Cosa si intende per CELLULA STAMINALE stato altamente indifferenziato (morfologia - caratteristiche antigeniche) capacità illimitata di autorinnovamento per l’intera vita dell’organismo multipotenzialità proliferazione lenta (quiescenza)
Inner cell mass
Embryonic STEM CELL
Somatic STEM CELL
ESISTONO VERE CELLULE STAMINALI nel SNC adulto ?
METODI STUDI in vitro = espianto di tessuto in cui è stata riscontrata neurogenesi e coltura di cellule dissociate STUDI in vivo = marcatura delle cellule e studio del lineage/utilizzo di antimitotici (cytosine-β-D-arabinofuranoside, AraC) in dosi sub-letali
SVZ
in vitro
primi anni ‘90
Reynolds and Weiss ⇒striato Morshead and van der Kooy ⇒SVZ
astrociti
neurone
SERUM-FREE MEDIUM + FATTORI DI CRESCITA (EGF/FGF-2) PROLIFERAZIONE INDUZIONE DIFFERENZIAMENTO
Questo risultato non è una prova definitiva dell’esistenza di NSC …potrebbe trattarsi di una popolazione eterogenea di progenitori ‘COMMITTED’….
oligodendrocita
Con questo esperimento si dimostra che da 1 unica cellula si ottengono i tre stipiti cellulari del SNC‌
STEM CELLS !! Le cellule sono piastrate ad una densitĂ tale da garantire 1 cellula/piastra NEURONI ASTROCITI OLIGODENDROCITI
progenitore
cellula staminale
Quale è la potenzialità ? in vitro MULTIPOTENTIALITY SELF-RENEWING QUIESCENCE
Le NSC dell’adulto hanno caratteristiche simili alle NCS presenti nel SNC in sviluppo? Esistono diversi tipi di cellule staminali nel SNC? Cosa induce una cellula staminale o un progenitore a scegliere un destino es. gliale vs. neuronale? Le c. staminali o i progenitori delle aree neurogenetiche del SNC sono in grado di dare origine a neuroni diversi da quelli che producono normalmente ?
Le NCS fetali ed adulte rispondono in modo simile a fattori di crescita, tuttavia è stato dimostrato che NSC espiantate in momenti diversi dello sviluppo e da diverse regioni del SNC reagiscono in modo diverso agli stessi fattori di crescita‌...
Le NSC dell’adulto hanno caratteristiche simili alle NSC presenti nel SNC in sviluppo? Esistono diversi tipi di cellule staminali nel SNC? Cosa induce una cellula staminale o un progenitore a scegliere un destino es. gliale o neuronale? Le c. staminali o i progenitori delle aree neurogenetiche del SNC sono in grado di dare origine a neuroni diversi da quelli che producono normalmente?
AREE NEUROGENICHE SVZ e Ippocampo
AREE NON NEUROGENICHE Cellule multipotenti possono essere isolate da regioni del SNC (ES. IL MIDOLLO SPINALE E LA PARETE DEL III E IV VENTRICOLO) che non presentano neurogenesi in vivo.
QUESTI RISULTATI FANNO IPOTIZZARE CHE NEL SNC DI ANIMALI ADULTI ESISTANO: -VERE C. STAMINALI = caratteristiche delle aree in cui persiste la neurogenesi -C. STAMINALI ‘POTENZIALI’ che solo in presenza di particolari stimoli si trasformano in VERE C. STAMINALI
Le NSC dell’adulto hanno caratteristiche simili alle NSC presenti nel SNC in sviluppo? Esistono diversi tipi di c. staminali nel SNC? Cosa induce una cellula staminale o un progenitore a scegliere un destino es. gliale o neuronale? Le c. staminali o i progenitori delle aree neurogenetiche del SNC sono in grado di dare origine a neuroni diversi da quelli che producono normalmente?
programma genetico intrinseco
stimoli ambientali
STUDI in vitro: ‘potenziali’ attributi di una cellula staminale
in vivo LA CELLULA SARA’ IN GRADO DI DIFFERENZIARSI IN TUTTI I TIPI CELLULARI OTTENUTI in vitro ?
