Spot On - Micotoxinas: O que espera de uma solução de teste rápido? by BIOMIN

Edição 13

Uma publicação da Romer Labs®

Micotoxinas: O que espera de uma solução de teste rápido? Os 4 tipos de analistas Tamanho do grão: Uma maneira simples de melhorar a sua solução de teste de extração e ident. de resultados?

ppm

Foto: Sebastian LeeschEyeEm

Conteúdo

4-7

Que tipo de usuário análises de micotoxinas você é? 4 usuários e o que esperam de uma solução rápida Perdas economicas, riscos para a saúde dos humanos e dos animais, quadros regulamentares cada vez mais complexos: as razões pelas quais os produtores de grãos, alimentos e rações animais necessitam de testar as micotoxinas que são múltiplas. O Diretor de Comunicações Joshua Davis e o Gerente de Contas Chave Ervin Tanyi da Romer Labs observam algumas situações comuns nas quais os testes rápidos podem ajudar. Por Joshua Davis, Diretor de Comunicações, e Ervin Tanyi, Gestor de Contas, Romer Labs

A Spot On é uma publicação da Romer Labs Division Holding GmbH, distribuída gratuitamente. ISSN: 2414-2042

Editores: Joshua Davis, Cristian Ilea

Colaboradores: Joshua Davis, Henriette Hobbs, Nora Kogelnik, Ervin Tanyi Pesquisa: Kurt Brunner

Editora: Romer Labs Division Holding GmbH Erber Campus 1 3131 Getzersdorf, Austria Tel: +43 2782 803 0 www.romerlabs.com

©Direitos de autor 2021, Romer Labs® Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação poderá se reproduzida por nenhuma forma, para fins comerciais sem a autorização por escrito do detentor dos direitos de autor. Todas as fotos aqui contidas são propriedade da Romer Labs ou são utilizadas com licença.

Foto: BJI

Gráfica: GraphX ERBER AG

8-15

Quanto menor, melhor: Melhore os resultados da análise às micotoxinas reduzindo o tamanho das partículas A pesquisa mais recente mostra que o tamanho das partículas numa amostra possui um efeito considerável na precisão dos métodos analíticos de micotoxinas. As especialistas em micotoxinas, Henriette Hobbs e Nora Kogelnik avaliam o problema e disponibilizam algumas recomendações para manter as suas operações de teste de micotoxinas precisas e confiáveis. Por Nora Kogelnik, Gerente de Produto e Henriette Hobbs, Cientista Sénior, Romer Labs

Spot On Edição 13

Edição Rápido e preciso - e fácil de utilizar:

Respondendo às necessidades dos usuários de análises de micotoxinas Há mais de 39 anos. Desde a nossa fundação em 1982, nós, na Romer Labs, tornamos a análise das micotoxinas um ponto central para o nosso negócio. Esse longo período deu-nos uma compreensão incomparável não apenas dos meandros da análise, mas também das diversas necessidades do mercado. Não é suficiente desenvolver apenas um produto ou serviço que funcione. Tem que funcionar no sentido de cumprir com os requisitos específicos do cliente. Ou, colocando de outra forma: a precisão não deve ter o custo da utilização. Quando começamos a trabalhar no sistema AgraStrip® Pro WATEX®, recorremos a quem utiliza os nossos produtos no dia a dia: os nossos laboratórios de serviço, as nossas equipes de suporte técnico e, claro, os nossos clientes. Perguntamos-lhes, “O que necessitam que um teste rápido faça no local? Quais são os desafios com os quais são confrontados diariamente?” A partir de circunstâncias de teste tão diversas como os silos de grãos no Brasil, as fábricas de amido de milho na Europa e produtores de rações para animais de estimação nos EUA, havia uma resposta que estávamos sempre a escutar: “Porque é que o teste às micotoxinas não pode ser mais simples de utilizar?” Assim, ao mesmo tempo em que garantimos a melhoria dos padrões de sensibilidade e velocidade, dedicamo-nos a otimizar o processo e a abordar os problemas que preocupam os analistas de micotoxinas. O resultado? LFDs com LODs baixos e o novo leitor AgraVision™ Pro, que faz muito do trabalho que os analistas costumavam fazer, controlando o tempo, a temperatura e o fluxo de teste. Com um visor de 7 polegadas que funciona com um toque e 4 cartuchos de testes de operam de forma independente, o leitor AgraVision™ Pro é a nossa forma de proporcionar aos analistas de micotoxinas um elevado desempenho e tranquilidade. Nesta edição do Spot On, enfrentamos alguns dos problemas que mantem os analistas de micotoxinas acordados à noite. O nosso Gerente de Contas Chave, Ervin Tanyi, baseia-se nos seus anos de experiência para identificar quatro tipos diferentes de usuários análises de micotoxinas, os desafios com os quais se confrontam e o que esperam de uma solução de teste rápido. A Gerente de produto Nora Kogelnik junta-se à cientista sénior Henriette Hobbs para analisar um problema específico relacionado com a preparação da amostra: tamanho do grão e o seu efeito na extração da amostra e na recuperação de micotoxinas. Lançam uma nova luz sobre este tópico frequentemente esquecido e mostram como alguns ajustes podem melhorar a sua precisão do teste. Esperamos que desfrute desta edição do Spot On.

