Replikaciq

Репликация Какво е репликация?

Това е процес, при който от една молекула ДНК се получава нейно идентично копие

С какво е свързана репликацията?

Тя е свързана с митотичното и мейотичното делене на клетките и разможнаване на организмите. Способността за репликация на ДНК е заложена в химичната й структура, по-точно в правилото за комплементарност. Т.е нуклеотидната последователност в едната верига определя нуклеотидната последователност в другата верига. Верига1

Аденин-Гуанин-Аденин-Цитозин

Верига2

Тимин-Цитозин-Тимин-Гуанин

Репликация Възможни механизми за репликация Консервативен – при този механизъм двете родителски вериги се разделят, всяка от тях служи за матрица за синтез на новите комплементарни вериги. След завършването на синтеза всяка двойка се разделя и двете нови молекули са – изцяло родителски и изцяло дъщерни.

Полуконсервативен – при този механизъм двете родителски вериги се

разделят, всяка от тях служи за матрица за синтез на новите. И след това новите молекулите не се разделят и всяка е формирана от една родителска и една дъщерна верига. Така се пести енергията, която е необходима за разделянето на веригите. Изходна(родителска)ДНК Репликация

Родителски вериги

Дъщерни вериги

Полуконсервативен

Консервативен механизъм

механизъм

Дъщерни молекули ДНК

Консервативен и полуконсервативен механизъм за репликация на ДНК

Репликация Геометрични форми на ДНК в живите организми Линейна  При еукариоти  Някои фаги - Фаг ∅29, Т-фаги

Кръгова  Бактериални геноми – E.coli  Фагови геноми  Вирусни геноми  Полов фактор при бактериите  Плазмиди

Репликация Започване на репикацията: репликацията започва в точно определено място на веригата , наречено начало на репликацията (ori)

и протича двупосочно.

В линейните вериги на еукариотните хромозоми има много такива начала на репликацията, за да може репликацията да се извърши бързо, тъй като тези вериги са изключително дълги Репликативна вилка – У-образната структура, която се формира на мястото на репликацията Репликон – участъците в ДНК, Репликативни вилки Репликативни вилки които се реплицират в резултат на РЕПЛИКОН РЕПЛИКОН еднократна инициация на синтезата на ДНК. В кръговите ДНК-и обикновено има само едно начало на репликацията. Начала на репликация

Начало на репликация

Репликативна вилка

Репликативна вилка

Цялата молекула е един репликон

Край на репликацията

Тета структура (θ - структура)– структурата, която се образува при репликацията на кръгова ДНК.

Репликация Двупосочната репликация не е ПРАВИЛО. Има няколко възможности за начало на репликацията

a) Две ori, еднопосочно. Репликацията започва в две начала на репликацията и двете репликативни вилки се движат една към друга. Този механизъм се среща при линейни ДНК вируси, като аденовирусите. b) Едно ori, еднопосочно.Репликацията започва в едно начало на репликацията и една репликативна вилка се движи в една посока. Този механизъм се среща при бактериални плазмиди. c) Едно ори, двупосочно.Репликацията започва в едно начало на репликацията и две репликативни вилки се движат в противоположни посоки. Най-често използвания механизъм в еукариотни и прокариотни клетки.

Репликация

Ori при бактериалния геном на E.coli

Ori - това на практика са местата, където се инициира образуването на репликативна вилка Генома на бактерията Е.coli e двуверижна, кръгова молекула. Началото на репликацията в нея се нарича OriC. То се състои от 245 нуклеотидни двойки, като само тези, които се разпознават от специфични белтъци играят ролят в инициацията на репликацията.

OriC има повтори от 9 и съответно 13 базови двойки , предимно А-Т (на снимката R1, R2, R3 и R4. Гена dnaA кодира протеин, който се свързва към четири от 9-мерите в OriC .

