DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTÍGENO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA (Kit ELISA INMUNO EXPLORER de Bio-Rad)
Módulo: ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS
Tema: UD7 Identificación molecular, serológica y/o inmunológica de microorganismos
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
Duración: 2 horas (1 sesión)
Contenido 1.
OBJETO ........................................................................................................................................... 2
2.
ALCANCE ......................................................................................................................................... 2
3.
REFERENCIAS .................................................................................................................................. 2
4.
DESCRIPCIÓN .................................................................................................................................. 2 4.1. FUNDAMENTO........................................................................................................................ 2 4.2. MATERIAL NECESARIO ............................................................................................................ 5 Equipamiento ......................................................................................................................... 5 Materiales .............................................................................................................................. 5 Reactivos ................................................................................................................................ 5 Disoluciones ........................................................................................................................... 6 4.3. PREPARACIÓN......................................................................................................................... 6 Preparación de reactivos ........................................................................................................ 6 Preparación de las muestras de los alumnos .......................................................................... 7 Preparación de los puestos de trabajo de los alumnos .......................................................... 7 4.4. PROCEDIMIENTO OPERATIVO ................................................................................................ 8
5.
TRATAMIENTO DE DATOS ............................................................................................................. 11
6.
PUNTOS CRÍTICOS ......................................................................................................................... 11
7.
NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIO AMBIENTE................................................................................. 12
8.
ANEXOS ........................................................................................................................................ 13
AURORA CRIADO MONTERO, CARLOS DE PAZ VILLASENÍN, PILAR MACÍA RODRÍGUEZ Y MARIANO PAZOS AFONSO
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1. OBJETO Describir el método para la detección y cuantificación de un antígeno específico en una muestra simulada mediante la técnica ELISA.
2. ALCANCE El kit ELISA Inmuno Explorer de Bio-Rad contiene un antígeno (gammaglobulina de pollo), el anticuerpo primario que reconoce y se une a este Ag, un anticuerpo secundario unido a una enzima (peroxidasa de rábano, HRP) y el sustrato de la enzima (tetrametilbencidina, TMB). Podemos así preparar muestras simuladas con el Ag o con el Ac, y existen varios protocolos en el manual de instrucciones del kit para la detección y/o cuantificación de Ag o Ac. El procedimiento descrito aquí se utiliza para cuantificar antígeno. La actividad se puede ajustar para poner de manifiesto que la técnica ELISA es una poderosa herramienta en el diagnóstico clínico, y en el apéndice C del Manual hay información detallada sobre los antígenos detectados y los reactivos utilizados realmente en la prueba ELISA de muchas enfermedades, pero la técnica también se usa en otros campos: análisis de alimentos (detección de alérgenos en alimentos, patógenos en alimentos, organismos modificados genéticamente OMG en alimentos, gluten en alimentos “sin gluten”), agricultura (detectar virus y micotoxinas en cultivos), toxicología (detección de drogas), calidad ambiental (contaminación del aire o del agua), etc.
3. REFERENCIAS Para la elaboración de este procedimiento se ha utilizado el siguiente documento: Instruction Manual ELISA Inmuno Explorer Kit Biotechnology Explorer
4. DESCRIPCIÓN 4.1. FUNDAMENTO La técnica ELISA (del inglés Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) consiste en un ensayo basado en el principio inmunológico del reconocimiento y unión de los anticuerpos a las moléculas que reconocen como extrañas (antígenos). Esta unión específica Ag-Ac se produce sobre una superficie (el fondo de los pocillos de una microplaca de plástico), a la que previamente se ha unido el anticuerpo o el antígeno, por lo que el conjugado resultante queda inmovilizado. Como uno de los componentes del ensayo (anticuerpo o antígeno) se encuentra unido a una enzima (peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, generalmente), la reacción AgAc será fácilmente revelada mediante la adición del sustrato adecuado, ya que la enzima 2 de 13 | P á g i n a
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTÍGENO MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA (Kit ELISA INMUNO EXPLORER de Bio-Rad) catalizará la formación de un producto coloreado, que podrá ser observable a simple vista o cuantificado por espectrofotometría. La técnica ELISA tiene muchas propiedades del inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple, emplea reactivos económicos, y mediante el uso de la fase sólida consigue una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Cuando se inmoviliza sobre la fase sólida el Ag, el Ac específico que se une a él puede estar marcado con la enzima (ELISA directo) o bien, como no siempre es posible disponer de anticuerpos específicos contra una sustancia determinada marcados con enzimas, puede ser necesario utilizar un segundo anticuerpo marcado, que se una al anticuerpo primario (ELISA indirecto):
En este protocolo se describe cómo cuantificar los niveles de antígeno en una muestra mediante ELISA INDIRECTO. La técnica consta de una serie de etapas que se describen a continuación:
Inmovilización del antígeno. Se añade la muestra, que contiene el Ag, a los pocillos de una microplaca de poliestireno y se incuba para permitir el enlace. El enlace entre el Ag y el soporte sólido se produce por interacciones hidrofóbicas.