Klaus Hasler Diretor Geral, Romer Labs Diagnostic GmbH

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Spot On Edição 13

Que tipo de usuário de micotoxinas você é?

4 tipos de usuários e o que esperam de uma solução rápida Perdas económicas, riscos para a saúde dos humanos e dos animais, quadros regulamentares cada vez mais complexos: as razões pelas quais os produtores de grãos, alimentos e rações animais necessitam de testar as micotoxinas são múltiplas. Diretor de comunicações da Romer labs Joshua Davis e o gestor de contas Ervin Tanyi da Romer Labs observam algumas situações comuns nas quais os testes rápidos podem ajudar. Por Joshua Davis, Diretor de Comunicações, Romer Labs, e Ervin Tanyi, Gestor de Contas, Romer Labs

Uma publicação da Romer Labs®

A tecnologia do dispositivo de fluxo lateral (LFD) provou ser suficientemente versátil e robusta para ser utilizada no local e suficientemente precisa, em muitos casos, para substituir a necessidade de métodos laboratoriais.

Micotoxinas: uma ameaça crescente Os danos economicos que podem ser atribuídos às micotoxinas estão a aumentando: a FAO estima que 25 % da produção agrícola global está contaminada com micotoxinas. Estes compostos tóxicos podem desencadear problemas de saúde em humanos e animais, variando desde doenças oncológicas a doenças do fígado, rins, sistema nervoso, sistema hormonal e muito mais. Sabe-se que algumas micotoxinas suprimem o sistema imunitário. À medida que o nosso conhecimento sobre micotoxinas aumenta, também aumentam as restrições regulamentares sobre elas em matérias-primas, ração animal e alimentos. Estas restrições, por sua vez, desencadearam uma infinidade de estratégias e produtos desenvolvidos para detetar micotoxinas e prevenir os danos que causam à saúde e aos negócios. Das ferramentas à nossa disposição, as soluções de deteção rápida de micotoxinas baseadas na tecnologia de dispositivo de fluxo lateral (LFD) provaram ser suficientemente versáteis e robustas para serem utilizadas no local e suficientemente precisas, em muitos casos, para substituir a necessidade de métodos laboratoriais. Há já vários anos, temos trabalhado com produtores e comerciantes de grãos e rações em todo o mundo, ajudando-os a implementar soluções de deteção de micotoxinas nos seus pontos de recepção de matériaprima, silos de grãos, fábricas de rações e outros locais onde necessitam de resultados de micotoxinas que sejam rápidos e precisos. Neste artigo, discutimos quatro tipos diferentes que necessitam de soluções de teste rápido por razões relacionadas, mas diferentes. Esperamos que aqueles leiam isto e se reconheçam numa destas quatro funções possam aprender um pouco sobre como as soluções de teste rápido o/a podem ajudar no seu programa de deteção de micotoxinas.

#1: O produtor de grãos (entrada de matérias-primas)

Um dos pontos de teste críticos mais significativos na cadeia alimentar é a recepção da matéria-prima; gostamos de pensar naqueles que desempenham este papel crucial como “produtores de grãos”. O produtor de grãos decide se aceita, rejeita ou se separa os ingredientes, na maioria das vezes grãos crus, com base nos seus níveis de contaminação por micotoxinas. Os produtores de grãos necessitam de métodos de teste que cumpram com requisitos locais muito específicos. Para o produtor de grãos, o tempo até o resultado é de importância vital, já que todos na cadeia de fornecimento estão a aguardar pela sua decisão. Em minutos, os condutores de camiões ou os operadores ferroviários necessitam de saber se podem descarregar as suas cargas e, se sim, onde devem ser

descarregadas. Aqueles que estão mais abaixo na linha de fornecimento, como aqueles que aguardam para armazenar ou processar os materiais, também confiam no produtor de grãos para tomarem uma decisão rápida e precisa. O método de teste também deve ser simples, para que os produtores de grãos possam aprender facilmente e trabalhar com confiança. Esta simplicidade é essencial, pois eles já estão ocupados com outros parâmetros que precisam de ser medidos: humidade, limpeza e teor de proteína são apenas alguns outros para além das micotoxinas que necessitam medir num curto período de tempo. A recepção de matéria-prima também exige um design robusto, dos testes e equipamentos. A recepção de grãos e a moagem geram muito mais pó em comparação com um ambiente de laboratório padrão. Além disso, a temperatura ambiente pode variar largamente, dependendo das condições atmosféricas quando os grãos são colhidos. O equipamento de análise deve ser adequadamente resistente a estas condições adversas. Confrontado com todos estes desafios, o produtor de grãos necessita de uma maneira conveniente de gerir os resultados. Costumava ser suficiente ler os resultados das tiras de teste ou do visor de um leitor e registá-los manualmente. Hoje em dia, a conectividade é obrigatória: os resultados devem ser facilmente transferíveis para os sistemas de computador, incluindo as plataformas LIMS e ERP.