аtp

asn

оriC, 245 н. д.

tgtggata a R1

tttggataa

ttatacaca R2

R3

ttatccaca R4

транскрипционно начало

R (1-4) - места, които се разпознават от DnaA-белтъка

Репликация

Ori при бактериалния геном на E.coli

След като dnaA протеина се свърже с участъците от OriC, ДНК в мястото се огъва и се образува отворен преиницииращ комплекс, съдържащ 10-20 белтъчни субединици и става денатурация в 13-мерните участъци. Това се извършва с енергия от АТФ. За да започне репликацията, ДНК молекулата трябва да е в отрицателна суперспирализирана форма. Това се осигурява от ензима Топоизомераза I, чрез единично скъсване в една от веригите. Това се прави, защото е по-лесно да се отворят веригите локално.

По-нататък за разделянето на веригата спомага продукта от гена dnaB – ензима хеликаза.

Репликация

Ori при бактериалния геном на E.coli

Хеликазата може да бъде мономер или хескамер. Хеликазата като хексамер се формира с помощта на белтък, който е продукт на гена dnaC. Хеликазата и белтъка dnaB образуват комплекс, с помощта на енергия от АТФ. Всяка едноверижна ДНК се свързва с по един dnaB-хексамер. dnaB – хексамерите се движат в противоположни посоки. Формират се 2 репликативни вилки от едно начало. Хеликазата разкъсва водородните връзки между двете вериги на ДНК, с помощта на енергия от хидролизата на АТФ. Посоката на движение на хеликазата е 5’ → 3’. Така се формира преиницииращия комплекс.

Репликация

Ori при бактериалния геном на E.coli По разделените ДНК вериги се закачат SSB (single-strand binding proteins), това са белтъци, които задържат ДНК в едноверижно състояние. При бактералните геноми основния ензим при репликацията е ДНК-полимераза III. Посоката му на работа е 5’-3’. Той добавя свободни дезоксинуклеотиди към растящата верига, проблема е, че за да ги добави му е необходим свободен 3’ – OH край.

Рибонуклеотид

Дезоксирибонуклеотид

Репликация

Репликация при Е.coli

За да се извърши репликацията, трябва да се синтезират 2 дъщерни вериги от матричните родителски. 5’- 3’ родителската веригата се нарича водеща, а другата е изощаваща. Двете вериги се синтезират по различен начин – водещата верига се синтезира непрекъснато, а изощаващата – по прекъснат, чрез фрагменти на Оказаки. Основния полимеризиращ ензим ДНК – полимераза III изисква праймер със свободен 3’OH – край, за да може да добява дезоксирибонуклеотиди към него и да дострои дъщерната верига. Този праймер се построява от ДНК-зависима-РНК-полимераза, тъй като тя може да свърже два рибуноклеотида. РНК-полимераза се свързва със стартовото място и строи около 10 рибонуклеотида, които да служат за зародиш на водещата верига. Комплекса РНК-полимераза+Хеликаза се нарича праймозома, а самата РНКполимераза се нарича – праймаза. След синтеза на зародиша, ДНКполимераза III достроява водещата верига като свързва дезоксирибуноклеотиди.

Репликация

Репликация при Е.coli

Синтез на изоставащата верига Изоставащата верига се синтезира по прекъснат начин. РНК-полимеразата се движи в комплекс с хеликазата , която разплита веригата. РНК-полимеразата, наречена праймаза синтезира РНК праймери в изоставащата верига. РНК праймерите се отстраняват от ензим ДНК-полимераза I, който има 5’-3’ екзонуклеазна активност. Тя откъсва рибонуклеотиди откъм 5’ края и съответно достроява ДНК веригата чрез полимеразната си активност. Така се синтезират така наречените фрагменти на Оказаки. Свободните краища на фрагментите на Оказаки се свързват чрез ензима ДНКлигаза. При лигазната реакция , 5’ края е енергетично активен – има 2 фосфатни групи. Свързването с 3’-OH края става с фосфодиестерен мост, фосфатните групи се улавят от АМФ и НАД и се образува молекула АТФ.

