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균류연구반 동아리 탐구보고서

경희여자고등학교 내 장소별로 부유하는 균류에 대한 연구

지도교사 : 김지광 연구학생 : 정우예, 변정인, 김채윤 G.O.B(경희여자고등학교 균류 연구반)

Ⅰ. 탐구 동기 및 목적 생명과학 실험시간이었다. 실험시간에 우리는 대장균의 플라스미드 DNA를 추출하는 실험을 하게 되었다. DNA 추출 키트를 이용하여 플라스미드를 추출하고, 각각 다른 제한효소로 DNA를 잘라낸 후 로딩하고 DNA 조각의 지문을 관찰하였다. 이러한 과정에서 우리는 대장균처럼 작은 원생동물도 DNA를 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 아울러 진화의 정도와 관계없이 각각의 생명체들은 나름대 로의 염기서열을 통한 정교한 유전암호를 지니고 있다는 것을 알았다. 정말 신기했다. 그때 생물선생 님께서 우리들을 소집하셨다. 그리고 우리만의 생물동아리를 결성하자는 제안을 하셨다. 생명에 대해 샘솟던

호기심과

탐구하고자

하는

열망을

채워줄

좋은

기회라고

여기고

우리는

마침내

G.O.B(Godless Of Biology)을 결성하게 되었다. 첫 연구주제를 정해야 했다. 세상에는 수많은 생명체가 존재하고 그랬기에 우리는 무엇을 연구해 야할 지 막막하기만 했다. 마침 2학년 7반 교실 벽에 피어있는 울긋불긋한 수많은 곰팡이를 발견하 게 되었다. 그전에는 더럽고 불쾌하다고만 여기고 넘어갔지만, 이번에는 달랐다. 우리가 하루에 12시 간 이상 생활하는 주 활동지인 학교에서 머물면서 가장 가까이서 오랫동안 함께하고 있기에 다른 어떤 것들보다도 그들의 정체가 무엇인지에 대해 알아야 된다고 여겼다. 그래서 우리는 교실, 화장 실, 양현재(자율학습실), 교무실, 급식실 등의 우리 학교 내부의 여러 장소에서 곰팡이를 채집하였다. 그리고 각 장소별 환경적 요인들을 기재하고 곰팡이의 종류와 환경적 요인의 상관관계에 대해 알아 보기로 하였다.

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Ⅱ. 사전조사 1. 곰팡이의 종류 현재 균류는 5개의 문으로 분류한다. 균류에는 약 5만종 의 생물이 포함되어 있으며, 그 중 우리가 채집한 공기중 의 곰팡이는 대부분 접합균류와 자낭균류에 속한다. 약 1000종이 존재한다고 알려진 접합균류는 고구마, 딸기같은 산물을 부패시키는 성장이 빠른 곰팡이류를 포함한다. 약 3만 2000종 이상의 자낭균류는 다양한 서식지에 존재하는 데, 크기와 복잡성이 단세포인 효모에서부터 복잡한 주발 버섯과 곰보버섯에 이르기 까지 다양하다. 접합균류는 수평으로 자라는 균사가 먹이에 침투하여 영 양물질을 흡수한다. 무성생식 시기에는 수직으로 자란 균 사 끝에 공모양의 포자낭이 발달한다. 각 포자낭 안에는 수백 개의 반수체 포자가 발생하며, 공기를 통해 분산된다. 분산된 포자가 습한 먹이 위에 떨어지게 되면 발아하여 새로운 균사체로 자란다. 접합균류와 달리 자낭균류는 격벽이 있는 다세포이며, 포자를 생성하는 주머니 모양의 자낭이 있다. 대부분의 곰팡이는 세포가 길쭉하고 세로로 연결되어 실과 같은 모양을 하고 있다. 이것을 균사 라고 하는데 곰팡이의 생식적 기능을 담당하고 있다. 2. 배지의 종류 및 제조방법 미생물의 분리, 배양에는 미생물의 종류 및 사용목적에 따라서 여러 종류의 배지가 필요하다. 미 생물은 그 종류에 따라서 영양 요구 성분이 다르며, 배지에 따라서는 대상으로 하는 미생물의 생 육에 필요한 영양소를 적당량을 가지고 있어야 하며, 또한 pH와 물리성이 맞아야 하고 무균상태 여야 한다. 가. 배지의 주요성분 미생물 중에는 탄소 원으로서 탄산가스, 질소원으로서 공기 중의 질소를 이용할 수 있는 것이 있으나, 미생물은 일반적으로 탄소 원으로는 당류, 유기산, 질소원으로는 무기 또는 유기의 질소 화합물을 요구함과 동시에 각종 무기염류를 필요로 한다. 그 외에 일부 미생물은 비타민이나 미 량의 요소를 필요로 한다. 1) 탄소 원(Carbon sources) 탄소원은 에너지원으로서 이용되며, 미생물의 배양에는 탄소 원으로서 sucrose와 glucose가 가장 많이 사용된다. 미생물의 종류 및 목적에 따라서 fructose, maltose, lactose, 전분 등의 당 류, 사과산, 구연산, 주석산 등의 유기산 및 분자량이 적은 지방산 등이 사용된다. 2) 질소원(Nitrogen sources) 질소원은 단백질의 합성에 이용되나. 미생물은 질소원으로서 암모니움염이나 질산염 등의 무 기태 질소를 이용할 수 있으나 미생물의 종류에 따라서는 아미노산 또는 peptone 등의 유기태 질소를 요구하는 것도 있다.