Esperimenti di trapianto di cellule 3 variabili: L’origine delle c. trapiantate il sito in cui avviene il trapianto (area specifica del SNC) il momento dello sviluppo in cui avviene il trapianto (SNC embrionale, postnatale, adulto)
Trapianti di cellule 1. ESPIANTO DI TESSUTO (embrionale, postnatale o adulto) 2. (ESPANSIONE IN VITRO CON FATTORI DI CRESCITA) 3. MARCATURA DELLE CELLULE CHE VERRANNO TRAPIANTATE 4. TRAPIANTO (in specifiche regioni del SNC di animali a diverso stadio di sviluppo e in animali adulti) 5. ANALISI DEL DESTINO DELLE CELLULE TRAPIANTATE: - localizzazione (homing) - fenotipo (markers) - integrazione (circuiti)
I RISULTATI OTTENUTI, PUR CON UNA GRANDE ETEROGENEITA’ DI RISPOSTA, SEMBRANO INDICARE L’IMPORTANZA DETERMINANTE DEI FATTORI AMBIENTALI SULLA SCELTA DEL FENOTIPO FINALE
IPPOCAMPO ADULTO
1. omotopico
espianto
Produzione di fenotipo atteso: NEURONI E GLIA
trapianto
espansione in vitro
IPPOCAMPO ADULTO
2. eterotopico
espianto espansione in vitro
trapianto SVZ
Acquisizione caratteristiche tipiche delle c. locali: MIGRAZIONE FENOTIPO
LE STESSE NSC TRAPIANTATE IN AREE NON NEUROGENICHE (cervelletto, striato) DELL’ANIMALE ADULTO NON DANNO ORIGINE A NEURONI E SI DIFFERENZIANO IN CELLULE GLIALI
Se si modifica l’ambiente si osserva neurogenesi anche in aree non normalmente neurogenetiche (Alvarez-Buylla et al. 2001 BMP-noggin nello striato).
I fattori ambientali sono importanti in relazione alla capacità delle cellule di RICEVERLI ed ELABORARLI
Potenzialità intrinseche donatore SUCCESSO DEL TRAPIANTO • sopravvivenza • acquisizione di un fenotipo specifico • integrazione funzionale
Proprietà ambiente ricevente
CAMBIAMENTO D’ IDENTITA’… La potenzialià delle cellule staminali somatiche è più ampia del previsto
Geni che regolano alcune fasi della genesi e committment neurale nel sistema nervoso centrale Controllo della neurogenesi, proliferazione, uscita dal ciclo ... stadi embrionali Geni “proneurali” precoci: Mash1, Ngn2, Sox Geni proliferativi Vax1, Emx2, Dlx2 Geni per uscire dal ciclo Vax1, Vax2 Geni del committment neuronale NeuroD, Dlx5, Dlx6 Geni per iniziare migrazione e differenziamento Ebf2 Geni del primo differenziamento neuronale NeuroD, NeuroM, NeuN, β3-tubulina, neurofilamenti Geni per il differenziamento gliale CoR
)
bHLH Homeogenes HLH + ZF
Controllo del destino differenziativo ... Stadi embrionali
(
Geni Dlx, Vax Gene ER81 (committment interneuroni olfattivi) Gene Islet1 (committment neuroni di proiezione dello striato)
Controllo della nicchia neurogenica ... Stadi post-natali Geni
( Noggin Bmp
(committment neuronale) (committment gliale)
Geni Notch-Delta Geni precoci Dlx, Emx ...