Репликация

Репликация при Е.coli

При прокариоти има три ДНК-полимерази  ДНК полимераза I – има три активности. Чрез 5'-->3‘ екзонуклеазната активност изрязва праймерите от изоставащата верига. Чрез 5'-->3‘ полимеразната си активност запълва празнините от изрязаните праймери в изоставащата верига. Има 3'-->5‘ екзонуклеазна активност, която се проявява, ако е включен погрешен нуклеотид.  ДНК полимераза II – има три активности – 5'-->3'-полимеразна, 3'-->5'-екзонуклеазна (извършва коректорна функция) и 5'-->3'-екзонуклеазна (изрязва праймерите от новосинтезираната верига).  ДНК полимераза III – главния ензим, катализира синтеза и на водещата и на изоставащата верига. При еукариотите има 5 ДНК-полимерази - α, β, γ, δ и ε, като α, β, δ и ε са локализирани в ядрото, а γ-в митохондриите

Репликация

Структура на ДНК полимераза III

Холоензимът се състои от 10 различни полипептида. Така наречената сърцевина (core) се състои от 3 субединици α е с полимеразна активност, ε - 3’ → 5’ екзонуклеазна активност, която служи за корекции на погрешно свързани нуклеотиди. Тази функция се нарича “proofreading”. Θ-субединицата е с все още неизвестна функция. Останалите субединици имат роля да да превръщат ензима от дистрибутивен в процесивен. Това се дължи на способността на β -субединицата да формира димер около ДНК дуплекса и да се асоциира с core-полимеразата близо да 3’ края на нарастващата верига, като така я задържа там. Изоставащата и водещата верига се синтезират едновременно, защото ДНК-полимераза III е димер. Има две корови части (сърцевини), β субединицата като пръстен обгръща двете вериги, а τ субединиците свързват двете корови части, които са обърнати в противоположни посоки. Едната τ субединица е свързана с хеликазата и целия комплекс се движи в посока от 5’ към 3’ и това е първата репликативна вилка.

Репликация

Структура на ДНК полимераза III

ДНК-полимераза III  α субединица Сърцевин  ε субединица а  Θ субединица 2 броя  β субединица – 2 броя  τ субединица – 2 броя Между втората корова част и хеликазата се образува едноверижна ДНК-ова бримка. Към нея се свързва РНК-полимеразата, която синтезира РНК-ов праймер. Тогава β субединицата позиционира α полимеразата в близост до 3’-края на праймера и започват да се удължават фрагментите на Оказаки. β субединицата по принцип се откача от комплекса и се свързва само когато вече се е синтезирал РНК-ов праймер и след него в посока 5’-3’ позиционира α полимеразата. Междувременно хеликазата действа и бримката между нея и β субединицата отново расте. Целият ензим се движи като едно цяло и двете корови части работят едновременно.

Репликация

Репликация при еукариоти

Ori при еукариоти- дрожди S.cerevisiae В 17-те хромозоми на S.cerevisiae има 400 ori места. Всяко едно такова се нарича автономно-реплицираща се последователност(autonomously replicating sequence ARS). От тях е разпозната последователност от 11 базови двойки. Доказано е, че комплекс от 6 различни протеина, наречен ORC (origin-recognition complex) се свързва специфично с ARS в АТФ-зависима реакция. Този комплекс остава свързан през целия клетъчен цикъл и по време на репликацита към него се свързват още протеини, които инициират синтезата на ДНК. Еукариотните ДНК-полимерази също се нуждаят от ДНК или РНК праймер, за да удължат новата верига. Тяхната функция е катализиране прибавянето на нуклеотиди към свободен 3’ OH-край и веригата расте единствено посока 5’ → 3’.

Репликация

Репликация при еукариоти

Етапи на репликацията при еукариоти –пример вируса SV40  Свързване на Тag – хеликаза към двойноверижната ДНК  Разделяне на дуплекса и свързване на RPA протеини към единичните вериги  Свързване на комплекса праймаза- ДНК-полимераза α , синтезиране на праймер, свързване на RFC, синтез на ДНК верига от ДНК-полимераза α, стимулирана от RFC.  Свързване на PCNA, който измества комплекса праймаза - ДНК-полимераза α.  Свързване на ДНК-полимераза δ към комплекса PCNARFC и синтез на водещата верига. Свързване на горния комплекс към матрицата на изоставащата верига и синтез на изоставащата верига по прекъснат начин.