#2: Analistas Especializados (CQ para produtos altamente refinados)

Tal como os produtores de grãos, aqueles que efetuam o controle de qualidade para produtos altamente refinados, como ácido cítrico, amido, xarope de milho com alto teor de frutose e outros ingredientes biodegradáveis de origem natural, precisam de soluções conconfiáveis e rápidas para testar as micotoxinas. No entanto, a sua situação inicial não poderia ser mais diferente: normalmente não têm a pressão do tempo que vem com os caminhões de aguardar para descarregar as suas mercadorias nos pontos de recepção e, muitas vezes, beneficiam de um ambiente de laboratório e de pessoal com formação. Preocupados principalmente com as exigências exatas da produção de ingredientes, têm um olho para a precisão; chamamo-los de “analistas especializados ”. Embora possam ter acesso a métodos analíticos, como HPLC ou espectrometria de massa, os analistas especializados geralmente preferem um teste rápido de micotoxinas devido à sua simplicidade e flexibilidade. Aumentar o volume de teste com kits de teste rápido liberta equipamentos mais complexos e tempo de trabalho para outros trabalhos de laboratório necessários. Spot On Edição 13

#3: Os inspetores de micotoxinas (conformidade com regulamentos e limites)

Tanto o produtor de grãos como o analista especializado costumam negociar para uma empresa que comercializa matérias-primas ou que produz bens a partir destas matérias-primas. Aqueles que desempenham o nosso terceiro papel não estão normalmente a prestar atenção aos resultados financeiros de um negócio; certificam-se que os regulamentos estão a ser seguidos como devem ser. Frequentemente a trabalhar em empresas de certificação ou agências regulamentares, o seu trabalho é fiscalizar os limites de micotoxinas e certificar as cargas enviadas por comboio ou camião. Gostamos de chamar aos que desempenham este papel essencial de “inspetor das micotoxinas”. Os inspetores das micotoxinas estão quase sempre a trabalhar afastados de um ambiente de laboratório tradicional; na verdade, o seu laboratório é limitado ao que conseguem carregar na bagageira do seu veículo. Eles inspecionam comboios com destino a locais remotos para garantir a conformidade com os regulamentos. Trabalhando com frequência longe dos centros comerciais, a ligação à Internet é um luxo nem sempre disponível para eles. Muitas vezes, eles não possuem o equipamento de moagem disponível para o produtor de grãos e têm que contar com moinhos de café para obter as suas amostras de teste. Embora os equipamentos complexos de laboratório não sejam uma opção para o inspetor de micotoxinas, não basta qualquer solução de teste rápido. Para além dos requisitos básicos de sensibilidade, precisão e utilização, as tiras de teste e os leitores devem ser capazes de manter um desempenho de qualidade, apesar de estarem sempre em movimento. A mobilidade é a principal preocupação, com equipamentos especiais, como adaptadores de energia e baterias, permitindo que os inspetores das micotoxinas se desloquem para onde são mais necessários.

#4: O guardião dos animais (programa de gestão de risco de micotoxinas)

Para os que desempenham esta última função de teste rápido em discussão, a saúde dos animais sob os seus cuidados é primordial. Os “guardiões dos animais” garantem que a alimentação que os seus animais recebem é saudável e está dentro dos limites regulamentares aceitáveis para a concentração de micotoxinas. No entanto, os regulamentos são apenas parte da história; as recomendações dos veterinários podem resultar com frequência em limites muito mais rígidos do que os oficiais. O produtor sabe que, para gerir o risco de micotoxinas na ração, deve primeiro medir este risco. A concentração de micotoxinas de um lote específico de Uma publicação da Romer Labs®

ração ou de ingredientes de ração fornecerá informações úteis sobre as espécies dos animais para as quais pode ser utilizada - ou se pode mesmo ser utilizada. Pela nossa experiência, o produtor nem sempre pode esperar que os resultados das micotoxinas cheguem antes de decidir como usar um lote ou se um aditivo alimentar, como um desativador de micotoxinas, é indicado. Os testes rápidos ajudam o produtor a manter o rebanho protegido dos efeitos nocivos das micotoxinas, garantindo que as necessidades nutricionais do rebanho são cumpridas em tempo útil.

O que torna um sistema de teste rápido fácil de utilizar? Uma interface com usuário pela tela do leitor que é bem simples e fácil de utilizar.

