Facultad de Bioanรกlisis Campus Xalapa
Término que se refiere al uso Radicación Electromagnética (REM) medir las concentraciones de una sustancia.
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Antes de 1940 la mayoría de las determinaciones en química clínica eran del tipo volumétricas y gravimétricas. Por lo que la mayor parte de los resultados fueron semi-cuantitativos. En la década de 1950 se comienza a utilizar el espectrofotómetro (EE.UU.). Éste eliminó el comparador de color, logrando así que los análisis fuesen más cuantitativos, confiables, reproducibles e incrementando la precisión y la exactitud. El espectrofotómetro es un instrumento útil, por las ventajas tales como rapidez, sencillez, especificidad y sensibilidad
La energía puede proporcionarse en forma de REM, “luz” . El tipo y la cantidad de REM absorbida por una molécula esta relacionada con su estructura. Así mismo la cantidad de REM absorbida está relacionada con el número de moléculas que interaccionan con ella
De la REM sólo se trabaja para la espectrofotometría en química clínica con la ultravioleta y la visible.
La radicación electromagnética tiene un comportamiento dual, es decir, como onda y como partícula. Como onda se sabe que presenta la propiedades de reflexión, refracción y difracción, esta última explica la descomposición de la luz en los diferentes colores.
Radiación electromagnética,de luz polarizada en un plano y que se propaga a lo largo del eje de las x
Espectro de luz visible
La radiación electromagnética al incidir sobre la materia puede sufrir los siguientes procesos: 1. Absorción 2. Transmisión 3. Reflexión 4. Refracción Luz refractada 5. Dispersión
Luz Reflejada
Luz Transmitida Luz incidente
Luz absorbida
La REM se desplaza describiendo una onda, mientras más pequeña es la longitud de onda (λ) mayor energía posee y viceversa. La longitud de onda (λ) es la distancia lineal desde cualquier punto de una onda hasta el punto correspondiente de la onda adyacente y se mide comúnmente en nm .
Todas las moléculas poseen energía la cual es debida a: a) La translación. b) La vibración de sus constituyentes (átomos). c) Rotación d) Su configuración electrónica. a+b+c+d = ET
Por lo tanto nos índica que la molécula sólo puede adoptar ciertos valores de energía y que y es diferente para cada compuesto.
En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En espectofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región de energía muy alta. Provoca daño al ojo. La región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos. humano así como quemadura común.
región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
La absorción de la REM por alguna especie M se considera en dos etapas y como un proceso irreversible. Número de ondas que pasan por un punto dado en una unidad de tiempo. Donde M* es la partícula en estado excitado Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2 M + hν M* h= constante de Planck y ν= Frecuencia, La molécula regresa a su estado basal mediante la liberación de la energía antes adsorbida, es decir, M* M + calor.
Fundamento Cuando una muestra absorbe fotones, la potencia del haz disminuye (I≤I0) donde I0 es la que sale del monocromador.
La ley que explica la relación entre la absorción y la concentración de una sustancia es conocida comúnmente como ley de Beer o Lambert-Beer. Si T es la transmitancia, es decir la radiación que pasa a través del cuerpo entonces T = P/P0 por lo que T solo puede tener valores que van desde cero hasta uno.
La Absorbancia (A) nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma muestra y se define como: A = log 1/T = -log T = -log It/I0 Cuando la intensidad incidente y la transmitida son iguales I0= It la transmitancia será de 100% e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A = log1 = 0 La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de la solución y de la concentración de éste.
Ley de Lambert - Beer a) La relación entre la intensidad de la luz transmitida o energía radiante I y la energía radiante incidente I0 es una función del espesor de la celda b a través del medio absorbente, de acuerdo a: α = abc donde: α =absorbancia b = espesor de la celda a =absortividad c = concentración b) La cantidad de energía electromagnética monocromática absorbida por un elemento es directamente proporcional a la concentración de las especies que absorben y a la longitud de la trayectoria de la muestra para un conjunto de condiciones instrumentales establecidas. si α = log(I0/I) donde: α = absorbancia entonces T = ( I/ I0) donde: T = transmitancia α = -log T
La ley de Lambert – Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
Los equipos comúnmente utilizados en las técnicas analíticas de espectrofotometría son los espectrofotómetros y los fotocolorímetros o fotómetros. Los espectrofotómetros son equipos que tienen en su sistema un monocromador que permite la selección de la longitud de onda con una alta resolución. Un fotocolorímetro a diferencia del espectrofotómetro utiliza sólo sistemas de filtros para seleccionar un intervalo de longitudes de onda con una menor resolución que el espectrofotómetro.