Васи, много е важно да не бъркаш ДНК-полимераза α при еукариоти с α субединицата на ДНК-полимераза III при прокариоти.

Репликация

Репликация на теломерите в еукариотните хромозоми

В краищата на хромозомите се намират т.н. теломери. Те не могат да се съединяват с други хромозоми и извършват защитна функция. Теломерите, съдържат олигомерни повторени последователности. Поради прекъснатия начин на синтез се появява проблем при изоставащата верига. Когато се премахне последния праймер няма upstream верига, която да послужи на ДНК-полимеразата за матрица за дострояване на получената дупка. Затова се използва действието на ензима теломераза. Теломеразата е специфичен ензим, който разпознава 3’ края на родителската, която е матрица на изоставащата. В активния му център има РНК, която служи като матрица за дострояване на ДНК-ови краища. По своята същност теломеразата е модифицирана обратна транскриптаза (РНК-зависима-ДНКполимераза). 3’ края на на родителската верига се удължава до определена позиция, след което ДНК-РНК дуплекса транслоцира(премества) и хибридизира и удължаването продължава до достигане на определена точка, когато комплекса дисоциира. Дъщерната верига се доизгражда комплементарно с помощта на праймери. Такъв механизъм има само в генеративните (половите) клетки.

Репликация на двойноверижни линейни геноми Т-фаги

Репликация повтори от 160 н. д.

репликация

ori

продукти на

+

репликацията

Сдвояване на комплементарните опашки в 3’-краищата запълване на геповете с ДНКполимераза и лигаза място-специфично нуклеазно скъсване

полимеризация на 3’-краищата РЕПЛИКАЦИЯ НА ФАГА Т7

Генома на Т-фага е изграден от една линейна двойноверижна молекула ДНК, като запазва линейната си форма през целия жизнен цикъл, за разлика от ламбда-фага, чийто геном преминава през кръгова форма. Геномите на тези фагове представляват един репликон с вътрешно начало и двупосочна репликация. Проблемът: как се доизграждат ДНК след отстраняването на РНКпраймерите от 5’ краищата на веригите, синтезирани като изоставащи?

Репликация

Репликация на двойноверижни линейни геноми Т-фаги

Когато е опакована в капсида линейната молекула на Т7 фага, завършва с подравнени краища, нормално сдвоени чрез водородни връзки. Особеното е, че в левия и десния край на ДНК се открива една и съща последователност от 160 нуклеотидни двойки под формата на прав повтор. При синтезата на изоставащите вериги в тези участъци не се инициират фрагменти на Оказаки и те остават едноверижни. Резултатът след приключване на репликацията на изходната (с подравнени краища) ДНК е получаването на две дъщерни молекули с 3’-стърчащи краища, които са взаимно комплементарни. Двете дъщерни молекули взаимодействат помежду си чрез тези комплементарни краища, като останалите “гепове” и “никове” се възстановяват от действието на ДНК-полимераза I и лигазата. По този начин на практика след репликацията на фаговата ДНК се получават не две единични дъщерни молекули, а една димерна молекула ДНК, в която двете дъщерни са последователно и ковалентно свързани помежду си. Сега тази димерна молекула се реплицира подобно на изходната (родителска мономерна фагова ДНК) и крайният резултат от нейната репликация ще бъде получаването на четири ковалентно свързани фагови геноми и т. н. Така получените мултимерни производни на фаговия геном се наричат конкатемери. Предполага се, че връзката между отделните мономерни фагови геноми в конкатемерите се разпознават от място-специфични нуклеази (подобни на рестриктазите), които освобождават (този път) 5’-стърчащи краища, които лесно могат да се доизградят от ДНК-полимеразата.