Conclusão: Uma necessidade universal de velocidade (e sensibilidade e utilização e precisão)

O produtor de grãos, o analista especializado, o inspetor de micotoxinas, o produtor de animais: todos estes tipos de usuários de micotoxinas partilham algumas expectativas básicas de uma solução de teste rápido de micotoxinas. VELOCIDADE. Os analistas não têm tempo a perder. Talvez seja o produtor de grãos com os caminhões a aguardar que lhes diga se ou onde vão descarregar, ou talvez seja o inspetor de micotoxinas que deve testar, certificar (ou não) e dirigir-se rapidamente para o próximo local. Ao mesmo tempo, precisa de um sistema que coloque o “rápido” num teste rápido. SENSIBILIDADE. Todos os analistas precisam de um sistema que possa fornecer resultados até aos níveis inferiores de concentração exigidos pela legislação. Alguns analistas podem lidar com limites internos mais rigorosos do que os dos reguladores. Se isso descreve você, então você precisa se certificar de que qualquer sistema que você está considerando tem um LOD que atenda às suas necessidades e é validado para a matriz ou matrizes que você precisa testar. USABILIDADE. O que torna um sistema de teste rápido amigável? Os clientes continuam a mencionar uma coisa que torna um kit utilizável: um fluxo de trabalho simplificado. Quando considera as necessidades do, digamos, produtor dos animais que tem que fazer malabarismos com diferentes tipos de tarefas, é essencial um fluxo de trabalho com o mínimo de etapas possível. Gostaríamos apenas de acrescentar que o fluxo de trabalho é apenas parte da história: uma interface de utilizador de grandes dimensões e intuitivamente construída no leitor também ajuda muito a tornar a vida mais fácil para todos os analistas. PRECISÃO. Por razões óbvias, ninguém em qualquer uma destas funções pode aceitar um sistema de teste rápido que ofereça resultados falhos. Por exemplo, o trabalho altamente especializado que vai para a produção de materiais refinados como DDGS não pode ser prejudicado por níveis inaceitáveis de micotoxinas. Em última análise, independentemente do papel que possamos desempenhar na deteção de micotoxinas, somos guiados por um imperativo: manter os nossos alimentos e rações dentro de níveis aceitáveis. As soluções de teste rápido de micotoxinas continuarão a ser ferramentas indispensáveis para cumprir com esta missão.

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Quanto menor, melhor:

Melhore

os resultados da análise às micotoxinas reduzindo o tamanho das partículas A pesquisa mais recente mostra que o tamanho das partículas numa amostra possui um

efeito considerável na precisão dos métodos

analíticos de micotoxinas. As especialistas em micotoxinas, Henriette Hobbs e Nora Kogelnik

avaliam o problema e disponibilizam algumas

recomendações para manter as suas operações de teste de micotoxinas precisas e conconfiáveis.

Foto: BJI

Por Henriette Hobbs, Ph.D., Cientista Sénior, e Nora Kogelnik, Ph.D., Gerente de Produto

Uma publicação da Romer Labs®

A amostragem e a preparação de amostras são processos complexos, repletos de potenciais armadilhas; cada etapa do processo de preparação da amostra apresenta um nível de variabilidade que contribui para a variabilidade total num único resultado analítico.

a comunidade analítica de micotoxinas, geralmente trabalhamos com três etapas p r o ce s s u a i s principais quando se trata de matérias-primas agrícolas, como milho, trigo e cevada: amostragem, preparação de amostras e análise. Para determinar a concentração de micotoxinas presente num lote a granel, devemos analisar uma porção menor, mas ainda representativa do lote; isto significa que resultados confiáveis são impossíveis sem um plano de amostragem adequado, que inclui utilizar amostras incrementais do lote e combiná-las numa subamostra (também conhecida como amostra composta). Isto forma uma base que garante que a amostra a ser testada é verdadeiramente representativa do lote. A partir daqui, o nosso foco passa para a preparação da amostra. Para produtos à base de grãos, a preparação da amostra consiste em duas etapas importantes, moagem da amostra e subamostragem: 1) um moinho ou outro dispositivo é utilizado para moer o grão na amostra composta para reduzir o tamanho da partícula e para garantir a uniformidade; 2) desta amostra, obtemos uma subamostra representativa de todo o lote, que testamos depois. Esta amostra de teste é posteriormente preparada para extração de acordo com um protocolo definido [10]. No entanto, a amostragem e a preparação da amostra são processos complexos, repletos de potenciais armadilhas; cada passo dentro do processo de preparação da amostra introduz um nível de variabilidade que contribui para a variabilidade total dentro de um único resultado analítico [2, 5]. Vários estudos mostraram que dois terços da variabilidade observada resultam do método de amostragem, sendo um terço atribuível à forma como a amostra é preparada. Uma percentagem

Figura 1. Variação observada durante a amostragem (61 %), preparação da amostra (36 %) e análise (3 %) para uma amostra contaminada com 20 ppb AFLA. Total variation observed for Adaptado de [2].