Fuente de luz: suele ser una lámpara que emite una luz (por incandescencia de un filamento) policromática, es decir que contiene distintas longitudes de onda con distintas intensidades, I0. Sistema óptico: a través de filtros, lentes y redes de difracción se focaliza el haz de luz y se selecciona una longitud de onda fija. Compartimiento muestra: es donde se coloca la muestra, con un espesor conocido, normalmente disuelta y en una cubeta de 1cm de paso óptico, sobre la que se hace incidir el haz de luz monocromática Sistema óptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza y selecciona por longitudes de onda Detector: recibe la señal de la intensidad de la luz transmitida a cada longitud de onda y la transforma en señal eléctrica que un ordenador pueda procesar.
M U E S T R A
D E T E C T O R
Punto de vista operativo.
Seleccionar fuente de luz y longitud de onda a la que se realizará la medida. Medir primero la absorbancia del disolvente (blanco) al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (I0 = It) por lo tanto la A=0 Colocar la celdilla con la muestra y leer absorbancia.
A
B
C
D
E
F
G
a) Lámparas de tungsteno es una magnifica fuente de radiación en el intervalo de los 380-780nm. Las más empleadas en química clínica son las de yoduro de tungsteno que tiene una vida útil de 2 a 3000h.
b, c y d son componentes del monocromador. b. La rendija de entrada reduce al máximo la luz difusa y evita que la luz dispersa penetre al dispersor, éste solo lo puede hacer con un mínimo de luz directa. c. Dispersor de luz (selector de longitud de onda, o monocromador propiamente dicho). Pueden ser prismas orejillas de difracción.
B
C
D
En caso de los prismas. Para la luz visible un prisma de vidrio es bueno, sin embargo, este material no es conveniente para las mediciones en la región del ultravioleta, pues el vidrio absorbe la radicación a estas λ.
Rejillas de difracción. Las rejillas de difracción, estas se preparan a partir de una rejilla patrón en la cual se graban surcos. La dispersión de la luz en las rejillas de difracción es lineal. Como los surcos están muy próximos entre sí cuando la luz es reflejada por la rejilla, cada estría se comporta como una fuente de radiación.
Ranura o rendija de salida. Ésta determina el ancho del espectro de dispersión que sale del sistema monocromador. Ancho de Banda Como la luz obtenida que sale del sistema monocromador no es verdaderamente de una sola λ, sino que comprende un intervalo de λ. El grado de monocromaticidad se define como el Ancho de Banda. Es el intervalo de λ que pasan a través de la rendija de salida.
e) Existen de todos tamaños y formas. Las más comunes para medir espectros visibles y de ultravioleta son de cuarzo, tienen un espesor de 1,00cm (o trayectoria óptica). Las más fáciles de conseguir son las redondas (tipo tubo de ensayo) las mejores son las cúbicas.
E
F
G
f) Detectores, fotomultiplicadores y fototubos Poseen la capacidad de producir una señal eléctrica cuando son bombardeados por fotones. Se basan en el efecto fotoeléctrico. El más sensible es el fotomultiplicador. En éste los electrones emitidos por una superficie fotosensible inciden en una segunda superficie, llamada dínodo, la cual se mantiene (+) respecto al emisor fotosensible.
g) Registrador De aguja o digital. Incorporado a un sistema de impresión. Conectado a una computadora.
Espectro de absorción. Es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida (є) a diferentes valores de (λ). A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de (λ) al que el compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la hora de hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. Es espectro de absorción de un cromóforo depende de la estructura química de cada molécula.
A B S O R C I O N
Espectros de absorción de tres pigmentos fotosintéticos cloroplastídicos. Observar que un compuesto puede tener más de un pico de absorción (λmax).
Longitud de Onda
Curvas de Calibración. Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones de diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de absorbancia a λmax.
Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se observará que, a bajas concentraciones, el aumento de concentración se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las medidas son poco fiables.