Репликация

Репликация на двойноверижни Кръгови геноми

Завършването на реплицирането на кръгов геном, се осъществява на 180 градуса от началото (ori). След отстраняванеро на РНК-праймера от последния фрагмент на Оказаки, ДНК-полимераза I запълва образувалия се “геп”, като се залавя за 3’ края на водещата верига. Начало на репликация Репликативна вилка

Репликативна вилка

Цялата молекула е един репликон

Край на репликацията

Има и алтернативен механизъм, който преминава през генерирането на линейни конкатемерни структури от типа на тези при фага Т7. Този механизъм е известен като “Механизъм на въртящото се колело”

Репликация

“Механизъм на въртящото се колело”

едноверижно скъсване

3' 5' РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК ПО МЕХАНИЗМА НА ВЪРТЯЩОТО СЕ КОЛЕЛО

ре пл из о м и

новосинтезиращ се фрагмент на Оказаки

3' 5'

Завършен фрагмент на Оказаки

Особеното е, че в областа на ori се извършва едноверижно скъсване с освобождаване на 3’-OH и 5’-фосфатен край. 3’ края действа като субстрат за ДНК-полимераза III, а 5’ края с изместване на 5’- напредване на репликацията се края и свързване измества под формата на свободна на SSB-белтъци едноверижна опашка, която веднага се покрива с SSB белтъци, за да не се сдвои.Тъй като има свободен край в ДНК няма проблеми със свръхспирализацията. Освободената едноверижна опашка се реплицира по известния механизъм чрез образуването на фрагменти на Оказаки, а водещата верига се синтезира върху интактната кръгова матрица и непрекъснато доставя матрицата на изоставащата верига

Репликация

“Механизъм на въртящото се колело”

едновери жно скъсване

3' 5' РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК ПО МЕХАНИЗМА НА ВЪРТЯЩОТО СЕ КОЛЕЛО

изместване на 5’края и свързване на SSB-белтъци

р е п л и з о м и

новосинтезиращ се фрагмент на Оказаки

3' 5'

Завършен фрагмент на Оказаки

Така елонгацията (удължаването на ДНК) на репликацията може да продължи до синтезата на двойноверижни опашки, чиято дължина многократно да надхвърля тази на изходната кръгова молекула ДНК, т. е. и в този случай се образуват мултимерни конкатемерни структури. Подобно нещо се случва в късните стадии от репликацията на ДНК на фага ламбда. Специално при този фаг конкатемерните структури служат като субстрат за опаковане на фаговите глави като ролята на “маркери” между единичните фагови геноми изпълняват cos-краищата. Последните се разпознават от ензима терминаза, който извършва място-специфично скъсване при формирането на фаговите глави.

Репликация на едноверижни кръгови геноми

Репликация

Такъв е генома на филаментозния фаг М13 РНК-полимераза,

SSB-белтъци

Примаза или примозома

едноверижна фагова ДНК

RFII-форма на фаговата

СИНТЕЗ НА ДВОЙНОВЕРИЖНА ФАГОВА ДНК (RFII-ФОРМА)

ДНК (суперспирализира се)

След заразяване на бактериалната клетка с такива фаги, геномите им преминават в двойноверижна репликативна форма – RF-форма. Това се случва като едноверижната фагова ДНК веднага след навлизането в клетката се покрие с SSB-белтъци, освен в един малък участък, в който се синтезира РНК-праймер, необходим за започване на синтезата. Репликацията протича по описания вече механизъм с участието на ДНК-полимераза III, която извършва елонгацията на новосинтезираната верига, ДНК-полимераза I, която отстранява рибонуклеотидите от праймера и завършва синтезата, и лигаза, която формира ковалентната връзка между двата края на новосинтезираната молекула

Репликация на едноверижни кръгови геноми

Репликация

3' ori

5'

белтък А едноверижно скъсване

RFII-форма на фаговата ДНК

реплизома SSB-белтъци

едноверижна фагова ДНК

RFI

релаксирана двойноверижна форма на фаговата ДНК (RFI)

опаковката на едноверижната фагова ДНК с фагови белтъци СИНТЕЗ НА ЕДНОВЕРИЖНА ФАГОВА ДНК

Всички репликативни форми на едноверижните ДНК-фаги използват механизма на въртящото се колело, както за намножаване на самите себе си, така и за синтезата на (+)веригите на фаговото потомство, което ще се опакова в новите фагови частици. Този процес е най-добре изучен при фага ∅Х174 (“фита хикс” 174). Този фаг кодира белтък (белтък А), извършващ едноверижното скъсване в областта ori, което е необходимо за да започне репликация по механизма на въртящото се колело.