3+36+61 a 20 ppb AFLA corn sample

Análise Analysis 33% %

Amostragem Sampling 61% 61 %

Preparação da amostra Sample 36 % preparation 36%

muito menor de variabilidade está relacionada com o método analítico a ser aplicado (Figura 1). Consequentemente, os resultados precisos dependem do grau em que levamos estes três fatores em consideração. Enquanto vários estudos discutem a importância dos métodos de amostragem e solventes analíticos sobre o efeito da deteção de micotoxinas [ver 1, 2, 4] para exemplos proeminentes), este artigo irá considerar a importância da preparação da amostra, ou seja, moagem e tamanho da amostra, e, ao resumir pesquisas recentes sobre o assunto, discutir o efeito da preparação da amostra na análise precisa de micotoxinas e variação da amostra [10].

Selecione uma amostra representativa Quando um produto é naturalmente contaminado com micotoxinas, os grãos contaminados são geralmente distribuídos de forma desigual num determinado lote; estes agrupamentos de grãos contaminados são conhecidos como “pontos quentes”. Para proporcionar uma visão precisa do grau de contaminação num lote, um plano de amostragem deve levar em conta a distribuição aleatória desses pontos quentes. Isto é efetuado considerando um grande número de amostras pequenas e incrementais de vários locais distribuídos pelo lote de modo a obter uma amostra representativa (Figura 2) [8]. A seleção de amostras incrementais de um lote a granel é essencial para dar a todos os grãos uma oportunidade igual de serem selecionados, reduzindo assim a polarização [10].

Figura 2. Procedimento de seleção da amostra para obter uma amostra de teste representativa de um lote a granel, em que a amostra composta é a acumulação de muitas porções incrementais menores retiradas de diferentes locais. O “divisor” segmenta ainda mais a amostra composta em amostras de teste individuais [10].

Lote Incrementos Amostra composta Divisor Amostra de teste Spot On Edição 13

definiu especificações para o tamanho da amostra, moagem da amostra e subamostragem para aflatoxina, desoxinivalenol, fumonisina, ocratoxina e zearalenona [9]. O USDA-FGIS recomenda que uma amostra seja moída de modo a que 60 – 75 % das partículas passem por um peneira n.º 20 e que 50 g da amostra teste (incluindo as partículas que não passam pelo peneira) sejam utilizadas para a extração da micotoxina.

Moer para garantir um tamanho de partícula uniforme Os bolores que produzem micotoxinas possuem várias rotas diferentes de contaminação; como resultado, as micotoxinas podem ser encontradas tanto no interior dos grãos como na superfície. A rota de infeção depende da micotoxina e do grão em questão. É bem conhecido que certos fungos produtores de micotoxinas, como o Fusarium, estão presentes no grão ou no núcleo, enquanto outros, como o Aspergillus, estão presentes na superfície. Moer uma amostra de forma uniforme resolve este problema, abrindo os núcleos contaminados e permitindo uma distribuição uniforme das partículas. Em última análise, isso melhora a deteção de partículas contaminadas [3].

Mantenha o tamanho do grão pequeno, o tamanho da amostra grande e os resultados de micotoxinas precisos Utilizamos os termos “exatidão” e “precisão” ao longo deste artigo, assim, é necessária uma definição rápida destes termos: exatidão e precisão significam incertezas associadas à análise que podem ser introduzidas a partir do método ou plano de preparação da amostra inicial. A exatidão é definida como a proximidade de um valor medido ao valor verdadeiro,enquanto a precisão é definida como a proximidade dos valores medidos entre si. O objetivo final deve ser implementar um processo que garanta uma elevada exatidão e uma elevada precisão [10]. Estudos demonstram que a precisão de um método de deteção de micotoxinas e, portanto, a variação dos resultados depende muito do tamanho das partículas na amostra. Para demonstrar a variabilidade da medição associada ao tamanho das partículas na amostra e ao tamanho da amostra em análise, consultámos vários estudos que a avaliaram (Figura 3 e Figura 4). No primeiro estudo realizado por Whitaker et al. (ilustrado na Figura 3), foram caracterizadas amostras de milho naturalmente contaminadas por aflatoxina. As amostras de grãos de tamanhos diferentes passaram posteriormente por uma peneira n.º 20: 1) uma moagem grossa (60 % das partículas passaram), 2) uma moagem fina (99 % das partículas passaram) e 3) pó (com uma trituradora).

Homogeneizar a potencial distribuição de micotoxinas, passando o grão por uma peneira e misturando Após selecionar a amostra para ser representativa do lote e moer para garantir o tamanho uniforme da partícula, a amostra deve ser homogeneizada misturando-a completamente; isto também ajuda a torná-la representativa da amostra composta [3]. Os grãos segregam de acordo com o tamanho, reduzindo o grau de representatividade da amostra e levando a um resultado analítico impreciso. Por esta razão, antes de misturar, confirmamos que a uniformidade da moagem é adequada passando a amostra moída através de uma peneira. O objetivo não é filtrar partículas maiores, pois também podem conter micotoxinas; pelo contrário, estas partículas maiores devem ser incluídas na amostra. Em vez disso, garantimos a uniformidade da moagem, verificando se uma determinada percentagem de partículas consegue passar. O USDA-FGIS, por exemplo,

O objetivo de passar a amostra moída através de uma peneira não é filtrar partículas maiores, pois elas também podem conter micotoxinas; pelo contrário, estas partículas maiores devem ser incluídas na amostra.