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3) 무기염류(Mineral sources) 무기염은 균체의 구성성분으로서 이용되기도 하고 배지의 pH, 삼투압의 조절에도 중요한 작 용을 한다. 병원균의 배양에 필요한 주요한 무기염은 P, Na, K, Mg, S, Fe, Cl이며 Ca, Mn, Cu 등을 필요로 하는 것도 있다. P, Na, K은 인산나트륨 혹은 염화마그네슘으로서 배지에 첨가한 다. 그 외의 무기염류는 미량이 요구되는데, 감자, 육즙, yeast extract, peptone 등의 천연의 배 지를 사용하는 경우에는 그 속에 필요한 량이 들어 있어서 별도로 첨가하지 않아도 된다. 4) 생장소(Growth factors) 대부분의 미생물은 비타민 등의 생장소를 합성하지만 일부 미생물은 생장소를 체내에서 합성 할 수 없으므로 배지에 미량의 생장소를 첨가하지 않으면 안 된다. 보통 배지에 첨가되는 생장 소로서는 니코틴산, 니코틴산아미드, 비타민 B1, B2, B6, 판토텐산(pantothenic acid), 엽산(folic acid), 트립토판(tryptophan), 헤마틴산(hematinic acid), 바이오틴(biotin) 등이 있다. 순수한 합성 배지에 생장소를 첨가하지 않으면 많은 미생물이 생육할 수 없다. 식물즙액, yeast extract, 육 즙 등에는 이들의 생장소가 함유되어 있으므로 별도로 첨가하지 않아도 된다. 나. 배지의 종류 배지는 이용되는 재료에 따라 천연배지, 합성배지, 반합성배지로 나누며, 사용형태에 따라 액체 배지와 고체배지로 나눈다. 또한 사용목적에 따라 보통배지와 특수배지로 나눈다. 1)재료에 따른 분류 ①천연배지 : 1배지재료가 천연물로서 그의 화학조성이 확실히 알려져 있지 않은 배지를 천연 배지라 한다. 감자한천, Oat meal배지, 볏짚 배지, Nutrient broth 배지 등이 있다. ②합성배지 : 화학조성이 알려져 있는 재료만으로 만들어진 배지로서 Czapek-Dox 배지 등이 있다. ③반합성배지 : 합성배지 성분의 일부를 peptone, yeast extract 등 화학조성이 밝혀지지 않은 천연물로 바꾸어 놓은 배지이다. 2)사용형태에 의한 분류 ①액체배지/고체배지 : 액체배지(liquid medium)에 한천, 젤라틴 혹은 실리카젤등을 첨가하여 굳힌 것이 고체배지(solid medium)이다. 액체배지는 미생물의 생리*화학적 연구 혹은 미생물 의 대량 배양에 사용되며, 고체배지는 미생물의 보존배양, 순수 분리 등에 사용된다. 고체배지 에는 평판배지, 고층배지, 사면배지 등이 있으며, 목적에 따라 사용방법이 다르다. 한천 등 고 형제의 함량은 사용목적에 따라 바뀐다. 3) 사용목적에 의한 분류 ①보통배지 : 보통배지는 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육할 수 있도록 제조된 배지로서 세 균용으로는 Nutrient broth, Nutrient agar, 사상균용으로는 감자 한천, Czapek-Dox, Oat meal 등이 있다. ②특수배지 : 특수배지에는 선택배지(selective medium), 판별배지(differential medium), 증식 배지, 생화학적 시험용 배지 등이 있다. 선택배지는 목적하는 미생물의 생육을 증진시키고 다 른 미생물의 생육이 억제되도록 만들어진 배지로서 토양 혹은 병든 조직에서 목적하는 균을 분리 배양하기 위해서 많은 선택배지가 고안되어 있다. 판별배지는 미생물의 생화학적 성질을 이용하여, 여러 미생물이 혼재 되어 있는 곳에서 목적으로 하는 미생물을 판별 또는 확인하기