Tapizado del pocillo con detergente. El tampón de lavado contiene Tween 20, que sirve para eliminar el Ag sin enlazar, pero también sirve de agente bloqueante, uniéndose a todos los sitios de unión a proteínas sin usar en los pocillos y prevenir así la unión inespecífica de anticuerpos.
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Adición de los anticuerpos primarios. Se añade la solución de anticuerpo primario a los pocillos y se incuba para permitir que el anticuerpo se una al antígeno. A continuación se lava el anticuerpo primario sin unir de los pocillos.
Adición de los anticuerpos secundarios marcados. Se añade la solución de anticuerpo secundario unido a enzima para permitir que el anticuerpo secundario se una al primario. Entonces se lava el anticuerpo secundario sin unir de los pocillos.
Adición del sustrato específico de la enzima unida al anticuerpo secundario. Por la acción de esta enzima sobre el sustrato se produce la aparición de un producto coloreado. Los pocillos que permanecen sin color después de la incubación son negativos y los que se vuelven azules son positivos. Para realizar la vertiente cuantitativa del ensayo se preparan diluciones seriadas de concentración conocida del Ag, de manera que a mayor concentración, mayor será la intensidad del color azul de los pocillos y mayor será la A 655 nm, y este valor de absorbancia se puede medir en un lector de microplacas. Así, se construye una curva estándar y se puede interpolar en ella el valor de A655 de la muestra problema para calcular la concentración de Ag en la misma.
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4.2. MATERIAL NECESARIO Equipamiento ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫
Micropipeta de 5 mL Micropipeta de 20-200 L Agitador vórtex Cronómetro Lavador de microplacas de ELISA Analizador o Lector de microplacas de ELISA Nevera
Materiales ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫ ▫
▫ ▫
Probeta de 100 mL Probeta de 1 L Botellas o matraces Erlenmeyer Tubos de ensayo de 15 mL de capacidad Guantes de látex o de nitrilo Puntas de pipeta apropiadas Papel absorbente Material incluido en el kit: - Pipetas Pasteur de plástico de 1 mL graduadas - Tubos eppendorf de diferentes colores (violeta, azul, verde, naranja, marrón, amarillo) - Microplaca con 8 tiras extraíbles de 12 pocillos (son de poliestireno y cada pocillo con una capacidad de 250 L) Rotulador permanente Contenedor de residuos
Reactivos ▫ ▫
Agua destilada estéril Reactivos que incluye el kit: Antígeno (Ag): gammaglobulina de pollo liofilizada, 1 vial Anticuerpo primario (AP): Ac policlonal de conejo anti-gammaglobulina de pollo liofilizado, 1 vial Anticuerpo secundario (AS): fabricado inmunizando a cabras con IgG de conejo y conjugado con peroxidasa de rábano, HRP, liofilizado, 1 vial Sustrato de la peroxidasa de rábano: 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB), 1 botella Tampón fosfato salino (PBS) 10x, 1 botella de 100 mL Tween 20 al 10%, 1 botella de 5 mL
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Disoluciones ▫
Tampón fosfato salino PBS 1x, 100 mL = 10 mL PBS 10x + 90 mL agua destilada estéril. Se usa para resuspender los reactivos liofilizados (Ag, AP y AS) y como disolvente en las soluciones que contienen el antígeno.
▫
Solución de lavado, 900 mL = 4,5 mL Tween 20 al 10% + 90 mL PBS 10x + 805 mL agua destilada estéril. Se usa como disolvente en las soluciones que contienen AP y AS, y en el lavado de microplacas.
▫
Solución de frenado = H2SO4 0,18 M Opcionalmente para detener la reacción enzimática en muestras diluidas.
4.3. PREPARACIÓN Para preparar la práctica se requieren 1-3 horas.
Preparación de reactivos Rehidratar el antígeno, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario liofilizados
Retirar con cuidado los tapones de los tres reactivos liofilizados y utilizar una pipeta Pasteur para agregar 0,5 mL de PBS 1x a cada uno. Cerrar los tapones y agitar para mezclar. Estas soluciones tienen una concentración 50x, y se denominan soluciones stock o “dilución madre”. Diluir las soluciones stock 50x de los reactivos
Utilice la pipeta de plástico para enjuagar el vial con algo de reactivo diluido y asegurarnos así que se usó toda la solución stock. 6 de 13 | P á g i n a
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTÍGENO MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA (Kit ELISA INMUNO EXPLORER de Bio-Rad) La rehidratación y dilución del Ag y del AP se debe hacer como mucho 3 días antes de la práctica, mientras que la del AS máximo 24 horas antes. Todos se conservarán en nevera a 4 o C.