Tabella 3: O efeito da partícula e do tamanho da amostra nos níveis de aflatoxina em amostras de milho naturalmente contaminadas [9]. Amostra Número 1

60 % amostra em peneira 20 50 g

10 g

50 g

10 g

151

140

149

160

167

136

135

151

222

217

5 6 7 8

Média (ppb) SD (ppb) RSD (%)

Amostra moída com trituradora

10 g

2 3

99 % amostra em peneira 20

135 95 86

108 140 56 40

125 110 123 139 111 115 126 15 12

Uma publicação da Romer Labs®

154 138 155 141 147 167

147 11 7

148 144 151 140 148 149

145 5 4

154 155 156 153 162 171 158 7 4

Estudos demonstram que a precisão de um método de deteção de micotoxinas e, portanto, a variação dos resultados depende muito do tamanho das partículas na amostra.

Foram depois analisadas oito amostras de cada intervalo de moagem utilizando um método de referência de HPLC modificado para demonstrar a variação entre amostras num único estado de moagem [9]. Como poderá observar na Tabela 3, existe uma variação nos resultados analíticos dependendo do tamanho da amostra e do tamanho da moagem. Contudo, como podemos quantificar esta variação de uma forma que seja útil para nós? O desvio padrão relativo (RSD) ou o coeficiente de variação (CV) são frequentemente utilizados para determinar quão diferentes são os resultados num determinado conjunto de dados. O RSD é frequentemente declarado como uma percentagem e é definido pela relação do desvio padrão em relação à média. Quanto menor for o desvio padrão, menor será a variação no conjunto de dados e mais fiável será o resultado. Nos dados do estudo apresentado na Tabela 3, foi observada uma variabilidade significativa entre amostras de 10 g constituídas por diferentes tamanhos de partículas. Os 10 g de amostras moídas de forma mais grossa mostram em 40 % o maior RSD quando comparadas com a amostra moída de forma mais fina (99 % da amostra

com rede 20), com um RSD calculado de 7 %. O RSD mais baixo, 4 %, foi alcançado com amostras em pó da trituradora. Embora uma trituradora possa não ser financeiramente viável para o usuário médio, o estudo de Whitaker et al. demonstra que a melhor maneira de evitar a variação proveniente da preparação da amostra é moer de forma fina e utilizar uma rede para garantir a uniformidade do tamanho das partículas [9]. Para demonstrar ainda mais o impacto do tamanho da partícula (moagem) e do tamanho da amostra na variabilidade analítica entre diferentes micotoxinas, Brunkhorst et al. realizaram uma análise em amostras de milho naturalmente contaminadas com aflatoxina total (soma de B1, B2, G1 e G2), fumonisina total (soma de B1, B2 e B3) ou zearelenona (Figura 4). Para este estudo, foram moídas 10 amostras de milho para cada micotoxina em diferentes tamanhos de partículas para permitir que passem por um crivo n.º 10, uma peneira n.º 20 ou uma peneira n.º 30. A variação de diferentes tamanhos de amostra (1 g, 5 g, 10 g e 25 g) para extração foi também analisada. As amostras de aflatoxina foram extraídas com acetonitrila/água (84/16) e analisadas utilizando um método AOAC e uma célula KOBRA para

Figure 4. O efeito do tamanho da moagem (moagem) e do tamanho da amostra (1 g, 5 g, 10 g, 25 g) na variabilidade analítica. Foram analisados extratos individuais (n = 10) de diferentes combinações de rede e tamanho da amostra para a aflatoxina total (A, B), fumonisina total (C, D) e zearalenona (E, F) em milho naturalmente contaminado. Foram utilizados métodos de referência para caracterização da amostra. Os resultados foram calculados em média, o desvio padrão foi calculado e representado no gráfico A, C e E. Além disso, o CV em % foi determinado e representado como um gráfico de linhas nas Figuras B, D e F. (Adaptado com permissão dos autores de [2, 7, 12].)

Aflatoxina total

A Concentração de Aflatoxina total[em ppb]

400

n 1 grama n 5 gramas n 10 gramas n 25 gramas

350 300 250 200 150 100 50 0

Passou 52,8 % através da peneira 10

Passou 97,1 % através da peneira 20

Passou 100 % através da peneira 30

Coeficiente de variação (CV)

CV [em%] para Aflatoxina totaltotal

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Passou 51,3 % através da peneira 20

Peneira 10 passa 52,8 % Peneira 20 passa 51,3 % Peneira 20 passa 97,1 % Peneira 30 passa 100 %

1 grama

5 gramas

10 gramas

GRAMAS da AMOSTRA utilizada para EXTRAÇÃO

25 gramas

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Quanto menor for

Fumonisina total 9

n 1 grama n 5 gramas n 10 gramas n 25 gramas

Concentração de Fumonisina total [em ppm]

8 7

o desvio padrão, menor a variação dentro do conjunto

6 5

de dados e mais

confiável será o

resultado.

