Page 1

Oznaczanie glukozy w plynach ustrojowych metoda kolorymetryczna z oksydaza glukozy Wprowadzenie: Glukoza jest monosacharydem o wzorze C6H12 O6 nalezacym do aldoheksoz (w formie

lancuchowej).

Moze

równiez

wystepowac

w

formie

cyklicznej,

jako

heterocykliczny pólacetal. Glukoza w naturze wystepuje w formie D, a jej wodne roztwory skrecaja plaszczyzne polaryzacji swiatla w prawo [+109.6º]. Rosliny wytwarzaja glukoze w procesie fotosyntezy, podczas gdy zwierzeta uzyskuja ja z sacharydów i skrobi dostarczanej w pokarmach. Glukoza jest podstawowym zródlem energetycznym organizmu ludzkiego. Utrzymuje sie we krwi w stalym stezeniu 80-120 mg dzieki regulacji hormonów trzustki, gl. insuliny (obniza poziom glukozy) i glukagonu bedacego jej fizjologicznym antagonista. Duze ilosci glukozy wystepuja w owocach, miodzie, czesciach wegetatywnych roslin. W przemysle otrzymuje sie glukoze ze skrobi ziemniaczanej i kukurydzianej. Wzrost stezenia glukozy spowodowany jest cukrzyca, chorobami trzustki, podaniem adrenaliny, oparze niami (pierwsze 24h) i innymi stanami i zespolami chorobowymi. Hipoglikemie czyli niedocukrzenie powoduje przedawkowanie insuliny lub niejedzenie posilku po podaniu leku, niedoczynnosc hormonalna przysadki, nadnerczy; alkoholizm, toksyczne uszkodzenie watroby; wplyw trucizn - chloroform, czterochlorek wegla, etanol, paracetamol. Cel cwiczenia : Celem cwiczenia jest oznaczenie zawartosci glukozy w badanym roztworze enzymatyczna metoda kolorymetryczna z oksydaza glukozy. W metodzie tej wykorzystuje sie zdolno sc aldoheksoz do tworzenia barwnych polaczen. glukoza + H2 O + O 2 2 H2O 2 + fenol + 4-aminoantypiryna

GOD POD

glukonian + H2 O2 4-(p -benzochinonomonoimino)-fenazon + 4H2O (czerwone zabarwienie)

1


Metoda kolorymetryczna mozna oznaczyc zawartosc glukozy w badanej próbce, która pozostaje w prostej zaleznosci od intensywnosci zabarwienia roztworu (max. absorpcji 500 nm).

Sprzet i materialy: Ø Roztwór wzorcowy glukozy o stezeniu 100mg/dl (5.5 mmol/l), Ø Surowica krwi ludzkiej, Ø Zestaw

diagnostyczny

do

oznaczania

stezenia

glukozy

Lquick

Cor-GLUCOSE-sklad: •

Bufor fosforanowy (pH 7.0)

250 mmol/l

fenol

5 mmol/l

oksydaza glukozy (GOD)

>250 µkat/l

peroksydaza (POD)

>20 µkat/l

4-aminoantypiryna

500 µmol/l

Ø 6 probówek typu eppendorf, Ø pipety automatyczne, koncówki do pipet, Ø kuwety polistyrenowe d = 10 mm, Ø Spektrofotometr UV-Vis SP-830 PLUS lub Spectroquant ® Pharo 100/300. Wykonanie cwiczenia: 1. Próba zerowa: do probówki typu eppendorf dodac 1 ml odczynnika do oznaczen. Pozostawic do osiagniecia temperatury pokojowej. Wykonac pomiary absorbancji przy dlugosci fali 500 nm. 2. Próba wzorcowa: do probówki typu eppendorf dodac 1 ml odczynnika do oznaczen. Pozostawic do osiagniecia temperatury pokojowej. Nastepnie dodac 10µl roztworu wzorcowego. Wymieszac i pozostawic na 10 min. Wykonac pomiar absorbancji przy dlugosci fali 500 nm wzgledem próby zerowej jako próby odniesienia. Pomiar wykonac trzykrotnie. 3. Próbka badana: do probówki typu eppendorf dodac 1 ml odczynnika do oznaczen. Pozostawic do osiagniecia temperatury pokojowej. Nastepnie dodac 10µl 2


roztworu badanego. Wymieszac i pozostawic na 10 min. Wykonac pomiar absorbancji przy dlugosci fali 500 nm wzgledem próby zerowej jako próby odniesienia. Pomiar wykonac trzykrotnie.

Próba Skladnik próbki Odczynnik do oznaczen

Zerowa

Wzorcowa

Badana

(PZ)

(PW)

(PB)

1 ml

1 ml

1 ml

Pozostawic do osiagniecia temperatury pokojowej Roztwór wzorcowy

---

10µl

---

Roztwór badany

---

---

10µl

Wymieszac i pozostawic na 10 min. w temperaturze pokojowej. Trzykrotnie wykonac pomiar absorbancji przy dlugosci fali 500 nm wzgledem próby zerowej jako próby odniesienia.

Opracowanie wyników: Ø Obliczyc stezenie glukozy w badanej próbie korzystajac ze wzoru: Stezenie glukozy = A(PB) / A(PW) x stezenie wzorca

Wartosci prawidlowe: Surowica, osocze

74-106 mg/dl (4.1-5.9 mmol/l)

Krew pelna

65-95 mg/dl (3.5-5.3 mmol/l)

Plyn mózgowo-rdzeniowy

40-70 mg/dl (2.2-3.9 mmol/l)

Zalecane jest opracowanie przez kazde laboratorium wlasnych zakresów wartosci prawidlowych charakterystycznych dla lokalnej populacji. Ø Przeprowadzic analize statystyczna wynikó w, obliczajac srednia zawartosc glukozy w próbce, odchylenie standardowe oraz procentowy blad oznaczenia. Literatura uzupelniajaca: 1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN Warszawa 1996. 3


2. L. Klyszejko-Stefanowicz, Cwiczenia z biochemii, PWN Warszawa 1999. 3. L. Stryer, Biochemia, PWN Warszawa 1999.

Zagadnienia: 1. glukoza (budowa, poznanie zagrozen wynikajacych z zachwiania r贸wnowagi glukozy w organizmie, metody oznaczania glukozy we krwi). 2. Spektrofotometria UV-Vis (prawa absorpcji i odc hylenia od tych praw, aparatura). 3. Opracowanie wynik贸w i ich ocena statystyczna.

4

tytul  

opis ssssssss

Read more
Read more
Similar to
Popular now
Just for you