Preparación de las muestras de los alumnos Para los alumnos se preparan dos muestras problema: A y B
[Ag]muestra +
Muestra A
1,25 mL
8,75 mL
125ng/mL
Muestra B
0,25 mL
9,75 mL
25 ng/mL
Se agita para mezclar y se reservan en dos tubos de ensayo de 15 mL de capacidad.
Preparación de los puestos de trabajo de los alumnos Los estudiantes trabajan en parejas, por lo que hay 4 alumnos por cada puesto de trabajo. En cada puesto se dispone lo siguiente:
Tubos Eppendorf Tubos amarillos etiquetados como “A” y “B” Tubo amarillo etiquetado como “Ag 1000 ng/mL” Tubo amarillo etiquetado como “PBS” Tubo violeta etiquetado como “+” Tubo azul etiquetado como “”
Contenido
Descripción
Cantidad
Verificar
0,25 mL de muestras A y B
Muestras problema
2
☐
0,25 mL de Ag 1x
1
☐
1
☐
0,5 mL de Ag 1x
Muestra de [Ag] conocida para preparar la dilución seriada Diluyente para preparar la dilución seriada Control positivo
1
☐
0,5 mL de PBS 1x
Control negativo
1
☐
1 mL de PBS 1x
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Material
Contenido
Descripción
Cantidad
Verificar
Tubo verde etiquetado como “AP”
1,5 mL de AP 1x
Anticuerpo primario
1
☐
Tubo naranja etiquetado como “AS”
1,5 mL de AS 1x
Anticuerpo secundario
1
☐
Tubo marrón etiquetado como “SUS”
1,5 mL de TMB
Sustrato de la HRP ligada al AS
1
☐
Cantidad
Verificar
Tiras de 12 pocillos de la microplaca
2
Micropipeta de 20-200 L
1
Puntas de pipeta amarillas
9
Pipetas de plástico graduadas
1
Rotulador permanente negro
1
Contenedor de residuos
1
☐ ☐ ☐ ☐ ☐ ☐
Otro material
4.4. PROCEDIMIENTO OPERATIVO 1. Rotule los pocillos de una de las tiras con los números del 1 al 12. En la otra tira de 12 pocillos marque los 3 primeros con un “+” para los controles positivos, los 3 siguientes con un “” para los controles negativos, los siguientes tres pocillos con las iniciales de uno de los tubos de muestra, y los 3 últimos con las iniciales del segundo tubo de muestra.
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2. Use una pipeta para añadir 50 L del tubo amarillo etiquetado como “PBS” a los pocillos etiquetados del 2 al 12. 3. Añada 100 L del tubo amarillo etiquetado “Ag 1000 ng/mL” al pocillo 1 4. Para hacer la dilución seriada del pocillo 1 al 11 se procede de la siguiente manera: a. Con una pipeta transfiera 50 L del pocillo 1 al 2. Pipetee suavemente tres veces para mezclar la muestra en el pocillo 2. b. Usando la misma punta de pipeta transfiera 50 L del pocillo 2 al 3 y mezcle pipeteando en el pocillo 3. c. Usando la misma punta de pipeta transfiera 50 L del pocillo 3 al 4 y mezcle pipeteando en el pocillo 4. d. Repita este paso de transferencia y mezcla de un pocillo al siguiente hasta llegar al pocillo 11. Deseche 50 L de la solución del pocillo 11 a un contenedor de residuos. De esta forma tendremos los 12 pocillos con 50 L de solución. 5. En la segunda tira de la microplaca, use una nueva punta de pipeta para transferir 50 L del control positivo (+) del tubo violeta dentro de los 3 pocillos marcados como “+”. 6. Use una nueva punta de pipeta para transferir 50 L del control negativo () del tubo azul dentro de los 3 pocillos marcados como “”. 7. Use una nueva punta de pipeta para transferir 50 L de la muestra de cada equipo dentro de los 3 pocillos marcados con sus iniciales (A o B). 8. Espere 5 minutos para permitir que las proteínas de las muestras se unan a los pocillos de plástico. 9. LAVADO: coloque las tiras de pocillos en la microplaca e introduzca la misma en el lavador de microplacas. Programe un ciclo de lavado con las siguientes características: 4 lavados, aspiración doble y volumen de lavado de 200 L.