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위해서 만들어진 배지이다. 증식배지는 보통배지에서는 생육이 잘 안되거나, 또는 생육이 나쁜 미생물의 생장, 증식을 촉진시키는 것을 목적으로 하는 배지이다. 생화학적 성질의 조사를 위 한 것이나 세균의 분류, 동정을 위해 여러 종류의 생화학적 시험용 배지가 개발되어 있다. 3. 진탕배양기(Shanking incubator) 온도를 자동 온도조절기로 조절하며, 회전 장치를 하여 일정한 속도를 유지할 수 있어서 산소의 공급이 필요한 통성*호기성 미생물의 배양에 사용한다. 4. 계대배양법 계대배양법은 일정 기간마다 새로운 배지에 옮겨 심어 배양하면서 보존하는 방법이다. 이 방법 은 오래 전부터 이루어지고 있는 기본적인 보존법이나, 배지가 건조해지기 때문에 수개월에 한 번씩 이식해야 하는 번거로움과 보존 중에 잡균에 의한 오염의 위험, 그리고 이식을 반복함으로 서 돌연변이에 의해 병원력, 포자형성 능력의 저하 등의 돌연변이를 일으키기 쉬운 결점이 있다. 5. PCR(중합효소 연쇄반응)원리 PCR은 최고의 방법으로 DNA염기서열을 증폭시킨다. 매우 적은 양의

DNA로 시작했다 하더라

도, 그것이 검출만 가능하다면, PCR을 통해서 엄청나게 많은 DNA카피를 만들 수 있다. PCR은 의 학적 진단, 유전적 분석, 유전적 설계 및 법의학적 분석에 사용될 수 있다. PCR의 단계로는 첫 번째, DNA는 온도에 민감해 높은 온도에서는 두 가닥으로 분리된다. 그러므 로 90℃ 정도로 가열해 꼬여있던 DNA 2중 나선을 푼다, 다시 온도를 낮춰주면 DNA는 서로 붙으 려 한다. 이를 이용해 50~60℃로 온도를 낮춰 주변의 프라이머와 붙을 수 있게 한다. 그 후 70℃ 로 유지해 새로운 DNA가닥을 신장시킨다. 이를 반복하면 많은 DNA 조각을 만들어 낼 수 있다. 6. 항온수조기(water bath) 수조 속의 수온을 일정하게 유지하는 기구로 곰팡이, 세균, 바이러스 등의 온도 저항력 실험 등 의 용도로 사용된다. 7. 전기영동 완성된 gel은 젤판에 붙어있는 채로 single cassette에 결합시켜 증류수 90g 와 10X TAE buffer 1.6g가 채워져 있는 DGGE tank안에 넣었다. PCR 산물 1㎕ 6X loading star 2㎕를 추가한 후, 증 류수 9㎕를 섞어 12㎕ 만들어 8㎕씩 loading하였다. gel 전기영동은 60℃의 일정한 온도에서 110V로 25분 진행하였으며, UV transilluminator(WUV-L20, DAIHAN Scientific, Korea)상에 옮겨 밴드를 확인하고 사진을 촬영하였다. 8. 염기서열 분석 염기서열 분석은 솔젠트(SolGemt, http://solgent.com)에 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)하여 일치도가 가장 높은 종을 확인하였다. 확인된 종들에 대한 염기서열을 NCBI로부터 내려 받아 대표적인 AMF 염 기서열로 지정한다. 이렇게 지정된 염기서열과 실험을 통해 분석된 염기서열들은 MEGA5를 이용 하여 alignment후 유연관계 계통도로 나타낸다.(Tamura et al., 2011).