Репликация

Репликация на едноверижни кръгови геноми

В този случай скъсването се извършва в (+)-веригата на репликативната форма. Особеното е, че белтък А остава свързан през цялото време с освободения 5’-край на тази верига. При синтезата на водещата верига (съответно също (+)-верига) върху (-)-веригата, скъсаната родителска верига се измества от новосинтезираната и се покрива с SSB-белтъци, без обаче да се реплицира. Фактически, в случая се извършват многократни цикли на синтез само на (+)-веригата. Другата особеност е, че белтък А, освен че се свързва с 5’-края на старата (+)-верига, се асоциира и с реплизомата, която синтезира новите (+)-вериги “обикаляйки” около (-)-веригата. По този начин белтък А е ковалентно свързан и с първото ново (+) копие на фаговата ДНК, което е субстрат на реплизомата. Така, когато комплексът между реплизомата и белтък А достигне до 3’-края на старата (+)-верига, белтък А извършва ново скъсване като се отделя от стария 5’-край, свързва се с новоосвободения 5’-край на новосинтезираната верига и в същото време свързва 5’- и 3’-края на първия едноверижен фагов геном (този геном не съдържа новосинтезирана ДНК, а всъщност представлява старата (+)-верига снета от RF-формата). С помощта на този механизъм се образуват много едноверижни фагови геноми, които или се опаковат в зрели фагови частици или се превръщат в двойноверижна репликативна форма.

Репликация Еднопосочна репликация на двойноверижни линейни фагови геноми без използването на РНК-праймер Фага ∅29 5' a b c

C B A

5'

5' a b c

C B A

5'

c b a

5' C B A 5'

5'

5' 5' 5' 5' EДНОПОСОЧНА РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК

Репликацията започва директно от края на линейната молекула ДНК, без значение дали това е единия или другия край. В тези краища, подобно на ДНК на фага Т7, се намират повторени последователности, които представляват обратни повтори. Особеното при репликацията на тези фаги е, че репликацията започва в единия край (независимо кой) и се реплицира само едната верига.

Репликация Еднопосочна репликация на двойноверижни линейни фагови геноми без използването на РНК-праймер Фага ∅29 Другата верига се измества, отделя се от своята комплементарна (която е ангажирана като матрица) под формата на едноверижна ДНК, която взаимодейства със своите комплементарни краища като образува структура от типа на фуркетите (със стебло и бримка). Едва тогава в стъбловидния двойноверижен край може да започне репликацията на втората верига ДНК, при който процес фуркетната структура се разрушава и се формира другата дъщерна двойноверижна молекула ДНК. Първият нуклеотид в 3’-краищата и на двете вериги е Г. Преди започване на репликация специален белтък, кодиран от генома, се свързва за 5’-фосфатната група на дезоксицитидинмонофосфат. Така образувания нуклеотид-белтъчен комплекс взаимодейства с 3’-края на едната от двете вериги, при което се образуват водородни връзки между носения от белтъка Ц-нуклеотид и 3’-крайния Г-нуклеотид в ДНК. На практика нуклеотидбелтъчният комплекс служи като праймер за синтезата на ДНК.Така образувания нуклеотид-белтъчен комплекс взаимодейства с 3’-края на едната от двете вериги. Полимеризацията се извършва от ДНК-полимераза, специално кодирана за целта от генома. В процеса участва и друг геномно-кодиран белтък, който има хеликазна активност и е отговорен за изместване на другата верига, която ще се реплицира покъсно.