Fotometría es la ciencia que se encarga de la medición de la intensidad de la luz, como el brillo percibido por el ojo humano. Es decir, estudia la capacidad que tiene la radiación electromagnética de estimular el sistema visual. Candela (cd) la cantidad de luz recibida por una superficie dependiendo de la intensidad de la fuente luminosa y la distancia a la que esta colocada esa fuente de luz, se calcula con la fórmula :
E = I/d2
La unidad de IIuminación (E) es el LUX (lux = cd / m2) E: iluminación I: intensidad d: distancia
¿Para que sirve la fotometría? La fotometría se aplica para la correcta selección de equipos y/o dispositivos a utilizar o proponer para su correcta aplicación en el proceso de diseño de iluminación. Si la fotometría no se utiliza de la manera adecuada esto nos traerá como consecuencia un entorno mal iluminado traerá como consecuencia consumos innecesarios o mal administrados, mala distribución de la luz o bien, selección inadecuada de las luminarias en función de los espacios o superficies a iluminar
Las radiaciones luminosas provienen pues del calentamiento de un determinado material a consecuencia del cual radia energĂa.
Un fotómetro es un instrumento que nos permite medir la cantidad de luz que hay en una escena. En la actualidad la mayoría de los fotómetros utilizan una célula fotoeléctrica. Fotogeneradoras.- En este tipo de célula cuando incide luz
sobre ella genera una pequeña corriente eléctrica,
Fotorresistentes.- Cuando la luz incide sobre este tipo de célula, varía su resistencia eléctrica
Ciencia que estudia los colores, caracterizandolos por números para poder cuantificarlos y así deducir características de los colores cuando estos se mezclan. En 1666 Newton descubrió la descomposición de colores. 1931 la Comisión internacional de iluminación (CIE) definió patrones para la especificación numérica del color. Básicamente, los colores que el ser humano percibe en un objeto están determinados por la naturaleza de la luz reflejada del objeto. El color del objeto no sólo depende del objeto en sí, sino de la fuente de luz que lo ilumina, del color del área que le rodea y del sistema visual humano (el mecanismo ojo-cerebro).
La Colorimetría es cuantitativa, orientada a lo físico, con mediciones a través del espectro-radio (spectroradiometer) , el colorímetro (que mide la cantidad de colores primarios)
Términos perceptuales Tono Saturación Claridad (objetos reflectantes) Brillo (objetos con luz propia)
Términos colorimétricos Longitud de onda dominante Pureza de la excitación Luminancia Luminancia
El efecto visual de cualquier distribución espectral puede caracterizarse por tres características (longitud de onda dominante, pureza de la excitación y la luminancia)
La pureza de la excitación es el radio de la luz monocromática de la longitud de onda dominante y la luz blanca necesario para producir el color: e1 = e2, la pureza de excitación es del 0% (insaturado). e1 = 0, la pureza de excitación es del 100% (totalmente saturado). La luminancia se refiere a la energía total. En este caso dependería de e1 y e2. Si la luz es acromática (sin color), su atributo único es su intensidad, o cantidad. ( luz acromática es lo que se ve en una televisión en blanco y negro). De forma que se define una escala de grises que va desde el negro al blanco. La luz cromática se refiere a la sensación visual del color, abarca el espectro de energía electromagnética desde aproximadamente 400 a 700nm
Un colorímetro es cualquier herramienta que identifica el color y el matiz para una medida más objetiva del color. El colorímetro también es un instrumento que permite la absorbancia de una solución en una específica frecuencia de luz a ser determinada. Es por eso, que hacen posible descubrir la concentración de un soluto conocido que sea proporcional a la absorbancia.
El método fotocolorimétrico se refiere a la medición de la absorción que produce una sustancia coloreada cuando se la atravieza con un haz de luz de determinado color. Esa absorción es directamente proporcional a la intensidad de color de la muestra.
Los sensores miden la cantidad de luz que atravesó la solución, comparando la cantidad entrante y la lectura de la cantidad absorbida. Se realiza una serie de soluciones de concentraciones conocidas de la sustancia química en estudio y se mide la absorbancia para cada concentración, así se obtiene una gráfica de absorbancia respecto a concentración. Por extrapolación de la absorbancia en la gráfica se puede encontrar el valor de la concentración desconocida de la muestra. Otras aplicaciones de los colorímetros son para cualificar y corregir reacciones de color en los monitores, o para calibrar los colores de la impresión fotográfica. Los colorímetros también se utilizan en personas con déficit visual (ceguera o daltonismo), donde los nombres de los colores son anunciados en medidas de parámetros de color (por ejemplo, saturación y luminiscencia)
Longitud de onda aproximada
Color de luz que se absorbe
Color de luz que se refleja o se ve
390 – 435
Violeta
Amarillo Verdoso
435 – 490
Verde
Amarillo
490 – 580
Azul
Rojo
580 – 595
Amarillo
Azul
595 – 650
Naranja
Azul Verdoso
650 - 780
Rojo
Verde Azulado