Capítulo
23
TÉCNICAS DE IMUNOLOGIA Fernando A. Arosa / Elsa M. Cardoso
Este capítulo tem como objetivo principal apresentar algumas das técnicas mais importantes usadas em Imunologia para isolar e estudar os diferentes tipos celulares que constituem o sistema imunológico, nomeadamente linfócitos, monócitos e células dendríticas, assim como os mediadores biológicos que produzem. Não pretende ser um manual de laboratório, mas antes um guia que ajude à compreensão de algumas das principais técnicas imunológicas utilizadas em investigação e diagnóstico. O capítulo incidirá, sobretudo, em técnicas imunológicas mais avançadas utilizadas na investigação biomédica e que foram desenvolvidas graças ao progresso nas áreas da bioquímica e da biofísica (por exemplo, imunoprecipitação de proteínas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo), referindo mais sucintamente técnicas imunológicas clássicas de deteção e quantificação de antigénios (por exemplo, imunoensaios). Todavia, em primeiro lugar serão abordadas as técnicas de isolamento e cultura de populações de células mononucleares do sangue.
ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO O sangue periférico é a principal fonte de células linfoides e mieloides para investigação do sistema imunológico em humanos. O método mais comum é fazer o isolamento de células mononucleares do sangue periférico humano ou PBMC (do inglês Peripheral Blood Mononuclear Cells) centrifugando o sangue sobre soluções comerciais como o Lymphoprep, Ficoll-Hypaque ou Percoll. Estas soluções são uma mistura de polissacáridos e de um composto de alta densidade, o diatrizoato de sódio, que permitem separar os diferentes tipos celulares presentes de acordo com a sua densidade, os quais, após centrifugação, distribuem-se em camadas de acordo com a sua densidade. Assim,
os glóbulos vermelhos sedimentam na parte inferior do tubo e os granulócitos sedimentam formando uma camada na zona imediatamente superior. Na parte central do tubo aparece um anel formado pelas células mononucleares (que pode ser removido com o auxílio de uma pipeta Pasteur) e na região superior do tubo encontram-se o plasma e as plaquetas (Figura 23.1). Esta técnica é conhecida como centrifugação em gradiente de densidade e é também usada para isolar células mononucleares de sangue de cordão umbilical e de recém-nascidos. Porém, nestes casos as células mononucleares obtidas costumam conter células imaturas, nomeadamente eritroblastos, pelo que a sua remoção utilizando técnicas suplementares torna-se necessária. Uma vez isoladas as células mononucleares, poderá proceder-se à purificação dos diferentes tipos presentes: monócitos, linfócitos B, linfócitos T e linfócitos NK, assim como