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DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ANTÍGENO MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA (Kit ELISA INMUNO EXPLORER de Bio-Rad) 10. Use una punta de pipeta nueva para transferir 50 L de Ac primario (AP, tubo verde) dentro de los 12 pocillos de las tiras. 11. Espere 5 minutos para que el Ac se una a sus dianas. 12. Lavar para retirar de los pocillos el Ac primario no unido, repitiendo todos los pasos de lavado del punto 9. 13. Use una punta de pipeta nueva para transferir 50 L de Ac secundario (AS, tubo naranja) dentro de los 12 pocillos de las tiras de la microplaca. 14. Espere 5 minutos para que el Ac se una a sus dianas. 15. Lavar para retirar de los pocillos el Ac secundario no unido, programando en el lavador de microplacas un ciclo con 6 lavados. 16. Use una punta de pipeta nueva para transferir 50 L de Sustrato de la enzima (SUS, tubo marrón) dentro de los 12 pocillos de las tiras de la microplaca.
17. Espere 5 minutos. Se introducen ahora las tiras en la microplaca y se lleva esta al lector de ELISA para medir la absorbancia a 655 nm en todos los pocillos. Si bien este procedimiento está diseñado para encajar en un período de laboratorio, se puede detener el procedimiento mediante la adición de tampón de lavado a los pocillos de microplacas en cualquier etapa después de la adición de antígeno y antes de la adición del sustrato de la enzima. Coloque las tiras de la microplaca y todos los reactivos en el refrigerador a 4 ° C durante toda la noche.
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5. TRATAMIENTO DE DATOS Construir la curva estándar representando las concentraciones de Ag conocidas de los pocillos 1 al 12 en el eje Y y los valores correspondientes de absorbancia obtenidos con el lector de microplacas en el eje X:
Como esta curva es logarítmica, para hacerla lineal se tendrán que representar los datos en papel semilogarítmico (en ANEXO). Calcular la concentración de la muestra problema A y B interpolando el valor de absorbancia obtenido en el lector de ELISA en la recta estándar obtenida con el papel semilogarítmico.
6. PUNTOS CRÍTICOS A la hora de realizar la técnica hay que tener en cuenta una serie de puntos críticos que pueden afectar al resultado obtenido. Estos puntos críticos son:
El sustrato TMB es sensible a la luz, por lo que se deben usar tubos oscuros para almacenarlo. Los controles se ejecutan siempre al lado de las muestras para asegurarnos que el proceso está funcionando correctamente. Los controles pueden resolver los resultados ambiguos que ocurren por error humano o por reactivos contaminados, y deben ser incluidos en cualquier ELISA válido. 11 de 13 | P á g i n a
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Una muestra negativa que da un resultado positivo se denomina “falso positivo”, y una muestra positiva que da un resultado negativo se llama “falso negativo”. En una prueba ELISA de determinación de Ag, un control negativo apropiado serían los pocillos con antígeno omitido. Cualquier producto de color en esos pocillos sería el resultado de 1) la unión no específica de los anticuerpos, o 2) del error experimental. Un control positivo adecuado sería una muestra conocida que contiene el antígeno. La tasa de unión depende de la Tª de incubación y de las concentraciones de los reactivos. Este kit ha sido optimizado para que cada incubación se realice durante 5 minutos a Tª ambiente. Si se excede este tiempo o esta Tª puede suceder un incremento en la intensidad del color y posiblemente algo de color de fondo en los controles negativos. Se pierde la correlación entre la concentración de antígeno y el valor de absorbancia cuando el sustrato sin oxidar escasea, ya sea debido a antígeno demasiado concentrado o después de un tiempo de reacción demasiado largo. Por eso, las microplacas deben leerse no más tarde de 15 minutos después de añadir el sustrato. El lector de microplacas que tenemos en el laboratorio no puede medir absorbancia a 655 nm, pero sí a 630, por lo que haremos la lectura a esta longitud de onda. Cuando se tienen muestras diluidas, para obtener una lectura más lineal se debe detener la reacción enzimática después de 5 minutos mediante la adición a los pocillos de ácido sulfúrico 0,18 M. La solución azul se volverá amarilla. La solución amarilla se puede leer usando un lector de microplacas con un filtro de 450 nm.
7. NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIO AMBIENTE 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
No comer, beber ni fumar mientras se manipulan los reactivos y/o las muestras Usar gafas y guantes durante la realización de la práctica Se recomienda lavar las manos con agua y jabón antes y después de realizar el ejercicio Evitar cualquier contaminación de los reactivos Utilizar una punta de pipeta nueva por cada muestra a testar Incluir sistemáticamente un control negativo y un control positivo La solución de frenado (H2SO4 0,18N) es un ácido fuerte, por lo que debe ser manipulado con precaución. En caso de contacto con piel y ojos, lavar inmediatamente con agua abundante. 8. Si alguna de las otras soluciones contacta con los ojos, enjuagar con agua abundante durante 15 minutos.
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8. ANEXOS
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