2 1 0

Passou 50 % através da peneira 10

Passou 50 % através da peneira 20

Passou 95 % através da peneira 20

Passou 95 % através da peneira 30

Coeficiente de variação (CV)

CV [em%] para Fumonisina total

120

Peneira 10 passa 50 %

100

Peneira 20 passa 50 %

Peneira 20 passa 95 %

Peneira 30 passa 95 %

40 20 0

1 grama

5 gramas

10 gramas

GRAMAS da AMOSTRA utilizada para EXTRAÇÃO

25 gramas

Zearalenona 2500

Concentração de zearalenona [em ppb]

n 1 grama n 5 gramas n 10 gramas n 25 gramas

2000 1500 1000 500 0

Passou 50 % através da peneira 10

Passou 50 % através da peneira 20

Passou 95 % através da peneira 20

Passou 100 % através da peneira 30

Coeficiente de variação (CV) Passou 50 % através da peneira 10 Passou 50 % através da peneira 20 Passou 95 % através da peneira 20 Passou 100 % através da peneira 30

CV [em %] para Zearalenona

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1 grama

5 gramas

10 gramas

GRAMAS da AMOSTRA utilizada para EXTRAÇÃO

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25 gramas

Os resultados demonstram claramente que a variabilidade analítica pode ser reduzida quando as amostras são moídas para passarem por uma peneira mais fina.

brominação pós-coluna. As amostras de fumonisina foram extraídas com metanol/água (3/1) e foram também analisadas de acordo com o método da AOAC. Amostras de zearealenona foram também extraídas com acetonitrila/água e analisadas utilizando o LCMS/MS. Nota: Os dados ilustrados em cada par de gráficos são um pouco redundantes. No entanto, pensamos ser útil representar o coeficiente de variação num gráfico em separado. Os resultados mostram claramente que o tamanho da moagem e o tamanho da amostra afetam a precisão da análise. O estudo sugere que AFLA e ZON exibem um maior grau de dependência (ou seja, um maior CV) no volume da amostra e no tamanho de moagem do que FUM, embora hesitemos em tirar uma conclusão exata destes estudos individuais; pois são necessárias mais pesquisas para confirmar a nossa

observação. Para tamanhos de amostra de 1 g e 5 g, os RSDs para AFLA, FUM e ZON foram maiores em comparação com tamanhos de amostra de 10 g e 25 g. A variabilidade observada para uma amostra de 10 g de milho contaminado com AFLA diminuiu de 58,9 % (moagem grossa) para 9,3 % (moagem fina), para FUM de 39,8 % (moagem grossa) para 4,6 % (moagem fina), e para ZON de 21 % (moagem grossa) para 2 % (moagem fina). Estes resultados confirmam ainda mais o efeito do tamanho da moagem na variação analítica e na precisão em relação à extração e análise de micotoxinas dos grãos. Finalmente, Brunkhorst et al. elucidaram ainda mais as suas descobertas e determinaram os níveis de desoxinivalenol em amostras de cevada naturalmente contaminadas com o mesmo esboço de estudo. Amostras de cevada foram moídas em quatro tamanhos de rede

Figura 5. O efeito da moagem e do tamanho da amostra na variabilidade analítica do desoxinivalenol em cevada. Foram analisados extratos individuais (n = 10) em diferentes combinações de rede e tamanho da amostra utilizando LC-MS / MS. Os resultados foram calculados em média, o desvio padrão foi determinado e representado no gráfico (A) e o CV em % foi calculado e representado como um gráfico de linhas (B) [6].

Deoxynivalenol

A 4.50

Concentração de Desoxinivalenol em ppm

n 1 grama n 5 gramas n 10 gramas n 25 gramas

4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00

Passou 50 % através da peneira 10

Passou 50 % através da peneira 20

Passou 95 % através da peneira 20

Passou 95 % através da peneira 30

Coeficiente de variação (CV)