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Ⅲ. 실험 방법 1. 학교에 자생하는 곰팡이의 다양성 가. 배지 만들기 고체 PDA 배지를 이용하여 실험한다. 고체 PDA 배지를 만드는 방법은 다음과 같다. ① 1L의 증류수에 PDA 가루 39g를 녹인 후 부드럽게 섞고 1분간 스터링을 한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. ② 알코올램프에 불을 붙이고 페트리접시를 가까이 가져가서 뚜껑을 불꽃을 향하여 살짝 열 고 소독한 액체 PDA를 붓는다. ③ 액체 PDA가 굳으면 뒤집어서 3일간 보관한다. 나. 곰팡이 채집 ① 급식실, 2-8교실 2-7교실, 본관 2층 화장실, 에메랄드룸, 본관 1·2교무실, 양현재에서 진행 한다. ② 만든 고체 PDA 배지를 각 장소별 사람의 손이 잘 닿지 않는 공간에 배치한다. 이 후 12시 간 동안 뚜껑을 열어놓은 채로 방치한다. (* 이 때 1시간 간격으로 해당 공간의 환경적 상황을 기재한다. 환경적 상황이란 온도, 사람의 방문 빈도, 햇빛 등 비교적 육안으로 판단할 수 있는 조건들을 말한다.) ③ 시간이 지나고 곰팡이를 채집한 배지를 파라핀 테이프로 실링한다. 다. 곰팡이 배양 ① 인큐베이터에 3일 동안 배양하면서 콜로니를 관찰한다. ② 콜로니를 관찰한 후 콜로니의 생성 정도를 확인하고 콜로니를 적당한 양으로 배양한다. 라. 곰팡이 분리 순수분리란 미생물 등을 배양할 때 다른 미생물이나 종이 오염(혼입)되지 않은 상태에서 단일 종만을 배양하는 것을 말한다.(출처: 해양과학대 사전 한국해양협회편) 여러 종류의 곰팡이가 자란 배지의 뚜껑을 알코올램프를 향하여 열고 종류가 다른 것처럼 보 이는 곰팡이를 구별한다. 각각 다른 종류의 곰팡이를 소독한 칼로 자른다. 그 후, 핀셋을 소독하 고 자른 곰팡이를 각각 새로운 배지에 옮긴다. (이때 배지를 멸균상태에서 실험하기 위해 배지 의 뚜껑은 항상 알코올램프를 향하여 열도록 한다.) 곰팡이를 옮긴 배지는 실링하고 뒤집어서 배양기에서 배양한다. 세포를 동물로부터 떼어내면 배양접시나 시험관에서 배양하게 된다. 배양접시에서 세포를 배양 하면, 세포는 배양접시의 바닥에 한 층으로 붙어서 자라게 된다. 이 상태에서 세포들이 계속 분 열하다 보면 더 이상 배양접시에 붙어 증식할 수 있는 공간이 부족하여 증식을 멈추게 된다. 이 러한 세포들을 계속하여 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어서 새로운 배양접시 에 옮겨주어야 하는데, 이를 계대배양이라고 한다.