Molti studi basati sui fenotipi di topi knock-out
Fattori Trascrizionali
Additional Reading • Soria et al. (2004) Defective neurogenesis in the absence of Vax1. J. Neurosci 24: 11171 • Garcia-Dominguez et al. (2003) Ebf is required for neuronal differentiation and cell cycle exit. Development 130: 6013 • Galli et al. (2002) Emx2 regulates proliferation of adult stem cells. Development 129: 1633 • Perera et al (2003) Defective neurogenesis in the absence of Dlx5. Mol Cell Neurosci 25: 153-161 • Yun et al. (2002) Mash1, Dlx and Notch function in differentiation of progenitor cells. Development 129: 5029 • Nieto et al (2001) bHLH genes controls neuronal progenotors. Neuron 29: 401 • Stuhmer et al (2002) Dlx genes induce GAD expression. Development 129: 245
Il destino dei neuroblasti generati nella VZ embrionale è stabilito da un complesso pattern di espressione genica
Ricapitolare gli eventi neurogenici utilizzando il modello delle colture di neurosfere
Da SVZ adulta
Parmar et al. (2003) Mol. Cell. Neurosci. 24: 741
Ricapitolare gli eventi neurogenici utilizzando il modello delle colture di neurosfere In vitro
In vivo EGF bFGF
Precursori precoci
Cellule che formano neurosfere
EGF bFGF
Progenitori dello striato
Progenitori olfattivi
Neuroni proiezione striatali
Interneuroni BO
DLX GABA DARPP-32
DLX GABA ER81
Interneuroni del tipo BO DLX GABA ER81
Astrociti Oligodendrociti
Expression of Dlx5 in E12.5 mouse embryo
Dlx5-/-
Dlx5+/-
VZ-SVZ
GE
OB
Expression of Dlx genes at E14.5
LGE MGE
X-gal
anti-dll
From basal brain
neurospheres + bFGF -serum, 7 days
Immunostaining
neurotubulin GFAP
Defective neuronal differentiation in NPCs from Dlx5-/- P0 brains. Single cell suspensions derived from neurospheres of normal (A) and mutant (B) mice were replated in differentiating medium. Cultures were stained with antibodies that recognize population-specific markers (neurotubulin for neurons, GFAP for astrocytes). Cultures of neonatal Dlx5-/- NPCs generated a much lower number of neurotubulin-positive neurons
Grafting di neuroblasti in colture organotipiche
Cx EG
48 h
BO
?? 1. Migrazione tangenziale
2. Migrazione radiale
Frammento di GE laterale
OB
Host WT
Donor EGFP+ cells
Regolazione globale della genesi e committment neurale nel sistema nervoso centrale Controllo della neurogenesi, proliferazione, uscita dal ciclo Geni “proneurali” precoci: Mash1, Ngn2, Sox Geni proliferativi Vax1, Emx2, Dlx2 Geni per uscire dal ciclo Vax1, Vax2 Geni del committment neuronale NeuroD, Dlx5, Dlx6 Geni per iniziare migrazione e differenziamento Ebf2 Geni del primo differenziamento neuronale NeuroD, NeuN, β3-tubulina, neurofilamenti Geni per il differenziamento gliale CoR
Controllo del destino differenziativo ... Stadi embrionali
(
Geni Dlx, Vax Gene ER81 (committment interneuroni olfattivi) Gene Islet1 (committment neuroni proiezione dello striato)
Controllo della nicchia neurogenica ... Stadi post-natali Geni
( Noggin Bmp
(committment neuronale) (committment gliale) Geni Notch-Delta Geni “proneurali” Dlx, Emx ...
cell-autonomous epigenetic modifications
bFGF EGF BMP-Noggin Nurr Delta-Notch Fgf8 Shh TGF-alfa Wnt-Frz
non cell-autonomous
cell fate determination
Transcription Profiling per definire in termini biologici il concetto di “stemness”
Ramalho-Santos al. (2002) Science 298: 597 Ivanova N.B. et al. (2002) Science 298: 601
Transcription Profiling per definire in termini biologici il concetto di “stemness” Hematopoietic SC-enriched Embryonic SC-enriched
Neural SC-enriched
Ramalho-Santos al. (2002) Science 298: 597 Ivanova N.B. et al. (2002) Science 298: 601
L’ azione del segnale Nogo, di derivazione gliale, nell’allungamento assonale
Kim et al. (2003) Neuron 38: 187
Limiti nell’uso delle cellule fetali per i trapianti
• problemi di tipo etico (uso di materiale da feti abortiti) • purezza e vitalità delle cellule • cellule postmitotiche, difficili da espandere e da conservare (la preparazione del tessuto donatore e l’intervento chirurgico devono essere sincronizzati)
La ricerca sulle NSC ha aperto nuove possibilità…….
Approfondimenti • Vescovi, R. Galli e A. Gritti. (2001) Le risorse delle cellule staminali somatiche. Le Scienze n.392 • Rossi & Cattaneo (2002) Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews/Neuroscience 3: 401-409 • Galli R., Gritti A., Bonfanti L. e Vescovi AL. (2003) Neural stem cells-An overview. Circulation Research •Alvarez-Buylla & Lim. (2004) Maintaining the germinal nihes in the adult brain. Neuron 41: 683-686 • Conover & Allen (2002) The subventricular zone: molecular and cellulare development. Cell Mol Life Sci. 59: 2128