CV [em %] para Desoxinivalenol na cevada

Peneira 10 passa 50 %

Peneira 20 passa 50 %

Peneira 20 passa 95 %

Peneira 30 passa 95 %

30 25 20 15 10 5 0

1 grama

5 gramas

10 gramas

GRAMS of SAMPLE used for EXTRACTION

25 gramas

Spot On Edição 13

diferentes, extraídas (10 extratos individuais em cada rede e tamanho da amostra) utilizando acetonitrila/água (84/16) e analisadas por LC-MS-MS (Figura 5) [6]. Os resultados demonstram claramente que a variabilidade analítica pode ser reduzida quando as amostras são moídas para passarem por uma rede mais fina. Além disso, aumentar o tamanho da amostra ajuda ainda mais a reduzir a variabilidade analítica. O coeficiente de variação pode ser reduzido de 11 % para apenas 5 % ao utilizar uma amostra de 10 g com uma rede n.º 10. Um tamanho de amostra de 10 g e 25 g em combinação com uma peneira n.º 20 (95 %) e uma peneira n.º 30 (95 %) fornece resultados exatos e precisos, reduzindo o CV para 5 % e 3 %, respetivamente. Como este estudo utilizou cevada em vez de milho, sugere que o efeito do tamanho da amostra e da moagem na variabilidade analítica das micotoxinas pode não ser dependente da matriz. São necessários mais estudos para confirmar isto [6].

Conclusão: Passe pela peneira, misture e repita conforme necessário A importância da moagem e do tamanho da amostra, bem como o impacto que estes fatores têm na redução da variabilidade e na minimização de erros durante a análise

de micotoxinas, é evidente. Nos estudos apresentados, foi observada uma variação significativa entre amostras com moagem grossa e com moagem fina da mesma fonte e nível de contaminação. Para além da simples observação da variação, os dados destes estudos sugerem algumas abordagens iniciais ao tamanho da amostra e moagem. Em relação ao tamanho da amostra, 10 g tem sido suficiente, enquanto 25 g pode fornecer uma precisão ainda maior. Quando utilizar uma peneira n.º 20, 95 % da amostra deve passar. Quando utilizar uma peneira n.º 30, 100 % da amostra deve passar. O principal objetivo da análise às micotoxinas é obter resultados precisos e confiáveis, apesar das dificuldades de amostragem e das complexidades da preparação da amostra para grãos e culturas. No entanto, mesmo a melhor tecnologia, seja na forma de testes rápidos de ponta ou equipamento de espectrometria de massa de elevada precisão, será inútil se a sua amostra não for representativa do lote em análise. Existe mais numa amostra representativa do que apenas a amostragem; a preparação da amostra é a chave. Se aderir aos três fatores-chave de preparação da amostra (tamanho da moagem, tamanho da amostra e homogeneidade), poderá manter o seu RSD em <10 %, aumentando a fiabilidade do seu resultado analítico.

Em relação ao tamanho da amostra, 10 g tem sido suficiente, enquanto 25 g pode fornecer uma precisão ainda maior.

Referências 1) E. Pilcher: Amostragem para micotoxinas – preocupamo-nos o suficiente? Romer Labs. 2016, https://www.romerlabs.com/en/ knowledge-center/knowledge-library/articles/news/sampling-for-mycotoxins-do-we-care-enough/ 2) J. Brunkhorst: Efeitos do tamanho da partícula e tamanho de extração para análise eficaz de micotoxinas, Trilogy Analytical Laboratory, apresentado na AAFCO 2017 Collin L. O efeito da moagem e tamanho de extração na variabilidade da aflatoxina. Trilogy Analytical Laboratory, Washington, MO 63090 3) J. Richard: Amostragem e preparação da amostra para análise de micotoxinas. Em: Romer Labs guia para micotoxinas, 2. 2000 4) T.B. Whitaker ABS, M.B. Doko, B.M. Maestroni, A. Cannavan: Procedimentos de amostragem para detetar micotoxinas em produtos agrícolas:: Springer; 2011. 5) T.B. Whitaker FED, W. M. Hagler, F. G. Giesbrecht, J. Wu: Variabilidade associada à amostragem, preparação da amostra e testes químicos para aflatoxina em amendoim em stock de agricultores. Journal of AOAC International 1994, 77(1):107 - 116. 6) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Efeito da moagem e do tamanho da extração na variabilidade do resultado do desoxinivalenol, Trilogy Analytical Laboratory 7) V. Brunkhorst, C. Maune, J. Brunkhorst, J. Bierbaum, R. Niemeijer: Efeito da moagem e do tamanho da extração na variabilidade do resultado de zearalenona, Trilogy Analytical Laboratory 8) MFood Standards Agency. Guia de amostragem de micotoxinas, 2016. 9) Whitaker, T.B; Slate, A.B; and Johansson, A.S. Amostragem de alimentos para análise de micotoxinas. Em: O Livro Azul das Micotoxinas. D.Durat, ed. Nottingham University Press, Bath, England, 2005] 10) Whitaker T.B; Alimentos de Amostragem para Micotoxinas, Aditivos e Contaminações Alimentares, 2007. 11) Departamento de Agricultura dos Estados Unidos da América. Mycotoxin Handbook, 2015 12) Carrie K. Maune, Thomas Maune, Jordan Bierbaum, Julie Brunkhorst, Ronald Niemeijer. efeito da moagem e do tamanho da extração na variabilidade do resultado de Fuinsina. Washington, MO 63090 Uma publicação da Romer Labs®

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