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곰팡이가 자란 배지의 뚜껑을 알코올램프를 향하여 열고 소독한 칼로 옮길 부분을 자른 후 핀 셋을 소독하고 자른 곰팡이의 일부를 새로운 배지에 옮기고, (이때 배지를 멸균상태에서 실험하 기 위해 배지의 뚜껑은 항상 알코올램프를 향하여 열도록 한다.) 곰팡이를 옮긴 배지는 실링하 고 뒤집어서 배양기에서 배양한다. 마. 곰팡이의 형태적 동정 형태적 동정은 각 곰팡이별로 배지 앞면과 뒷면에서의 색, 모양, 균사의 형태, 냄새, 질감 등의 외적인 요소를 분석하는 방법으로 진행된다. 바. 곰팡이의 분자적 동정 분자적 동정은 순수 분리되어 배양된 배지에서 추출된 균사를 이용하여 DNA 추출, 유전자 증 폭(PCR), 염기서열분석, NCBI DB를 이용한 종간 유사도 및 계통수를 분석하는 단계로 진행된다. ① 균사로부터 DNA추출 형태 동정을 실시하여 동일종으로 간주되는 배지 중 상태가 양호한 배지 하나씩을 선택하여 GeneAll Exgene™ Plant SV mini의 protocol에 따라 DNA를 추출한다. 선별된 배지에서 멸균 된 이쑤시개를 이용하여 균사를 일정량씩 채취하여 1.5ml micro-centrifuge 튜브에 옮겨 담았 다. 1.5ml 튜브에 배지에서 채취한 균사를 넣고 PL buffer 400ul와 RNase A solution 4ul를 첨 가한다. Vortex하여 65℃의 항온수조에서 15분간 Incubate한다. Incubate하는 동안 5분에 한번 씩 vortexing한다. 140ml의 PD buffer를 넣고, Vortex하여

얼음에 5분간 Incubate한 후 다시

13500rpm으로 8분간 원심 분리한다. EzSep™ filter에 상등액 450ul을 옮겨 담고 13500rpm에 서 3분간 원심 분리한다. column을 통과한 용액

450ul를 새로운 튜브에 옮겨 담는다. 675ul

의 BD Buffer를 튜브에 pipetting한다. 전 단계의 용액 700ul를 GeneAl™l SV column에 넣는다. 8000rpm으로 1분간 원심분리하고 통과한 용액을 버린다. SV column에 700ul의 CW buffer를 넣고 8000rpm으로 30초 동안 원 심분리 한다. 통과한 용액을 버리고 다시 300ul의 CW buffer를 넣고 13500rpm으로 3분간 원 심 분리한 후 SV column을 조심스럽게 1.5ml 튜브에 옮겨 담는다. 100ul의 AE buffer를 SV column의 막 중앙에 떨어뜨리고 상온에서 5분간 Incubate한 후 8000rpm으로 1분 원심 분리 한다. 통과한 용액 100ul를 다시 SV column의 막 중앙에 떨어뜨린다. ② 추출된 DNA의 증폭(PCR) PCR 전용 튜브에5.8s ribosomal DNA(rDNA)의 ITS(internal transcribed spacer)영역을 선택적 으로 증폭시켜지는 균(Fungi) 특이적인 primer ITS1F와 ITS4를 각각 1ul, DMSO 1ul, DNA 1ul, 멸균수 6ul, premix를 10ul 넣어 최종부피가 10ul로 되게 하여 PCR 장치(TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice)에서 PCR을 수행한다. 이 PCR 반응물은 ~gel상에 1ul씩 loading한 후 전기 영동하 여 UV~에서 약 500bp 밴드를 확인한다. 사용한 primer에 대한 반응 조건과 특성은 Table.1에 제시하였으며 primer의 위치는 Fig.2와 같다. 염기서열 분석은 솔젠트(SolGent Co. LTD, http:/solgent.com)에 의뢰한다.

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Table. 1 Characteristics of primers used in this study & polymerase chain reaction(PCR) conditions. primer name ITS1F

ITS4

Nucleotide sequences 5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3' 5'-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTA

Tm 47.4℃

1cycle

94℃ 3분

30cycle

94℃ 1분 55℃ 1분 72℃ 1분

51.7℃

1cycle

72℃ 5분

A-3'

Fig.2. Position on 5.8s rDNA of primers used in this study & prospective DNA length when polymerase chain reaction with a pairs of these was reacted. Svedberg sedimentation (s), intergenic spacer (IGS), internal transcribed spacer (ITS), small subunit (SSU), large subunit (LSU).

