
Controle de qualidade
Estudo fitoquímico
Análises quali e quantitativas
Usada para fins de purificação
Pré- Coluna
É utilizada para proteger e aumentar a vida útil da coluna analítica.
Localiza-se entre o injetor e a coluna. Colunas de 2 a 5 cm. Utiliza-se a mesma FE da coluna.
4. Coluna Cromatográfica
• Coluna: suporte (aço) + fase estacionária*. *partículas de sílica com diâmetro de 1,8 – 5 μm.
Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da amostra para separá-los um do outro.
Separação Cromatográfica
Em função da fase estacionária utilizada, tem-se os seguintes mecanismos de separação:
CLAE
ADSORÇÃO
PA R T I ÇÃ O
I Ô N I CA
E X C L US Ã O
CARGA IÔNICA: TAMANHO: Fasee estacionária líquida FE sólida FM líquida ou A fase estacionária é uma é resina a recheada com forma um filme fino na A coluna gasosa. O soluto é adsorvido qual gruposinerte iônicoscujos poros matéria superfície de um suporte na superfície da partícula esão o- ligados (— SO 3, — NR+3); fase móvel é sólido. O soluto está em líquida. têm tamanho equilíbrio entre FE e FM controlado. equilíbrio entre dos FM e FE. justifica a separação componentes.
Fase Normal
x
Fase Reversa
Fase Normal • fase estacionária polar;
• fase móvel menos polar. * Solventes mais polares têm
Fase Reversa •
fase estacionária apolar ou
fracamente polar; •
fase móvel mais polar.
* Solventes menos polares têm de eluição
força
força de eluição
Fase Normal
Fase Reversa
5. Detector
5. Detector
O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado.
5. Detector
Características ideais:
• Sensibilidade e seletividade adequada • Ampla faixa linear • Baixo volume interno
• Resposta rápida • Boa estabilidade • Precisão
5. Detector
Tipo de detectores: • Índice de refração • Espectrofotometira UV-Visível
• Fluorescência • Eletroquímico • Espectrometria de massa LC/MS
Detector - Espectrofotometria UVVisível
Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor mede a luz que passa através desta
célula.
Quando um composto que absorve a energia da luz elui da
coluna, ocorrerá uma alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor.
Detector - Espectrofotometria UVVisível A alteração na
Por conseguinte, um
quantidade de energia é
espectro de UV é obtido,
amplificada e dirigida
podendo auxiliar na
para um sistema de
identificação de alguns
registro de dados.
compostos.
Detector - Espectrofotometira UVVisível Ácido Clorogênico
Catequina
Detector - Espectrofotometira UVVisível
Aplicações
6. Aquisição de dados
6. Aquisição de dados
Processa os dados obtidos pelo detector. Monitoramento contínuo dos parâmetros da separação e detecção de possíveis problemas.
Registro da composição da fase móvel; vazão da bomba; injeção da amostra; temperatura da coluna.
Considerações Finais
Referências Bibliográficas
Argenton, A. Conceitos Fundamentais de Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, 2010. COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos. HARRIS, D.C. Análise química quantitativa. V Ed. Rio de Janeiro: Livros técnicos e científicos Editora S.A. 2001.
Obrigada!!