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Ⅳ. 결과 1. 학교에 자생하는 곰팡이의 다양성 가. 곰팡이의 형태적 동정 장소

곰팡이 사진 Forth

특징

Back 앞면

- 진한 초록색 G1

- 원형으로 퍼져나감

2층

뒷면

화장실

- 중심 붉은색 - 가장자리는 노란빛으로 연해짐

앞면 - 진한 초록색 - 흰색 균사로 테두리 G2

2층

누락

화장실

둘러짐 뒷면 - 중심부 연한 노랑색 - 테두리는 더 진한 노란색

앞면 - 진한 초록색 G3

뒷면

양현재

- 연한 노랑색 - 가장자리는 미색 균 사로 테 둘러짐

앞면 - 진한 초록색 - 흰색 균사로 테 둘 G4

러짐

양현재

뒷면 - 중심부는 초록빛 - 연한 노란색으로 테 둘러짐

- 8 -


W1

- 가장자리가 거칠고

2-7 교실

앞면 뒷면이 흰색

앞면 - 하얀색 W2

- 솜의 형태

제2

누락

교무실

뒷면 - 연한 노란색 악취가 심함

앞면 W3

- 하얀색

2층

- 물방울 형태

화장실

뒷면 - 미색

앞면 - 하얀색 - 원형이며 중심이 볼 W4

2층

록함.

화장실

뒷면 - 중심부터 가장자리 까지 노란빛이 점 점 연해짐.

- 9 -


앞면 Y1

- 중심부는 흰색

제2

- 가장자리는 주황색

교무실

뒷면 - 주황색

앞면 Y2

- 주황색

2-7 교실

뒷면 - 연한 노란색

누락 앞면 - 진한 노란색 Y3

2층

뒷면

화장실

- 진한 노란색 점성이 강함.

앞면 - 노란색 Y4

양현재

- 광택이 남 뒷면 - 노란색

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<광학현미경 관측>

G1 현미경사진 (x1000)

G2 현미경사진 (x1000)

G3 현미경사진 (x1000)

G4 현미경사진 (x1000)

W1 현미경사진 (x1000)

W2 현미경사진 (x1000)

W3 현미경사진 (x1000)

W4 현미경사진 (x1000)

- 11 -


Y1 현미경사진 (x1000)

Y2 현미경사진 (x1000)

Y3 현미경사진 (x1000)

Y4 현미경사진 (x1000)

- 12 -


나. 곰팡이의 분자적 동정

4 0

Talaromyces ruber strain JX965239.1 Talaromyces ruber strain JX315666.1 Talaromyces ruber strain JX965241.1

0

Penicillium sp. JQ912017.1 0

4

Penicillium purpurogenum strain GU566198.1 Penicillium minioluteum L14505.1

0 3

Penicillium minioluteum AF380354.2 Penicillium purpurogenum strain HQ839781.1

0

Talaromyces amestolkiae strain JX965214.1

0 4

Penicillium purpurogenum var. JN899316.1 Talaromyces ruber strain JX965238.1

41

Talaromyces ruber strain JX315662.1

0

Penicillium sp. HM565951.1

0 4

45

Penicillium purpurogenum strain JQ422620.1 Penicillium sp. JN899312.1

4 54

Penicillium minioluteum strain HM469414.1 Talaromyces amestolkiae strain JX965229.1

14

Y4-ITS-1F Y3-ITS-1F

53

99

W4-ITS-1F 16

G1-ITS-1F

40

Talaromyces verruculosus isolate HQ607791.1 Acremonium cellulolyticus GU479898.1 Talaromyces verruculosus isolate HQ607919.1

43

Acremonium cellulolyticus AB474749.2

45 100

Penicillium pinophilum strain JQ776546.1

50 25

Penicillium pinophilum strain HM469418.1 Penicillium expansum strain DQ267827.1

3 0

Penicillium sp. EU926977.1 G4-ITS-1F G3-ITS-1F

0

Uncultured fungus clone KC191763.1 0

99

2

Penicillium oxalicum strain JF732994.1 Penicillium oxalicum strain FJ977097.1 Penicillium expansum strain HQ732137.1

0

Penicillium oxalicum genomic HE651144.1

0

64 100

3

G2-ITS-1F

3

Uncultured fungus clone GQ851781.1

0

Penicillium oxalicum genomic HE651146.1 Penicillium sp. HQ832798.1

- 13 0

0

3

Penicillium sp. FJ177638.1 Penicillium oxalicum isolate JQ446378.1


Penicillium oxalicum strain FJ977097.1 Penicillium expansum strain HQ732137.1

0

Penicillium oxalicum genomic HE651144.1

0

64 100

3

G2-ITS-1F

3

Uncultured fungus clone GQ851781.1

0

Penicillium oxalicum genomic HE651146.1 Penicillium sp. HQ832798.1 3

0

0

Penicillium sp. FJ177638.1 Penicillium oxalicum isolate JQ446378.1 Penicillium oxalicum strain AY213676.1

3

0

Penicillium sp.HM235946.1 Penicillium oxalicum isolate GU078430.1 Penicillium sp. HM439951.1

0

Penicillium sp. FJ770072.1

0

Penicillium oxalicum strain KC344971.1

0 3

Penicillium oxalicum strain HM469410.1 W3-ITS-1F

13 100

Candida parapsilosis voucher EF193066.1 Candida parapsilosis strain JQ952735.1 Candida parapsilosis voucher EF193067.1

5

Candida parapsilosis strain FJ746065.1

3 13

Candida parapsilosis strain EF198017.1

24

Trametes versicolor strain JX290580.1

43

Trametes versicolor AB811860.1 Trametes versicolor strain AY840587.1

39

Y1-ITS-1F

50 72 99

Trametes versicolor AB733645.1 Phellinus igniarius strain DQ311085.1 Phellinus sp. FJ940909.1

88

100

Agaricaceae sp. JQ312210.1 Agaricaceae sp. JQ312209.1

16

99

W2-ITS-1F Schizophyllum commune isolate EU530002.1 Schizophyllum commune isolate EF155505.1

88

Schizophyllum commune strain JX848644.1

8 16

Schizophyllum commune strain FJ478109.1 Spathularia flavida AY779316.1

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분자적 동정은 형태적 동정을 통해 분류한 종류의 균주에서 균사를 추출하여 DNA 분석을 실시하 였고, 종류별로 중복되는 샘플이 있을 경우에는 배지에서 성장이 가장 활발하게 이루어지고 있는 샘플을 선택하여 분석하였다. 균 특이 primer ITS1F와 ITS4를 사용하여 DNA를 선별 증폭하였고, 분석된 염기서열을 MEGA-5를 이용하여 alignment 후 Maximum Parsimony 반복수 1000번으로 설 정하여 계통수를 작성하고 유사도와 계통수의 형태를 통해 5속 7종을 동정하였고, 각 장소별로 나 타나는 결과는 2층 화장실에서 Acremonium cellulolyticus, Talaromyces verruculosus, Penicilium oxalicum, Candida parapsilosis 등 3속 4종, 양현재에서

Taralomyces verruculosus, Penicillium

expansum 1속 2종, 제 2교무실에서 Schizophyllum commune, Trametes versicolor 등 2속 2종이 확인되었다.

다. 곰팡이의 장소별 분포논의 분리된 내생균의 형태적 동정 결과와 분자적 동정 결과를 바탕으로 5개 속(genus) 7개 종(species) 의 내생균을 동정하였고 이들 내생균의 장소별 분포를 분석한 결과 2층 화장실에서 Acremonium cellulodyticus, Talaromyces verruculosus, Penicilium oxalicum, Candida parapsilosis이 양현재에서 Taralomyces verruculosus, Penicillium expansum이, 제 2교무실에서 Schizophyllum commune, Trametes versicolor이 분리되었다. 또한 각 장소별로 고유하게 나타난 종은 2층 화장실에서 cellulolyticus, oxalicum, parapsilosis 종, 양현재에서 expansum 종, 제 2 교무실에서 commune, versicolor 종이 각 장소별로만 나타났다.

<학교에 자생하는 곰팡이의 특징>

Candida parapsilosis는 효모 중 하나의 종류로 패혈증을 유발하거나 면역 저하 환자의 상처 조직에 감염시키기도 한다.

Schizophyllum commune는 버섯의 매우 일반적인 종이다. 식용버섯으로 여겨지긴 하지만 거친 질 감 때문에 요리재료로 잘 쓰이진 않고, 독성이 있을 수 있기 때문에 인간의 질병을 일으키는 원인 이 될 수 있다.

Trametes versicolor는 중국 의학에서는 양지버섯으로 의학적 효과가 있다고 하지만, 검증된 과학적 증거는 없다고 한다.

Penicillium 속에서 Penicillium expansum과 Penicilium oxalicum를 발견했는데 일반적으로 페니실린 (푸른곰팡이)는 항생제로 체내 박테리아의 특정 종류의 성장을 죽이고 또는 중지시킴으로써 인체에 유익한 약품을 만들어 낼 수 있다고 알려져 있지만 Penicillium expansum은 감귤류, 사과, 배, 체리 등의 과일의 부패에 영향을 끼치는 곰팡이다.

Talaromyces verruculosus는 Penicillium 속에 해당하는 곰팡이다. Acremonium 속의 균의 경우 많은 종의 원인, 인간과 동물의 기회 병원체로 인식되어 조갑 진균증 을 유발해내기는 하지만 인체에 직접적으로 감염되는 경우는 드물다고 한다.

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Ⅳ. 아쉬웠던 점 및 제언 1. 처음에는 장소와 온도, 배지 종류, 배지 뚜껑의 개폐시간, 온풍기 작동여부와 작동시간까지 모두 실험의 조작변인으로 정했었으나, 실험을 단순화시켜 결국 장소에 따른 곰팡이의 종류만 분류하게 된 점이 매우 아쉽다. 다양한 배양조건에 따른 곰팡이를 분류해보고 싶다. 2. 곰팡이를 관찰하면서 사진을 충분히 찍어놓지 않은 것, 정식 동아리가 아니어서 만나는 시간이 일정하지 않았고, 역할분담이 원활하지 않아 실험이 지체되었던 점등이 아쉬운 점으로 남는다. 3. 공기 중에 존재하는 곰팡이들은 배지에 배양할 수 있는 것과 배양할 수 없는 것이 있는데, 배양 할 수 없는 곰팡이들은 관찰 할 수 없어 종류를 알 수 없었다. 우리가 배양했던 배지는 PDA 배지 였는데 PDA배지 외에 다른 배지에서 자라는 곰팡이들 또한 관찰 할 수 없었다. 배양할 수 있는 곰팡이들도 육안으로는 정확한 구분이 힘들어 분류를 하던 중에 같은 종을 또 배양하기도 했고 다른 종을 같은 종으로 착각하여 배양하지 않았던 경우도 있었다. 4. W4와 G1 그리고 Y3, Y4는 Mega5를 돌렸을 때 Penicilium, Acremonium, Talaromyces와 함께 묶였다. 인터넷으로 사진을 비교해 보아 이들이 무엇인지 알 수 있었는데 sequencing한 내용은 DNA의 아주 짧은 구간이기 때문에 유사도를 보는 Mega5로 돌렸을 때 정확하게 묶이지 않은 듯 하다. 5. 스카치테이프로 곰팡이를 떼어내고 그 테이프를 슬라이드 글라스에 붙여 프레파라트를 만들었 었다. 만든 프레파라트를 고배율 현미경으로 관측하니 스카치테이프의 접착제와 우리가 채집한 곰 팡이의 상이 겹치게 되어서 제대로 된 관찰하기가 힘들었었다.

Ⅴ.참고문헌 1. 라이프 사이언스 생명과학 7판 - 옮긴이 전상학 p.607 2. 인삼의 잎에서 분리된 내생균의 다양성과 탄저병 내성 - 한국 교원 대학교 대학원 (p.11, p.13, p.14) 3. 위키피디아(wikipidia) 영문판 4. 네이버 지식백과 내 두산백과 5. 미생물학 실험(환경 생태 해양) - 강헌 편저 (동화기술) 6. 응용미생물학 - 정동효 박봉선 김현수 유관희 박경량 공역 (p.29~31, p.38, p.43~51, p.59~63, p.69) 7. 미생물학실험 <기초와 응용> - 미생물학 실험 교재 편찬위원회 편 (월드사이언스) 8. 기초군류학 - 박희문 신현동 오덕천 윤권상 이종규 공역 (월드사이언스) (p.1, p.55~59) 9. 미생물학 실험 - 한국미생물학회 공역 대표역자 이건형 (지코사이언스)

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경희여자고등학교 내 장소별로 부유하는 균류에 대한 연구